KR20080073745A - 암의 예측 및 예후 방법, 및 암 치료 요법을 모니터하는방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 바이오마커, 및 암의 예측 및 예후를 위한 바이오마커의 용도 뿐만 아니라, 암 치료법의 효능을 모니터하기 위한 바이오마커의 용도에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 소라페니브로 치료받은 대상자에 대한 바이오마커로서 VEGF 및 sVEGFR의 용도에 관한 것이다.
바이오마커, 암, 소라페니브, VEGF
Description
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2005년 11월 14일 출원된 우선 출원 미국 가출원 시리얼 번호 제60/735,854호 (본원에서 그의 전문이 참고로 인용된다)의 잇점을 주장한다.
기술분야
본 발명은 바이오마커, 및 암의 예측 및 예후를 위한 바이오마커의 용도 뿐만 아니라, 암 치료법의 효능을 모니터하기 위한 바이오마커의 용도에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 소라페니브를 사용한 치료법의 효능에 대한 바이오마커로서 가용성 VEGF ("VEGF") 및 가용성 VEGF 수용체 (sVEGFR)의 용도에 관한 것이다.
다수의 질환 상태는 유전적 DNA 카피수의 변화를 통한 또는 특정 유전자의 전사 수준의 변화를 통한 (예컨대, 개시, RNA 전구체 공급, RNA 프로세싱 등의 제어를 통한) 다양한 유전자의 발현 수준상의 차이를 특징으로 한다. 예를 들면, 유 전 물질의 득실이 악성 형질전환과 진행에 있어 중요한 역할을 한다. 이러한 득실은 유전자, 종양 유전자 및 종양 억제 유전자중 2종 이상에 의해 유도된다고 생각된다. 종양 유전자는 종양발생의 양성 조절 인자인 반면, 종양 억제 유전자는 종양발생의 음성 조절 인자이다 ([Marshall, Cell 64:313-326, 1991]; [Weinberg, Science 254:1138-1146, 1991]). 그러므로, 조절되지 않는 성장을 활성화시키는 하나의 기전은 (예컨대, 세포 또는 환경상의 변화에 대한 반응으로) 종양 유전자 단백질을 코딩하는 유전자의 수를 증가시키거나, 이들 종양 유전자의 발현 수준을 증가시키는 것이고 , 또다른 기전은 유전 물질을 상실시키거나, 종양 억제 인자를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 감소시키는 것이다. 이러한 모델은 신경아교종 진행과 관련된 유전 물질의 득실에 의해 입증된다 [Mikkelson, et al., J. Cellular Biochem. 46:3-8, 1991]. 따라서, 특정 유전자 (예컨대, 종양 유전자 또는 종양 억제 인자)의 발현 (전사) 수준의 변화가 다양한 암의 존재와 진행에 대한 표지로서의 역할을 한다.
본 발명의 요약
본 발명은 바이오마커, 및 암의 예측 및 예후를 위한 바이오마커의 용도 뿐만 아니라, 암 치료법의 효능을 모니터하기 위한 바이오마커의 용도에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 소라페니브를 사용한 치료법의 효능에 대한 바이오마커로서 VEGF 및 sVEGFR, 더욱 바람직하게 sVEGFR-2 (가용성 VEGFR-2)의 용도에 관한 것이다. 하기 실시예에서 보다 상세히 기술하는 바와 같이, 소라페니브로 치료받은 대상자에서 sVEGFR-2는 감소한 반면, VEGF 수준은 증가한 것으로 밝혀졌다. 따라서, 이러한 마커는 소라페니브 치료법의 효능을 측정하는데 사용될 수 있다.
추가로, 본 발명의 목적은 암의 예측, 진단, 예후, 및 치료를 위한 방법 및 반응 물질을 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 실시태양은 하나 이상의 유전자 및/또는 유전자 산물의 발현 수준을 분석하는 단계를 포함하되, 여기에서, 약물에 노출시키기 이전과 이후에 조직 또는 세포 샘플중 유전자 발현 및/또는 유전자 산물 수준을 분석하고, 유전자 및/또는 유전자 산물의 발현 수준상의 변동이 약물 효과를 지시하거나, 환자를 진단하거나, 치료에 대한 환자의 반응을 예측하는 것인, 약물이 조직 또는 세포 샘플에 미치는 효과를 스크리닝하는 방법이다. 추가의 실시태양에서, 약물은 소라페니브이다. 또다른 실시태양에서, 유전자 또는 유전자 산물은 VEGF 및 VEGFR, 더욱 바람직하게 VEGFR-2, 및 그의 가용성 형태이다 (예컨대, 유출된(shed) VEGFR2의 검출).
본 발명의 또다른 측면은 하나 이상의 유전자 및/또는 유전자 산물의 발현 수준을 분석하는 단계를 포함하되, 여기에서, 약물에 노출시키기 이전과 이후에 세포의 유전자 발현 및/또는 유전자 산물 수준을 분석하고, 유전자 및/또는 유전자 산물의 발현 수준상의 변동이 약물 효능을 지시하는 것인, 신규한 약물을 발견하는 방법이다. 추가의 측면에서, 유전자 또는 유전자 산물은 VEGF 및 VEGFR, 더욱 바람직하게 VEGFR-2, 및 그의 가용성 형태이다 (예컨대, 유출된 VEGFR2의 검출).
본 발명은 추가로 암에 걸린 대상자에게 시험 화합물을 투여하고, 폴리펩티드의 활성을 측정하는 것을 포함하되, 여기에서, 폴리펩티드의 활성상의 변화가 시험 화합물이 암 치료에 유용한 것인지를 지시하는 것인, 암 치료에 유용한 화합물을 동정하는 방법을 제공한다. 추가의 실시태양에서, 폴리펩티드는 VEGF 및 VEGFR, 더욱 바람직하게 VEGFR-2, 및 그의 가용성 형태이고 (예컨대, 유출된 VEGFR2의 검출), 또다른 실시태양에서, 화합물은 소라페니브이다.
따라서, 본 발명은 예를 들면, 효현제 및 길항제, 부분 효현제, 역 효현제, 활성제, 공-활성제, 및 저해제와 같은 조절 인자 또는 조정 인자로서 작용할 수 있는 화합물을 동정하는데 사용될 수 있는 방법을 제공한다. 따라서, 본 발명은 암과 관련된 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 발현을 조절하는 반응 물질 및 방법을 제공한다. 폴리뉴클레오티드의 발현, 안정성, 또는 양, 또는 폴리펩티드의 활성을 조정하는 반응 물질은 단백질, 펩티드, 펩티도유사작용제(peptidomimetic), 핵산, 핵산 유사체 (예컨대, 펩티드 핵산, 잠긴(locked) 핵산), 또는 소분자일 수 있다.
본 발명은 또한 하나 이상의 유전자 및/또는 유전자 산물의 발현 수준을 분석하되, 여기에서, 정상 및 환자 샘플의 유전자 발현 및/또는 유전자 산물 수준을 분석하고, 환자 샘플에서의 유전자 및/또는 유전자 산물의 발현 수준상의 변동이 질환의 증상을 나타내는 것인, 환자를 진단하는 방법을 제공한다. 환자 샘플로는 혈액, 양수, 혈장, 정액, 골수, 및 조직 생검을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 추가의 실시태양에서, 유전자 또는 유전자 산물은 VEGF 및 VEGFR, 더욱 바람직하게 VEGFR-2, 및 그의 가용성 형태이다 (예컨대, 유출된 VEGFR2의 검출).
본 발명은 추가로 암에 걸린 것으로 의심되는 대상자에서 폴리펩티드의 활성을 측정하는 것으로 포함하되, 여기에서, 암에 걸리지 않은 대상자에서의 폴리펩티드의 활성과 비교하여 상기 폴리펩티드의 활성에 차이가 있다면, 대상자를 암에 걸린 것으로 진단하는 것인, 대상자에서 암을 진단하는 방법을 제공한다. 추가의 실시태양에서, 폴리펩티드는 VEGF 및 VEGFR, 더욱 바람직하게 VEGFR-2, 및 그의 가용성 형태이다 (예컨대, 유출된 VEGFR2의 검출).
또다른 실시태양에서, 본 발명은 환자의 샘플내의 단백질에 대한 항체를 사용하여 환자의 샘플내 단백질과 반응시키는, 환자의 샘플에서 암을 검출하는 방법을 제공한다. 추가의 실시태양에서, 항체는 VEGF 및 VEGFR, 더욱 바람직하게 VEGFR-2, 및 그의 가용성 형태에 특이적이다 (예컨대, 유출된 VEGFR2의 검출). 항체는 예컨대, 폴리펩티드의 노출 영역에 대하여 통상적으로 생성될 수 있다. 예를 들면, 항체는 VEGFR-2, 예컨대, 가용성 VEGFR-2의 세포외 도메인에 대하여 통상적으로 생성될 수 있다.
본 발명의 또다른 측면은 하나 이상의 유전자 및/또는 유전자 산물의 발현 수준을 분석하는 단계를 포함하되, 여기에서, 정상 조직과 질환 조직의 유전자 발현 및/또는 유전자 산물 수준을 분석하고, 유전자 및/또는 유전자 산물의 발현 수준상의 변동은 질환 상태를 지시하는 것인, 정상 상태와 질환 상태를 식별하는 방법이다. 추가의 측면에서, 유전자 또는 유전자 산물은 VEGF 또는 VEGFR-2이다.
또다른 실시태양에서, 본 발명은 정상 세포와 비교하여 1개 이상의 유전자의 차별적인 발현을 검출하는 것을 포함하되, 여기에서, 유전자는 2배 이상, 5배 이상, 20배 이상, 또는 50배 이상만큼 차별적으로 발현되는 것인, 세포의 표현형을 측정하는 방법을 포함한다. 추가의 실시태양에서, 유전자는 VEGF 및 VEGFR, 더욱 바람직하게 VEGFR-2를 코딩한다.
추가의 또다른 실시태양에서, 본 발명은 정상 세포와 비교하여 1개 이상의 폴리펩티드의 차별적인 발현을 검출하는 것을 포함하되, 여기에서, 단백질은 2배 이상, 5배 이상, 20배 이상, 및 50배 이상만큼 차별적으로 발현되는 것인, 세포의 표현형을 측정하는 방법을 포함한다. 추가의 실시태양에서, 폴리펩티드는 VEGF 및 VEGFR, 더욱 바람직하게 VEGFR-2, 및 그의 가용성 형태이다 (예컨대, 유출된 VEGFR2의 검출).
또다른 실시태양에서, 본 발명은 약 10개 이상, 약 15개 이상, 약 25개 이상, 또는 40개 이상의 연속 뉴클레오티드를 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 프로브를 제공하고, 환자로부터 세포 샘플을 수득하고, 임의로 실질적으로 모두가 비암성인 세포의 제2 샘플을 제공하고, 엄격한 조건하에서 상기 제1 및 제2 세포 샘플 각각의 mRNA와 핵산 프로브를 접촉시키고, (a) 프로브와 제1 세포 샘플의 mRNA의 혼성화 양을 (b) 프로브와 제2 세포 샘플의 mRNA의 혼성화 양과 비교하되, 여기에서, 제2 세포 샘플의 mRNA의 혼성화 양과 비교하여 제1 세포 샘플의 mRNA의 혼성화 양이 2배 이상, 5배 이상, 20배 이상, 및 50배 이상만큼 차이가 날 경우, 이것이 제1 세포 샘플에서의 세포의 표현형을 지시하는 것인, 환자로부터의 세포의 표현형을 측정하는 방법을 제공한다. 추가의 실시태양에서, 핵산 프로브는 VEGF 및/또는 VEGFR, 바람직하게 VEGFR-2를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
또다른 실시태양에서, 본 발명은 환자로부터 단리된 세포 샘플내 핵산 수준을 측정하기 위한 것으로서, 프로브/프라이머를 포함하는, 암성 세포 또는 조직의 존재를 동정하는 시험용 키트를 제공한다. 특정 실시태양에서, 키트는 추가로 키트 사용 설명서, 세포를 현탁시키기나 고정시키기 위한 용액, 검출가능한 태그 또는 표지, 핵산이 쉽게 혼성화할 수 있도록 하는 용액, 세포를 용해시키는 용액, 또는 핵산 정제용 용액을 포함할 수 있다. 추가의 실시태양에서, 프로브/프라이머는 VEGF 및/또는 VEGFR, 바람직하게 VEGFR-2의 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
하나의 실시태양에서, 본 발명은 단백질에 특이적인 항체를 포함하는 것으로, 암 세포 또는 조직의 존재를 동정하기 위한 시험용 키트를 제공한다. 특정 실시태양에서, 키트는 추가로 키트 사용 설명서를 포함한다. 특정 실시태양에서, 키트는 추가로 세포를 현탁시키기나 고정시키기 위한 용액, 검출가능한 태그 또는 표지, 폴리펩티드가 항체와 쉽게 결합할 수 있도록 하는 용액, 세포를 용해시키는 용액, 또는 폴리펩티드 정제용 용액을 포함할 수 있다. 추가의 실시태양에서, 항체는 VEGF 및/또는 sVEGFR, 바람직하게 sVEGFR-2에 특이적이다.
또다른 실시태양에서, 본 발명은 환자로부터 단리된 세포 샘플중 핵산 수준을 측정하기 위한 것으로서, 프로브/프라이머를 포함하는, 암성 세포 또는 조직에서 화합물 또는 치료제의 효능을 모니터하기 위한 시험용 키트를 제공한다. 특정 실시태양에서, 키트는 추가로 키트 사용 설명서, 세포를 현탁시키기나 고정시키기 위한 용액, 검출가능한 태그 또는 표지, 핵산이 쉽게 혼성화할 수 있도록 하는 용액, 세포를 용해시키는 용액, 또는 핵산 정제용 용액을 포함할 수 있다. 추가의 실시태양에서, 프로브/프라이머는 VEGF 및/또는 VEGFR을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
하나의 실시태양에서, 본 발명은 단백질에 특이적인 항체를 포함하는 것으로, 암성 세포 또는 조직에서 화합물 또는 치료제의 효능을 모니터하기 위한 시험용 키트를 제공한다. 특정 실시태양에서, 키트는 추가로 키트 사용 설명서를 포함한다. 특정 실시태양에서, 키트는 추가로 세포를 현탁시키기나 고정시키기 위한 용액, 검출가능한 태그 또는 표지, 폴리펩티드가 항체와 쉽게 결합할 수 있도록 하는 용액, 세포를 용해시키는 용액, 또는 폴리펩티드 정제용 용액을 포함할 수 있다. 추가의 실시태양에서, 항체는 VEGF 및/또는 VEGFR-2, 예로서, 그의 가용성 세포외 도메인에 특이적이다.
본 발명의 상세한 설명
본 발명은 기술된 특정 방법, 프로토콜, 세포주, 동물 종 또는 속, 작제물, 및 시약으로 제한되는 것은 아니며, 상기는 다양할 수 있다는 것을 이해하여야 한다. 또한, 본원에서 사용된 전문 용어는 단지 특정 실시태양을 기술하기 위한 것이며, 본 발명의 범주는 오직 첨부된 청구의 범위에 의해서만 제한되는 것이며, 이러한 본 발명의 범주를 제한하고자 하는 것이 아님을 이해하여야 한다.
본원 및 첨부된 청구의 범위에서 사용되는 바, 단수형 "하나(a)," "하나(an)," 및 "그(the)"는 달리 명확하게 언급하지 않는 한, 복수 용어를 포함한다. 따라서, 예를 들면, "하나의 유전자"라고 언급하는 것은 하나 이상의 유전자를 언급하는 것이며, 이는 당업자에게 공지되어 있는 상기의 등가물 등을 포함한다.
달리 정의하지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 용어 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 분야의 숙련인이 통상적으로 이해하고 있는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기술된 것과 유사하거나 등가인 임의의 방법, 장치 및 재료가 본 발명을 실시하거나 시험하는데 사용될 수 있지만, 바람직한 방법, 장치 및 재료는 이제 기술한다.
본원에서 언급된 모든 간행물 및 특허는 예를 들면 기술되는 본 발명과 관련하여 사용될 수 있는, 간행물에 기재된 작제물 및 방법을 기술하고 개시하기 위한 목적으로 본원에서 참고로 인용된다. 상기와 본 명세서 전체적에서 논의되는 간행물은 단지 본 출원의 출원일 이전의 개시 내용만을 위해 제공된다. 본원에서는 선행 발명에 의해 본 발명이 상기 개시 내용보다 선행할 수 있는 자격이 없다는 것을 인정하는 것으로 해석되어서는 안된다.
정의
편의상, 본 명세서, 실시예 및 첨부된 청구의 범위에서 사용되는 특정 용어와 표현의 의미는 하기에 제공한다.
어레이 (예컨대, 마이크로어레이)상의 "어드레스"는, 어레이의 고체 표면상에 소자, 예를 들면, 올리고뉴클레오티드가 부착되어 있는 위치를 지칭한다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "효현제"는 단백질의 생체활성을 모사하거나 상향-조절하는 (예컨대, 효능을 증가시키거나 보충시키는) 제제를 지칭함을 의미한다. 효현제는 야생형 단백질 또는 야생형 단백질의 생체활성중 1가지 이상을 갖는 그의 유도체일 수 있다. 효현제는 또한 유전자의 발현을 상향-조절하는 화합물, 또는 단백질의 생체활성중 1가지 이상을 증가시키는 화합물일 수 있다. 효현제는 또한 폴리펩티드와 또다른 분자, 예를 들면, 표적 펩티드 또는 핵산 간의 상호작용을 증가시키는 화합물일 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "증폭"은 핵산 서열 카피를 추가로 생산하는 것에 관한 것이다. 예를 들면, 증폭은 당업계에 잘 알려져 있는 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 기술을 사용함으로써 수행될 수 있다 (예컨대, [Dieffenbach and Dveksler (1995) PCR Primer, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Pres, Plainview, N. Y.]를 참조할 수 있다).
본원에서 사용되는 바, "길항제"는 단백질의 생체활성중 1가지 이상을 하향-조절하는 (예컨대, 억제하거나 저해하는) 제제를 지칭함을 의미한다. 예를 들면, 소라페니브는 그러한 길항제의 한 일례이다. 길항제는 단백질과 또다른 분자, 예를 들면, 표적 펩티드 또는 효소 기질 간의 상호작용을 저해하거나 감소시키는 화합물일 수 있다. 길항제는 또한 유전자의 발현을 하향-조절하는 화합물, 또는 존재하는 발현된 단백질의 양을 감소시키는 화합물일 수 있다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "항체"는 예를 들면, 임의의 동종형 (IgG, IgA, IgM, IgE 등)의 전체 항체를 포함하고, 또한 척추동물 (예컨대, 포유동물)의 단백질과 특이적으로 반응하는 그의 단편도 포함하는 것으로 한다. 항체는 통상의 기법을 사용하여 단편화될 수 있고, 단편은 전체 항체에 대하여 상기 기술된 것과 동일한 방식으로 유용성에 대하여 스크리닝될 수 있다. 따라서, 본 용어는 특정 단백질과 선택적으로 반응할 수 있는, 단백질 분해적으로-절단되거나, 재조합적으로-제조된 항체 분자의 일부분의 세그먼트를 포함한다. 그러한 단백질 분해 및/또는 재조합 단편의 비제한적인 일례로는 Fab, F(ab')2, Fab', Fv, 및 펩티드 링커에 의해 연결된 V[L] 및/또는 V[H] 도메인을 함유하는 단일 쇄 항체 (scFv)를 포함한다. scFv's는 공유 또는 비-공유 결합하여 2개 이상의 결합 부위를 갖는 항체를 형성할 수 있다. 본 대상 발명은 다중클론 항체, 단일클론 항체, 또는 다른 정제된 항체 시료, 및 재조합 항체를 포함한다.
용어 "어레이" 또는 "매트릭스"는 장치상의 어드레스 지정 가능한 위치 또는 "어드레스"의 배열을 지칭한다. 상기 위치는 2차원 어레이, 3차원 어레이, 또는 다른 매트릭스 포맷으로 배열될 수 있다. 위치 갯수의 범위는 수천개 내지 수십만개 이상일 수 있다. 가장 중요하게, 각 위치는 전적으로 독립적인 반응 부위를 나타낸다. "핵산 어레이"는 핵산 프로브, 예로서, 올리고뉴클레오티드, 또는 그보다 큰 유전자 부분을 함유하는 어레이를 지칭한다. 어레이상의 핵산은 바람직하게 싱글-스트랜드이다. 프로브가 올리고뉴클레오티드인 어레이는 "올리고뉴클레오티드 어레이" 또는 "올리고뉴클레오티드 칩"으로 지칭된다. 또한 본원에서 "바이오칩" 또는 "생물학적 칩"으로도 지칭되는 "마이크로어레이"는 별개 영역의 밀도가 약 100/㎠ 이상, 및 바람직하게 약 1000/㎠ 이상인 영역의 어레이이다. 마이크로어레이에서 영역은 예를 들면, 직경이 약 10-250 ㎛ 사이의 범위인 전형적인 크기를 가지며, 어레이내 다른 영역과 거의 동일한 간격을 두고 분리되어 있다.
상호교환적으로 사용되는 "생물학적 활성" 또는 "생체활성" 또는 "활성" 또는 "생물학적 작용"은 본원에서 폴리펩티드 (그의 본래의 형상이거나 또는 변성된 형상이거나)에 의해 또는 그의 임의의 하위서열에 의해 직접 또는 간접적으로 이행되는 효과기 또는 항원 작용을 의미한다. 생물학적 활성은 폴리펩티드에 대한 결합, 다른 단백질 또는 분자에 대한 결합, DNA 결합 단백질로서의 활성, 전사 조절 인자로서의 활성, 손상된 DNA에 결합할 수 있는 능력 등을 포함한다. 생체활성은 대상 폴리펩티드에 직접 영향을 미침으로써 조정될 수 있다. 별법으로, 생체활성은 폴리펩티드의 수준을 조정함으로써, 예를 들면, 상응하는 유전자의 발현을 조정함으로써 변경될 수 있다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "생물학적 샘플"은 유기체 또는 유기체의 성분 (예컨대, 세포)으로부터 수득된 샘플을 지칭한다. 샘플은 임의의 생물학적 조직 또는 생물학적 유체일 수 있다. 샘플은 환자로부터 유래된 샘플일 수 있다. 그러한 샘플로는 타액, 혈액, 혈액 세포 (예컨대, 백혈구), 조직 또는 생검 샘플 (예컨대, 종양 생검), 뇨, 복수, 및 흉수, 또는 그로부터 유래된 세포를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 생물학적 샘플은 또한 조직 절편, 예로서, 조직학적 목적을 위해 채취한 동결 절편도 포함할 수 있다.
용어 "바이오마커" 또는 "마커"는 광범위하게 세포내- 및 세포외 이벤트 뿐만 아니라, 전체-유기체의 생리학적 변화도 포함한다. 바이오마커는 본질적으로, 예를 들면, 제한하는 것은 아니지만, 신호 분자, 전사 인자, 대사물질, 유전자 전사체의 생산 수준 또는 생산율, 단백질의 번역후 변형과 같은 세포 작용의 임의의 측면을 나타낼 수 있다. 바이오마커는 전사체 수준의 전체 게놈 분석, 또는 단백질 수준 및/또는 변형의 전체 프로테옴 분석을 포함할 수 있다.
바이오마커는 또한 질환을 앓는 대상자의 화합물로 처리한 병적 세포에서, 처리하지 않는 병적 세포와 비교하여 상향- 또는 하향-조절된 유전자 또는 유전자 산물을 지칭할 수 있다. 즉, 유전자 또는 유전자 산물은 임의로 다른 유전자 또는 유전자 산물과 함께 소분자의 효능을 동정, 예측 또는 검출하기 위하여 사용될 수 있는 처리된 세포에 대하여 충분히 특이적이다. 따라서, 바이오마커는 병적 세포에서 화합물의 효능 또는 화합물 처리에 대한 상기 병적 세포의 반응을 특징으로 하는 유전자 또는 유전자 산물이다.
뉴클레오티드 서열은 두 서열의 각 염기가 매치된다면, 즉, 왓슨-크릭 염기쌍을 형성할 수 있다면, 이는 또다른 뉴클레오티드 서열에 "상보적"인 것이다. 본원에서 용어 "상보적 스트랜드"는 용어 "상보체"와 상호교환적으로 사용된다. 핵산 스트랜드의 상보체는 코딩 스트랜드의 상보체 또는 비-코딩 스트랜드의 상보체일 수 있다.
"유전자 검출제"는 유전자 또는 그와 관련된 다른 생물학적 분자, 예를 들면, 유전자로부터 전사된 RNA 또는 유전자에 의해 코딩되는 폴리펩티드를 특이적으로 검출하는데 사용될 수 있는 제제를 지칭한다. 예시적인 검출제는 유전자에 상응하는 핵산에 혼성화하는 핵산 프로브, 및 항체이다.
용어 "암"은 고형 종양, 예로서, 유방, 기도, 뇌, 생식 기관, 소화관, 요로, 눈, 간, 피부, 두경부, 갑상선, 부갑상선의 암 및 그의 원위 전이를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 용어는 또한 림프종, 육종, 및 백혈병을 포함한다.
유방암의 일례로는 침윤성 관 암종, 침윤성 소엽성 암종, 관상피내 암종, 및 소엽상피내 암종을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
기도암의 일례로는 소세포 폐 암종 및 비-소세포 폐 암종 뿐만 아니라, 기관지 선종 및 흉막폐장 모세포종을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
뇌암의 일례로는 뇌간 및 시상하부 신경아교종, 소뇌 및 대뇌 성상세포종, 수모세포종, 뇌실막세포종 뿐만 아니라, 신경외배엽 또는 송과체 종양을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
남성 생식 기관의 종양으로는 전립선암 및 고환암을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 여성 생식 기관의 종양으로는 자궁내막암, 자궁경부암, 난소암, 질암, 및 외음부암 뿐만 아니라, 자궁의 육종을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
소화관의 종양으로는 항문암, 결장암, 직장결장암, 식도암, 담낭암, 위암, 췌장암, 직장암, 소장암 및 타액선암을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
요로의 종양으로는 방광암, 음경암, 신장암, 신우암 (예컨대, 신 세포 암종), 요관암 및 요도암을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
안구암으로는 안내 흑색종 및 망막모세포종을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
간암의 예로는 간세포 암종 (섬유층판성 변형이 있거나 없는 간 세포 암종), 담관암종 (간내 쓸개관 암종) 및 혼합 간세포 담관암종을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
피부암으로는 편평세포 암종, 카포시 육종, 악성 흑색종, 메르켈 세포 피부암 및 비-흑색종 피부암을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
두경부암으로는 후두/하인두/비인두/구인두 암, 및 구순 및 구강 암을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
림프종으로는 AIDS-관련 림프종, 비-호지킨 림프종, 피부 T-세포 림프종, 호지킨병 및 중추신경계의 림프종을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
육종으로는 연조직의 육종, 골육종, 악성 섬유 조직구종, 림프육종 및 횡문근육종을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
백혈병으로는 급성 골수성 백혈병, 급성 림프모구성 백혈병, 만성 림프성 백혈병, 만성 골수성 백혈병 및 모발상세포 백혈병을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
"암의 병적 세포"는 암에 걸린 대상자에 존재하는 세포를 지칭한다. 즉, 정상 세포의 변형된 형태이고, 암에 걸리지 않은 대상자에는 존재하지 않는 세포, 또는 암에 걸리지 않은 대상자와 비교하여 암에 걸린 대상자에 현저히 더 많은 수로 또는 더 적은 수로 존재하는 세포이다.
"등가의"라는 용어는 작용상 등가인 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것으로 이해된다. 등가의 뉴클레오티드 서열은 예로서, 대립유전자 변이체와 같이 하나 이상의 뉴클레오티드의 치환, 부가, 또는 결실에 의해 상이한 서열을 포함할 수 있다.
본원에서 "유전자 발현 프로파일" 및 세포의 "핑거프린트"와 상호교환적으로 사용되는 용어 "발현 프로파일"은 세포에서 하나 이상의 유전자의 mRNA 수준을 나타내는 한 세트의 값을 지칭한다. 발현 프로파일은 바람직하게 약 10개 이상의 유전자, 바람직하게, 적어도 약 50, 100, 200개 이상의 유전자의 발현 수준을 나타내는 값을 포함한다. 발현 프로파일은 또한 다중 세포 및 조건에서 유사한 수준으로 발현되는 유전자 (예컨대, 하우스키핑 유전자 예로서, GAPDH)의 mRNA 수준을 포함할 수 있다. 예를 들면, 암의 병적 세포의 발현 프로파일은 병적 세포에서 10개 이상의 유전자의 mRNA 수준을 나타내는 한 세트의 값을 지칭한다.
용어 "유전자"는 폴리펩티드 또는 코딩 서열 및 전구체의 생산에 필요한 제어 서열을 포함하는 핵산 서열을 지칭한다. 폴리펩티드는 전장의 코딩 서열, 또는 상기 코딩 서열의 임의의 일부분에 의해 코딩될 수 있다. 유전자는 식물, 진균, 동물, 세균 게놈 또는 에피솜, 진핵성, 핵 또는 플라스미드 DNA, cDNA, 바이러스 DNA, 또는 화학적으로 합성된 DNA를 비롯한, 당업계에 공지된 임의의 공급원으로부터 전체적으로 또는 부분적으로 유래될 수 있다. 유전자는 발현 산물의 생물학적 활성 또는 화학적 구조, 발현율, 또는 발현 제어 방식에 영향을 줄 수 있는 코딩 영역 또는 비번역 영역내 하나 이상의 변형을 포함할 수 있다. 그러한 변형은 하나 이상의 뉴클레오티드의 돌연변이, 삽입, 결실, 및 치환을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 유전자는 연속하는 코딩 서열의 구성 요소가 될 수 있거나, 적절한 스플라이스 접합 부위에 의해 결합된 하나 이상의 인트론을 포함할 수 있다.
"혼성화"는 핵산 스트랜드가 염기쌍 짝짓기를 통해 상보적인 스트랜드와 결합하는 임의의 과정을 지칭한다. 예를 들면, 2개의 싱글-스트랜드 핵산이 더블-스트랜드 이중체를 형성할 때 "혼성화"한다. 더블-스트랜드 영역은 싱글-스트랜드 핵산중 하나 또는 둘 모두의 전장, 또는 하나의 싱글-스트랜드 핵산은 모두와 나머지 하나의 싱글-스트랜드 핵산은 하위서열을 포함할 수 있거나, 더블-스트랜드 영역은 각 핵산의 하위서열을 포함할 수 있다. 혼성화는 또한 만일 2개의 스트랜드가 여전히 더블-스트랜드 나선을 형성하고 있다면 특정의 미스매치를 포함하는 이중체 형성도 포함한다. "엄격한 혼성화 조건"은 본질적으로 특이적인 혼성화를 이루게 하는 혼성화 조건을 지칭한다.
핵산, 예로서, DNA 또는 RNA와 관련하여 본원에서 사용되는 "단리된"이라는 용어는 거대분자의 천연 공급원내 존재하는 각각의 다른 DNAs 또는 RNAs로부터 분리된 분자를 지칭한다. 본원에서 사용되는 바, "단리된"이라는 용어는 또한 세포 물질, 바이러스 물질, 재조합 DNA 기법에 의해 생산되었을 때 배양 배지, 또는 화학적으로 합성되었을 때 화학 전구체 또는 다른 화학 물질이 실질적으로 존재하지 않는 핵산 또는 펩티드를 지칭한다. 더욱이, "단리된 핵산"은 자연적으로는 단편으로서 발생되지 않고, 자연 상태하에서는 발견되지 않는 핵산 단편을 포함할 수 있다. "단리된"이라는 용어는 또한 다른 세포 단백질로부터 단리된 폴리펩티드를 지칭하기 위하여 사용되며, 이는 정제된 폴리펩티드 및 재조합 폴리펩티드, 둘 모두를 포함하는 것으로 한다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "표지" 및 "검출가능한 표지"는 방사성 동위 원소, 형광단, 화학발광 부분, 효소, 효소 기질, 효소 보조인자, 효소 저해제, 염료, 금속 이온, 리간드 (예컨대, 비오틴 또는 합텐) 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는 검출 가능한 분자를 지칭한다. 용어 "형광 물질"은 검출가능한 범위에서 형광을 나타낼 수 있는 물질 또는 그의 일부분을 지칭한다. 본 발명에 사용될 수 있는 표지의 특정 일례로는 플루오레세인, 로다민, 댄실, 움벨리페론, 텍사스 레드(Texas red), 루미놀, NADPH, 알파- 베타-갈락토시다제, 및 호스래디시퍼옥시다제를 포함한다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "발현 수준"은 소정 핵산의 측정가능한 발현 수준을 지칭한다. 핵산의 발현 수준은 당업계에 잘 알려져 있는 방법에 의해 측정된다. "차별적으로 발현된" 또는 "차별적 발현"이라는 용어는 소정 핵산의 측정가능한 발현 수준에서의 증가 또는 감소를 지칭한다. 본원에서 사용되는 바, "차별적으로 발현된" 또는 "차별적 발현"이라는 것은, 비교를 위해 사용되는 2개의 샘플에서 둘 모두는 동일한 정상 표준 샘플에 비교되는데, 2개의 샘플에서 핵산의 발현 수준이 적어도 1.4-배 이상 차이가 나는 것을 의미한다. 본 발명에 따라 "차별적으로 발현된" 또는 "차별적 발현"이라는 것은 또한 1.4-배 이상에서 2-배, 5-배, 10-배, 20-배, 50-배까지 차이가 나는 것을 의미한다. 2개의 샘플중 하나가 소정 핵산의 검출가능한 발현을 포함하지 않되, 단, 검출가능하게 발현된 핵산은 +/- 1.4배 이상으로 발현된다면, 핵산이 2개의 샘플에서 "차별적으로 발현된" 것이라고 한다. 비교를 위해 사용되는 2개 이상의 샘플에서 핵산의 발현 수준은 더 이상 1.4배 이상의 차이가 나지 않도록 변경됨으로써 핵산 서열의 차별적 발현은 "저해된다." 농도(들)를 아는 하나 이상의 제어 핵산 종을 포함하고, 제어 핵산의 양에 기초하여 표준 곡선을 작성하고, 표준 곡선과 관련하여 미지의 혼성화 강도로부터 "미지의" 핵산 종의 발현 수준을 외삽함으로써 핵산 발현 수준의 절대 정량화를 달성할 수 있다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "핵산"은 폴리뉴클레오티드, 예로서, 데옥시리보핵산 (DNA), 및 적절할 경우, 리보핵산 (RNA)을 지칭한다. 용어는 뉴클레오티드 유사체로부터 제조된 DNA 또는 DNA의 등가물, 유사체, 및 기술된 실시태양에 적용할 수 있는 것, 싱글-스트랜드 (센스 또는 안티센스) 및 더블-스트랜드 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 염색체, cDNA, mRNA, rRNA, 및 ESTs는 핵산으로서 지칭될 수 있는 분자의 대표적인 일례이다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "올리고뉴클레오티드"는 예를 들면, 약 10개 내지 약 1000개의 뉴클레오티드를 포함하는 핵산 분자를 지칭한다. 본원에서 사용하기 위한 올리고뉴클레오티드는 바람직하게 길이가 약 15개 내지 약 150개인 뉴클레오티드, 더욱 바람직하게 약 150개 내지 약 1000개인 것이다. 올리고뉴클레오티드는 자연발생적으로 발생된 올리고뉴클레오티드 또는 합성 올리고뉴클레오티드일 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 포스포라미다이트 방법에 의해 [Beaucage and Carruther, Tetrahedron Lett. 22:1859-62, 1981], 또는 트리에스테르 방법에 의해 [Matteucci, et al., J. Am. Chem. Soc. 103:3185, 1981], 또는 당업계에 공지된 다른 화학적 방법에 의해 제조될 수 있다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "환자" 또는 "대상자"는 포유동물 (예컨대, 인간 및 동물)을 포함한다.
본원에서 사용되는 바, 어레이에 부착된 핵산 또는 다른 분자는 "프로브" 또는 "포획 프로브"로서 지칭된다. 어레이가 하나의 유전자에 상응하는 수개의 프로브를 포함하는 경우, 이들 프로브는 "유전자-프로브 세트"로서 지칭된다. 유전자-프로브 세트는 예를 들면, 약 2개 내지 약 20개의 프로브, 바람직하게 약 2개 내지 약 10개의 프로브, 및 가장 바람직하게는 약 5개의 프로브로 구성될 수 있다.
세포의 생물학적 상태의 "프로파일"은 약물 처리에 대한 반응으로 변화하는 것으로서 알려진 세포의 다양한 구성 요소의 수준 및 세포의 생물학적 상태의 다른 교란을 지칭한다. 세포의 구성 요소로는 예를 들면, RNA 수준, 단백질 존재도 수준, 또는 단백질 활성 수준을 포함한다.
용어 "단백질"은 본원에서 용어 "펩티드" 및 "폴리펩티드"와 상호교환적으로 사용된다.
유사도가 공통된 특징, 예를 들면, 동일 세포 유형을 지시할 정도로 2개의 프로파일에서 유전자의 발현 수준이 충분히 유사할 때, 한 세포의 발현 프로파일은 또다른 세포에서의 발현 프로파일과 "유사하다." 따라서, 제1 세포에서 발현된 유전자중 75% 이상이 제1 세포와 비교하여 2배 이내의 수준으로 제2 세포에서 발현될 때 제1 세포 및 제2 세포의 발현 프로파일은 유사하다.
본원에서 사용되는 바, "소분자"는 분자량이 약 5 kD 미만, 및 가장 바람직하게는 약 4 kD 미만인 조성물을 지칭한다. 소분자는 핵산, 펩티드, 폴리펩티드, 펩티도유사작용제, 당질, 지질, 또는 다른 유기 또는 무기 분자를 일 수 있다. 다수의 제약 회사는 화학적 및/또는 생물학적 혼합물, 대개 진균, 세균 또는 조류 추출물의 광범위한 라이브러리를 소유하고 있으며, 이는 생체활성을 조정하는 화합물을 동정하는 본 발명의 임의의 검정법의 사용으로 스크리닝될 수 있다.
주형 핵산의 표적 부위에 대한 프로브의 "특이적인 혼성화"라는 용어는 지배적으로 표적에 대하여 혼성화되어 혼성화 신호가 명확하게 번역될 수 있는 프로브의 혼성화를 지칭한다. 본원에서 추가로 기술되는 바와 같이, 특이적인 혼성화를 이르게 하는 조건은 상동성 영역의 길이, 영역의 GC 함량, 및 하이브리드의 온도 ™에 따라 달라진다. 따라서, 혼성화 조건은 혼성화 용액 및 세척제의 염 함량, 산도, 및 온도에서 달라질 수 있다.
폴리펩티드의 "변이체"는 하나 이상의 아미노산 잔기가 변경된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 지칭한다. 변이체는 치환된 아미노산이 유사한 구조 또는 화학적 성질을 갖는 "보존적" 변화를 가질 수 있다 (예컨대, 류신을 이소류신으로 대체). 변이체는 또한 "비보존적" 변화를 가질 수 있다 (예컨대, 글리신을 트리토판으로 대체). 유사한 부수적인 변형은 아미노산 결실 또는 삽입, 또는 이들 둘 모두를 포함할 수 있다. 생물학적 또는 면역학적 활성을 소멸시키지 않으면서 어떤 아미노산 잔기를 치환, 삽입, 또는 결실시킬지 결정하는 것에 관한 가이던스는 당업계에 잘 알려져 있는 컴퓨터 프로그램, 예를 들면, LASERGENE 소프트웨어 (DNASTAR)를 사용하여 확인할 수 있다.
폴리뉴클레오티드 서열와 관련하여 사용될 때 용어 "변이체"는 특정 유전자의 서열 또는 그의 코딩 서열과 관련된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 이러한 정의는 또한 예를 들면, "대립유전자," "스플라이스," "종," 또는 "다형" 변이체도 포함할 수 있다. 스플라이스 변이체는 기준 분자와 유의적인 동일성을 가질 수 있지만, 일반적으로는 mRNA 프로세싱 동안 변경된 엑손 스플라이싱에 기인하여 더 많거나 더 적은 갯수의 폴리뉴클레오티드를 갖게 될 것이다. 상응하는 폴리펩티드는 추가의 작용성 도메인을 가질 수 있거나, 도메인이 존재하지 않을 수 있다. 종 변이체는 종마다 다른 폴리뉴클레오티드 서열이다. 생성된 폴리펩티드는 일반적으로 서로 비교하여 유의적인 아미노산 동일성을 가질 것이다. 다형 변이체는 소정 종의 개체들 간에 특정 유전자의 폴리뉴클레오티드 서열에서의 변형이다. 다형 변이체는 또한 폴리뉴클레오티드 서열에서 하나의 염기가 상이한 "단일 염기 다형성" (SNPs)를 포함할 수 있다. SNPs의 존재는 예를 들면, 특정 집단, 질환 상태, 또는 질환 상태에 대한 성향을 지시할 수 있다.
본 발명의 측면은 비정상적인 증식을 특징으로 하는 세포의 분화와 증식을 조정할 수 있는 제제를 동정하는 것에 관한 것이다. 본 발명은 핵산 서열의 차별적 발현을 조절할 수 있는 능력에 대하여 후보 화합물 또는 물질을 스크리닝하는 방법에 관한 것이다. 즉, 핵산 서열이 암 세포에서 과다 발현된 경우, 후보 화합물은 발현을 감소시킬 수 있는 그의 능력에 대하여 스크리닝되고, 핵산 서열이 암 세포에서 과소 발현된 경우, 시험 화합물은 발현을 증가시킬 수 있는 그의 능력에 대하여 스크리닝된다. 추가로, 본 발명은 본원에 기술된 차별적으로 발현된 서열에 의해 코딩된 하나 이상의 폴리펩티드의 활성을 조정하는 시험 화합물 또는 물질을 동정하기 위한 스크리닝 검정법에 관한 것이다. 이와 관련하여, 본 발명은 마커 핵산의 발현을 조정하고/거나, 코딩된 폴리펩티드 생체활성을 변경시키는 화합물을 결정하는 검정법을 제공한다.
차별적 발현의 조정을 위한 스크리닝
약물 스크리닝은 시험 화합물 (예컨대, 소라페니브 및 그의 디아릴 우레아 유도체)을 세포의 샘플에 가하고, 그 효과를 모니터함으로써 실시된다. 시험 화합물을 받지 않은 비교 샘플 또한 대조군으로서 모니터한다. 이어서, 처리된 세포와 비처리된 세포를 현미경 분석, 생육성 시험, 복제능, 조직학적 검사, 세포와 관련된 특정 RNA 또는 폴리펩티드의 수준, 세포 또는 세포 용해물에 의해 발현되는 효소 활성 수준, 및 다른 세포 또는 화합물과 상호작용할 수 있는 세포의 능력을 포함하나, 이에 한정되지 않는 임의의 적합한 표현형 기준에 의해 비교한다. 처리된 세포와 비처리된 세포 사이의 차이는 시험 화합물에 기인한 효과를 지시한다.
바람직한 시험 화합물의 효과로는 암-관련 마커 핵산 서열에 의해 부여받은 임의의 표현형에 미치는 효과를 포함한다. 일례로는 mRNA의 과잉을 제한하거나, 코딩된 단백질의 생산을 제한하거나, 단백질의 작용 효과를 제한하는 시험 화합물을 포함한다. 시험 화합물의 효과는 처리된 세포와 비처리된 세포 사이의 결과를 비교할 때 분명해질 것이다.
따라서, 본 발명은 제제가 mRNA의 생산을 저해할 수 있는지 또는 증진시킬 수 있는지를 측정하기 위하여 제제에 마커 핵산 mRNA (예컨대, VEGF 또는 VEGFR-2)가 배양된 세포에서 검출가능해지는 세포 또는 조직을 노출시키고; 노출된 세포 또는 조직에서 mRNA의 수준을 측정하는 것을 포함하되, 여기에서, 세포주가 제제에 노출된 이후에 mRNA 수준이 감소된 것은 마커 핵산 mRNA 생산의 저해를 지시하고, mRNA 수준이 증가된 것은 마커 mRNA 생산의 증진을 지시하는 것인, 시험관내에서 핵산 마커의 발현을 저해하거나 증진시키는 제제 (예컨대, 소라페니브 및 그의 디아릴 우레아 유도체)를 스크리닝하는 방법을 포함한다.
별법으로, 스크리닝 방법은 마커 단백질의 생산을 저해 또는 증진시킬 수 있는 것으로 의심되는 제제에 대하여 마커 단백질이 배양된 세포에서 검출가능해지는 세포 또는 조직을 시험관내 스크리닝을 하고; 세포 또는 조직에서 마커 단백질의 수준을 측정하는 것을 포함할 수 있되, 여기에서, 세포 또는 조직이 제제에 노출된 이후에 마커 단백질 수준이 감소된 것은 마커 단백질 생산의 저해를 지시하고, 마커 단백질 수준이 증가된 것은 마커 단백질 생산의 증진을 지시하는 것이다.
본 발명은 또한 마커 mRNA 또는 단백질의 생산을 저해 또는 증진시킬 수 있는 것으로 의심되는 제제에 대하여 마커 mRNA 또는 단백질이 검출가능한 종양 세포를 갖는 대상자를 노출시키고; 노출된 포유동물의 종양 세포에서 마커 mRNA 또는 단백질의 수준을 측정하는 것을 포함하는, 마커 핵산의 발현을 저해하거나 증진시키는 제제를 스크리닝하는 생체내 방법을 포함한다. 대상자를 제제에 노출시킨 이후에 마커 mRNA 또는 단백질 수준이 감소된 것은 마커 핵산 발현의 저해를 지시하고, 마커 mRNA 또는 단백질 수준이 증가된 것은 마커 핵산 발현의 증진을 지시하는 것이다.
따라서, 본 발명은 마커 핵산을 발현시키는 세포를 시험 화합물과 함께 인큐베이션시키고, mRNA 또는 단백질 수준을 측정하는 것을 포함하는 방법을 제공한다. 본 발명은 추가로 세포 집단에서 마커 핵산의 발현 수준을 정량적으로 측정하는 방법, 및 제제가 세포 집단에서 마커 핵산의 발현 수준을 증가시킬 수 있는지 여부 또는 감소시킬 수 있는지 여부를 측정하는 방법을 제공한다. 제제가 세포 집단에서 마커 핵산의 발현 수준을 증가시킬 수 있는지 여부 또는 감소시킬 수 있는지 여부를 측정하는 방법은 (a) 대조군 및 제제-처리된 세포 집단으로부터 세포 추출물을 제조하는 단계, (b) 세포 추출물로부터 마커 폴리펩티드를 단리시키는 단계, 및 (c) 마커 폴리펩티드와, 상기 폴리펩티드에 대하여 특이적인 항체 사이에 형성된 면역복합체의 양을 정량화하는 (예컨대, 동시에) 단계를 포함한다. 본 발명의 마커 폴리펩티드는 또한 그의 생체활성을 검정함으로써 정량화될 수 있다. 마커 핵산 발현의 증가를 유도하는 제제는 대조군 세포에서 형성된 면역복합체의 양과 비교하여 처리된 세포에서 형성된 면역복합체의 양을 증가시킬 수 있는 능력에 의해 동정될 수 있다. 유사한 방식으로, 마커 핵산의 발현을 감소시키는 제제는 대조군 세포와 비교하여 처리된 세포 추출물에서 형성된 면역복합체의 양을 감소시킬 수 있는 그의 능력에 의해 동정될 수 있다.
본 발명은 암에서 차별적으로 조절되는 단리된 핵산 서열, 및 그러한 서열을 동정하는 방법을 제공한다. 본 발명은 대상자로부터 수득한 RNA에 상응하는 핵산 샘플을, 신원을 알고 있는 하나 이상의 핵산 분자를 포함하는 핵산 샘플에 혼성화하고; 신원을 알고 있는 하나 이상의 핵산 분자에 대한 핵산 샘플의 혼성화를 측정하는 것을 포함하되, 여기에서, 신원을 알고 있는 하나 이상의 핵산 분자에 대한 핵산 샘플의 혼성화가 암에 걸리지 않은 대상자로부터 수득한 핵산 샘플과 비교하여 2-배의 차이가 나는 것이 암에 걸린 대상자에서 뉴클레오티드 서열의 차별적 발현을 지시하는 것인, 암에 걸린 대상자에서 차별적으로 조절되는 뉴클레오티드 서열을 동정하는 방법을 제공한다.
일반적으로, 본 발명은 대상자로부터 메신저 RNA를 단리시키고, mRNA 샘플로부터 cRNA를 생성하고, 어레이상의 별개 위치에 안정적으로 결합된 복수개의 핵산 분자를 포함하는 마이크로어레이에 cRNA를 혼성화하고, 어레이에 대한 cRNA의 혼성화 패턴을 동정하는 것을 포함하는, 암에 걸린 대상자에서 차별적으로 조절되는 핵산 서열을 동정하는 방법을 제공한다. 본 발명에 따라, 어레이상의 소정의 위치에 혼성화한 핵산 분자는 혼성화 신호가 암에 걸리지 않은 대상자로부터 수득한 핵산 샘플과 혼성화된 동일 어레이상의 동일한 위치에서의 혼성화 신호보다 2-배 이상 더 높거나 더 낮을 경우, 이는 차별적으로 조절되었다고 한다.
유전자의 발현 수준을 측정하는
마이크로어레이
마이크로어레이를 사용하여 유전자 발현 수준을 측정할 수 있다. 일반적으로, (a) 대상자로부터 mRNA 샘플을 수득하고, 그로부터 표지된 핵산 ("표적 핵산" 또는 "표적")을 제조하는 단계; (b) 표적 핵산이 어레이상의 상응하는 프로브에 결합하기에 충분한 조건하에서 표적 핵산을 어레이와 접촉시키는 단계; (c) 어레이로부터 비결합 표적을 임의로 제거하는 단계; (d) 결합된 표적을 검출하는 단계; 및 (e) 예를 들면, 컴퓨터 기초 분석 방법을 사용하여 결과를 분석하는 단계를 포함할 수 있다. 본원에서 사용되는 바, "핵산 프로브" 또는 "프로브"는 어레이에 부착된 핵산인 반면, "표적 핵산"은 어레이에 혼성화되는 핵산이다.
핵산 검체는 "침윤성" 또는 "비-침윤성" 샘플링 수단을 사용하여 시험하고자 하는 대상자로부터 수득될 수 있다. 샘플링 수단은 동물 (뮤린, 인간, 양, 말, 소, 돼지, 개, 또는 고양이과 동물)의 피부 또는 기관 안쪽에서 핵산을 수집하는 것을 포함한다면, 이는 "침윤성"이라고 한다. 침윤성 방법의 일례로는 예를 들면, 혈액 채취, 정액 수집, 경침 생검법, 흉막 흡인, 제대 생검법을 포함한다. 그러한 일례는 김(Kim) 등[J. Virol. 66:3879-3882, 1992]; 비스와(Biswa) 등 [Ann. NY Acad. Sci. 590:582-583, 1990]; 및 비스와 등 [J. Clin. Microbiol. 29:2228-2233, 1991]에 의해 논의된 바 있다.
대조적으로, "비-침윤성" 샘플링 수단은 핵산 분자를 동물의 내부 또는 외부 표면으로부터 회수하는 것이다. 그러한 "비-침윤성 샘플링 수단의 일례로는 예를 들면, "면봉 채취법," 눈물, 타액, 뇨, 분변 물질, 땀(sweat) 또는 땀(perspiration), 모발 채취를 포함한다.
본 발명의 하나의 실시태양에서, 시험하고자 하는 대상자로부터 하나 이상의 세포를 수득하고, RNA를 세포로부터 단리시킨다. 바람직한 실시태양에서, 말초 혈액 백혈구 (PBLs) 세포의 샘플을 대상자로부터 수득한다. 대상자로부터 세포 샘플을 수득한 후, 원하는 세포 유형에 대하여 샘플을 농축시키는 것도 가능하다. 예를 들면, 원하는 세포 유형의 세포 표면상의 에피토프에 결합하는 항체로 단리시키는 것을 포함하는 다양한 기법을 사용하여 세포를 다른 세포로부터 단리시킬 수 있다. 원하는 세포가 고형 조직내 존재하는 경우, 특정 세포는 예를 들면, 미세절제에 의해 또는 레이저 미세절제 기법 (LCM)에 의해 절제될 수 있다 (예컨대, [Bonner, et al., Science 278:1481 , 1997]; [Emmert-Buck, et al., Science 274:998, 1996]; [Fend, et al., Am. J. Path. 154:61 , 1999]; 및 [Murakami, et al., Kidney Int. 58:1346, 2000]을 참조할 수 있다).
RNA는 예를 들면, 구아니디움 티오시아네이트 용해에 이어 CsCl 원심분리하는 다양한 방법에 의해 조직 또는 세포 샘플로부터 추출될 수 있다 [Chirgwin, et al., Biochemistry 18:5294-5299, 1979]. 단일 세포로부터의 RNA는 단일 세포로부터 cDNA 라이브러리를 제조하는 방법에 기술되어 있는 바와 같이 수득될 수 있다 (예컨대, [Dulac, Curr. Top. Dev. Biol. 36:245, 1998]; [Jena, et al., J. Immunol. Methods 190:199, 1996]을 참조할 수 있다).
RNA 샘플은 특정 종에 대하여 추가로 농축될 수 있다. 하나의 실시태양에서, 예를 들면, 폴리(A)+ RNA는 RNA 샘플로부터 단리될 수 있다. 또다른 실시태양에서, RNA 집단은 프라이머-특이 cDNA 합성, 또는 다회전 선형 증폭 기초의 cDNA 합성 및 주형-지정 시험관내 전사에 의해 관심의 대상이 되는 서열에 대하여 농축될 수 있다 (예컨대, [Wang, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:9717, 1989]; [Dulac, et al., 상기 동일]; [Jena, et al., 상기 동일]을 참조할 수 있다). 추가로, 특정 종 또는 서열에 대하여 농축되거나 또는 농축되지 않는 RNA 집단은 추가로 예를 들면, PCR; 리가제 연쇄 반응 (LCR) (예컨대, [Wu and Wallace, Genomics 4:560, 1989]; [Landegren, et al., Science 241:1077, 1988]을 참조할 수 있다); 자립 서열 복제 (SSR) (예컨대, [Guatelli, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874, 1990]을 참조할 수 있다); 핵산 기초 서열 증폭 (NASBA) 및 전사 증폭 (예컨대, [Kwoh, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173, 1989]를 참조할 수 있다)을 비롯한 다양한 증폭 방법에 의해 증폭될 수 있다. PCR 기술 방법은 당업계에 잘 알려져 있다 (예컨대, [PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification (ed. H. A. Erlich, Freeman Pres, N.Y., N.Y., 1992)]; [PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (eds. Inni, et al., Academic Pres, San Diego, Calif., 1990)]; [Mattila, et al., Nucleic aicds Res. 19:4967, 1991]; [Eckert, et al., PCR Methods and Applications 1 :17, 1991]; [PCR (eds. McPherson et al., IRL Pres, Oxford)]; 및 미국 특허 번호 제4,683,202호를 참조할 수 있다). 증폭 방법은 예를 들면, (오야마(Ohyama) 등 [BioTechniques 29:530, 2000]; 루오(Luo) 등 [Nat. Med. 5:117, 1999]; 헤지(Hegde) 등 [BioTechniques 29:548, 2000]; 카차르미나(Kacharmina) 등 [Meth. Enzymol. 303:3, 1999]; 리버세이(Livesey) 등 [Curr. Biol. 10:301, 2000]; 스피린(Spirin) 등 [Invest. Ophtalmol. Vis. Sci. 40:3108, 1999]; 및 사카이(Sakai) 등 [Anal. Biochem. 287:32, 2000])에 의해 기재되어 있다. RNA 증폭 및 cDNA 합성은 또한 계내 세포에서 수행될 수 있다 (예컨대, [Eberwine, et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:3010, 1992]를 참조할 수 있다).
핵산 분자는 핵산 분자의 마이크로어레이에 대한 혼성화를 검출할 수 있도록 표지화될 수 있다. 즉, 프로브는 신호 생성 시스템의 구성원을 포함할 수 있고, 따라서, 직접적으로, 또는 신호 생성 시스템의 하나의 이상의 추가적인 구성원과의 조합 작용을 통해 검출가능하다. 예를 들면, 핵산은 형광적으로 표지된 dNTP (예컨대, [Kricka, 1992, Nonisotopic DNA Probe Technique, Academic Press San Diego, Calif.]를 참조할 수 있다), 표지된 스트렙트아비딘의 첨가로 이어지는 비오틴화된 dNTPs 또는 rNTP, 화학발광 표지, 또는 동위 원소로 표지될 수 있다. 표지의 또다른 일례로는 티아기(Tyagi) 및 크레머(Kramer) [Nature Biotech. 14:303, 1996]에 의해 기재된 "분자 비콘"을 포함한다. 혼성화는 또한 예를 들면, 플라즈몬 공명 (예컨대, [Thiel, et al. Anal. Chem. 69:4948, 1997])에 의해 측정될 수 있다.
하나의 실시태양에서, 복수개 (예컨대, 2, 3, 4, 5개 이상)의 표적 핵산 세트가 표지되고, 하나의 혼성화 반응에 사용된다 ("다중" 분석). 예를 들면, 한 세트의 핵산은 하나의 세포로부터의 RNA에 상응할 수 있고, 또다른 핵산 세트는 또다른 세포로부터의 RNA에 상응할 수 있다. 복수개의 핵산 세트는 별개의 발광 스펙트럼을 가짐으로써 식별될 수 있는 상이한 형광 표지 (예컨대, 플루오레세인 및 로다민)와 같은 상이한 표지로 표지화될 수 있다. 이어서, 상기 세트를 혼합하고, 하나의 마이크로어레이에 동시에 혼성화시킬 수 있다 (예컨대, [Shena, et al., Science 270:467-470, 1995]를 참조할 수 있다).
본 발명에 따라 사용되는 마이크로어레이는 소분자 효능을 특징으로 하는 유전자의 하나 이상의 프로프를 포함한다. 바람직한 실시태양에서, 마이크로어레이는 암에서 상향-조절되는 유전자, 및 암에서 하향-조절되는 유전자로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자에 상응하는 프로브를 포함한다. 마이크로어레이는 소분자 효능을 특징으로 하는 10개 이상, 바람직하게, 20개 이상, 50개 이상, 100개 이상, 또는 1000개 이상의 유전자에 상응하는 프로브를 포함할 수 있다.
마이크로어레이상의 각 유전자에 상응하는 프로브는 1개 또는 1개 초과로 존재할 수 있다. 예를 들면, 마이크로어레이는 하나의 유전자에 상응하는 2개 내지 20개의 프로브를 함유할 수 있고, 바람직하게는 약 5개 내지 10개를 함유할 수 있다. 프로브는 소분자 효능을 특징으로 하는 유전자의 전장의 RNA 서열 또는 그의 상보체에 상응할 수 있거나, 프로브는 특이적인 혼성화를 허용할 수 있기에 충분한 길이를 갖는 그의 일부분에 상응할 수 있다. 그러한 프로브는 약 50개의 뉴클레오티드 내지 약 100개, 200개, 500개, 또는 1000개의 뉴클레오티드 또는 1000개 초과의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 본원에 추가로 기술되는 바와 같이, 마이크로어레이는 약 10개 내지 50개의 뉴클레오티드, 바람직하게 약 15개 내지 30개의 뉴클레오티드, 및 더욱 바람직하게 약 20-25개의 뉴클레오티드로 구성된 올리고뉴클레오티드 프로브를 함유할 수 있다. 프로브는 바람직하게 싱글-스트랜드이고, 원하는 수준의 서열 특이적인 혼성화를 제공할 수 있도록 그의 표적에 대한 충분한 상보성을 가질 것이다.
전형적으로, 본 발명에 사용되는 어레이는 1 ㎠당 100개 초과의 상이한 프로브를 갖는 부위 밀도를 가질 것이다. 바람직하게, 어레이는 500/㎠ 초과, 더욱 바람직하게 약 1000/㎠ 초과, 및 가장 바람직하게 약 10,000/㎠ 초과의 부위 밀도를 가질 것이다. 바람직하게, 어레이는 단일 기판상에 100개 초과의 상이한 프로브를 가질 것이며, 단일 기판상에 더욱 바람직하게 1,000개 초과의 상이한 프로브, 더욱더 바람직하게 10,000개 초과의 상이한 프로브, 및 가장 바람직하게, 100,000개 초과의 상이한 프로브를 가질 것이다.
다수의 상이한 마이크로어레이 형상 및 그의 생산 방법은 당업자에게 공지되어 있고, 이는 (미국 특허 번호 제5,242,974호; 제5,384,261호; 제5,405,783호; 제5,412,087호; 제5,424,186호; 제5,429,807호; 제5,436,327호; 제5,445,934호; 제5,556,752호; 제5,405,783호; 제5,412,087호; 제5,424,186호; 제5,429,807호; 제5,436,327호; 제5,472,672호; 제5,527,681호; 제5,529,756호; 제5,545,531호; 제5,554,501호; 제5,561 ,071호; 제5,571 ,639호; 제5,593,839호; 제5,624,711호; 제5,700,637호; 제5,744,305호; 제5,770,456호; 제5,770,722호; 제5,837,832호; 제5,856,101호; 제5,874,219호; 제5,885,837호; 제5,919,523호; 제6,022,963호; 제6,077,674호; 및 제6,156,501호; [Shena, et al., Tibtech 16:301, 1998]; [Duggan, et al., Nat. Genet. 21 :10,. 1999]; [Bowtell, et al., Nat. Genet. 21 :25, 1999]; [Lipshutz, et al., 21 Nature Genet. 20-24, 1999]; [Blanchard, et al., 11 Biosensors and Bioelectronic, 687-90, 1996]; [Masko, et al., 21 Nucleic acids Res. 4663-69, 1993]; [Hughe, et al., Nat. Biotechol. (2001) 19:342] (그의 개시 내용은 본원에서 참고로 인용된다))에 개시되어 있다. 다양하게 적용하여 어레이를 사용하는 방법을 기재하고 있는 특허로는 미국 특허 번호 제 5,143,854호; 제5,288,644호; 제5,324,633호; 제5,432,049호; 제5,470,710호; 제5,492,806호; 제5,503,980호; 제5,510,270호; 제5,525,464호; 제5,547,839호; 제5,580,732호; 제5,661 ,028호; 제5,848,659호; 및 제5,874,219호 (그의 개시 내용은 본원에서 참고로 인용된다))를 포함한다.
어레이는 바람직하게 대조군 및 기준 핵산을 포함한다. 대조군 핵산은 예를 들면, 원핵생물 유전자, 예로서, bioB, bioC 및 bioD, P1 박테리오파지로부터의 ere 또는 폴리A 제어, 예로서, dap, lys, phe, thr, 및 trp을 포함한다. 기준 핵산을 통해 하나의 실험으로부터 얻은 결과를 또다른 것으로 표준화할 수 있고, 정량적 수준으로 다중 실험을 비교할 수 있다. 예시적인 기준 핵산으로는 발현 수준이 알려져 있는 하우스키핑 유전자, 예를 들면, GAPDH, 헥소키나아제, 및 액틴을 포함한다.
하나의 실시태양에서, 올리고뉴클레오티드 어레이는 고체 지지체상에서 합성될 수 있다. 예시적인 고체 지지체로는 유리, 플라스틱, 중합체, 금속, 준금속, 세라믹, 유기물 등을 포함한다. 칩 차폐 기술 및 광보호성 화학물질을 사용함으로써 정렬된 핵산 프로브 어레이를 생성할 수 있다. 예를 들면, "DNA 칩" 또는 매우 대규모의 고정된 중합체 어레이 ("VLSIPS™" 어레이)와 같이 공지된 이러한 어레이는 면적이 약 1 ㎠ 내지 수 ㎠인 기판상의 규정된 프로브 영역을 수백만개 포함함으로써 수개 내지 수백만개의 프로브를 혼입시킬 수 있다 (예컨대, 미국 특허 번호 제5,631,734호를 참조할 수 있다).
발현 수준을 비교하기 위하여 표적 핵산과 어레이 상의 프로브 사이에 결합이 이루어지기에 충분한 조건하에서 표지된 핵산을 어레이에 접촉시킬 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 혼성화 조건은 원하는 수준의 혼성화 특이성을 제공하기 위하여 선택될 수 있고; 즉, 이는 표지된 핵산과 마이크로어레이상의 프로브 사이에 혼성화가 일어나기에 충분한 조건이다.
혼성화는 본질적으로 특이적인 혼성화를 허용하는 조건하에서 수행될 수 있다. 핵산 길이와 GC 함량이 열적 융점을 결정할 것이며, 따라서, 표적 핵산에 대한 프로브의 특이적인 혼성화를 이루기 위해 필요한 혼성화 조건을 결정하게 될 것이다. 이러한 인자는 당업자에게 잘 알려져 있고, 검정법에서 시험될 수도 있다. 핵산 혼성화에 대한 다량의 가이드는 [Tijssen, et al. (Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Vol. 24: Hybrization With Nucleic Acid Probe, P. Tijssen, ed. Elsevier, N.Y., (1993)]에서 찾아볼 수 있다.
상기 기술된 방법을 통해 어레이 표면상에서 표지된 표적 핵산의 혼성화 패턴을 생산할 수 있다. 생성된 표지된 핵산의 혼성화 패턴은 표적 핵산의 특정 표지에 기초하여 선택되는 특정 검출 방식을 사용하여 다양한 방법으로 가시화되거나 검출될 수 있다. 대표적인 검출 수단으로는 섬광 계수, 자가방사기록법, 형광 측정, 비색 측정, 광 발광 측정, 광 산란 등을 포함한다.
그러한 검출 방법은 상업적으로 구입가능한 어레이 스캐너 (캘리포니아주 산타클라라에 소재하는 미국 애피메트릭스(Affymetrix)), 예를 들면, 417™ 어레이어(417™ Arrayer), 418™ 어레이 스캐너(418™ Array Scanner), 또는 애질런트 유전자어레이™ 스캐너(Agilent GeneArray™ Scanner)를 사용한다. 이러한 스캐너는 인터페이스와 사용이 편리한 소프트웨어 툴로 시스템 컴퓨터로부터 제어된다. 다양한 소프트웨어 응용에 의해 출력값은 직접 입력될 수 있거나, 직접 판독될 수 있다. 바람직한 스캔 장치는 예를 들면, 미국 특허 번호 제5,143,854호 및 제5,424,186호에 기재되어 있다.
형광 표지된 프로브의 경우, 전사체 어레이 각 부위의 형광 발광은 바람직하게 공초점 레이저 현미경을 스캐닝함으로써 검출될 수 있다. 별법으로, 2개의 형광단에 특이적인 파장에서 검체가 동시에 조사할 수 있도록 하는 레이저가 사용될 수 있고, 상기 2개의 형광단으로부터의 발광은 동시에 분석될 수 있다 (예컨대, [Shalon, et al., Genome Res. 6:639-645, 1996]을 참조할 수 있다). 바람직한 실시태양에서, 어레이는 컴퓨터 제어식 X-Y 스테이지와 현미경 대물 렌즈를 포함하는 레이저 형광 스캐너로 스캐닝될 수 있다. 형광 레이저 스캐닝 장치는 [Shalon, et al, 상기 동일]에 기재되어 있다.
유전자 발현 데이타, 예를 들면, 실시하는 비교 유형의 분석을 위해 다양한 알고리즘이 사용될 수 있다. 특정 실시태양에서, 공-조절되는 유전자를 분류하는 것이 바람직할 수 있다. 이를 통해 다수의 프로파일을 비교할 수 있다. 그러한 유전자 군을 동정하는데 바람직한 실시태양은 클러스터링 알고리즘을 포함한다 (클러스터링 알고리즘에 대한 리뷰를 위해서는 예컨대, [Fukunaga, 1990, Statistical Pattern Recognition, 2nd Ed., Academic Press, San Diego]; [Everitt, 1974, Cluster Analysis, London: Heinemann Educ. Books]; [Hartigan, 1975, Clustering Algorithms, New York: Wiley]; [Sneath and Sokal, 1973, Numerical Taxonomy, Freeman]; [Anderberg, 1973, Cluster Analysis for Applications, Academic Press: New York]를 참조할 수 있다).
바이오마커
발견
발현 패턴은 환자에서 약물 처리의 효능을 예측하는데 사용될 수 있는 바이오마커 패널을 유도하는데 사용될 수 있다. 바이오마커는 생물학적 샘플로부터 단리된 RNA, 종양 생검의 동결 샘플로부터 단리된 RNA상에서의 마이크로어레이 실험으로부터 얻은 유전자 발현 수준, 또는 혈청내 질량 분석법-유도 단백질 질량으로 구성될 수 있다.
데이타 분석에 대한 정확한 기전은 데이타의 정확한 성질에 따라 달라지지만, 바이오마커 패널을 개발하는 전형적인 방법은 하기와 같다. 처리전 각 환자에 대한 데이타 (유전자 발현 수준 또는 질량 스펙트럼)를 수집한다. 연구가 진행됨에 따라 환자를 약물 처리에 대한 그의 반응에 따라 효능이 있는 것 또는 효능이 없는 것으로 분류한다. 데이타 모델에서 다수의 효능 수준이 수용될 수 있지만, 특히 환자 집단이 수백명 미만일 경우 2원 비교가 최적인 것으로 생각된다. 각 부류에서 적절한 환자수를 가정하여 당업계에 공지된 다수의 기법에 의해 단백질 및/또는 유전자 발현 데이타를 분석할 수 있다. 다수의 기법은 종래의 통계 뿐만 아니라, 기계 학습 분야로부터 유도된 것이다. 이러한 기법은 2가지를 목표로 한다:
1. 데이타 차원 축소 - 질량 스펙트럼 또는 유전자 발현 마이크로어레이의 경우, 데이타를 수천개의 개개 데이타점으로부터 약 3개 내지 10개로 축소한다. 이러한 축소는 한 세트로 취했을 때의 데이타점의 예측력에 기초한다.
2. 훈련 - 이어서, 이들 3개 내지 10개의 데이타점을 사용하여 다중 기계 학습 알고리즘을 훈련하여, 이러한 경우 효능이 없는 것으로부터 효능이 있는 약물 처리를 식별하는 단백질 질량 또는 유전자 발현 패턴을 인식할 수 있도록 "학습"한다. 모든 환자 샘플을 사용하여 알고리즘을 훈련할 수 있다.
이어서, 그의 예측력을 측정하기 위하여 생성된 훈련 알고리즘을 시험한다. 전형적으로, 100개 미만의 훈련 예가 이용될 수 있는 경우, 몇몇 형태의 교차-검증이 실시된다. 설명하기 위하여 10배의 교차 검증을 주시한다. 이러한 경우, 환자 샘플을 10개의 빈중 하나에 무작위적으로 지정한다. 1회차 검증에서 9개의 빈에 있는 샘플은 훈련에 사용하고, 남은 샘플은 10번째 빈에 사용하여 알고리즘을 시험한다. 이를 추가로 9번 반복하고, 매번 시험용의 다른 빈에 있는 샘플을 소거한다. 10회차 모두로부터 얻은 결과 (정확한 예측 및 오류)를 조합한 후, 예측력을 평가한다. 상이한 알고리즘 뿐만 아니라 상이한 패널을 이러한 연구에서 상기와 같은 방식으로 비교될 수 있다. 이어서, "최상"의 알고리즘/패널 조합을 선택한다. 처리에 대하여 반응할 수 있는 환자를 선택하는 추후 연구에서 이러한 "스마트" 알고리즘을 사용할 수 있다.
다수의 알고리즘은 환자에 대해 얻은 추가 정보로부터 이익을 얻는다. 예를 들면, 성별 또는 연령을 사용하여 예측력을 개선시킬 수 있다. 또한, 데이타 전환, 예로서 정상화 및 평활화(smoothing)를 사용하여 잡음을 축소시킬 수 있다. 이러한 이유에서 결과를 최적화하기 위하여 다수의 상이한 파라미터를 사용함으로써 다수의 알고리즘 훈련이 이루어질 수 있다. 예측 패턴이 데이타에 존재할 경우, 최적의, 또는 근사 최적의, "스마트" 알고리즘이 개발될 수 있다. 더 많은 환자 샘플이 이용가능한 경우, 알고리즘은 새로운 데이타를 이용하기 위해 재훈련될 수 있다.
질량 분석법을 사용하는 일례로서, 혈장 (1 ㎕)을 소수성 SELDI-표적에 가하고, 물에서 철저히 세척하고, SELDI-Tof 질량 분석계에 의해 분석하였다. 이를 100개 이상의 환자 샘플에서 반복할 수 있다. 약물 효능의 전조되는 비 m/z 값 세트를 동정하기 위하여 각 샘플에서 몇몇 16,000 m/z 값 강도로부터 얻은 단백질 프로파일을 통계학적으로 분석할 것이다. 다른 SELDI-표적, 예로서, 이온-교환 또는 IMAC 표면을 사용하는 동일한 실험 또한 수행될 수 있다. 이는 혈장내 존재하는 단백질의 상이한 하위세트를 포획할 것이다. 추가로, 혈장은 SELDI 표적에 가해지기 앞서 변성될 수 있고, 미리분획화될 수 있다.
진단학적 &
예후적
검정법
본 발명은 바이오마커 (예컨대, VEGF 또는 VEGFR, 예로서, VEGFR-2), 즉, 암에 관한 핵산 및/또는 폴리펩티드 마커를 검출함으로써 대상자가, 원치않는 세포 증식을 특징으로 하는 질환 또는 용태가 발병될 위험에 놓여 있는지를 측정하는 방법을 제공한다.
임상 적용에서, 인간 조직 샘플은 본원에서 동정된 바이오마커의 존재 및/또는 부재에 대하여 스크리닝될 수 있다. 그러한 샘플은 경침 생검 중심, 외과적 절제술 샘플, 림프절 조직, 또는 혈청으로 구성될 수 있다. 예를 들면, 이러한 방법은 생검을 수득하고, 임의로 동결 절편을 제작함으로써 분획화하여 종양 세포를 전체 세포 집단의 약 80% 까지 농축시키는 것을 포함한다. 특정 실시태양에서, 이들 샘플로부터 추출된 핵산을 당업계에 잘 알려져 있는 기법을 사용하여 증폭시킬 수 있다. 선택된 마커의 검출 수준은 통계학적으로 유효한, 전이성, 비-전이성 악성, 양성, 또는 정상 조직 샘플 군과 비교될 것이다.
하나의 실시태양에서, 진단학적 방법은 예로서, 노던 블롯 분석, 역 전사-중합효소 연쇄 반응 (RT-PCR), 계내 혼성화, 면역침전, 웨스턴 블롯 혼성화, 또는 면역조직화학에 의해 대상자가 바이오마커 (예컨대, VEGF 또는 VEGFR, 예로서, VEGFR-2와, 그의 가용성 형태 포함)의 비정상적인 mRNA 및/또는 단백질 수준을 갖는지 여부를 측정하는 것을 포함한다. 본 방법에 따라, 세포를 대상자로부터 수득할 수 있고, 바이오마커 수준, 단백질, 또는 mRNA 수준을 측정하고, 건강한 대상자에서의 이들 마커의 수준과 비교한다. 바이오마커 폴리펩티드 또는 mRNA 수준의 비정상적인 수준이 암을 지시할 가능성이 높다.
따라서, 하나의 측면에서, 본 발명은 본원에 개시된 유일의 핵산 마커에 특이적인 프로브 및 프라이머를 제공한다. 따라서, 핵산 프로브는 길이가 10개 이상의 뉴클레오티드, 바람직하게, 15개 이상의 뉴클레오티드, 더욱 바람직하게 25개 이상의 뉴클레오티드, 및 가장 바람직하게 40개 이상의 뉴클레오티드인 뉴클레오티드 서열 내지 마커 핵산 서열의 코딩 서열의 일부에 상보적인 코딩 서열 모두 또는 거의 모두까지의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
하나의 실시태양에서, 본 방법은 환자로부터의 조직에서 암성 세포의 존재를 측정하기 위해 핵산 프로브를 사용하는 것을 포함한다. 특히, 본 발명은:
1. 길이가 10개 이상의 뉴클레오티드, 바람직하게, 15개 이상의 뉴클레오티드, 더욱 바람직하게 25개 이상의 뉴클레오티드, 및 가장 바람직하게 40개 이상의 뉴클레오티드인 뉴클레오티드 서열 내지 핵산 서열의 코딩 서열의 일부에 상보적이고 종양 세포에서 차별적으로 발현되는 코딩 서열 모두 또는 거의 모두까지의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 프로브를 제공하고;
2. 잠재적으로 암성 세포를 포함하는 환자로부터 조직 세포를 수득하고;
3. 실질적으로 그 모두가 비-암성인 세포를 함유하는 제2 조직 샘플을 제공하고;
4. 엄격한 조건하에서 상기 제1 및 제2 조직 샘플 각각의 RNA와 핵산 프로브를 접촉시키고 (예컨대, 노던 블롯 또는 계내 혼성화 검정법에서);
5. (a) 프로브와 제1 조직 샘플 RNA와의 혼성화 양을 (b) 프로브와 제2 조직 샘플 RNA와의 혼성화 양을 비교하되; 여기에서, 제2 조직 샘플 RNA와의 혼성화 양과 비교하여 제1 조직 샘플 RNA와의 혼성화 양에서 통계적학적으로 유의적인 차이가 나는 것이 제1 조직 샘플에 암성 샘플이 존재하는 것을 지시한다는 것을 포함한다.
하나의 측면에서, 본 방법은 소정의 마커 핵산 서열 (예컨대, VEGF 또는 VEGFR-2)로부터 유래된 프로브와의 계내 혼성화를 포함한다. 본 방법은 잠재적으로 암성 또는 전-암성 세포 뿐만 아니라, 정상 세포를 함유하는 소정의 조직 유형의 샘플과 표지된 혼성화 프로브를 접촉시키고, 프로브가 동일 조직의 다른 세포를 표지하는 정도와는 유의적으로 다른 정도로 (예컨대, 2배 이상, 또는 5배 이상, 20배 이상, 또는 50배 이상) 소정의 조직 유형의 몇몇 세포를 표지하는지 여부를 측정하는 것을 포함한다.
시험 세포 mRNA를, 길이가 12개 이상의 뉴클레오티드, 바람직하게, 15개 이상의 뉴클레오티드, 더욱 바람직하게 25개 이상의 뉴클레오티드, 및 가장 바람직하게 40개 이상의 뉴클레오티드인 뉴클레오티드 서열 내지 핵산 서열의 코딩 서열의 일부에 상보적이고, 소정의 조직 유형의 정상 세포와 비교하여 종양 세포에서 차별적으로 발현되는 서열 모두 또는 거의 모두까지의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 프로브와 접촉시키고, mRNA에 대한 프로브의 대략적인 혼성화 양을 측정하는 것을 포함하되, 혼성화 양이 조직 유형의 정상 세포의 mRNA에서 관찰되는 것보다 더 많거나 적을 경우, 이는 시험 세포가 암성 또는 전-암성임을 지시하는 것인, 소정의 인간 조직으로부터의 시험 세포의 표현형, 예를 들면, 세포가 (a) 정상인지, 또는 b) 암성 또는 전암성인지 여부를 측정하는 방법 또한 본 발명에 포함된다.
별법으로, 상기 진단학적 검정법은 마커 핵산 서열 (예컨대, VEGF 또는 sVEGFR-2)에 의해 코딩되는 단백질을 검출하기 위하여 항체를 사용함으로써 수행될 수 있다. 따라서, 하나의 실시태양에서, 본 검정법은 시험 세포의 단백질을 핵산의 유전자 산물에 특이적인 항체와 접촉시키되, 마커 핵산은 시험 세포와 동일한 조직 유형의 정상 세포에서 소정의 제어 수준으로 발현되는 것이며, 시험 세포에서 항체와 단백질에 의해 형성된 대략적인 면역복합체 형성량을 측정하되, 여기에서, 동일 조직 유형의 정상 세포와 비교하여 시험 세포의 단백질과 형성된 면역복합체의 양에서 통계학적으로 유의적인 차이가 나는 것은 시험 세포가 암성 또는 전-암성임을 지시하는 것을 포함할 것이다. 바람직하게, 항체는 VEGF 또는 sVEGFR-2, 특히, 그의 세포외 도메인에 특이적이다.
본 발명에 유용한 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 다중클론 및/또는 단일클론 항체의 생산 방법은 당업자에게 공지되어 있고, 이는 예를 들면, ([Dymecki, et al., (J. Biol. Chem. 267:4815, 1992)]; [Boersma & Van Leeuwen, (J. Neurosci. Methods 51 :317, 1994); [Green, et al., (Cell 28:477, 1982)]; 및Arnheiter, et al., (Nature 294:278, 1981)])에서 찾아볼 수 있다.
상기의 또다른 방법은 마커 핵산 서열의 유전자 산물에 특이적인 항체를 제공하되, 상기 유전자 산물은 동일한 조직 유형의 비-암성 조직내의 유전자 산물 수준보다 더 많거나 더 적은 수준으로 소정의 조직 유형의 암성 조직내 존재하는 단계; 환자로부터 소정의 조직 유형의 제1 샘플 조직을 수득하되, 샘플은 잠재적으로 암성 세포를 포함하는 단계; 동일한 조직 유형 (이는 동일한 환자로부터 또는 정상 대조군, 예컨대, 또다른 개체 또는 배양된 세포로부터의 것일 수 있다)의 제2 샘플 조직을 제공하되, 제1 샘플은 정상 세포를 함유하고, 본질적으로는 암성 세포를 함유하지 않는 단계; 항체와, 샘플내 존재하는 마커 핵산 서열 산물 사이의 면역복합체 형성을 허용하는 조건하에서 제1 및 제2 샘플의 단백질 (이는 부분적으로 정제된 것이거나, 용해되되 분획화되지 않는 세포에 존재하거나, 계내의 것일 수 있다)을 접촉시키는 단계; 및 (a) 제1 샘플에서의 면역복합체 형성량과 (b) 제2 샘플에서의 면역복합체 형성량을 비교하되, 여기에서, 제2 샘플에서의 면역복합체 형성량과 비교하여 더 적은 것으로 제1 샘플에서의 면역복합체 형성량에서 통계학적으로 유의적인 차이가 나는 것이 제1 샘플 조직에 암성 세포가 존재함을 지시하는 단계를 포함한다.
대상 발명은 추가로 (a) 대상자로부터 세포 샘플을 수득하고, (b) 그렇게 수득한 샘플내 마커 폴리펩티드의 양을 정량적으로 측정하고; (c) 그렇게 측정된 마커 폴리펩티드의 양을 공지된 표준과 비교함으로써 대상자로부터 수득한 세포 샘플이 비정상적인 양으로 마커 폴리펩티드를 갖는지 여부를 측정하는 것을 포함하는, 대상자로부터 수득한 세포 샘플이 비정상적인 양으로 마커 폴리펩티드를 갖는지 여부를 측정하는 방법을 제공한다. 상기 마커 폴리펩티드는 면역조직화학적 검정법, 도트-블롯 검정법, ELISA 등으로 검출될 수 있다.
면역검정법은 통상 세포 샘플내 단백질 수준을 정량화하기 위하여 사용되며, 다수의 다른 면역검정 기법이 당업계에 공지되어 있다. 본 발명은 특정 검정 방법으로 제한되지 않고, 그러므로, 동정의 및 이종성 방법, 둘 모두를 포함하고자 한다. 본 발명에 따라 수행될 수 있는 예시적인 면역검정법은 형광 편광 면역검정법 (FPIA), 형광 면역검정법 (FIA), 효소 면역검정법 (EIA), 혼탁 저해 면역검정법 (NlA), 효소결합 면역흡착 검정법 (ELISA), 및 방사면역검정법 (RIA)을 포함한다. 지시사 부분, 또는 표지기는 대상 항체에 부착될 수 있고, 이는, 대개 검정 장치 및 상용성의 면역검정 방법의 이용가능성에 의해 지시되는 방법의 각종 용도의 필요를 충족시키기 위해 선택된다. 상기 언급된 다양한 면역검정법을 실시하는데 사용되는 일반 기법은 당업계의 숙련인에게 알려져 있다.
또다른 실시태양에서, 환자의 생물학적 유체 (예컨대, 혈액 또는 뇨)내의 코딩된 산물의 수준, 또는 별법으로, 폴리펩티드의 수준은 상기 환자의 세포에서 마커 핵산 서열의 발현 수준을 모니터하는 방식으로 측정될 수 있다. 그러한 방법은 환자로부터 생물학적 유체의 샘플을 수득하는 단계, 샘플 (또는 샘플로부터의 단백질)을 코딩된 마커 폴리펩티드에 특이적인 항체와 접촉시키는 단계, 및 항체에 의해 형성된 면역복합체의 형성량을, 샘플내 마커 코딘된 산물의 수준을 지시하는 면역복합체 형성량과 비교하는 단계를 포함할 것이다. 이러한 측정법은 특히 정상 개체로부터 채취한 대조군 샘플 또는 이전에 또는 이후에 동일인으로부터 수득한 하나 이상의 샘플에서 동일 항체에 의해 형성된 면역복합체의 형성량과 비교할 때에 유익하다.
또다른 실시태양에서, 본 방법은 결국은 증식성 질병과 관련될 수 있는, 세포내 존재하는 마커 폴리펩티드의 양을 측정하기 위하여 사용될 수 있다. 마커 폴리펩티드의 수준은 세포 샘플이 형질전환된 세포이거나 그러한 세포가 되기 쉬운 세포를 함유하는지 여부를 예측적으로 평가하기 위하여 사용될 수 있다. 더욱이, 본 대상 방법은 형질전환된 것으로 알려진 세포의 표현형을 평가하는데 사용될 수 있는데, 표현형 결과는 특정 치료학적 요법을 계획하는데 유용하다. 예를 들면, 샘플 세포내 매우 높은 수준의 마커 폴리펩티드는 암에 관한 강력한 진단학적 및 예후적 마커가 된다. 예를 들면, 보다 공격적인 요법의 사용에 관하여 결정할 때 마커 폴리펩티드 수준의 관찰 결과가 사용될 수 있다.
상술한 바와 같이, 본 발명의 하나의 측면은 환자로부터 단리된 세포와 관련하여 마커 폴리펩티드의 수준이 샘플 세포에서 현저히 감소되었는지 여부를 측정하는 진단학적 검정법에 관한 것이다. "현저히 감소되었다"라는 것은 세포 표현형을 지칭하는 것으로, 여기에서, 세포는 유사한 조직 기원의 정상 세포와 비교할 때 감소된 마커 폴리펩티드의 세포량을 갖는 것이다. 예를 들면, 세포는 정상 대조군 세포의 것과 비교하여 약 50% 미만, 25% 미만, 10% 미만, 또는 5% 미만의 마커 폴리펩티드를 가질 수 있다. 특히, 검정법은 시험 세포에서 마커 폴리펩티드의 수준을 평가하고, 바람직하게, 1종 이상의 대조군 세포, 예를 들면, 정상 세포 및/또는 표현형을 알고 있는 형질전환된 세포에서 검출된 마커 폴리펩티드와 측정된 수준을 비교한다.
정상 또는 비정상적인 마커 폴리펩티드 수준과 관련하여 세포 수준으로 측정되는 바와 같은 마커 폴리펩티드의 수준을 정량화할 수 있는 능력이 본 대상 발명에 있어 특히 중요하다. 이어서, 특정 마커 폴리펩티드 표현형을 갖는 세포의 수는 환자 예후와 서로 관련될 수 있다. 본 발명의 하나의 실시태양에서, 병변의 마커 폴리펩티드 표현형은 비정상적으로 높은/낮은 수준의 마커 폴리펩티드를 갖는 것으로 관찰된 생검에서의 세포 백분율(%)로서 측정된다. 그러한 발현은 면역조직화학적 검정법, 도트-블롯 검정법, ELISA 등에 의해 검출될 수 있다.
조직 샘플이 사용되는 경우, 마커 폴리펩티드 표현형을 갖는 세포의 갯수를 측정하기 위하여 면역조직화학적 염색법이 사용될 수 있다. 그러한 염색법의 경우, 다중블록의 조직을 생검 또는 다른 조직 샘플로부터 채취하고, 프로테아제 K 또는 펩신과 같은 반응 물질을 사용하여 단백질분해성 가수분해시킬 수 있다. 특정 실시태양에서, 샘플 세포로부터 핵 분획을 단리시키고, 핵 분획중 마커 폴리펩티드 수준을 검출하는 것이 바람직할 수 있다.
조직 샘플을 예로서, 포르말린, 글루타르알데히드, 메탄올 등과 같은 시약으로 처리하여 고정시킨다. 이어서, 샘플을 항체, 바람직하게, 단일클론 항체와 인큐베이션시키는데, 이는 마커 폴리펩티드에 대하여 결합 특이성을 갖고 있다. 이러한 항체를 추후의 결합 검출을 위한 표지에 접합시킬 수 있다. 면역복합체 형성에 충분한 시간 동안 샘플을 인큐베이션시킨다. 이어서, 이러한 항체에 접합된 표지에 의해 항체 결합을 검출한다. 항체가 비표지된 경우, 제2의 표지된 항체, 예를 들면 항-마커 폴리펩티드 항체의 동종형에 특이적인 것이 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 표지의 일례로는 방사성 핵종, 형광 물질, 화학발광체, 효소 등을 포함한다.
효소가 사용되는 경우, 착색 또는 형광 산물을 제공하기 위하여 효소에 대한 기잘을 샘플에 가할 수 있다. 접합체에서 사용하기 적합한 효소의 일례로는 호스래디시 퍼옥시다제, 알칼리 인산분해효소, 말산 탈수소효소 등을 포함한다. 상업적으로 구입할 수 없는 경우, 그러한 항체-효소 접합체는 당업자에게 공지되어 있는 기법에 의해 용이하게 생산된다.
하나의 실시태양에서, 검정법은 도트 블롯 검정법으로서 실시된다. 갯수가 미리 정해져 있는 세포로부터 생산된 무세포 추출물에서 마커 폴리펩티드의 양을 서로 관련시킴으로써 단일 세포와 관련된 마커 폴리펩티드의 평균적인 양을 측정할 수 있도록 함에 따라 조직 샘플이 사용되는 특정의 적용이 도트 블롯 검정법을 통해 발견되었다.
동일한 유형의 종양 세포 (예컨대, 유방 및/또는 결장 종양 세포)는 개개 종양 유전자의 균일하게 증가된 발현 또는 개개 종양 억제 인자 유전자의 균일하게 감소된 발현을 나타낼 수 없다고 암에 관한 문헌에 잘 확립되어 있다. 심지어 소정의 암 유형의 세포 사이에도 소정의 마커 유전자의 발현 수준은 다양할 수 있고, 이는 추가로 단일 시험보다는 다수의 시험에 대한 신뢰성이 필요함을 강조한다. 따라서, 하나의 측면에서, 본 발명은 진단학적 시험의 신뢰성 및/또는 정확성을 개선시키기 위하여 본 발명의 프로브를 다수 사용함으로써 다수의 시험을 제공한다.
하나의 실시태양에서, 본 발명은 또한 핵산 프로브를 조직화된 어레이의 DNA 칩상에 고정화시키는 방법을 제공한다. 올리고뉴클레오티드는 리소그래피를 비롯한 다양한 공정에 의해 고체 지지체에 결합될 수 있다. 예를 들면, 칩은 250,000개 이하의 올리고뉴클레오티드를 보유할 수 있다. 이러한 핵산 프로브는 길이가 12개 이상의 뉴클레오티드, 바람직하게, 15개 이상의 뉴클레오티드, 더욱 바람직하게 25개 이상의 뉴클레오티드, 및 가장 바람직하게 40개 이상의 뉴클레오티드인 뉴클레오티드 서열 내지 마커 핵산 서열의 코딩 서열의 일부에 상보적이고, 종양 세포에서 차별적으로 발현되는 서열 모두 또는 거의 모두까지의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 본 발명은 단일 칩에 핵산 마커 어레이를 제공함으로써 시험의 신뢰성을 증가시킬 수 있기 때문에, 이는 다양한 암에 관하여 이용가능한 시험에 대해 유의적인 잇점을 제공한다.
본 방법은 생검을 수득하고, 임의로 동결 절편을 제작함으로써 분획화하여 종양 세포를 전체 세포 집단의 약 80%까지 농축시키는 것을 포함한다. 이어서, DNA 또는 RNA을 추출하고, 증폭시키고 DNA 칩을 사용하여 분석함으로써 마커 핵산 서열의 존재 또는 분재를 측정한다.
하나의 실시태양에서, 핵산 프로브는 2-차원 어레이 매트릭스 또는 어레이내 기판사에 스폿팅된다. 핵산 샘플을 표지화한 후 프로브에 혼성화시킬 수 있다. 프로브 핵산에 결합한 표지된 샘플 핵산을 포함하는 더블-스트랜드 핵산은, 일단 비결합 샘플부가 세척으로 제거되면 검출될 수 있다.
프로브 핵산은 유리, 니트로셀룰로스 등을 비롯한 기질상에 스폿팅될 수 있다. 프로브는 공유 결합 또는 비-특이 상호작용, 예로서, 소수성 상호작용에 의해 기판상에 결합할 수 있다. 샘플 핵산은 방사성 표지, 형광단, 발색단 등을 사용하여 표지될 수 있다.
어레이를 구성하는 기법, 및 이들 어레이를 사용하는 방법은 예를 들면, EP 번호 0 799 897; PCT 번호 WO 97/292 12; PCT 번호 WO 97127317; EP 번호 0 785 280; PCT 번호 WO 97/02357; 미국 특허 번호 제5,593,839호; 미국 특허 번호 제5,578,832호; EP 번호 0 728 520; 미국 특허 번호 제5,599,695호; EP 번호 0 721 016; 미국 특허 번호 제5,556,752호; PCT 번호 WO 95/22058; 및 미국 특허 번호 제5,631,734호에 기재되어 있다.
추가로, 어레이는 유전자의 차별적 발현을 조사하기 위하여 사용될 수 있고, 유전자 작용을 측정하기 위하여 사용될 수 있다. 예를 들면, 핵산 서열 어레이를 사용하여 임의의 핵산 서열이 정상 세포와 암 세포 사이에서 차별적으로 발현되었는지에 대하여 결정할 수 있다. 상응하는 정상 세포에서는 관찰되지 않는, 암 세포내 특정 메세지의 발현이 증가한 것은 암-특이 단백질을 지시할 수 있다.
하나의 실시태양에서, 핵산 분자는 어레이된 핵산 분자가 임의의 핵산이 정상의 세포 또는 조직과 암성 세포 또는 조직 사이에서 차별적으로 발현되는지 여부를 측정하기 위해 사용될 수 있도록 고체 표면 (예컨대, 막)상에 마이크로어레이를 생성하는데 사용될 수 있다. 하나의 실시태양에서, 본 발명의 핵산 분자는 cDNA일 수 있거나, 추후 PCR에 의해 증폭되고 나일론 막상에 스폿팅되는 cDNA 분자를 생성하는데 사용될 수 있다. 이어서, 막을 암성 및 정상 조직 또는 세포의 등가 샘플로부터 수득된 방사성표지된 표적 핵산 분자와 반응시킬 수 있다. cDNA 생성 방법 및 마이크로어레이 제작 방법은 당업자에게 공지되어 있고, 이는 예를 들면, ([Bertucci, et al., (Hum. Mol. Genet. 8:2129, 1999)]; [Nguyen, et al., (Genomics 29:207, 1995)]; [Zhao, et al., (Gene 156:207)]; [Gres, et al., (Mammalian Genome 3:609, 1992)]; [Zhumabay.eva, et al., (Biotechniques 30:158, 2001)]; 및 [Lennon, et al., (Trends Genet. 7:314, 1991)])에서 찾아볼 수 있다.
또다른 실시태양에서, 본 발명은 본 발명의 마커 폴리펩티드에 대하여 생성되는 항체 패널을 사용하는 것에 주시한다. 바람직하게, 항체는 VEGF 또는 sVEGFR-2에 대하여 생성된다. 그러한 항체 패널은 암에 관하여 신뢰가능한 진단학적 프로브로 사용될 수 있다. 본 발명의 검정법은 세포, 예를 들면, 폐 세포를 함유하는 생검 샘플을, 하나 이상의 코딩된 산물에 대한 항체 패널과 접촉시켜 마커 폴리펩티드의 존재 또는 부재를 측정하는 것을 포함한다.
본 대상 발명의 진단학적 방법은 치료에 대한 후속-과정으로서 사용될 수 있으며, 예를 들면, 마커 폴리펩티드의 수준의 정량화가 현재 또는 이전에 사용된 암 요법의 효능을 지시할 수 있을 뿐만 아니라, 환자 예후시 이들 요법의 효과를 지시할 수 있다.
추가로, 마커 핵산 또는 마커 폴리펩티드는 초기 검출, 후속-과정 스크리닝, 재발 검출, 및 화학요법 또는 외과적 치료에 대한 치료 이후의 모니터하기 위해 진단학적 패널의 일부분으로서 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명은 예를 들면, 세포의 발암성 형질전환으로부터 유발되는 증식성 질병을 진단하고 표현형을 분석하는데 도움이 될 수 있도록 세포로부터의 마커 폴리펩티드의 이득 및/또는 손실을 검출하는 진단학적 검정법 및 시약을 이용할 수 있다.
상기 기술된 진단학적 검정법은 예후적 검정법으로도 사용될 수 있도록 적합화될 수 있다. 그러한 적용은 종양 진행시 특징적인 단계에서 발생하는 이벤트에 대한 본 발명의 검정법의 감수성을 이용한다. 예를 들면, 소정의 마커 유전자는 가능하다면 세포가 악성으로 비가역적으로 발생되기 이전인 매우 이른 단계에서 상향- 또는 하향-조절될 수 있지만, 또다른 마커 유전자는 그보다 훨씬 이후에만 특징적으로 상향- 또는 하향-조절될 수 있다. 그러한 방법은 시험 세포의 mRNA를, 상이한 종양 진행 단계에서 암성 또는 전암성 세포중 상이하게 특징적인 수준으로 발현되는 소정의 마커 핵산으로부터 유래된 핵산 프로브와 접촉시키는 단계, 및 프로브와 세포의 mRNA의 대략적인 혼성화량을 측정하되, 상기 양이 세포에서 유전자의 발현 수준을 지시하며, 따라서, 세포의 종양 진행 단계를 지시하는 것인 단계를 포함할 수 있고; 별법으로, 검정법은 시험 세포의 단백질과 접촉되는 소정의 마커 핵산의 유전자 산물에 특이적인 항체를 사용함으로써 수행될 수 있다. 다수의 그러한 실험은 종양의 존재 여부 및 위치를 밝혀낼 뿐만 아니라, 의사가 종양에 가장 적절한 치료 모드를 선택할 수 있도록 하고, 그러한 치료법의 성공 가능성을 예측할 수 있도록 한다.
본 발명의 방법은 또한 종양의 임상 과정을 따라 사용될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 검정법을 환자로부터 얻은 조직 샘플에 적용시키고; 암에 대하여 환자를 치료한 이후, 또다른 조직 샘플을 채취하고 시험을 반복한다. 성공적인 치료법일 경우, 암성 또는 전암성 세포의 특징인 차별적 발현을 나타내거나, 그러한 세포의 유전자 발현에서 실질적인 증가를 보이는 세포는 모두 제거될 것이며, 가능하게는 정상 수준에 도달하거나, 심지어는 그를 능가하게 될 것이다.
예측 검정법
소정의 항암제로부터의 임상적 이익을 예측할 수 있는, 실험실-기초 검정법은 암에 걸린 환자의 임상 관리를 현저히 증진시킬 것이다. 이러한 효과를 평가하기 위하여 항암제와 관련된 바이오마커는 치료 이전, 치료중, 및 치료 이후에 생물학적 샘플 (예컨대, 종양 샘플, 혈장)에서 분석될 수 있다.
예를 들면, VEGF 또는 sVEGFR, 바람직하게 sVEGFR-2, 폴리펩티드의 발현은 혈장에서 검출될 수 있다. 따라서, 기준선 혈장에서의 이들 폴리펩티드의 농도 변화는 암에 걸린 환자에서 모니터될 수 있다. 예를 들면, VEGF 수준의 증가 및 sVEGFR-2 수준의 감소는 소라페니브 효능과 관련될 수 있다.
추가로, 폴리펩티드 수준은 또한 파라핀-매몰된 생검을 사용하는 정량적 면역조직화학에 의해 모니터될 수 있다.
치료법을 모니터하는 또다른 접근법은 혈청 프로테옴 스펙트럼을 평가하는 것이다. 특히, 혈장 샘플은 질량 분석법 (예컨대, 표면-향상된 레이저 탈착 이온화)으로 측정될 수 있고, 각 환자에 대하여 프로테옴 스펙트럼이 생성될 수 있다. 치료 이전 및 치료시 환자로부터 유래된 혈장 분석으로부터 유도된 스펙트럼 세트를 반복적 검색 알고리즘에 의해 분석할 수 있는데, 이는 치료받은 샘플을 치료받지 않은 샘플로부터 완벽하게 식별할 수 있는 프로테옴 패턴을 동정할 수 있다. 이어서, 생성된 패턴을 사용하여 치료 이후의 임상적 이익을 예측할 수 있다.
생물학적 샘플 (예컨대, 종양 생검 샘플, 혈액 샘플)의 전반적인 유전자 발현 프로파일링과 생물정보학-유도 패턴 동정을 사용하여 임상적 이익, 및 항암제에 대한 감수성 뿐만 아니라, 그에 대한 내성 발생을 예측할 수 있다. 예를 들면, 치료 이전 및 치료시 환자로부터의 전혈로부터 유래된 세포로부터 단리된 RNA를 사용하여 애피메트릭스 유전자 칩 기술과 알고리즘을 사용함으로써 혈액 세포 유전자 발현 프로파일을 작성할 수 있다. 이어서, 이러한 유전자 발현 프로파일은 특정 항암제를 사용한 치료법으로부터의 임상적 이익을 예측할 수 있다.
1D 1H-NMR (핵 자기 공명)에 의한 뇨의 생화학적 조성물 분석 또한 예측적 검정법으로서 사용될 수 있다. 패턴 인식 기법을 사용하여 항암제를 사용한 치료법에 대한 대사 반응을 평가하고, 이러한 반응을 임상적 종점과 서로 연관시킬 수 있다. 뇨로 배출된 생화학적 또는 내인성 대사산물은 정상 대상자에 관하여 양자 NMR에 의해 잘-특징화되어 있다 [Zuppi, et al., Clin Chim Acta 265:85-97, 1997]. 이러한 대사산물 (대략 30-40)은 주요 대사 경로, 예로서, 시트르산 및 우레아 회로의 부산물을 나타낸다. 약물-, 질환-, 및 유전자-자극은 자극에 대한 대사 반응의 타임라인과 크기를 지시하는 기준선 뇨 프로파일상의 대사-특이 변화를 일으키는 것으로 나타났다. 이러한 분석은 다중-변형된 것이며, 그러므로, 데이타 번역을 개선시키기 위하여 패턴 인식 기법을 사용한다. 뇨 대사 프로파일을 임상적 종점과 서로 연관시켜 임상적 이익을 측정할 수 있다.
추가 설명 없이도 당업자는 상기 설명을 사용함으로써 하기 발명을 완전하게 이용할 수 있을 것으로 생각된다. 그러므로, 하기의 구체적인 바람직한 실시태양은 단지 예시적인 것이며, 어느 방식으로든 개시 내용의 나머지를 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다.
달리 언급하지 않는 한, 상기 및 하기 실시예에서, 모든 온도는 섭씨(℃)이고, 모든 부 및 백분율은 중량 기준이다.
본 발명은 하기의 비-제한적 실시예를 참고로 하여 하기에 설명될 것이다.
도입: 진행성 신 세포 암에 걸린 환자에서의 III상 표적 연구인 무작위, 위약-대조 연구를 통해 소라페니브가 전체 생존에 미치는 효과를 조사하였다. 본 연구의 두번째 목적은 특정 바이오마커에 미치는 치료 효과를 평가하고, 이들 바이오마커와 환자의 결과 사이의 관련성을 평가하는 것이다. 방법: 후보 바이오마커, 구체적으로 기록상의 종양 생검 검체, 전혈, 혈장 및 뇨를 동정하기 위하여 샘플을 수집하였다. 모든 분석은 IRB-승인받은 프로토콜하에 수행되었다. DNA 서열 분석에 의해 VHL 유전자 돌연변이 상태 (오직 유전자 분석에 동의한 환자의 경우에만) 에 관하여, 그리고 면역조직화학 (IHC)에 의해 포스포-ERK (pERK) 수준에 관하여 조직 검체를 분석하였다. 혈액으로부터 mRNA를 단리시키고, 마이크로어레이에 의해 환자의 결과와 서로 관련이 있는 유전자 발현 프로파일에 대하여 분석하였다. 추가로, 질량 분석법-기초 접근법을 사용하여 단백질 서명(signature)에 대하여 혈장을 평가하고, 1H-NMR에 의해 환자의 결과와 서로 관련이 있는 소분자 패턴에 관하여 뇨를 분석하였다. ELISA에 의해 VEGF 및 가용성 VEGFR-2 (sVEGFR-2)에 관하여 치료-전 및 치료-후 혈장 샘플을 분석하고, 소라페니브 치료와 관련된 이들 분자상의 변화를 조사하였다.
결과: 소라페니브로 치료받은 환자에서 치료 3주후 sVEGFR-2는 혈장내에서 현저히 감소하였고 (p < 2E-16), 이러한 감소는 치료후 8주째까지 계속되었다. 약물-치료받은 환자에서 상기와 같은 감소는 표적 변병 감소와의 연관성은 약하였다 (p = 0.028). 동일한 기간 동안 위약-치료받은 환자에서는 혈장내 sVEGFR-2 수준이 변함이 없었다. 두 환자군 모두에서 VEGF 수준도 분석하였다. 소라페니브를 받은 환자에서 VEGF 수준은 치료 3주후 기준선으로부터 현저히 증가한 반면 (p = 3.2 E-5), 위약-치료받은 환자에서는 어떤 증가도 관찰되지 않았다. 위약군에서, VEGF 기준선이 높은 (>250 pg/mL) 환자는 VEGF 기준선이 낮은 (<250 pg/mL) 환자보다 현저히 더 짧은 무진행 생존 (PFS)을 가진 반면 (p = 0.030), 소라페니브를 받은 환자에서는 기준선 VEGF 수준이 높거나 낮은 것 사이의 PFS에 있어서 어떠한 유의적 차이도 관찰되지 않았다. IHC에 의한 pERK에 대한 염색법을 통해 대다수의 환자 샘플은 고도의 최대 염색 강도 (0 내지 4+ 등급에서 4+)를 갖는 것으로 나타났다. 유사하게, 대부분의 샘플은 pERK에 대하여 염색된 종양 세포를 낮은 백분율 (염색된 종양 세포의 <25%)로 가졌다.
환자에서 VEGF 수준을 조사하는 연구를 실시하여 임상적 결과의 상호관련성을 확인하였다.
유용한 것으로 밝혀진 환자 결과의 측정치는 콕스(Cox) 회귀 분석을 사용한 사망까지의 시간(time to death) (TTD) 및 무진행 생존 (PFS)이었다. VEGF의 기준선 수준을 측정하고, 치료 18주째에 기준선 수준에서의 변화를 측정하였다. 관찰된 효과를 연령, 성별, ECOG 상태 또는 모쳐(Motzer) 점수에 대하여 조절하였다. 이러한 조절은 최소로 이루어졌다.
VEGF 기준선 대 TTD의 관계는 도 1에 도시하고 (카플란-메이어(Kaplan-Meyer) 분석), 18주째 VEGF 변화 대 TTD의 관계를 도 2에 도시한다 (카플란-메이어 분석). 도에 나타나 있는 바와 같이, VEGF의 기준선 수준이 높을수록 사망까지의 시간은 더욱더 짧은 것과 서로 관련이 있다 (VEGF를 연속 변수로서 분석하였을 때). 18주째 VEGF 수준의 큰 증가는 또한 사망까지의 시간은 더욱더 짧은 것과 서로 관련이 있다 (VEGF를 연속 변수로서 분석하였을 때).
도 1은 VEGF 기준선 대 TTD의 그래프이고;
도 2는 ΔBL-Wk 18 대 TTD의 그래프이다.
추가 설명 없이도 당업자는 상기 설명을 사용함으로써 본 발명을 완전하게 이용할 수 있을 것으로 생각된다. 그러므로, 상기의 구체적인 바람직한 실시태양 은 단지 예시적인 것이며, 어느 방식으로든 개시 내용의 나머지를 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다.
상기 실시예에서 사용된 것을 대신하여 일반적으로 또는 구체적으로 기술된 본 발명의 반응물 및/또는 운영 조건을 치환함으로써 상기 실시예는 유사하게 성공적으로 반복될 수 있다.
상기 설명으로부터 당업자는 본 발명의 본질적인 특징을 용이하게 확인할 수 있고, 그의 정신 및 범주로부터 벗어남 없이 본 발명을 다양하게 변형 및 수정함으로써 다양한 용도와 조건에 적합하도록 만들 수 있다.
당업자는 상기 정보와 당업계에서 이용가능한 정보를 사용함으로써 본 발명을 완전하게 이용할 수 있을 것으로 생각된다. 본원에 기술되어 있는 것과 같은 본 발명의 정신 및 범주로부터 벗어남 없이 본 발명을 변형 및 수정할 수 있다는 것이 당업계의 숙련인에게 자명하여야 한다. 상기 및 하기 기술된 토픽 표제는 적용시 특정 정보를 찾아볼 수 있는 가이던스로서의 의미를 지니며, 적용시 그러한 토픽에 관한 정보를 찾아볼 수 있는 유일한 소스는 결코 아닌 것으로 한다. 상기 인용된 모든 간행물 및 특허는 본원에서 참고로 인용된다.
| 바이오마커 | 결과 측정치 | 비교를 위한 p-값 | ||||||
| 비조절 | 연령에 대한 조절 | 성별에 대한 조절 | ECOG 상태에 대한 조절 | 모쳐 점수에 대한 조절 | ||||
| VEGF | 기준선 | 연속 | TTD | 0.015 | 0.017 | 0.014 | 0.016 | 0.038 |
| VEGF | 기준선 | 연속 | PFS | 0.030 | 0.033 | 0.020 | 0.025 | 0.052 |
| VEGF | ΔBL-Wk 18 | 연속 | TTD | 0.017 | 0.038 | 0.023 | 0.034 | 0.035 |
| 바이오마커 변수 | 비교를 위한 p-값 | 해석 | ||||
| TTD | PFS | BR | ||||
| VEGF | 기준선 수준 | 연속 | 0.015 | 0.030 | 0.431 | VEGF의 기준선 수준이 높을수록 TTD는 더욱더 짧고, PFS도 더 짧은 것과 서로 관련이 있다 |
| 빈(binned) | 0.081 | 0.171 | 미측정 | 트렌드: VEGF의 기준선 수준이 높을수록 TTD는 더욱더 짧은 것과 서로 관련이 있다 | ||
| BL로부터 18주째까지의 변화 | 연속 | 0.017 | 0.637 | 0.575 | 18주째 VEGF 수준의 큰 증가는 TTD가 더욱더 짧은 것과 서로 관련이 있다 | |
| 빈 | 0.020 | 0.190 | 미측정 | 18주째 VEGF 수준의 큰 증가는 TTD가 더욱더 짧은 것과 서로 관련이 있다 | ||
Claims (50)
- 환자 검체에서 VEGF 및/또는 sVEGFR-2의 수준 또는 활성을 검출하고, 상기 수준을 표준과 비교하는 것을 포함하는, 소라페니브로 치료받은 암 환자의 반응을 모니터하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 소라페니브-치료받은 환자 검체 및 상기 대조군 검체에서 VEGF 및/또는 sVEGFR-2를 mRNA 수준으로 검출하는 것을 포함하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 소라페니브-치료받은 환자 검체 및 상기 대조군 검체에서 VEGF 및/또는 sVEGFR-2를 단백질 수준으로 검출하는 것을 포함하는 방법.
- 제2항에 있어서, 상기 mRNA 수준은 상기 환자 검체를 상기 mRNA에 특이적으로 결합하는 반응 물질과 접촉시키고, 특이적으로 결합한 반응 물질의 양을 측정함으로써 검출되는 것인 방법.
- 제3항에 있어서, 상기 단백질 수준은 상기 환자 검체를 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 반응 물질과 접촉시키고, 특이적으로 결합한 반응 물질의 양을 측정함으로써 검출되는 것인 방법.
- 제4항에 있어서, 결합하는 반응 물질이 1개 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것인 방법.
- 제5항에 있어서, 결합하는 반응 물질이 1개 이상의 항체를 포함하는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 환자 검체가 체액을 포함하는 것인 방법.
- 제2항에 있어서, 상기 mRNA 수준이 노던 분석, RT-PCR, 또는 cDNA 마이크로어레이에 의해 검출되는 방법.
- 제3항에 있어서, 단백질 수준이 면역블롯팅, 면역침전, 또는 ELISA 검정법에 의해 검출되는 방법.
- 제8항에 있어서, 상기 체액이 혈액인 방법.
- 제2항에 있어서, 상기 암이 원발성 신생물 또는 전이성 종양인 방법.
- 제2항에 있어서, 상기 암이 암종, 림프종, 백혈병, 골수종, 육종, 아교모세포종, 성상세포종, 흑색종, 또는 윌름즈 종양(Wilms' tumor)인 방법.
- 제12항에 있어서, 상기 암이 유방, 기도, 뇌, 생식 기관, 소화관, 요로, 눈, 간, 피부, 두경부, 갑상선, 부갑상선, 혈액, 또는 근육의 암인 방법.
- 제12항에 있어서, 상기 유방암이 침습성 관 암종, 침습성 소엽 암종, 관상피내 암종, 또는 소엽상피내 암종인 방법.
- 제12항에 있어서, 상기 기도암이 소세포 폐 암종, 비-소세포 폐 암종, 기관지 선종 또는 흉막폐장 모세포종인 방법.
- 제12항에 있어서, 상기 뇌암이 뇌간 및 시상하부 신경아교종, 소뇌 및 대뇌 성상세포종, 수모세포종, 뇌실막세포종, 신경외배엽 또는 송과체 종양인 방법.
- 제12항에 있어서, 상기 생식 기관의 암이 전립선암, 고환암, 자궁내막암, 자궁경부암, 난소암, 질암, 외음부암, 또는 자궁의 육종인 방법.
- 제12항에 있어서, 상기 소화관의 암이 항문암, 결장암, 직장결장암, 식도암, 담낭암, 위암, 췌장암, 직장암, 소장암, 또는 타액선암인 방법.
- 제12항에 있어서, 상기 요로의 암이 방광암, 음경암, 신장암, 신우암, 요관 암 또는 요도암인 방법.
- 제12항에 있어서, 상기 안구암이 안내 흑색종 또는 망막모세포종인 방법.
- 제12항에 있어서, 상기 간암이 간세포 암종, 담관암종 또는 혼합 간세포 담관암종을 포함하는 방법.
- 제12항에 있어서, 상기 피부암이 편평세포 암종, 카포시 육종, 악성 흑색종, 메르켈 세포 피부암 또는 비-흑색종 피부암을 포함하는 방법.
- 제12항에 있어서, 상기 두경부암이 후두암, 하인두암, 비인두암, 또는 구인두암, 구순암 또는 구강암을 포함하는 방법.
- 제12항에 있어서, 상기 혈액암이 AIDS-관련 림프종, 비-호지킨 림프종, 피부 T-세포 림프종, 호지킨병, 중추신경계의 림프종, 급성 골수성 백혈병, 급성 림프모구성 백혈병, 만성 림프성 백혈병, 만성 골수성 백혈병 또는 모발상세포 백혈병을 포함하는 방법.
- 제12항에 있어서, 상기 육종이 연조직의 육종, 골육종, 악성 섬유 조직구종, 림프육종, 횡문근육종, 급성 골수성 백혈병, 급성 림프모구성 백혈병, 만성 림프성 백혈병, 만성 골수성 백혈병 또는 모발상세포 백혈병을 포함하는 방법.
- (a) 소라페니브로 치료하기 이전에 환자로부터 채취한 제1 혈장 샘플내 바이오마커 VEGF 및/또는 sVEGFR-2의 발현 수준을 측정하고;(b) 소라페니브로 초기 치료한 이후에 환자로부터 채취한 하나 이상의 제2 혈장 샘플내 VEGF 및/또는 sVEGFR-2의 발현 수준을 측정하고;(c) 제2 샘플내 VEGF 및/또는 sVEGFR-2의 발현 수준을 제1 샘플내 바이오마커의 발현 수준과 비교하되;여기에서, 제1 샘플내 상기 VEGF 및/또는 sVEGFR-2의 발현 수준과 비교하여 제2 샘플내 VEGF 및/또는 sVEGFR-2의 발현 수준상의 변화가 소라페니브를 사용한 치료법의 효능을 지시하는 것인 것을 포함하는,소라페니브 투여에 의해 신 세포 암종에 대하여 치료받은 환자의 반응을 모니터하는 방법.
- a. 환자로부터 채취한 생물학적 샘플로부터 VEGF 및/또는 sVEGFR-2의 발현 수준을 측정하고;b. VEGF 및/또는 sVEGFR-2의 발현 수준과,i) 암에 걸린 것으로 의심되지 않는 하나 이상의 대상자로부터 채취한 유사 샘플내 수준,ii) 암에 걸린 것으로 의심되는 하나 이상의 대상자로부터 채취한 유사 샘플 내 수준, 또는iii) 다른 시간에 상기 환자로부터 채취한 유사 샘플내 수준중 하나 이상을 갖는 샘플과 비교하되,여기에서, 샘플 (a)내 VEGF 및/또는 sVEGFR-2의 발현 수준과 하나 이상의 비교 대상이 차이가 나는 것은 질환 상태 및/또는 질환 상태에서 예상되는 변화와 관련된 환자의 증상과 서로 관련되는 것인 것을 포함하는, 암에 걸린 환자의 증상을 평가하는 방법.
- 제28항에 있어서, 환자의 증상을 평가하는 것은 치료를 하거나 하지 않고,질환 상태를 진단하는 것,변화에 대하여 질환 상태를 모니터하는 것, 및질환 상태에서 변화를 예후하는 것중 하나 이상을 포함하는 방법.
- 제28항에 있어서, 생물학적 샘플이 혈액, 양수, 혈장, 혈청, 정액, 골수, 뇨 또는 조직 생검으로부터 선택되는 것인 방법.
- 제28항에 있어서, 생물학적 샘플이 혈장인 방법.
- 제28항에 있어서, 암이(a) 유방, 기도, 뇌, 생식 기관, 소화관, 요로, 눈, 간, 피부, 두경부, 갑상 선, 부갑상선의 고형 종양, 또는 그의 원위 전이, (b) 림프종, (c) 육종 또는 (d) 백혈병인 방법.
- 제32항에 있어서, 상기 유방암이 침습성 관 암종, 침습성 소엽 암종, 관상피내 암종, 또는 소엽상피내 암종인 방법.
- 제32항에 있어서, 상기 기도암이 소세포 폐 암종, 비-소세포 폐 암종, 기관지 선종 또는 흉막폐장 모세포종인 방법.
- 제32항에 있어서, 상기 뇌암이 뇌간 및 시상하부 신경아교종, 소뇌 및 대뇌 성상세포종, 수모세포종, 뇌실막세포종, 신경외배엽 또는 송과체 종양인 방법.
- 제32항에 있어서, 상기 생식 기관의 암이 전립선암, 고환암, 자궁내막암, 자궁경부암, 난소암, 질암, 외음부암, 또는 자궁의 육종인 방법.
- 제32항에 있어서, 상기 소화관의 암이 항문암, 결장암, 직장결장암, 식도암, 담낭암, 위암, 췌장암, 직장암, 소장암, 또는 타액선암인 방법.
- 제32항에 있어서, 상기 요로의 암이 방광암, 음경암, 신장암, 신우암, 요관암 또는 요도암인 방법.
- 제32항에 있어서, 상기 안구암이 안내 흑색종 또는 망막모세포종인 방법.
- 제32항에 있어서, 간세포 암종, 담관암종 또는 혼합 간세포 담관암종을 포함하는 방법.
- 제32항에 있어서, 상기 피부암이 편평세포 암종, 카포시 육종, 악성 흑색종, 메르켈 세포 피부암 또는 비-흑색종 피부암을 포함하는 방법.
- 제32항에 있어서, 상기 두경부암이 후두암, 하인두암, 비인두암, 또는 구인두암, 구순암 또는 구강암을 포함하는 방법.
- 제32항에 있어서, 상기 혈액암이 AIDS-관련 림프종, 비-호지킨 림프종, 피부 T-세포 림프종, 호지킨병, 중추신경계의 림프종, 급성 골수성 백혈병, 급성 림프모구성 백혈병, 만성 림프성 백혈병, 만성 골수성 백혈병 또는 모발상세포 백혈병을 포함하는 방법.
- 제32항에 있어서, 상기 육종이 연조직의 육종, 골육종, 악성 섬유 조직구종, 림프육종, 횡문근육종, 급성 골수성 백혈병, 급성 림프모구성 백혈병, 만성 림프성 백혈병, 만성 골수성 백혈병 또는 모발상세포 백혈병을 포함하는 방법.
- 제28항에 있어서, 암이 신 세포 암종인 방법.
- 제1항에 있어서, 환자가 소라페니브로 치료받는 것인 방법.
- a) 환자로부터 수득한 생물학적 샘플내 VEGF 및/또는 sVEGFR-2의 발현 수준을 측정하고;b) 하기 화학식(I)의 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염, 다형태, 수화물, 용매화물, 또는 그의 조합으로 초기 치료한 이후에 환자로부터 채취한 하나 이상의 제2 생물학적 샘플내 VEGF 및/또는 sVEGFR-2의 발현 수준을 측정하고;(c) 제2 샘플내 VEGF 및/또는 sVEGFR-2의 발현 수준을 제1 샘플내 VEGF 및/또는 sVEGFR-2의 발현 수준과 비교하되; 여기에서, 제1 샘플내 상기 VEGF 및/또는 sVEGFR-2의 발현 수준과 비교하여 제2 샘플내 VEGF 및/또는 sVEGFR-2의 발현 수준상의 변화가 화학식(I)의 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염, 다형태, 수화물, 용매화물, 또는 그의 조합을 사용한 치료법의 효능을 지시하는 것인 것을 포함하는,고형 종양에 대하여 화학식(I)의 화합물 N-[4-클로로-3-(트리플루오로메틸)페닐]-N'-{4-[2-카바모일-1-옥소-(4-피리딜옥시)]페닐} 우레아 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염, 다형태, 수화물, 용매화물, 또는 그의 조합으로 치료받은 환자의 반응을 모니터하는 방법:
- 제47항에 있어서, 생물학적 샘플이 혈액, 양수, 혈장, 혈청, 정액, 뇨, 골수 또는 조직 생검인 방법.
- 제47항에 있어서, 생물학적 샘플이 혈장인 방법.
- 제47항에 있어서, 암이 신 세포 암종인 방법.
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