WO2002008456A2 - Verfahren zur identifizierung metastasierender tumorzellen - Google Patents

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WO2002008456A2
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Oliver Von Stein
Andrea Nestl
Martin Hofmann
Jonathan Sleeman
Peter Herrlich
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Forschungszentrum Karlsruhe Gmbh Technik Und Umwelt
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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
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    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
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    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/136—Screening for pharmacological compounds

Definitions

  • the present invention relates to a method for the identification of metastatic tumor cells and the identification of compounds for the treatment of tumors.
  • the present invention relates to a method for identifying metastatic tumor cells, the marker being at least one cDNA sequence selected from a population according to FIGS. A and / or B or corresponding complete gene sequences derived therefrom or functional fragments thereof, their homologs or alleles for hybridization can be used with tumor tissue.
  • the present invention also includes the gene products (polypeptides) derived from the cDNA sequences selected from a population according to FIGS. A and / or B or the corresponding complete gene sequences or functional fragments thereof, their homologs or alleles. According to the invention, this also includes the isoforms of these polypeptides, which although they have a changed amino acid sequence, have the same function in their function.
  • the invention also relates to antibodies with a specific binding to the aforementioned gene products, produced using the above-mentioned cDNA sequences and / or their gene products.
  • the complete gene sequences in addition to the coding nucleotide sequences, also include the associated regulatory regions in front of and behind the coding regions.
  • the regulatory regions are to be understood as functional structures, such as, for example, promoters, terminators, target or target sequences, retention signals, translation amplifiers, splice elements or polyadenylation signals.
  • a functional fragment is a nucleotide sequence which codes for a corresponding polypeptide, which in turn has a specific activity of the corresponding full-length protein.
  • a functional fragment is understood to mean a nucleotide sequence which leads to a specific hybridization signal under stringent conditions.
  • the length of the functional fragment can vary in a range from at least 10 to several hundred nucleotides. The same applies to a.
  • Functional fragment of an encoded protein which can vary in length in a range from at least 10 to 250 amino acids.
  • homologues are complementary or complete with the cDNA sequences selected from a population according to FIG. A and / or B or derived therefrom.
  • Hybridizing sequences comprise similar sequences selected from the group of DNA or RNA which specifically interact with the cDNA sequences according to the invention under stringent conditions.
  • a preferred but non-limiting example of stringent hybridization conditions is hybridization in 6x sodium chloride / sodium citrate buffer (SSC) at 45 ° C. followed by one or more washing steps in 0.2x SSC, 0.1% SDS at 65 ° C.
  • SSC sodium chloride / sodium citrate buffer
  • Alleles are sequences which, despite a different nucleotide sequence, still have the desired functions, ie are functionally equivalent.
  • Functional equivalents thus include naturally occurring variants of the sequences described herein as well as artificial, e.g. nucleotide sequences obtained by chemical synthesis and adapted to the codon use of the organism.
  • a functional equivalent is also understood to mean, in particular, natural or artificial mutations in the originally isolated gene sequences or the corresponding complete gene sequences or their homologs, which code for polypeptides involved in tumor metastasis, which continue to show the desired function. Mutations include substitutions, additions, deletions, exchanges or insertions of one or more nucleotide residues. Mutations can cause functional changes in the regulatory regions of a gene as well as a protein that has changed its activity.
  • the present invention also encompasses those nucleotide sequences which are obtained by modification of the cDNA sequences according to the invention or their complete gene sequences, functional fragments thereof or their homologs.
  • the aim of such a modification can, for example, be to further narrow down the coding sequence or, for example, also to insert further restriction enzyme interfaces.
  • Functional equivalents are also those variants in which the regulatory regions are changed, as a result of which, for example, the gene expression is weakened or enhanced compared to the parent gene or parent gene fragment.
  • the nucleotide sequences coding for metastasis-specific polypeptides or their isoforms can be natural, chemically synthesized, modified or artificially generated nucleotide sequences.
  • the aforementioned nucleotide sequences can consist of heterologous nucleotide sequences and mixtures of the previously described nucleotide sequences.
  • functionally equivalent sequences include those which have an altered nucleotide sequence which gives the gene product encoded by them an altered activity which can be weakened or enhanced.
  • artificial nucleotide sequences are the subject of the invention as long as they impart the desired properties, as described above.
  • Such artificial nucleotide sequences can be obtained, for example, by "back-translating" proteins constructed using molecular modeling or by in vitro selection. Coding nucleotide sequences which are obtained by back-translating a polypeptide sequence according to the codon usage specific to humans are particularly suitable. The specific Codon usage can easily be determined by a person skilled in genetic engineering methods by computer evaluations of other known genes.
  • the cDNA sequences mentioned above are isolated according to the invention from defined rat adenocarcinoma systems.
  • this is the 13762NF rat tumor system (breast carcinoma; Neri et al., JNCI, 1982, vol. 68 (3), 507-517).
  • the cell line MTPa was selected as the non-metastatic cell line.
  • the metastatic cell line is represented by the cell line MTLY.
  • Another preferred system according to the invention is the rat pancreas carcinoma system Bsp73 with the cell lines 1AS or 10AS and ASML (Matzku et al., Invasion Metastasis, 1983, (3): 109-123).
  • the cell lines G-Subline or AT-1, AT-3, MatLu and MatLyLu are mentioned as non-metastatic or metastatic cell lines (Isaacs et al., Prostate, 1986, ( 9): 261-281).
  • this selection is not limiting for the present invention, but also includes the use of other suitable cell lines or carcinoma systems.
  • rat cell lines show an analogous metastatic behavior to human cancer cells in vivo (Neri et al., Int. J. Cancer, 1981, 28: 731-738; Matzku et al., Invasion Metastasis, 1983, 3: 109-123).
  • the cell lines are easier to handle than human tumor tissue.
  • the use of defined rat cell lines also offers the advantage of a high reproducibility of the results compared to human tumor tissue. In particular, in this system there is the possibility of genetically modifying the cell lines and checking the acquired or lost properties in test systems.
  • marker genes involved in the metastasis of tumor cells are identified by the steps a) Creation of a PCR-based subtractive cDNA library based on total mRNA populations from metastatic and non-metastatic tumor cells, b ) Identification of a population of different cDNA clones, each cDNA sequence representing an individual (potentially) metastasis-specific gene, c) generation of the complete gene sequence based on these cDNA clones, d) cloning of the cDNA and / or complete gene sequence both in "Sense” - as well as in "antisense” reading direction in an expression vector e) transfer and subsequent expression of this (er) vector (s) in non-human mammalian cell lines, preferably rat cell lines, f) validation of the involvement of the genes identified in step b) on the metastasis of tumor cells by identifying in vasive tumors.
  • the method according to the invention for identifying metastatic tumor cells is characterized in that at least one cDNA sequence selected from a population according to FIG. B is based on the metastasis of pancreatic tumor tissue and selected from one A population involved in the metastasis of breast tumor tissue.
  • An essential feature of the present invention is the provision of an extraordinarily large population of different cDNA clones, representative of a correspondingly large number of different, i.e. individual metastasis-specific genes, so that molecular typing of the various clinical manifestations of cancer can be carried out with high reliability.
  • a statement about the follow-up, i.e. H. the cancer cell stage of the various manifestations and in particular the metastasis potential of the tumor tissue to be examined are met.
  • the present invention thus provides a large number of potential marker sequences, marker genes and / or corresponding proteins for the identification and / or treatment of invasive tumor cells and / or tissues or cells and / or tissues with a high metastatic potential.
  • the method according to the invention is characterized in that the cDNA sequences according to FIG. C are preferably suitable as markers for identifying metastatic human breast and / or colon tumor tissue.
  • the cDNA sequences according to FIG. C are preferably suitable as markers for identifying metastatic human breast and / or colon tumor tissue.
  • CD 24 is a differentiation-specific protein that occurs during the maturation of B and T lymphocytes (Fischer GF et al., 1990, J. Immunol., 144: 638-641). With the help of CD 24 mRNA is the detection of metastatic human colon tissue possible.
  • the main task of the ribosomal protein S7 is the correct folding of the 16S RNA (Wimberley, BT et al., 1997, Structure, 5: 1187-1198). So far, S7 has not been involved in tumor progression. With the S7 mRNA, the present invention thus provides a new tumor marker for metastatic breast cell tissue. Metastases from lymph node tissue, which result from invasive breast cell carcinoma, are indicated by an increased expression of both tumor markers.
  • FIG. D A comparison of the gene expression of genes and tumor-associated molecules in cell lines with different metastatic potential is shown in FIG. D. Results of the in situ hybridizations are shown in Fig. E.
  • the findings of the present invention are also suitable for better diagnosis of cancer diseases, in particular the typing of the cancer cell stage and subsequent more efficient therapeutic options.
  • cancer diseases in particular the typing of the cancer cell stage and subsequent more efficient therapeutic options.
  • complementary (“antisense”) mRNA sequences in particular, short oligonucleotides are derived and the introduction of these “antisense” mRNA sequences into tumor cells reduces or suppresses the expression of metastasis-specific genes post-transcriptionally.
  • tumor metastasis is reduced or prevented.
  • the present invention also relates to a method for identifying compounds for tumor treatment, wherein a metastasis-specific gene sequence derived from at least one of the cDNA sequences selected from a population according to FIG. A and / or B in non-human mammalian cells, for example
  • Rat cell lines are expressed, chemically, biologically and / or pharmaceutically active compounds, such as. B. proteins, peptides or low molecular weight compounds are incubated with the aforementioned cells and then those compounds are selected that have a modulating effect on the expression of the
  • a modulating effect is to be understood as an amplification or weakening. In addition to regulatory interactions on the cell surface, this also includes interactive inhibition within the cells.
  • the introduction and expression of the metastase-specific gene sequences according to the invention in the non-human Mammalian cells can be carried out, for example, with the aid of a suitable recombinant vector, comprising at least one gene sequence according to the invention derived from a cDNA sequence selected from a population according to FIGS. A and / or B complete gene sequences or functional fragments thereof, for example coding sequences, furthermore regulatory nucleotide sequences, in particular from the group of promoters, terminators, target sequences, retention signals and translation enhancers,
  • Splice elements poly-adenylation signals or resistance-mediating nucleotide sequences as well as nucleotide sequences for replication in the corresponding target cell or for integration into its genome.
  • the present invention furthermore relates to a measuring system for identifying compounds for tumor treatment comprising at least one gene associated with tumor metastasis based on a cDNA sequence according to FIG. A and / or B or alleles or homologs thereof and at least one chemically, biologically and / or pharmaceutically active compound.
  • the measuring system according to the invention offers the possibility of carrying out extensive regulatory and binding studies with the primary aim of determining whether and, if appropriate, in which areas the compound has an effect on gene expression, i.e. this weakens or strengthens.
  • the measuring system used according to the invention can be, for example, non-human mammalian cells, preferably a defined rat cell line.
  • a further variant of the present invention relates to a measuring system containing at least one protein associated with tumor metastasis or isoforms thereof encoded by a gene sequence or its homologues starting from a cDNA sequence according to FIG. A and / or B and at least one chemically, biologically and / or pharmaceutical active connection.
  • the measuring system according to the invention offers the possibility of carrying out extensive regulation and binding studies, with the primary aim of determining whether and, if appropriate, in which areas the compound binds to a protein associated with tumor metastasis and changes its activity, ie weakens or amplifies it.
  • the compounds themselves are the subject of the present invention and / or their use for the preparation of agents for the treatment of tumor diseases containing compounds identified by a previously described method or with the aid of a previously described measuring system.
  • the present invention relates to cDNA sequences selected from a population according to FIG. A and / or B or complete gene sequences derived therefrom, their homologues or functionally equivalent
  • the present invention also relates to the gene products (polypeptides) which, using the cDNA according to the invention,
  • Sequences can be produced or derived therefrom.
  • genetically modified non-human mammalian cells containing at least one cDNA sequence according to the invention selected from a population according to FIGS. A and / or B or complete gene sequences derived therefrom, functional fragments, their homologs or alleles or a recombinant vector of the type described above or gene products of the aforementioned kind the subject of the present invention.
  • the present invention further comprises antibodies which bind specifically to the gene products according to the invention mentioned, it being possible for these antibodies to be produced using the cDNA sequences and / or gene products according to the invention.
  • a probe for specific hybridization with tumor tissue is used according to the invention, this starting from a cDNA sequence selected from a population according to FIG. A and / or B or derived from complete gene sequences, the homologues or functionally equivalent sequences of which is produced Detection contains suitable, preferably non-radioactive labeling and / or 30 nucleotides, preferably 15-20, particularly preferably 10 nucleotides in length.
  • the present invention furthermore relates to a test kit, comprising at least one cDNA sequence selected from a population according to FIGS. A and / or B or complete gene sequences derived therefrom, functional gene fragments thereof or their homologs or alleles, instructions for producing a previously described probe and instructions for hybridization and detection of nucleotide sequences from tumor tissue.
  • a test kit comprising at least one cDNA sequence selected from a population according to FIGS. A and / or B or complete gene sequences derived therefrom, functional gene fragments thereof or their homologs or alleles, instructions for producing a previously described probe and instructions for hybridization and detection of nucleotide sequences from tumor tissue.
  • the use of a mixture of several relevant cDNA sequences is preferred.
  • the present invention further relates to the use of compounds identified by a method according to the invention and / or by a measuring system according to the invention for the production of agents which can be used for tumor treatment.
  • the present invention also includes the use of the antibodies according to the invention for the production of agents which can be used for tumor treatment.
  • the cDNA sequences, gene products, antibodies and / or are also suitable Parts thereof and / or the compounds according to the invention which are involved in the formation of tumor metastases for use in areas of tumor metastasis diagnosis and / or therapy. In the field of tumor diagnostics, for example, this also includes the identification of other metastasis tumor markers of human origin.
  • the ligation of the PCR products of the 2nd PCR round of the SSH was carried out in a TA vector (pCRII.1, Invitrogen).
  • the cloning of an insert in the pCR.11.1 vector interrupts the coding sequence of the ⁇ -galactosidase gene, so that recombinant clones (white) can be distinguished from empty vectors (blue).
  • the Taq polymerase used has proofreading activity, it is necessary to PCR products after a previous phenol / chloroform extraction, in a further step for 15 min at 72 ° C with dATP and another Taq DNA polymerase (Eurobio -Taq polymerase) and again perform a phenol / chloroform extraction.
  • the ligation was carried out with the T4 DNA ligase (Invitrogen) added to the vector in a ratio of 1: 1 (each 25 ng vector and subtracted bank).
  • the bank ligated into the pCRI 1.1 vector was transformed into electrocompetent bacteria (ELEKTROMAX, strain DH10B, Invitrogen) and plated onto 15 cm large bacterial dishes.
  • electrocompetent bacteria ELEKTROMAX, strain DH10B, Invitrogen
  • the dishes contained the selection antibiotic ampicillin (100, ⁇ g / ml), as well as 100 ⁇ M IPTG and X-Gal (50 ⁇ g / ml) for blue / white sorting.
  • the bacterial dishes were incubated at 37 ° C until small Colonies were visible. To better distinguish between white and blue colonies, the plates were then incubated at 4 ° C.
  • a total of 1985 clones were picked under blue-white selection, transferred into sterile 96-v / e // microtiter plates containing LB medium and ampicillin (100 ⁇ g / ⁇ l). The bacteria in these plates were grown for 14 hours with gentle shaking at RT. To perform the colony PCR, 10 ⁇ l of each bacterial culture was removed using a multichannel pipette and transferred to a 96-well PCR plate, where it was mixed with 90 ⁇ l sterile water. For denaturation, the plate was incubated for 5 min at 95 ° C. in the PCR machine (Perkin-Elmer 9600 thermal cycler).
  • each lysate was transferred with a multichannel pipette into a second 96-well PCR plate into which 90 ⁇ l of the PCR mixture had been placed in each case.
  • the cDNA fragments were amplified using nested primers 1 and 2 of the subtraction.
  • the check which clones actually contain differentially expressed cDNA fragments, was carried out using a reverse Northem Blot analysis.
  • the amplified cDNA fragments colony PCR
  • 2 high cfens / ' y agarose gels Centipede TM gel electrophoresis chambers, Owl Scientific, Woburn, USA.
  • 2 x 96 samples (2 microtiter plates) were applied per gel. It is extremely important that both gels are loaded in exactly the same way.
  • a GAPDH control was placed in the last place for later quantification of the signal strength.
  • FIGS. A and B The result of the obtained and differentially expressed cDNA fragments is summarized in FIGS. A and B, with FIG. A representing cDNA fragments from a breast cancer-specific library (MLSSH) and FIG. B cDNA fragments from a pancreas-specific Library (PLSSH). figure description
  • C cDNA sequences from CD 24 and S7 as tumor markers for invasive human breast and / or colon tumor tissue.
  • the image consists of Northem blots from four different rat tumor systems and two human breast cancer cell lines. In addition to the pair MN081 / MT450, all tumor systems used consist of clonal cell lines that originate from a primary tumor and differ only in their metastatic capacity. This metastatic potential is indicated. Each lane of the Northern blots was loaded with 2ug poly-A + RNA. The blots were hybridized with various different experiments cDNAs isolated in the MLSSH and PLSSH subtraction banks (screens). The hybridization samples used were selected randomly from the metastasis-specific genes isolated in the MLSSH and PLSSH screens.
  • a rough classification is intended to correlate the expression of the genes with the Describe the metastatic potential of the investigated cell lines.
  • Genes whose expression is upregulated in all metastatic cell lines and which is not present or significantly reduced in all non-metastatic cells were designated +++.
  • Genes that are clearly differentially expressed but not exclusively in metastatic cells were labeled ++ or +, depending on the strength of the correlation of the expression with the metastatic potential.
  • the expression of some clones showed a strong association with the metastatic potential in only one tumor progression model.
  • ab (a, "sense”control; b, "antisense” radioactively labeled CD24 sample): CD24 expression in a moderately differentiated adenocarcinoma of the intestine, classified as pT3C; p21; pNO; pM1.
  • the section shows significant CD24 overexpression in intra-ductal carcinoma cells (localization in the cytoplasm), while the non-neoplastic mucosa is only weakly positive (constant basal expression), cd (c, "sense”control; d, "antisense” radioactively labeled CD24 sample): CD24 expression in a moderately invasive ductal, moderately differentiated breast carcinoma, classified as pT2; pNIbii.
  • a positive signal was detectable in the carcinoma, but not in the surrounding stroma, ef (e, "sense”control; f, "antisense” radioactively labeled S7 sample): S7 expression in a moderately differentiated adenocarcinoma of the intestine, classified as pT3C; p21; pNO; pM1.
  • the cut shows significant S7 Overexpression (predominant localization in the nucleus) in the carcinoma, but very poor expression in the non-neoplastic mucosa.
  • hg (h, "sense”control; g, "antisense” fluorescence-labeled S7 sample): Expression of S7 in a poorly differentiated invasive ductal breast carcinoma, classified as PT-1C; G3, N-1B1 or I, RO, L-1. A strong nuclear signal was detectable in intraductal carcinoma, but almost no signal was seen in the stroma.

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Identifizierung und Behandlung von metastasierenden Tumorzellen, eine Population von cDNA-Sequenzen metastasespezifischer Gene zur Verwendung als Tumormarker zur Identifizierung von humanen Zellen und/oder Gewebe mit Metastasierungspotential und zur Therapie von Krebserkrankungen.

Description

Verfahren zur Identifizierung metastasierender Tumorzellen
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Identifizierung von metastasierenden Tumorzellen sowie die Identifizierung von Verbindungen zur Behandlung von Tumoren.
Das Zellwachstum oder auch die Organogenese werden in höheren Organismen auf komplexe Weise durch differentielle Genexpression reguliert. Insbesondere die Aufklärung der molekularen Mechanismen, die an der Entstehung von Tumorzellen beteiligt sind, ist aufgrund der großen medizinischen Relevanz Gegenstand intensiver Untersuchungen.
Allerdings sind die Vorgänge, die an der Entstehung eines invasiven Tumors aus primärem Tumorgewebe (Metastasenbildung) beteiligt sind weniger gut untersucht. Bekannt ist, daß einige Grundvoraussetzungen geschaffen werden müssen, damit Tumoren invasieren können. Hierbei handelt es sich um Veränderungen der Mikroumgebung der Zellen, d.h. Proteolyse der Zellen sowie Veränderungen der Adhäsionseigenschaften und Migration. Bislang konnte lediglich eine geringe Anzahl an Genen, die während der Tumorprogression differentieil exprimiert wird, identifiziert werden. Beispielhaft seien einige Proteasegene, wie z. B. uPa oder Matrix-Metalloproteinasen (MMP) genannt (Matrisian L. M. et al., 1990, Curr. Top. Dev. Biol., 24: 219-259 und Matrisian, L. M., Bioessays, 1992, 14: 455-463). Hinsichtlich der adhäsiven Eigenschaften sind verschiedene Integrine (Riuz P. et al., 1993, Cell. Adhes. Commun., 1 : 67-81) oder der sogenannte lymphocyie homlng-Rezeptor CD44 bekannt (Ponta et al., Frontiers in Bioscience ,1998, 3: 650-656).
Die überwiegende Anzahl und Identität der Gene, die in dem metastatischen Prozeß involviert sind, ist jedoch noch weitgehend unbekannt. Für ein besseres Verständnis der an der Tumorprogression beteiligten Vorgänge ist es allerdings erforderlich eine möglichst große Anzahl an metastasespezifischen Genen eindeutig zu identifizieren.
Außerdem steht bislang kein geeignetes System zur Verfügung, welches mit vertretbarem Aufwand und ausreichender Zuverlässigkeit eine Aussage über den Krebszell-Status und die Wahrscheinlichkeit einer Tumormetastasierung erlaubt.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Identifizierung von metastasierenden TumorzelJen, wobei als Marker wenigstens eine cDNA-Sequenz ausgewählt aus einer Population gemäß den Figuren A und/oder B oder entsprechend davon abgeleitete vollständige Gensequenzen oder funktionelle Fragmente davon, deren Homologe oder Allele zur Hybridisierung mit Tumorgewebe eingesetzt werden.
Die vorliegende Erfindung schließt auch die Genprodukte (Polypeptide) abgeleitet von den cDNA-Sequenzen ausgewählt aus einer Population gemäß den Figuren A und/oder B oder den entsprechend vollständigen Gensequen∑en oder funktionelle Fragmente davon, deren Homologe oder Allele ein. Erfindungsgemäß zählen hierzu auch die Isoformen dieser Polypeptide, die zwar eine veränderte Aminosäuresequenz aufweisen, in ihrer Funktion jedoch gleichwirkend sind.
Gegenstand der Erfindung sind ferner auch Antikörper mit einer spezifischen Bindung an die zuvor genannten Genprodukte, hergestellt unter Verwendung der oben genannten cDNA-Sequenzen und/oder deren Genprodukte. Erfindungsgemäß umfassen die vollständigen Gensequenzen neben den kodierenden Nukleotidsequenzen auch die zugehörigen regulativen Regionen vor und hinter den kodierenden Bereichen. Unter den regulativen Regionen sind funktionelle Strukturen, wie beispielsweise Promotoren, Terminatoren, Ziel- oder target-Sequenzen, Retentionssignale, Translationsverstärker, Spleißelemente oder Polyadenylierungssignale zu verstehen.
Ein funktionelles Fragment ist erfindungsgemäß eine Nukleotidsequenz, die für ein entsprechendes Polypeptid kodiert, welches seinerseits eine spezifische Aktivität des korrespondierenden Gesamtlängen-Proteins aufweist. Ferner ist unter einem funktioneilen Fragment erfindungsgemäß eine Nukleotidsequenz zu verstehen, die unter stringenten Bedingungen zu einem spezifischen Hybridisierungssignal führt. Hierbei ist kann die Länge des funktioneilen Fragments in einem Bereich von wenigstens 10 bis zu mehreren hundert Nukleotiden variieren. Gleiches gilt für ein. funktionelles Fragment eines kodierten Proteins, das in seiner Länge in einem Bereich von wenigstens 10 bis 250 Aminosäuren variieren kann.
Unter Homologen sind erfindungsgemäß komplementäre oder mit den cDNA-Sequenzen ausgewählt aus einer Population gemäß Fig. A und/oder B oder davon abgeleiteten vollständigen . Gensequenzen oder funktioneilen Genfragmenten hybridisierende Nukleotidsequenzen zu verstehen. Hybridisierende Sequenzen umfassen ähnliche Sequenzen ausgewählt aus der Gruppe von DNA oder RNA, die unter stringenten Bedingungen spezifisch mit den erfindungsgemäßen cDNA-Sequenzen interagieren. Ein bevorzugtes aber nicht limitierendes Beispiel für stringente Hybridisierungsbedingungen ist die Hybridisierung in 6x Sodium-Chloride/Sodium-Citrate-Puffer (SSC) bei 45 °C gefolgt von ein oder mehreren Waschschritten in 0,2x SSC, 0,1% SDS bei 65 °C. Allele sind solche Sequenzen, welche trotz abweichender Nukleotidsequenz noch die gewünschten Funktionen besitzen, also funktionell äquivalent sind.
Funktioneile Äquivalente umfassen somit natürlich vorkommende Varianten der hierin beschriebenen Sequenzen sowie künstliche, z.B. durch chemische Synthese erhaltene, an den Kodon-Gebrauch des Organismus angepaßte, Nukleotidsequenzen.
Unter einem funktioneilen Äquivalent (Allel) versteht man insbesondere auch natürliche oder künstliche Mutationen der ursprünglich isolierten Gensequen∑en oder der korrespondierenden vollständigen Gensequenzen oder deren Homologe, die für an der Tumormetastasierung beteiligte Polypepetide kodieren, welche weiterhin die gewünschte Funktion zeigen. Mutationen umfassen Substitutionen, Additionen, Deletionen, Vertauschungen oder Insertionen eines oder mehrerer Nukleotidreste. Mutationen können sowohl funktionale Veränderungen der regulatorischen Regionen eines Gens als auch ein in seiner Aktivität verändertes Protein bedingen.
Somit werden beispielsweise auch solche Nukleotidsequenzen durch die vorliegende Erfindung mit umfaßt, welche man durch Modifikation der erfindungsgemäßen cDNA-Sequenzen oder deren vollständige Gensequenzen, funktionelle Fragmente davon oder deren Homologe erhält. Ziel einer solchen Modifikation kann z.B. die weitere Eingrenzung der kodierenden Sequenz oder z.B. auch die Einfügung weiterer Restriktionsenzym-Schnittstellen sein. Funktioneile Äquivalente sind auch solche Varianten, bei denen die regulatorischen Regionen verändert sind, wodurch beispielsweise die Genexpression verglichen mit dem Ausgangsgen bzw. Ausgangsgenfragment, abgeschwächt oder verstärkt ist. Erfindungsgemäß kann es sich bei den für metastasespezifische Polypeptide oder deren Isoformen kodierende Nukleotidsequenzen um natürliche, chemisch synthetisierte, modifizierte oder artifiziell erzeugte Nukleotidsequenzen handeln. Ferner können die zuvor genannten Nukleotidsequenzen aus heterologen Nukleotidsequenzen sowie aus Mischungen der zuvor beschriebenen Nukleotidsequenzen bestehen.
Darüber hinaus umfassen funktioneil äquivalente Sequenzen solche, die eine veränderte Nukleotidsequenz aufweisen, welche dem durch sie kodierten Genprodukt eine veränderte Aktivität verleiht, die abgeschwächt oder verstärkt sein kann.
Außerdem sind artifizielle Nukleotidsequenzen Gegenstand der Erfindung, solange sie, wie oben beschrieben, die gewünschten Eigenschaften vermitteln. Solche artifiziellen Nukleotidsequenzen können beispielsweise durch „Rückübersetzung" von mittels Molecular Modelling konstruierter Proteine oder durch in-vitro-Selektion erhalten werden. Besonders geeignet sind kodierende Nukleotidsequenzen, die durch Rückübersetzung einer Polypeptidsequenz gemäß der für den Menschen spezifischen Kodon-Nutzung erhalten werden. Die spezifische Kodon- Nutzung kann ein mit gentechnischen Methoden vertrauter Fachmann durch Computerauswertungen anderer, bekannter Gene leicht ermitteln.
Die Isolierung der zuvor genannten cDNA-Sequenzen erfolgt erfindungsgemäß aus definierten Adenokarzinom-Systemen der Ratte. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich dabei um das Rattentumorsystem 13762NF (Mamma-Karzinom; Neri et al., JNCI, 1982, Vol. 68 (3), 507-517). Als nicht metastasierende Zellinie wurde die Zellinie MTPa ausgewählt. Die metastasierende Zellinie wird erfindungsgemäß durch die Zellinie MTLY repräsentiert. Ein weiteres erfindungsgemäß bevorzugtes System stellt das Ratten-Pankreas- Karzinom-System Bsp73 mit den Zellinien 1AS bzw. 10AS und ASML dar (Matzku et al., Invasion Metastasis, 1983, (3): 109-123). Als ein Beispiel für ein Ratten-Prostata-Karzinom-System sind die Zellinien G-Subline bzw. AT-1 , AT-3, MatLu und MatLyLu als nicht metastasierende bzw. metastasierende Zellinien genannt (Isaacs et al., Prostate, 1986, (9): 261- 281). Diese Auswahl ist jedoch nicht limitierend für die vorliegende Erfindung, sondern schließt auch die Verwendung anderer geeigneter Zellinien bzw. Karzinomsysteme ein.
Ein entscheidender Vorteil der Verwendung von Ratten-Zellinien ist, daß die metastatischen Zellen in vivo ein analoges Metastasierungsverhalten zu menschlichen Krebszellen zeigen (Neri et al., Int. J. Cancer, 1981, 28: 731-738; Matzku et al., Invasion Metastasis, 1983, 3: 109-123). Darüber hinaus lassen sich die Zellinien einfacher handhaben als menschliches Tumorgewebe. Der Einsatz definierter Rattenzellinien bietet gegenüber humanem Tumorgewebe ferner den Vorteil einer hohen Reproduzierbarkeit der Ergebnisse. Insbesondere besteht in diesem System die Möglichkeit der genetischen Veränderung der Zellinien und Überprüfung der erworbenen bzw. verlorenen Eigenschaften in Testsystemen. Ferner ist eine einfache Übertragung auf syngene Tiere möglich, wohingegen menschliches Tumorgewebe aufgrund störender Immunantworten in ein aufwendiges künstliches System eines immunodefizienten Empfängers übertragen werden müßte. Darüber hinaus wurden auch einige Hybridisierungen mit menschlichen Mamma- Karzinom-Zellinien durchgeführt. Beispielsweise wurden die verwendeten Zellinien MDA-MB231 und MDA-MB-468 (Cailleau et al., J. Natl. Cancer Inst, 1974, 661-674 und Cailleau et al., In Vitro, 1978 (14): 911-915) u.a. eingesetzt, um z. B. durch Kreuzhybridisierungen zu zeigen, daß die eingesetzte „Ratten-Probe" für eine Analyse menschlichen Tumormaterials geeignet ist. Die Identifizierung der erfindungsgemäß großen Anzahl an differentieil exprimierten Transkripten metastasespezifischer Gene erfolgt nach an sich bekannten Methoden. Hier sind die Differenzanalyse SSH (Subtractive Suppression Hybridization; Diatchenko et al., Proc. Natl. Acad. Sei., 1996, 93: 6025-6030) zu nennen, die insbesondere zur Identifizierung seltener Transkripte besonders geeignet ist sowie ein sich daran anschließendes effektives Nachselektionsverfahren mit hohem Probendurchsatz und hoher Zuverlässigkeit, das die Auswahl falsch positiver oder falsch negativer Klone nahezu ausschließt (von Stein et al., Nucleic Acids Research, 1997, 25 (13): 2598-2602). Als weitere Methoden der Wahl zur erfindungsgemäßen Bestimmung einer Metastasenspezifischen Expression ausgewählter cDNA-Klone zur Identifizierung metastasierender Tumorzellen sind Northem-Blot- und RT-PCR-Analysen zu nennen, die sich jedoch nicht limitierend auf die vorliegende Erfindung auswirken.
Eine besondere Ausführungsvariante des erfindungsgemäßen Verfahrens umfaßt dabei folgende Schritte:
A) Erstellung einer PCR-basierten subtraktiven cDNA-Genbank ausgehend von Gesamt-mRNA-Populationen aus metastasierenden und nicht-metastasierenden Tumorzellen,
B) Identifizierung einer Population unterschiedlicher cDNA-Klone, wobei jede cDNA-Sequenz ein individuelles . (potentiell) metastasespezifisches Gen repräsentiert,
C) Erstellung der vollständigen Gensequenz auf der Basis dieser cDNA- Klone,
D) Erstellung einer „sense"- und „antisense"- RNA-Probe ausgehend von wenigstens einer Sequenz ausgewählt aus dieser cDNA-Population oder den entsprechend davon abgeleiteten vollständigen Gensequenzei , insbesondere aus einer Population gemäß den Figuren A und/oder B, E) Herstellung geeigneter Dünnschicht-Präparate von dem zu untersuchenden Tumormaterial,
F) in-situ-Hybridisierung des zu untersuchenden Tumormaterials mit den zuvor genannten „sense"- und „antisense"-RNA-Sonden und
G) Identifizierung metastasierender Tumorzellen durch Detektion positiver Hybridisierungsprodukte.
In einer weiteren Ausführungsvariante der vorliegenden Erfindung erfolgt die Identifizierung von an der Metastasierung von Tumorzellen beteiligten Marker-Gene durch die Schritte a) Erstellung einer PCR-basierten subtraktiven cDNA-Genbank ausgehend von Gesamt-mRNA-Populationen aus metastasierenden und nicht-metastasierenden Tumorzellen, b) Identifizierung einer Population unterschiedlicher cDNA-Klone, wobei jede cDNA-Sequenz ein individuelles (potentiell) metastasespezifisches Gen repräsentiert, c) Erstellung der vollständigen Gensequenz auf der Basis dieser cDNA- Klone, d) Klonierung der cDNA- und/oder vollständigen Gensequenz sowohl in „sense"- als auch in „antisense"-Leserichtung in einen Expressionsvektor e) Übertragung und anschließende Expression dieses(er) Vektors(en) in nicht-menschliche Säugerzellinien, vorzugsweise Rattenzellinien, f) Validierung der Beteiligung der in Schritt b) identifizierten Gene an der Metastasierung von Tumorzellen durch Identifizierung von invasiven Tumoren.
Ferner zeichnet sich das erfindungsgemäße Verfahren zur Identifizierung von metastasierenden Tumorzellen dadurch aus, daß wenigstens eine cDNA-Sequenz ausgewählt aus einer Population gemäß Fig. B an der Metastasierung von Pankreastumorgewebe und ausgewählt aus einer Population gemäß Fig. A an der Metastasierung von Brusttumorgewebe beteiligt sind.
Ein wesentliches Merkmai der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung einer außerordentlich großen Population unterschiedlicher cDNA-Klone, repräsentativ für eine entsprechend große Anzahl unterschiedlicher, d.h. individueller metastasespezifischer Gene, so daß mit hoher Zuverlässigkeit eine molekulare Typisierung der verschiedenen klinischen Erscheinungsformen einer Krebserkrankung vorgenommen werden kann. Ebenso kann eine Aussage über die Verlaufskontrolle, d. h. das Krebszellstadium der verschiedenen Erscheinungsformen und insbesondere über das Metastasierungspotential des zu untersuchenden Tumorgewebes getroffen werden.
Die vorliegende Erfindung stellt somit eine Vielzahl von potentiellen Markersequenzen, Markergenen und/oder korrespondierenden Proteinen zur Identifizierung und/oder Behandlung von invasiven Tumorzellen, und/oder -geweben bzw. Zellen und/oder Geweben mit einem hohen Metastasierungspotential zur Verfügung.
In einer weiteren Ausführungsvariante der vorliegenden Erfindung zeichnet sich das erfindungsgemäße Verfahren dadurch aus, daß bevorzugt die cDNA-Sequenzen gemäß Fig. C als Marker zur Identifizierung von metastasierendem humanem Brust und/oder Dickdarmtumorgewebe geeignet sind. Beispielhaft sei hierbei insbesondere auf die Sequenzen verwiesen, die in Fig. C mit CD 24 und S7 bezeichnet sind und die besten Kreuzhybridisierungsergebnisse mit humanem Tumorgewebe zeigten. Bei CD 24 handelt es sich um ein differenzierungsspezifisches Protein, das während der Reifung von B- und T-Lymphozyten auftritt (Fischer G. F. et al., 1990, J. Immunol., 144: 638- 641 ). Mit Hilfe der CD 24 mRNA ist die Detektion von metastasierendem humanen Dickdarmgewebe möglich. Die Hauptaufgabe des ribosomalen Proteins S7 ist die korrekte Faltung der 16S-RNA (Wimberley, B. T. et al., 1997, Structure, 5: 1187-1198). Eine Beteiligung von S7 an der Tumorprogression ist bisher nicht bekannt. Die vorliegende Erfindung stellt mit der S7 mRNA somit einen neuen Tumormarker für metastasierendes Brustzellgewebe zur Verfügung. Metastasen aus Lymphknotengewebe, welches von einem invasiven Brustzellkarzinom ausgehen, werden durch eine erhöhte Expression beider Tumormarker angezeigt.
Ein Vergleich der Genexpression von Genen und Tumor-assoziierten Molekülen in Zellinien mit unterschiedlichem metastatischen Potential ist in Fig. D dargestellt. Ergebnisse der in-situ-Hybridisierungen sind in Fig. E gezeigt.
Die erfindungsgemäß eindeutige Identifizierung von an der Metastasierung von Tumorgewebe beteiligten cDNA-Klonen ermöglicht auf einfache Weise sowohl eine umfassende Klonierung der vollständigen Gene ais auch eine funktionelle Analyse der im Menschen an der Ausprägung eines metastatischen Phänotyps beteiligten Gene. Dies eröffnet gleichzeitig die Möglichkeit, eine Vielzahl an metastasespezifischen, regulatorischen Sequenzen zu untersuchen. Die gewonnenen Erkenntnisse werden besonders bei der weiteren Aufklärung molekularer Regulationsmechanismen zur Tumormetastasierung sehr hilfreich sein.
Die Erkenntnisse der vorliegende Erfindung sind ferner zur besseren Diagnose von Krebserkrankungen, insbesondere der Typisierung des Krebszellstadiums und sich daran anschließende effizienterer Therapiemöglichkeiten geeignet Zur Behandlung von Tumorerkrankungen ist es denkbar, daß ausgehend von den zuvor genannten cDNA- Sequenzen komplementäre („antisense") mRNA-Sequenzen, insbesondere kürze Oligonukleotide abgeleitet werden und durch Einbringung dieser „antisense'-mRNASequenzen in Tumorzellen die Expression metastasespezifischer Gene posttranskriptional verringert oder unterbunden wird. Ferner ist eine Behandlung von Tumorerkrankungen denkbar, bei der auf posttranslationaler Ebene durch die spezifische Bindung von Stoffen oder Liganden an metastasespezifische Polypeptide letztere in ihrer Funktion behindert oder blockiert werden und somit die Tumormetastasierung verringert oder unterbunden wird.
Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem ein Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen zur Tumorbehandlung, wobei eine metastasespezifische Gensequenz abgeleitet von wenigstens einer der cDNA-Sequenzen ausgewählt aus einer Population gemäß Fig. A und/oder B in nicht-menschlichen Säugetierzellen, beispielsweise
Rattenzellinien exprimiert werden, chemisch, biologisch und/ oder pharmazeutisch aktive Verbindungen, wie z. B. Proteine, Peptide oder niedermolekulare Verbindungen mit den zuvor genannten Zellen inkubiert werden und anschließend diejenigen Verbindungen ausgewählt werden, die eine modulierende Auswirkung auf die Expression der mit der
Tumormetastasierung assoziierten Gene oder auf die Aktivität der durch sie kodierten Proteine zeigen. Ausgehend von diesen Verbindungen ist die
Herstellung von Mitteln denkbar, die zur Tumorbehandlung eingesetzt werden können.
Unter modulierender Wirkung ist erfindungsgemäß eine Verstärkung oder Abschwächung zu verstehen. Hierbei ist erfindungsgemäß neben regulativen Wechselwirkungen an der Zelloberfläche auch eine interaktive Hemmung innerhalb der Zellen umfaßt.
Die Einschleusung und Expression der erfindungsgemäß metastasespezifischen Gensequenzen in den nicht-menschlichen Säugetierzellen kann beispielsweise unter Zuhilfenahme eines geeigneten rekombinanten Vektors erfolgen-, enthaltend wenigstens eine erfindungsgemäße Gensequenz abgeleitet von einer cDNA-Sequenz ausgewählt aus einer Population gemäß Fig. A und/oder B vollständige Gensequenzen oder funktioneilen Fragmente davon, beispielsweise kodierende Sequenzen, ferner regulatorische Nukleotidsequenzen, insbesondere aus der Gruppe der Promotoren, Terminatoren, Ziel-(target)- Sequenzen, Retentionssignale und Translationsverstärker,
Spleißelemente, Poly-Adenylierungssignale oder Resistenz-vermittelnde Nukleotidsequenzen sowie Nukleotidsequenzen für die Replikation in der entsprechenden Zielzelle oder die Integration in deren Genom.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ferner ein Meßsystem zur Identifizierung von Verbindungen zur Tumorbehandlung enthaltend wenigstens ein mit der Tumormetastasierung assoziiertes Gen ausgehend von einer cDNA-Sequenz gemäß Fig. A und/oder B oder Allele oder Homologe davon sowie wenigstens eine chemisch, biologisch und/oder pharmazeutisch aktive Verbindung.
Das erfindungsgemäße Meßsystem bietet hier die Möglichkeit umfangreiche Regulations- und Bindungsstudien durchzuführen, mit dem primären Ziel festzustellen, ob und gegebenenfalls in welchen Bereichen die Verbindung einen Effekt auf die Genexpression ausübt, d.h. diese abschwächt oder verstärkt Das erfindungsgemäß eingesetzte Meßsystem kann beispielsweise nicht-menschliche Säugetierzelle, bevorzugt eine definierte Rattenzellinie sein.
Eine weitere Variante der vorliegenden Erfindung betrifft ein Meßsystem enthaltend wenigstens ein mit der Tumormetastasierung assoziiertes Protein oder Isoformen davon kodiert durch eine Gensequenz oder deren Homologe ausgehend von einer cDNA-Sequenz gemäß Fig. A und/oder B sowie wenigstens eine chemisch, biologisch und/oder pharmazeutisch aktive Verbindung. Auch hier bietet das erfindungsgemäße Meßsystem die Möglichkeit umfangreiche Regulations- und Bindungsstudien durchzuführen, mit dem primären Ziel festzustellen, ob und gegebenenfalls in welchen Bereichen die Verbindung an ein mit der Tumormetastasierung assoziiertes Protein bindet und dieses in seiner Aktivität verändert, d.h. abschwächt oder verstärkt.
Ferner sind die Verbindungen selbst Gegenstand der vorliegenden Erfindung und/oder ihr Einsatz zur Herstellung von Mitteln zur Behandlung von Tumorerkrankungen enthaltend Verbindungen identifiziert nach einem zuvor beschriebenen Verfahren oder mit Hilfe eines zuvor beschriebenen Meßsystems.
Außerdem betrifft die vorliegende Erfindung cDNA-Sequenzen ausgewählt aus einer Population gemäß Fig. A und/oder B oder davon abgeleitete vollständige Gensequenzen, deren Homologe oder funktionell äquivalente
Sequenzen zum Einsatz in einem der zuvor beschriebenen Verfahren oder Meßsystem. Dies schließt auch den Einsatz von Mischungen der erfindungsgemäßen cDNA-Sequenzen ein.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind auch die Genprodukte (Polypeptide), die unter Verwendung der erfindungsgemäßen cDNA-
Sequenzen hergestellt oder davon abgeleitet werden können.
Ebenso sind genetisch veränderte nicht-menschliche Säugetierzellen enthaltend wenigstens eine erfindungsgemäße cDNA-Sequenz ausgewählt aus einer Population gemäß Fig. A und/oder B oder davon abgeleitete vollständige Gensequenzen, funktionelle Fragmente, deren Homologe oder Allele oder einen rekombinanten Vektor der zuvor beschriebenen Art oder Genprodukte der vorgenannten Art Gegenstand der vorliegenden Erfindung. Die vorliegende Erfindung umfaßt ferner Antikörper, die spezifisch an die genannten erfindungsgemäßen Genprodukte binden, wobei diese Antikörper unter Einsatz der erfindungsgemäßen cDNA-Sequenzen und/oder Genprodukte hergestellt werden können.
Ferner kommt erfindungsgemäß eine Sonde zur spezifischen Hybridisierung mit Tumorgewebe zum Einsatz, wobei diese ausgehend von einer cDNA-Sequenz ausgewählt aus einer Population gemäß Fig. A und/oder B oder davon abgeleiteten vollständigen Gensequenzen, deren Homologe oder funktionell äquivalenten Sequenzen hergestellt wird, eine zur Detektion geeignete, bevorzugt nicht radioaktive Markierung enthält und/oder 30 Nukleotide, bevorzugt 15-20, besonders bevorzugt 10 Nukleotide lang ist.
Ferner ist ein Test-Kit Gegenstand der vorliegenden Erfindung, enthaltend wenigstens eine cDNA-Sequenz ausgewählt aus einer Population gemäß Fig. A und/oder B oder davon abgeleitete vollständige Gensequenzen, funktionelle Genfragmente davon oder deren Homologe oder Allele, eine Anleitung zur Herstellung einer zuvor beschriebenen Sonde sowie Anleitungen zur Hybridisierung und Detektion von Nukleotidsequenzen aus Tumorgewebe. Bevorzugt wird der Einsatz einer Mischung mehrerer relevanter cDNA-Sequenzen.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner die Verwendung von Verbindungen identifiziert nach einem erfindungsgemäßen Verfahren und/oder durch ein erfindungsgemäßes Meßsystem zur Herstellung von Mitteln, welche zur Tumorbehandlung verwendet werden können. Ebenso schließt die vorliegende Erfindung die Verwendung der erfindungsgemäßen Antikörper zur Herstellung von Mitteln, welche zur Tumorbehandlung eingesetzt werden können, ein. Ferner eignen sich die erfindungsgemäßen cDNA-Sequenzen, Genprodukte, Antikörper und/oder Teile davon und/oder die erfindungsgemäßen an der Entstehung von Tumormetastasen beteiligten Verbindungen zum Einsatz in Bereichen der Tumormetastasen-Diagnostik und/oder -Therapie. Dies schließt beispielsweise in Bereichen der Tumordiagnostik auch die Identifizierung von weiteren Metastase-Tumormarkem humanen Ursprungs ein.
Die vorliegende Erfindung wird durch die nachfolgenden Ausführungsbeispiele näher charakterisiert, die sich aber nicht limitierend auf die Erfindung auswirken:
Allgemeine Methoden
Die Isolierung und Analyse von Nukleinsäuren, allgemeine Klonierungstechniken, DNA-Sequenzierung, RNA-Techniken, Methoden zum Transfer und zur Hybridisierung von Nukleinsäuren sind in Sambrook et al., Molecular cloning: A laboratory manual, 1989, Cold Spring Harbour Laboratory Press beschrieben, ebenso wie allgemeine Vorgehensweisen zur Zellkultivierung und histologische Techniken.
Subtraktive Klonierung von differentieil exprimierten Genen (SSH) Die Herstellung einer differentiellen cDNA-Bank (Subtraktionsbank) nach dem Prinzip der sogenannten Suppressive Substractive Hybridization ist bei Diatchenko L. et al., 1996, Proc Natl Acad Sei USA, 93: 6025-6030 beschrieben. Die Subtraktionsreaktion erfolgte mit Hilfe des CLONTECH - PCR-Select cDNA Subtraction Kits der Firma Clontech Laboratories, Palo Alto, USA nach Herstellerangaben.
Analyse der cDNA-Klone der Subtraktionsbank am Beispiel der Rattenzellinie 13762
Zur Überprüfung der Effizienz der Subtraktion über eine Southern-Blot- Analyse müssen amplifizierte Rsal -Fragmente des Drivers MTPa hergestellt werden, da es sich auch bei der subtrahierten Bank ML um Rsa/-verdaute cDNA-Fragmente handelt. Nach Rsai-Verdau der MTPa- cDNA wurden Adaptoren (Eco-Linkeή an die Fragmente ligiert und mit Hilfe der entsprechenden PCR-Primer (Eco-Linker-Primeή gemäß den Bedingungen der 2. PCR der SSH amplifiziert. MTLY wurde in Form der Testerfraktion 1c (s. SSH-Handbuch) eingesetzt.
Ligation in einen TA-Vektor
Die Ligation der PCR-Produkte der 2. PCR-Runde der SSH erfolgte in einem TA-Vektor (pCRII.1 , Invitrogen). Die Klonierung eines Inserts in den pCR.11.1 -Vektor unterbricht die kodierende Sequenz des ß- Galactosidase-Gens, sodaß rekombinante Klone (weiß) von Leervektoren (blau) unterschieden werden können. Da die verwendete Taq-Polymerase aber proofreading-AkϊiV ät besitzt, ist es notwendig, die PCR-Produkte nach vorangegangener Phenol/Chloroformextraktion, in einem weiteren Schritt für 15 min bei 72°C mit dATP und einer anderen Taq-DNA-Polymerase (Eurobio-Taq-Polymerase) zu inkubieren und wieder eine Phenol/Chloroformextraktion vorzunehmen. Die Ligation erfolgte mit der dem Vektor beigefügten T4-DNA-Ligase (Invitrogen) im Verhältnis 1 : 1 (je 25 ng Vektor und Subtrahierte Bank).
Transformation in elektrokompetente Bakterien und BlauA/Veiß- Sortierung
Die in den pCRI 1.1 -Vektor ligierte Bank wurde in elektrokompetente Bakterien (ELEKTROMAX, Stamm DH10B, Invitrogen) transformiert und auf 15 cm große Bakterienschalen ausplattiert. Die Schalen enthielten neben LB-Agar, das Selektionsantibiotikum Ampicillin (100 , μg/ml), sowie 100 μM IPTG und X-Gal (50 μg/ml) zur Blau/Weiß- Sortierung. Die Bakterienschalen wurden bei 37°C inkubiert, bis kleine Kolonien sichtbar waren. Zur besseren Unterscheidung von weißen und blauen Kolonien wurden die Platten anschließend bei 4°C inkubiert.
Picken von Klonen und Kolonie-PCR
Eine Gesamtzahl von 1985 Klonen wurde unter Blau Weiß-Selektion gepickt, in sterile 96-vι/e//-Mikrotiterpiatten übertragen, die LB-Medium und Ampicillin enthielten (100μg/μl). Die Bakterien in diesen Platten wurden für 14 Stunden bei leichtem Schütteln bei RT wachsen gelassen. Zur Durchführung der Kolonie-PCR wurde mit Hilfe einer Multikanalpipette 10μl einer jeden Bakterienkultur entnommen und in eine 96-well-PCR-Platte übertragen und dort mit je 90μl sterilem Wasser vermischt. Zur Denaturierung wurde die Platte für 5 min bei 95°C in der PCR-Maschine (Perkin-Elmer 9600 thermal cycler) inkubiert. 5 μl eines jeden Lysats wurden mit einer Multikanalpipette in eine zweite 96-welI-PCR-Platte übertragen, in die jeweils 90 μl des PCR-Gemischs vorgelegt worden war. Die cDNA-Fragmente wurden mit Hilfe der Nested Primer 1 und 2 der Subtraktion amplifiziert.
PCR-Mischung (50 μl-Ansatz):
0,5 U Taq Polymerase (Promega), 5 μl 10xPCR-Puffer (Promega), 200 μM dNTPs, je 10 μmol des Nested Primers 1 und 2 der Subtraktionsreaktion + 5 μl des Bakterien lysats
PCR-Bedingungen: 94°C, 30 Sekunden - 68°C, 30 Sekunden - 72°C, 30 Sekunden
Reverse-Northern-Blot-Ana\yse
Die Überprüfung, welche Klone tatsächlich differentieil exprimierte cDNA-Fragmente enthalten, erfolgte mittels einer Reverse-Northem- Blot-Analyse. Hierzu wurden die amplifizierten cDNA Fragmente (Kolonie-PCR) in identischer Anordnung auf 2 high cfens/'-y-Agarosegele (Centipede™-Gelelektrophoresekammern, Owl Scientific, Woburn, USA) aufgetragen. Es wurden 2 x 96 Proben (2 Mikrotiterplatten) pro Gel aufgetragen. Hierbei ist es von größter Wichtigkeit, daß beide Gele exakt gleich beladen werden. Auf den letzten Platz wurde jeweils eine GAPDH-Kontrolle zur späteren Quantifizierung der Signalstärke aufgetragen. Nach alkalischem Blotten (s. Southem~Blot-Ana\yse) wurden die Membranduplikate mit 32P-markierter Tester (MTLY)- bzw. Driver (MTPa)-cDNA (jeweils Rsal- verdaut), hybridisiert und autoradiographisch ausgewertet.
Herstellung von Hybridisierungssonden der isolierten cDNA-Fragmente Die cDNA-Fragmente wurden zur Sondenherstellung dem Prinzip der Kolonie-PCR folgend, mit Hilfe der Nested Primer 1 und 2 der Subtraktion aus den entsprechenden Bakterienklonen amplifiziert
PCR-Mischung (50 μl-Ansatz):
0,5 U Taq Polymerase (Promega), 5 μl 10xPCR-Puffer (Promega), 200 μM dNTPs, je 10 μmol des Nested Primers 1 und 2 der Subtraktionsreaktion + 5 μl des Bakterienlysats
PCR-Bedingungen:
94°C, 30 Sekunden - 68°C, 30 Sekunden - 72°C, 30 Sekunden
Das Ergebnis der erhaltenden und differentieil exprimierten cDNA- Fragmente ist in Fig. A und Fig. B zusammengefaßt, wobei Fig. A cDNA- Fragmente aus einer Mammakarzinom-spezifischen Bibliothek (MLSSH) repräsentieren und Fig. B cDNA-Fragmente aus einer Pankreas- spezifischen Bibliothek (PLSSH). Figurenbeschreibung
Fig. A:
Auflistung der cDNA-Sequenzen der Mamakarzinom-spezifischen Bilbliothek erhalten durch Suppressive Substractive Hybridization (MLSSH).
Fig. B:
Auflistung der cDNA-Sequenzen der Pankreas-spezifischen Bilbliothek erhalten durch Suppressive Substractive Hybridization (PLSSH).
Fig. C: cDNA-Sequenzen von CD 24 und S7 als Tumormarker für invasives humanes Brust- und/oder Dickdarmtumorgewebe.
Fig. D:
Vergleich der Genexpression neuer Gene und Tumor-assoziierter Moleküle in Zellinien mit unterschiedlichem metastatischen Potential. Die Abbildung besteht aus Northem-Blots von vier unterschiedlichen Rattentumorsystemen und zwei humanen Brustkrebszellinien. Außer dem Paar MN081/MT450 bestehen alle benutzten Tumorsysteme aus klonalen Zellinien, die von einem primären Tumor abstammen und sich nur in ihrer Metastasierungskapazität unterscheiden. Dieses metastatische Potential ist angezeigt Jede Spur der Northern-Blots wurde mit je 2ug poly-A+ RNA beladen. Die Blots wurden mit verschiedenen differentieil experimenten cDNAs, die in den MLSSH und PLSSH Subtraktionsbanken (Screens) isoliert wurden, hybridisiert. Die benutzten Hybridierungsproben wurden zufällig aus den in den MLSSH und PLSSH Screens isolierten metastasierungs-spezifischen Genen ausgewält Sie repräsentieren in jeden Fall 10% der isolierten Gene. Eine grobe Klassifizierung (korrelativer Index) soll die Korrelation zwischen der Expression der Gene und dem metastatischen Potential der untersuchten Zellinien beschreiben. Gene, deren Expression in allen metastatischen Zellinien hochreguliert und in allen nicht-metastatischen Zellen nicht vorhanden bzw. signifikant reduziert ist, wurden mit +++ bezeichnet. Gene, die deutlich differentieil aber nicht ausschließlich in metastatischen Zellen exprimiert sind, wurden mit ++ oder + bezeichnet, abhängig von der Stärke der Korrelation der Expression mit dem metastatischen Potential. Die Expression einiger Klone zeigte eine starke Assoziation mit dem metastatischen Potential in nur einem Tumorprogressionsmodell.
Fig. E:
In-Situ-Hybridisierung. Schnitte (6μm) von Formaidehyd-fixierten und in Paraffin-eingebetteten menschlichen Karzinomen wurden mit 35S-UTP oder Fluoreszenz-markierter „sense" und „antisense" RNA hybridisiert und anschließend mit Hämatoxylin und Eosin (H und E) gegengefärbt. Die Karzinome wurden entsprechend der UICC-Richtlinien eingestuft. Die Maßstäbe repräsentieren 100 μm (a, b, e, f), 40 μm (c, d) und 20 μm (g, h). a-b (a, „sense" kontrolle; b, „antisense" radioaktiv markierte CD24-Probe): CD24-Expression in einem mäßig differenzierten Adenokarzinom des Darms, eingestuft als pT3C; p21; pNO; pM1. Der Schnitt zeigt signifikante CD24-Überexpression in intra-duktalen Karzinomzellen (Lokalisation im Zytoplasma), während die nicht-neoplastische Mucosa nur schwach positiv ist (konstante basale Expression), c-d (c, „sense" kontrolle; d, „antisense" radioaktiv markierte CD24-Probe): CD24-Expression in einem mäßig invasiven duktalen, mäßig differenzierten Brustkarzinom, eingestuft als pT2; pNIbii. Ein positives Signal war im Karzinom, aber nicht im umliegenden Stroma nachweisbar, e-f (e, „sense" kontrolle; f, „antisense" radioaktiv markierte S7-Probe): S7- Expression in einem mäßig differenzierten Adenokarzinom des Darms, eingestuft als pT3C; p21 ; pNO; pM1. Der Schnitt zeigt signifikante S7- Überexpression (vorherrschende Lokalisation im Nukleus) im Karzinom, aber sehr schwache Expression in der nicht-neoplastischen Mucosa. h-g (h, „sense" kontrolle; g, „antisense" Fluoreszenz-markierte S7-Probe): Expression von S7 in einem wenig differenzierten invasiven duktalen Brustkarzinom, eingestuft als PT-1C; G3, N-1B1 oder I, R-O, L-1. Ein starkes nukleares Signal war im intraduktalen Karzinom nachweisbar, aber fast kein Signal wurde im Stroma beobachtet.

Claims

Patentansprüche:
1. Verfahren zur Identifizierung von metastasierenden Tumorzellen, dadurch gekennzeichnet daß wenigstens eine cDNA-Sequenz ausgewählt aus einer Population gemäß den Fig. A und/oder B oder davon abgeleitete vollständige Gensequenzen, funktionelle
Genfragmente davon oder deren Homologe oder Allele zur Hybridisierung mit Tumorgewebe eingesetzt werden.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß die cDNA- Sequenzen ausgewählt aus einer Population gemäß Fig. B an der
Metastasierung von Pankreastumorgewebe und/oder ausgewählt aus einer Population gemäß Fig. A an der Metastasierung von Brusttumorgewebe beteiligt sind.
3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die cDNA-Sequenzen gemäß Fig. C an der Metastasierung von humanem Brust- und/oder Dickdarmtumorgewebe beteiligt sind.
4. Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen zur Tumorbehandlung, dadurch gekennzeichnet, daß a) eine metastasespezifische Gensequenz abgeleitet von wenigstens einer der cDNA-Sequenzen ausgewählt aus einer Population gemäß Fig. A und/oder B in nicht-menschlichen Säugetierzellen exprimiert werden, b) chemisch, biologisch und/ oder pharmazeutisch aktive Verbindungen mit den zuvor genannten Zellen inkubiert werden, c) diejenigen Verbindungen ausgewählt werden, die eine modulierende Auswirkung auf die Expression der mit der Tumormetastasierung assoziierten Genen oder auf die Aktivität der durch sie kodierten Proteine zeigen.
5. Meßsystem zur Identifizierung von Verbindungen zur Tumorbehandlung enthaltend wenigstens ein mit der Tumormetastasierung assoziiertes Gen ausgehend von einer cDNA-
Sequenz gemäß Fig. A und/oder B sowie wenigstens eine chemisch, biologisch und/oder pharmazeutisch aktive Verbindung.
6. Meßsystem gemäß Anspruch 5 enthaltend wenigstens ein mit der Tumormetastasierung assoziiertes Protein kodiert durch ein Gen ausgehend von einer cDNA-Sequenz gemäß Fig. A und/oder B sowie wenigstens eine chemisch, biologisch und/oder pharmazeutisch aktive Verbindung.
7. Verbindungen identifiziert nach einem Verfahren gemäß Anspruch 4 oder mit Hilfe eines Meßsystems gemäß einem der Ansprüche 5 oder 6.
8. cDNA-Sequenzen ausgewählt aus einer Population gemäß Fig. A und/oder B oder . davon abgeleitete vollständige Gensequenzen, funktionelle Genfragmente, deren Homologe oder Allele zum Einsatz in einem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 oder in einem
Meßsystem gemäß einem der Ansprüche 5 oder 6.
9. Genprodukte hergestellt unter Verwendung wenigstens einer cDNA- Sequenz gemäß Anspruch 8.
10. Genetisch veränderte nicht-menschliche Säugetierzellen enthaltend wenigstens eine cDNA-Sequenz gemäß Anspruch 8 oder wenigstens ein Genprodukt gemäß Anspruch 9.
11.Antikörper zur spezifischen Bindung an ein Genprodukt gemäß Anspruch 9, hergestellt unter Verwendung wenigstens einer cDNA- Sequenz gemäß Anspruch 8 oder eines Genproduktes gemäß Anspruch 9.
12. Sonde zur spezifischen Hybridisierung mit Tumorgewebe dadurch gekennzeichnet, daß sie ausgehend von wenigstens einer cDNA-
Sequenz gemäß Anspruch 8 hergestellt wird, eine zur Detektion geeignete Markierung enthält und/oder 30 Nukleotide, bevorzugt 15- 20, besonders bevorzugt 10 Nukleotide lang ist
13.Test-Kit enthaltend wenigstens eine cDNA-Sequenz gemäß Anspruch 8, eine Anleitung zur Herstellung einer Sonde gemäß Anspruch 12 sowie Anleitungen zur Hybridisierung und Detektion von Nukleotidsequenzen aus Tumorgewebe.
14. Verwendung von Verbindungen gemäß Anspruch 7 zur Herstellung von Mitteln zur Behandlung von Krebserkrankungen.
15. Verwendung von Antikörpern gemäß Anspruch 11 zur Herstellung von Mitteln zur Behandlung von Krebserkrankungen.
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