DE10229391A1 - METASTACHIP: ein Biochip zur Bestimmung des metastatischen Potentials von Tumoren - Google Patents

METASTACHIP: ein Biochip zur Bestimmung des metastatischen Potentials von Tumoren Download PDF

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft einen Biochip, den sogenannten "Metastachip", zur Bestimmung des metastatischen Potentials von Tumorzellen, der ein DNA-Array aus cDNA-Kopien aus Tumorzellen enthält, wobei cDNA-Kopien von Genen oder Teilen davon, die bei der Metastase ihre Expression verändern und als Kontrolle cDNA-Kopien von Genen oder Teilen davon, die bei der Metastase ihre Expression nicht verändern, auf einem Träger angeordnet sind. DOLLAR A Des weiteren betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Bestimmung des metastatischen Potentials von Tumorzellen sowie Verfahren zur Auswertung der Daten aus dem Screening mit dem Metastachip.

Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft einen Biochip, den sogenannten „Metastachip", zur Bestimmung des metastatischen Potentials von Tumorzellen. Des weiteren betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Bestimmung des metastatischen Potentials von Tumorzellen sowie Verfahren zur Auswertung der Daten aus dem Screening mit dem Metastachip.
  • Der Begriff „Biochip" ist ein fester Bestandteil der Terminologie der Biowissenschaften geworden. Die „Biochips" bestehen in der Regel aus einem Trägermaterial, an das biologische Sonden gebunden sind, hier DNA, die als Microarray bezeichnet werden. Deren Vorteil ist, daß eine große Anzahl von Proben (DNA) gleichzeitig an den Träger gebunden sind. Die Sonden sind Oligonukleotide, cDNA oder durch PCR-Amplifikation erhaltene DNA-Fragmente. Diese sind rasterförmig angeordnet, wobei jede Sonde einem Gen entspricht. Bei Hybridisierungsexperimenten (Screening) können so Unterschiede in der Expression von Tausenden von Genen gleichzeitig untersucht werden.
  • Die oben beschriebenen Biochips und die damit verbundenen Screening-Verfahren sind schon seit einigen Jahren bekannt. Sie werden eingesetzt zur qualitativen und quantitativen Analyse zellulärer Regulartionsprozesse wie zum Beispiel Untersuchungen von Geninteraktionen, Funktionsanalysen von Genen, Analyse von Punktmutationen oder Expressionsanalysen. Ebenso existieren und werden angewendet Microarrays mit Sonden für Z. B. humane, Ratten-, Maus, Drosophila oder E. coli-Gene.
  • Biochips werden schon seit einigen Jahren von verschiedenen Firmen kommerziell angeboten. Die meisten sind jedoch darauf ausgerichtet, festzustellen, welches Gen mit welcher Krankheit korreliert oder sie werden eingesetzt um neue Wirkstoffe zu testen. Verfahren zum Screenen von Aminosäuren bezüglich eines Rezeptors sind in der WO 90/15070 oder EP 0 619 321 A1 beschrieben. Biochips werden auch eingesetzt zum spezifischen Nachweis von Antikörpern oder zur DNA-Sequenzierung.
  • Viele der zur Zeit eingesetzten Chips und bekannten Verfahren zeigen jedoch noch eine relativ hohe Fehlerrate und eine noch zu große Störanfälligkeit. Außerdem ist zur Produktion der meisten Biochips ein zeit- und kostenaufwendiges Verfahren notwendig. Biochips zur Bestimmung des metastatischen Potentials von Tumoren werden jedoch in dem Stand der Technik nicht beschrieben.
  • Dem Fachmann sind verschiedene Verfahren zur Identifizierung von metastasierenden Tumoren bekannt. Z.B. werden Verfahren basierend auf Antikörpern schon lange in der klinischen Pathologie angewendet.
  • Aus der WO-A-02/08456 ist beispielsweise ein Verfahren zur Identifizierung von metastasierenden Tumorzellen bekannt. Dieses beruht auf einem Test-Kit, mit dem einzelne Sonden von mit der Metastase assoziierten Genen hergestellt werden und zur Detektion mit Nukleotidsequenzen aus Proben von Tumorgewebe hybridisiert wird. Die Verwendung von Biochips wird jedoch nicht erwähnt.
  • Mit den bisher eingesetzten Techniken, wie zum Beispiel RT-PCR oder immunohistochemischen Untersuchungen konnte die Expression lediglich einzelner oder einer geringen Anzahl an mit der Metastase assoziierten Genen gleichzeitig untersucht werden. Diese Untersuchungen sind hilfreich für eine Prognose betreffend die Tumormetastase oder für das Treffen eine klinisch, onkologischen Entscheidung, sie ermöglichen aber keine Aussagen über die Expression weiterer Gene, die für die möglichst vollständige und komplexe Erfassung des einzelnen Individuums notwendig sind.
  • Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es somit, einen Biochip und ein Verfahren zur Identifizierung von metastasierenden Tumoren zur Verfügung zu stellen. Dieser Biochip soll einfach und günstig in der Herstellung sein sowie eine geringe Fehlerquote aufweisen und wenig störanfällig sein.
  • Des weiteren ist es Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren bereitzustellen, das eine Bestimmung des metastatischen Potentials eines Tumors ermöglicht und die Entwicklung von Metastasen charakterisiert. Die Bestimmung des metastatischen Potentials eines Tumors soll qualitativ möglich sein. Außerdem soll die Bestimmung des metastatischen Potentials eines Tumors quantitativ möglich sein. Ebenso soll die Charakterisierung der Entwicklung, also des Fortschreiten, der Metastase qualitativ möglich sein. Auch soll die Charakterisierung der Entwicklung quantitativ möglich sein.
  • Außerdem ist es Aufgabe der vorliegenden Erfindung ein möglichst vollständiges Bild der Tumormetastase zu liefern.
  • Diese Aufgabe wird durch einen Biochip enthaltend ein DNA-Array aus cDNA-Kopien aus Tumorzellen gelöst, der dadurch gekennzeichnet ist, daß cDNA-Kopien von Genen oder Teilen davon, eingesetzt werden die bei der Metastase ihre Expression verändern und als Kontrolle cDNA Kopien von Genen oder Teilen davon, die bei der Metastase ihre Expression nicht verändern.
  • Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Identifizierung von metastasierenden Tumoren. Hierbei kann ein Screening des genetischen Materials eines Tumors mit dem Metastachip durchgeführt werden. D.h. zur Identifizierung von metastasierenden Tumoren kann für jede Tumorart ein tumorspezifischer, selektiver Biochip eingesetzt werden, wobei cDNA-Kopien des genetischen Materials eines Tumors gescreent werden. Bevorzugt kann die Tumor-RNA aus primären Tumorzellen verwendet werden.
  • Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung des erfindungsgemäßen Metastachips zur Bestimmung des metastatischen Potentials der Tumore.
  • Unter cDNA-Kopien sind Kopien vollständiger Gene oder davon abgeleitete Gensequenzen oder Teile oder funktionelle Fragmente davon, deren Homologe oder Allele zu verstehen.
  • Als „Metastachip" wird ein Biochip bezeichnet, der Anordnung (Micrarrays) von PCR-Produkten von mit der Metastase assoziierten Genen und von PCR-Produkten von sogenannten Kontrollgenen umfaßt. Die Expression der mit Metastasen assoziierten Gene ist spezifisch für metastasierende Tumore. Die Kontrollgene sind Gene, die ihre Expression durch die Metastase im Tumor nicht verändern.
  • Der Metastachip kann als mit Metastase assoziierte Gene besonders cDNA-Kopien aus malignen Tumorzellen oder aus Tumor-spezifischen Genbibliotheken enthalten. Solche Genbibliotheken oder andere Beschreibungen von mit Metastase assoziierten Genen sind aus der Literatur bekannt.
  • Eine Auswahl, die keineswegs einschränkend zu verstehen ist, von Literatur beschreibend Gene die im Metastachip eingesetzt werden können befindet sich im Anhang.
  • In einer bevorzugten Ausführung enthält der Metastachip cDNA-Kopien aus einer Mamakarzinom-Bibliothek gemäß A oder einer Pankreas-spezifischen Bibliothek gemäß B.
  • Durch den Einsatz von cDNA-Kopien von Genen oder Teilen davon als Kontrollgene, die ihre Expression bei der Metastase nicht verändern, ist gewährleistet, daß die Expression der mit der Metastase assoziierten Gene immer in Bezug auf die Expression nicht mit der Metastase assoziierten Gene gemessen wird. Damit ist eine Bestimmung der Expression sowohl Tumor spezifisch als auch Gewebe spezifisch, sogar Patienten spezifisch möglich.
  • Außerdem wird dadurch der Einfluß von Meßfehlern oder Artefakten bei der Datenerfassung und Datenverarbeitung reduziert.
  • Das Verhältnis von Kontrollgenen zu mit der Metastase assoziierten Genen ist frei wählbar. In einer bevorzugten Ausführung beträgt die Anzahl von Kontrollgenen bezogen auf die Gesamtzahl der Gene auf dem Chip mindestens 0.1 ‰ (1 von 10 000), bevorzugt mindestens 0.2‰ (1 von 5 000), besonders bevorzugt 0.5‰ (1 von 2 000) oder 1‰ (1 von 1 000). Der Anteil von Kontrollgenen bezogen auf die Gesamtzahl der Gene kann aber auch mindestens 1%, 2%, 3%, 5%, 10% oder 20% betragen.
  • Auf das Trägermaterial des beschriebenen Biochips können neben den cDNA-Kopien von metastasierenden Genen und den Kontrollgenen die aus dem zu analysierenden Gewebe gewonnene DNA oder cDNA (Targets) aufgebracht werden. Die Targets können aus primären Tumoren vorbereitet werden. Dazu können ganze Tumore oder auch nur Tumorteile einer Mikrodisektion verwendet werden. Bevorzugt werden ganze Tumore verwendet, da dadurch eine große Anzahl an tumorspezifischer RNA für die cDNA-Synthese zur Verfügung steht.
  • Erfindungsgemäß wird vorzugsweise ein Screening des genetischen Materials durchgeführt. Vorzugsweise wird die cDNA markiert, um eine Detektion der Hybridisierung zu ermöglichen. Dies kann mit allen dem Fachmann bekannten Verfahren durchgeführt werden. Bevorzugt werden Fluoreszensfarbstoffe eingesetzt. Die Markierung der cDNA kann aber auch radioaktiv oder magnetisch erfolgen.
  • Bei dem Screening findet die Hybridisierung der Targets mit den entsprechenden, dazu komplementären Proben statt. Bevorzugt erfolgt die Hybridisierung unter stringenten Bedingungen.
  • Die Analyse des Sreenings erfolgt ebenfalls mit bekannten Methoden und richtet sich nach der Art der Markierung der cDNA, bevorzugt werden Verfahren der Fluoreszens-Analyse eingesetzt. Ein Scanner tastet mit Hilfe von Laserstrahlung die Spots auf dem Chip ab und eine Kamera erfaßt die Färbung und die Intensität.
  • Die Hybridisierung und deren Detektion können bevorzugt gemäß den bekannten Verfahren erfolgen, wie sie zum Beispiel von Duggan et al., Nature Genetics Supplement 21, 1999, 10–14, oder Cheung et al., Nature Genetics Supplement 21, 1999, 15–19 beschrieben sind.
  • Die Herstellung des Metastachips erfolgt nach den bekannten Verfahren wie sie in der Literatur zur Herstellung von Biochips beschrieben werden. Ebenso wird das Screening und die Auswertung gemäß dem Stand der Technik durchgeführt, wie in z. B. „Drosophila Protocols", Cold Spring Harbor Laboratory Press oder von Hedge et al., Biotechniques, 29, 2000 beschrieben.
  • Als Trägermaterial können Glas- oder Kunststoffträger oder Membranen basierende Träger eingesetzt werden. Um darauf eine Immobilisierung der DNA zu ermöglichen, können die Träger mit verschiedenen Oberflächensubstraten versehen werden, wie z. B. Aldehygruppen, Aminosilane, Epoxy Aktivierung, Streptavidin, Phenole oder bevorzugt Aldehyd oder Poly-L-Lysin.
  • Die Proben, d.h. die auf dem Träger zu immobilisierende DNA, können mit bekannten technischen Verfahren auf den Träger aufgebracht werden. Die Proben können mit Hilfe der in-situ-Synthese von Oligonukleotiden auf dem Träger synthetisiert werden. Bevorzugt werden die Proben nach ihrer Synthese auf den Träger aufgebracht. Die Proben können durch UV-Bestrahlung mit der Beschichtung des Trägers vernetzt werden und können anschließend fixiert werden, zum Beispiel mit Succinanhydrid. Die Proben können fluoreszent markiert sein, z. B. mit Cye-3-dUTP oder Cye-5-dUTP.
  • Im folgenden wird die Erfindung unter Bezugnahme auf die Figuren näher erläutert:
  • 1 betrifft einen erfindungsgemäßen Metastachip, bei dem schematisch ein Träger 4 mit darauf immobilisierter cDNA 1,2 den sogenannten Proben, dargestellt ist. Diese beruhen auf Genen die ihre Expression bei der Metastase verändern, also mit der Metastase assoziierte Gene 1, sowie auf Genen die ihre Expression bei der Metastase nicht verändern, sogenannte Kontrollgene 2.
  • 2 betrifft einen erfindungsgemäßen Metastachip nach der Hybridisierung der Targets 3, welcher aus zu analysierendem Tumorgewebe gewonnen worden ist, mit den auf dem Träger immobilisierten Proben.
  • A: Auflistung der cDNA-Sequenzen der Mamakarzinom-spezifischen Bibliothek erhalten durch Suppressive Substractive Hybridization (MLSSH).
  • B: Auflistung der cDNA-Sequenzen der Pankreas-spezifischen Bibliothek erhalten durch Suppressive Substractive Hybridization (PLSSH).
  • Vorzugsweise erfolgt die Bestimmung des metastatischen Potentials unter Einsatz der erfindungsgemäßen Biochips in folgenden Schritten:
    • 1. Die cDNA als PCR-Produkte aus mit der Metastase assoziierten Genen 1 sowie die Kontrollgene 2 werden auf einem Trägermaterial 4 angeordnet und als Probe 1,2 bezeichnet.
    • 2. Es wird cDNA aus RNA aus metastatischem und/oder nicht-metastatischem Tumor-Material synthetisiert, wobei sie fluoreszent markiert wird, z. B. mit Cye-3-dUTP oder Cye-5-dUTP. Diese cDNA wird als Target 3 bezeichnet.
    • 3. Das screening erfolgt mit den fluoreszent markierten Targets 3.
    • 4. Die Targets 3 hybridisieren bei Übereinstimmung mit den Proben 1,2.
    • 5. Die Zahl der hybridiesierten Targets 3 wird mit Hilfe der Fluoreszensmarkierung erfaßt und ausgewertet.
    • 6. Für jede Tumorart wird ein metastatisches Potential bestimmt auf Basis der Hybridisierung der Targets 3 mit der DNA des Metastachips in Abhängigkeit von der Anzahl der mit der Metastase assoziierten Gene 1 und der Intensität dieser Expression.
  • Aus diesen Daten werden folgende Faktoren bestimmt:
    • 1. Die durchschnittliche Expression in Bezug auf die Kontrollgene 2 auf dem Biochip, bezeichnet als „normalisierte Expression"
    • 2. Normalisierte Werte der Genexpression, also der Grad an Induktion oder Supression der Expression in primären Tumoren die metastasieren in Vergleich zu primären Tumoren die nicht metastasieren.
    • 3. Die Zu- oder Abnahme der Frequenz mit der die Expression der mit der Metastase assoziierten Gene 1 in metastasierenden Tumoren.
  • Jedes Gen des Metastachips liefert somit mindestens zwei wichtige Werte für die Bestimmung des metastatischen Potentials des zu überprüfenden Tumors: die Änderung in der Genexpresssion der einzelnen Gene und die Frequenz mit der besagte Änderung in der Genexpresssion eintritt. Diese Werte können allgemein gültig sein oder tumorspezifisch. Bevorzugt sind diese Werte spezifisch für den jeweiligen Tumor-Typ.
  • Des weiteren können diese Werte zur Beschreibung von metastasierenden Tumoren zu jedem beliebigen Zeitpunkt verwendet werden. Ebenso sind sie geeignet um lediglich einen bestimmten Zeitpunkt in der Tumorprogression zu beschreiben. Da die jeweilige Genexpression sich im Laufe der Tumorprogression ändert, wird bevorzugt ein bestimmter Zeitpunkt beschrieben.
  • Mit Hilfe der oben genannten Werte kann somit das metastatische Potential eines Tumors bestimmt werden. Dies kann beispielsweise nach folgendem Algorithmus erfolgen:
    Figure 00100001
  • Mit: Pm – metastatisches Potential eines Tumors
    Epn – Genexpression (Induktion oder Supression) des Gens n in der Tumor Population
    Esn – Genexpression (Induktion oder Supression) des Gens n in dem Tumor sample, d. h. spezifisch für einen bestimmten Tumortyp, aber nicht in metastasierendem Zustand
    f% – Frequenz in Prozent mit der das Gen n hoch oder herunter geregelt in der Population
  • Gemäß oben angeführtem Beispiel wird die Abweichung der Induktion oder Supression der Genexpression vom Durchschnitt der Population eines jeden einzelnen Gens berechnet (Ep – Es). Je kleiner die Änderung in der Expression der einzelnen Gene in Bezug auf den Durchschnitt ist, desto geringer wird der Wert für die Abweichung sein. Dieser Wert für die Abweichung wird anschließend mit der Frequenz des Auftretens dieser Änderung (f%) gewichtet, d. h. je öfter die Änderung in der Genexpression auftritt, desto mehr Einfluß hat sie auf das gesamte metastatische Potential.
  • Die Summe dieser Werte für alle sich auf dem Metastachip befindenden Gene ergibt das metastatische Potential. Je geringer dieser Wert ist, desto größer ist die Übereinstimmung des untersuchten primären Tumors mit einem metastasierenden Tumor. In diese Berechnung müssen nicht die Werte aller sich auf dem Metastachip befindenden Gene berücksichtigt werden Bevorzugt kann eine Auswahl von spezifischen Genen in die Berechnung einbezogen werden. Aus einer für eine statistische Auswertung genügend großer Anzahl von Analysen mit dem Metastachip können Grenzwerte für das metastatische Potential festgelegt werden.
  • Die vorliegende Erfindung ermöglicht somit die vollständige Beschreibung der doch sehr komplexen Tumormetastase. Zusätzlich kann dadurch die Analyse auf jedes einzelne Individuum genau abgestimmt werden. Anhand von einer genügend großen Datenmenge für statistische Auswertungen lassen sich auch allgemeine Aussagen treffen.
  • Durch die Bestimmung des metastatischen Potentials von Tumoren in verschiedenen Phasen der Metastase kann eine Datenbank gebildet werden, mit deren Hilfe sich die Grenzwerte für die Metastase festlegen lassen. Ebenso kann daraus durch ein einfaches Screening mit cDNA gewonnen aus Tumorzellen die Wahrscheinlichkeit einer Metastase vorhergesagt werden.
  • Mit Hilfe eines Datenabgleichs mit klinischen Patientendaten kann eine Therapie spezifisch für den jeweiligen Tumortyp und Patienten ausgearbeitet werden.
  • Anhang
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Claims (10)

  1. Biochip enthaltend ein DNA-Array aus cDNA-Kopien aus Tumorzellen, dadurch gekennzeichnet daß, cDNA Kopien (1) von Genen oder Teilen davon, die bei der Metastase ihre Expression verändern und als Kontrolle (2) cDNA Kopien von Genen oder Teilen davon, die bei der Metastase ihre Expression nicht verändern, auf einem Träger (4) angeordnet sind.
  2. Biochip gemäß Anspruch 1, enthaltend ein cDNA-Array aus cDNA-Kopien (1) aus malignen Tumorzellen.
  3. Biochip gemäß Anspruch 2, enthaltend ein cDNA-Array aus cDNA-Kopien (1) aus Tumor spezifischen Genbibliothek.
  4. Biochip gemäß Anspruch 3, enthaltend ein cDNA-Array aus cDNA-Kopien (1) aus Mamakarzinom-Bibliothek.
  5. Verfahren zur Identifizierung von metastasierenden Tumoren, dadurch gekennzeichnet, daß ein Screening des genetischen Materials eines Tumors mit einem Biochip gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 durchgeführt wird.
  6. Verfahren zur Identifizierung von metastasierenden Tumoren gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß für jede Tumorart ein tumorspezifischer, selektiver Biochip eingesetzt wird.
  7. Verfahren zur Identifizierung von metastasierenden Tumoren gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß cDNA-Kopien des genetischen Materials eines Tumors gescreent werden.
  8. Verfahren zur Identifizierung von metastasierenden Tumoren gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Tumor-RNA aus primären Tumorzellen stammt.
  9. Verfahren zur Identifizierung von metastasierenden Tumoren gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die cDNA-Kopien des genetischen Materials eines Tumors fluoreszent markiert werden.
  10. Verwendung des Verfahrens gemäß Anspruch 5–9 zur Bestimmung des metastatischen Potentials der Tumore.
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