BRPI0618597A2 - métodos de predição e prognóstico de cáncer e método de monitoramento de terapia contra o cáncer - Google Patents

Abstract

MéTODOS DE PREDIçãO E PROGNóSTICO DE CáNCER E MéTODO DE MONITORAMENTO DE TERAPIA CONTRA O CáNCER. A presente invenção refere-se a biomarcadores e ao uso de biomarcadores na predição e no prognóstico de câncer, bem como ao uso de biomarcadores no monitoramento da eficária de tratamento de oâncer. Especialmente, a presente invenção refere-se ao uso de VEGF e sVEGFR, como biomarcadores, em indivíduos tratados oom sorafenib.

Description

MÉTODOS DE PREDIÇÃO E PROGNÓSTICO DE CÂNCER e MÉTODO PARA MONITORAMENTO DE TERAPIA CONTRA O CÂNCER

Este pedido reivindica o beneficio da prioridade em função do registro norte-americano de patente de número 60/735,854, depositado em 14 de novembro de 2005, o qual está incorporado a este, por referência.

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção se refere a biomarcadores e seu uso para predição e prognóstico de câncer, bem como para o monitoramento da eficácia de tratamento dessa doença. Especificamente, a presente invenção se refere ao emprego de VEGF solúvel ("VEGF") e de seu receptor (sVEGFR) como biomarcadores da eficácia do tratamento com sorafenib.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

Diversos estados patológicos são caracterizados por diferenças nos níveis de expressão de vários genes, seja por alterações no número de cópias do DNA ou por variação nos níveis de transcrição de determinados genes (por exemplo, pelo controle de iniciação, provisão de precursores de RNA, processamento de RNA, etc.). Perdas e ganhos de material genético, por exemplo, têm um papel importante na transformação maligna e na progressão. Acredita-se que tais perdas e ganhos sejam gerenciados por, pelo menos, dois tipos de genes: os oncogenes e os genes supressores de tumor. Os primeiros são reguladores positivos da tumorigênese, enquanto os segundos são reguladores negativos dela (Marshall, Célula 64:313-326, 1991; Weinberg, Science 254:1138-114 6, 1991). Sendo assim, um dos mecanismos de ativação do crescimento irregular se dá através do aumento do número de genes codificadores de proteínas oncogênicas, ou pelo aumento do nível de expressão desses oncogenes (por exemplo, em resposta a mudanças celulares ou ambientais); outro mecanismo acontece pela perda de material genético ou pelo decréscimo do nível de expressão de genes codificadores dos supressores de tumor. Este modelo é apoiado pelas perdas e ganhos de material genético associado com a progressão de gliomas (Mikkelson, et al., J. Célulaular Biochem. 46:3-8, 1991). Sendo assim, mudanças nos níveis de expressão (transcrição) de genes específicos (por exemplo, oncogenes ou supressores de tumor) servem como sinalizadores da presença e da progressão de diversos cânceres.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A presente invenção se refere a biomarcadores e seu uso na predição e no prognóstico do câncer, bem como no monitoramento da eficácia de tratamento dessa doença. Especificamente, a presente invenção se refere ao emprego de VEGF e sVEGFR, preferencialmente do sVEGFR-2 (VEGFR-2 solúvel), como biomarcadores da eficácia do tratamento com sorafenib. Como descrito em mais detalhes no exemplo abaixo, verificou-se que o nível de sVEGFR-2 diminui nos pacientes tratados com sorafenib, enquanto o de VDGF aumenta. Portanto, esses marcadores podem ser usados para determinar a eficácia do tratamento com sorafenib.

Além disso, um dos objetivos da invenção é disponibilizar métodos e reagentes para a predição, diagnóstico, prognóstico e terapia de câncer.

Outra concretização da presente invenção é um método para rastreamento dos efeitos de uma droga em uma amostra de tecido ou célula contendo uma etapa de análise do nivel de expressão de um ou mais genes e/ou produtos de genes, em que a expressão do gene e/ou níveis de seu produto na amostra de tecido ou célula são analisados antes e depois da exposição à droga; uma variação do nível de expressão do gene e/ou de seu produto indica efeito da droga ou fornece um diagnóstico do paciente, ou prediz a resposta deste ao tratamento. Em outra

concretização a droga é o sorafenib. Em outra concretização os genes ou seus produtos são VEGF e VEGFR, de preferência VEGFR-2, e suas formas solúveis (por exemplo, detecção de VEGFR2 acumulado).

Outra concretização da presente invenção é um método para descoberta de novas drogas, composto por uma etapa de análise do nível de expressão de um ou mais genes e/ou produtos de genes, em que a expressão de um ou mais genes e/ou seus produtos nas células é analisada antes e depois da exposição à droga, e em que uma variação do nível de expressão do gene e/ou de seu produto é um indicador da eficácia da droga. Em outra concretização os genes ou seus produtos são VEGF e VEGFR, de preferência VEGFR-2, e suas formas solúveis (por exemplo, detecção de VEGFR2 acumulado).

A invenção apresenta, ainda, um método para identificação de um composto útil para o tratamento de câncer, caracterizado por administrar a um paciente com câncer um composto-teste, e por medir a atividade de um polipeptideo, em que uma variação na atividade do polipeptideo é um indicador de que o composto- teste é útil no tratamento do câncer. Em outra concretização, os polipeptideos são VEGF e VEGFR, de preferência VEGFR-2, e suas formas solúveis (por exemplo, detecção de VEGFR2 acumulado); em outra concretização o composto é o sorafenib.

Assim, a invenção inclui métodos passíveis de serem usados para identificar compostos, que podem atuar, por exemplo, como reguladores ou moduladores, tais como agonistas e antagonistas, agonistas parciais, agonistas inversos, ativadores, co-ativadores e inibidores. Desse modo, a invenção fornece reagentes e métodos para regular a expressão de um polinucleotídeo ou de um polipeptideo associado ao câncer. Reagentes que modulam a expressão, estabilidade, quantidade de um polinucleotídeo ou a atividade de um polipeptideo podem ser uma proteína, um peptídeo, um peptídeomimético, um ácido nucléico, ou um análogo de ácido nucléico (por exemplo, ácido peptidonucléico, ácido nucléico bloqueado), ou uma molécula pequena. A presente invenção também fornece um método para diagnóstico de um paciente, caracterizado por compreender uma etapa de análise do nível de expressão de um ou mais genes e/ou produtos de genes, em que a expressão do gene e/ou nível de seu produto em amostras normais e de pacientes são analisados, e uma variação no nível de expressão do gene e/ou nível de seu produto em amostras normais e de pacientes fornecem o diagnóstico de uma doença. As amostras dos pacientes podem ser, entre outras, sangue, líquido amniótico, sêmen, medula óssea e tecido para biópsia. Em outra concretização, os genes ou seus produtos são VEGF e VEGFR, de preferência VEGFR-2, e suas formas solúveis (por exemplo, detecção de VEGFR2 acumulado).

A presente invenção fornece, ainda, um método para diagnóstico de câncer, que consiste em medir a atividade polipeptídica em um indivíduo suspeito de ser portador da doença, de modo que se há uma diferença na atividade do polipeptídio, em relação à atividade em um indivíduo sob o qual não há suspeita de câncer, o paciente é diagnosticado como portador de câncer. Em outra concretização os polipeptídeos são VEGF e VEGFR, de preferência VEGFR-2, e suas formas solúveis (por exemplo, detecção de VEGFR2 acumulado).

Em outra concretização, a invenção fornece um método de detecção de câncer em uma amostra retirada do paciente, no qual se utiliza um anticorpo de proteína para reagir com as proteínas dessa amostra. Em outra concretização o anticorpo é específico para VEGF e VEGFR, de preferência para VEGFR-2, e suas formas solúveis (por exemplo, detecção de VEGFR2 acumulado). Esses anticorpos podem ser gerados de modo rotineiro, por exemplo, para regiões expostas dos polipeptideos. Os anticorpos podem, por exemplo, ser gerados rotineiramente para um domínio extracelular de VEGFR-2, como por exemplo, um VEGFR-2 solúvel.

Outra concretização da presente invenção é um método para distinguir entre estados normal e patológico, compreendendo uma etapa de análise do nível de expressão de um ou mais genes e/ou produtos de genes, em que são analisados os níveis de expressão do gene e/ou de seu produto nos tecidos normal e doente, e em que uma variação do nível de expressão do gene e/ou de seu produto indica um estado patológico. Em outra concretização, o gene ou produto de gene é VEGF ou VEGFR-2.

Em outra concretização, a invenção refere-se a um método de determinação de fenótipo celular, compreendendo a detecção da expressão diferencial, em relação a células normais, de pelo menos um gene, em que este é expresso diferencialmente por pelo menos um fator de dois, ou pelo menos um fator de cinco, pelo menos um fator de vinte ou, pelo menos um fator de cinqüenta. Em outra concretização, o gene codifica VEGF e VEGFR, preferencialmente VEGFR-2.

Em. outra concretização ainda, a invenção refere-se a um método de determinação de fenótipo celular, compreendendo a detecção da expressão diferencial, em relação a células normais, de pelo menos um polipeptídeo, em que a proteína é expressa diferencialmente por, pelo menos, um fator de dois, ou pelo menos um fator de cinco, pelo menos um fator de vinte ou, pelo menos um fator de cinqüenta. Em outra concretização os polipeptideos são VEGF e VEGFR, de preferência VEGFR-2, e suas formas solúveis (por exemplo, detecção de VEGFR2 acumulado).

Em outra concretização, a invenção refere-se a um método para determinação de fenótipo celular de um paciente, por meio de uma sonda de ácido nucléico, que contém uma seqüência de nucleotideos com pelo menos 10, pelo menos 15, pelo menos 25 ou, pelo menos cerca de 40 nucleotideos consecutivos; obtenção de amostra celular do paciente; opcionalmente, disponibilização de uma segunda amostra de células - todas substancialmente não-cancerosas; contato da sonda de ácido nucléico, sob condições estringentes, com mRNA de cada uma das amostras celulares; e comparação: a) do nivel de hibridização da sonda com mRNA da primeira amostra de células, com b) nivel de hibridização da sonda com mRNA da segunda amostra de células, onde a diferença desses níveis de hibridização por, pelo menos, um fator de dois, pelo menos um fator de cinco, pelo menos um fator de vinte, ou pelo menos um fator de cinqüenta, é indicativo do fenótipo celular da primeira amostra de células. Em outra concretização, a sonda de ácido nucléico contém uma seqüência de nucleotideos que codifica VEGF e/ou VEGFR, preferencialmente VEGFR-2.

Em outra concretização, a invenção disponibiliza um kit de teste para monitoramento da eficácia de um composto ou terapia sobre células ou tecidos cancerosos, contendo uma sonda/um primer para medida do nivel de um ácido nucléico em uma amostra de células isoladas de um paciente. Em algumas concretizações, o kit pode incluir, ainda, instruções de uso, soluções para suspensão ou fixação das células, marcadores identificáveis, soluções para tornar um ácido nucléico suscetível a hibridização, soluções para Iise celular, ou soluções para purificação de ácidos nucléicos. Em outra concretização, a sonda/o primer inclui uma seqüência de nucleotídeos codificadora de VEGF e/ou VEGFR,

preferencialmente VEGFR-2.

Em uma concretização, a invenção apresenta um kit de teste para identificação da presença de células ou tecidos cancerosos, contendo um anticorpo específico para uma proteína. Em certas concretizações, o kit inclui, ainda, instruções de uso. Em algumas concretizações, o kit pode incluir, ainda, soluções para suspensão ou fixação das células, marcadores identificáveis, soluções para tornar um polipeptídeo suscetível de se ligar a um anticorpo, soluções para Iise celular, ou soluções para purificação dos polipeptídeos. Em outra concretização, o anticorpo é específico para VEGF e/ou sVEGFR, de preferência, sVEGFR-2.

Em outra concretização, a invenção disponibiliza um kit de teste para monitoramento da eficácia de um composto ou terapia sobre células ou tecidos cancerosos, contendo uma sonda/um primer para medida do nível de um ácido nucléico em uma amostra de células isoladas de um paciente. Em algumas concretizações, o kit pode incluir, ainda, instruções de uso, soluções para suspensão ou fixação das células, marcadores identificáveis, soluções para tornar um ácido nucléico suscetível a hibridização, soluções para lise celular, ou soluções para purificação de ácidos nucléicos. Em outra concretização, a sonda/o primer contém a seqüência nucleotídica codificadora de VEGF e/ou VEGFR.

Em uma concretização, a invenção apresenta um kit de teste para monitoramento da eficácia de um composto ou terapia sobre células ou tecidos cancerosos, contendo um anticorpo específico para uma proteína. Em algumas concretizações, o kit também inclui instruções de uso. Em certas concretizações, o kit pode incluir, ainda, soluções para suspensão ou fixação de células, marcadores identificáveis, soluções para tornarem um polipeptídeo suscetível à ligação a um anticorpo, soluções para lise de células, ou soluções para purificação dos polipeptídeos. Em outra concretização, o anticorpo é específico para VEGF e/ou VEGFR-2, como seu domínio extracelular solúvel.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Deve ficar claro que a presente invenção não se limita, em particular, à metodologia, protocolos, linhagens celulares, espécies ou gêneros de animais, construções e reagentes descritos; eles podem variar. Também deve ser entendido que a terminologia utilizada aqui tem por objetivo apenas a descrição de concretizações específicas. Ela não visa limitar o escopo da presente invenção, o qual se limitará somente pelas reivindicações anexas.

É preciso observar que, neste documento e nas reivindicações que o acompanham, as formas singulares "um", "e" e "o" incluem referências plurais, exceto se o contexto indicar, claramente, o contrário. Assim, por exemplo, a referência a "um gene" estende-se a um ou mais genes e inclui seus equivalentes, conhecidos das pessoas versadas na técnica, e assim por diante.

Exceto se definidos de outra forma, todos os termos técnicos e científicos aqui utilizados têm o mesmo significado que lhes é atribuído normalmente, por pessoas com conhecimento básico da área à qual a invenção pertence. Embora quaisquer métodos, dispositivos e materiais similares ou equivalentes àqueles aqui descritos possam ser usados na prática da invenção (ou para testá-la), preferem-se aqueles métodos, dispositivos e materiais aqui descritos.

Todas as publicações e patentes aqui mencionadas são incorporadas a este documento por referência, com o propósito de descrever e apresentar, por exemplo, as construções e as metodologias descritas nas publicações e que podem ser usadas em conexão com a invenção ora descrita. As publicações discutidas acima e ao longo de todo o texto são apresentadas apenas quanto aos seus aspectos divulgados antes do depósito da presente invenção. Nada aqui deve ser interpretado como uma admissão de que os inventores não sejam os titulares da invenção, em virtude de falta de novidade nela.

DEFINIÇÕES

Para facilitar, são dados abaixo os significados de certos termos e expressões empregados na especificação, nos exemplos e nas reivindicações.

Um "endereço" em um array (por exemplo, um microarray) se refere à posição em que um elemento, por exemplo, um oligonucleotideo, está ligado na superfície sólida do array.

O termo "agonista", como usado aqui, refere-se a um agente que imita ou regula (por exemplo, potência ou suplementa) a bioatividade de uma proteína. Um agonista pode ser uma proteína selvagem, ou um derivado dela que possua, pelo menos, uma bioatividade da proteína selvagem. Um agonista pode, também, ser um composto que regula a expressão de um gene ou que aumenta, pelo menos, uma bioatividade de uma proteína. Um agonista pode ser, ainda, um composto que aumente a interação de um polipeptídeo com outra molécula, por exemplo, um peptídeo ou ácido nucléico alvos.

"Amplificação", como usado aqui, se refere à produção de cópias adicionais de uma seqüência de ácidos nucléicos. Por exemplo, a amplificação pode ser feita usando tecnologia de reação em cadeia de polimerase (PCR) , que é bem conhecida na área (ver, por exemplo, Dieffenbach and Dveksler (1995) PCR Primerf Ά Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview, N.Y.).

"Antagonista", como usado aqui, refere-se a um agente que regula (por exemplo, suprime ou inibe), pelo menos, uma bioatividade de uma proteína. Sorafenib é um exemplo de antagonista. Um antagonista pode ser um composto que inibe ou diminui a interação entre uma proteína e outra molécula como, por exemplo, um peptídeo alvo ou um substrato enzimático. Um antagonista pode ser, também, um composto que regula - para menos - a expressão de um gene ou que reduz a quantidade presente de uma proteína expressada.

O termo "anticorpo", como usado aqui, inclui anticorpos inteiros como, por exemplo, os de qualquer isotipo (IgG, IgA, IgM, IgE, etc.), e seus fragmentos, os quais também são especificamente reativos frente a uma proteína de um vertebrado (por exemplo, de um mamífero) . Anticorpos podem ser fragmentados através de técnicas convencionais, e os fragmentos testados quanto à sua utilidade da mesma forma descrita acima para os anticorpos integrais. Sendo assim, o termo inclui segmentos de uma molécula de anticorpo quebrada proteoliticamente ou preparada por recombinação, capazes de reagir seletivamente com uma certa proteína. Exemplos não limitantes desses fragmentos proteolíticos e/ou recombinantes incluem Fab, F(ab')2, Fab1, Fv, e anticorpos de cadeia única (scFv) contendo um domínio V[L] e/ou V[H] unidos por um ligante peptídico. Os anticorpos scFv podem ser ligados covalentemente, ou não, para formar anticorpos com dois ou mais sítios de ligação. O objeto da presente invenção inclui anticorpos policlonais e monoclonais, bem como outras preparações purificadas de anticorpos e de anticorpos recombinantes.

Os termos "arranjo" ou "matriz" se referem a um arranjo de locais endereçáveis ou "endereços" em um dispositivo. Os locais podem se organizados em arranjos bi- dimensionais, tri- dimensionais, ou em outros formatos de matrizes. O número de locais pode variar de alguns até, pelo menos, centenas de milhares. Principalmente, cada local representa um sítio de reação totalmente independente. Um "arranjo de ácidos nucléicos" se refere a qualquer arranjo contendo sondas de ácido nucléico, como oligonucleotídeos ou porções maiores de genes. 0 ácido nucléico no arranjo deve ser, de preferência, de cadeia simples. Arranjos nos quais as sondas são oligonucleotídeos são chamados "arranjos de oligonucleotídeos" ou "chips de oligonucleotídeos". Um "microarray", também denominado "biochip" ou "chip biológico" é um arranjo de regiões com uma densidade de regiões discretas de, pelo menos, cerca de 100/cm2 e, de preferência, pelo menos cerca de 1000/cm2. As regiões em um microarray têm dimensões típicas - por exemplo, diâmetros na faixa entre cerca de 10-250 μπι, e são separadas das outras regiões no arranjo, mais ou menos, pela mesma distância.

Os termos "atividade biológica" ou "bioatividade" ou "atividade" ou "função biológica," que são intercambiáveis, significam uma função efetora ou antigênica que é desempenhada direta ou indiretamente por um polipeptideo (em sua conformação nativa ou em uma desnaturada), ou qualquer subseqüência dele. Atividades biológicas incluem ligação a polipeptideos (ou a outras proteínas ou outras moléculas), atividade como proteína de ligação a DNA, como um regulador de transcrição, capacidade de se ligar a um DNA danificado, etc. Uma bioatividade pode ser modulada por um efeito direto sobre o próprio polipeptideo. Alternativamente, uma bioatividade pode ser alterada por modulação no nível do polipeptideo, como ao se modular a expressão do gene correspondente a ele.

0 termo "amostra biológica", como utilizado aqui, se refere a uma amostra obtida de um organismo ou de componentes (por exemplo, células) de um organismo. A amostra pode ser qualquer tecido ou fluido biológico, e pode ser oriunda de um paciente. Tais amostras incluem, entre outras, escarro, sangue, células sangüíneas (por exemplo, glóbulos brancos), tecidos ou material de biópsia (por exemplo, biópsia de tumor), urina, fluidos peritoneal e pleural, ou células deles. As amostras biológicas' podem incluir, ainda, seções de tecidos, como as seções congeladas obtidas com objetivo histológico.

O termo "biomarcador" ou "marcador" engloba um gama variada de eventos intra- e extra-celulares, bem como mudanças fisiológicas em um organismo como um todo. Biomarcadores podem representar, essencialmente, qualquer aspecto da função celular como, por exemplo, níveis ou razão de produção de moléculas sinalizadoras, fatores de transcrição, metabólitos, transcritos de genes e modificações pós-traducionais de

proteínas. Biomarcadores podem incluir análise genômica

completa de níveis de transcrição ou análise proteômica

completa dos níveis e/ou das modificações protéicas.

Um biomarcador pode ser, também, um gene ou um produto gênico que é regulado, para mais ou para menos, em uma célula doente, tratada com um dado composto, em comparação com outra célula doente, não-tratada. Ou seja, o gene ou produto gênico é suficientemente específico para a célula tratada, de modo que pode ser usado - opcionalmente, com outros genes ou produtos gênicos -, para identificar, predizer ou detectar a eficácia de uma molécula pequena. Assim, um biomarcador é um gene, ou produto gênico, característico da eficácia de um composto sobre uma célula doente ou da resposta dessa célula ao tratamento com aquele composto.

Uma seqüência de nucleotídeos é "complementar" a outra se cada uma das bases das duas seqüências é compatível, ou seja, são capazes de formar um par de bases de Watson-Crick. O termo "fita complementar" é usado aqui como sinônimo de "complemento". O complemento de uma fita de ácidos nucléicos pode ser o complemento de uma fita codificadora ou de uma não- codificadora.

A expressão "agentes detectores de genes" se refere a agentes que podem ser usados para detectar, especificamente, o gene ou outra molécula biológica a ele relacionada; por exemplo, RNA transcrito por um dado gene ou polipeptídeos codificados por um certo gene. Agentes de detecção típicos são as sondas de ácidos nucléicos, que se hibridizam aos ácidos nucléicos correspondentes ao gene, e os anticorpos.

0 termo "câncer" inclui, entre outros, os tumores sólidos como o câncer de mama, o do trato respiratório, do cérebro, dos órgãos reprodutores, do trato digestivo, das vias urinárias, dos olhos, de fígado, de pele, de cabeça e pescoço, da tireóide, da paratireóide, e suas metástases distantes. 0 termo ainda inclui os linfomas, sarcomas e leucemias.

Exemplos de câncer de mama são, entre outros, o carcinoma ductal invasivo, o carcinoma lobular invasivo, o carcinoma ductal in situ, e o carcinoma lobular in situ.

Exemplos de cânceres do trato respiratório incluem, entre outros, o carcinoma de pequenas células e o de não-pequenas células do pulmão, o adenoma brônquico e o blastoma pleuropulmonar.

Exemplos de cânceres de cérebro incluem, sem se limitar a estes, os gliomas do tronco cerebral e o hipoftalmico, os astrocitomas do cerebelo e cerebral, o meduloblastoma, o ependimoma, e os tumores neuroectodermal e pineal.

Tumores dos órgãos reprodutores masculinos incluem, entre outros, o câncer de próstata e o de testículos. Os dos órgãos reprodutores femininos incluem, sem se limitar a, o câncer endometrial, o cervical, ο de ovários, o de vagina e o vulvar, assim como o sarcoma de útero.

Tumores do trato digestivo incluem o câncer anal, o de cólon, o colorretal, o de esôfago, o de vesicula biliar, o de estômago, o de pâncreas, o de reto, o de intestino delgado e o das glândulas salivares, sem se limitar a estes.

Tumores do trato urinário incluem o câncer de bexiga, o de pênis, o dos rins, o da pelve renal (por exemplo, o carcinoma de células renais), o da uretra e dos canais uretrais, entre outros.

Cânceres dos olhos incluem o melanoma intra-ocular e o retinoblastoma, sem se limitar a eles.

Exemplos de cânceres hepáticos incluem, entre outros, o carcinoma hepatocelular (carcinomas de células do fígado com ou sem variante fibrolamelar), colangiocarcinoma (carcinoma do duto biliar intra-hepático), e o carcinoma misto colangio- hepatocelular.

Cânceres de pele incluem o carcinoma de células escamosas, o sarcoma de Kaposi, o melanoma maligno, o câncer de pele de célula de Merkel e o câncer de pele não-melanoma, entre outros. Entre os cânceres de cabeça e pescoço incluem-se o de laringe, o de hipofaringe, o de nasofaringe e da orofaringe, além do câncer de lábios e o da cavidade oral, entre outros.

Os linfomas incluem aqueles relacionados à AIDS, o linfoma não-Hodgkin, o de células T cutâneas, a doença de Hodgkin e o linfoma do sistema nervoso central, mas não se limitam a estes.

Os sarcomas incluem, entre outros, sarcoma de tecido mole, osteossarcoma, histiocitoma fibroso maligno, linfossarcoma e rabdomiossarcoma.

Entre as leucemias incluem-se a mielóide aguda, a linfoblástica aguda, a linfocitica crônica, a mielogenosa crônica e a leucemia de células pilosas.

A expressão "uma célula doente de câncer" refere-se a uma célula presente em indivíduos com câncer. Ou seja, uma forma modificada de uma célula normal, e que não esteja presente em indivíduos não portadores de câncer, ou uma célula que esteja presente em um número significativamente maior - ou menor - do que naqueles indivíduos que não têm câncer.

O termo "equivalente" significa seqüências nucleotídicas que codificam polipeptídeos funcionalmente equivalentes. Seqüências nucleotídicas equivalentes podem incluir aquelas que diferem por uma ou mais substituições, adições ou eliminações de nucleotídeos, tais como as variantes alélicas. O termo "perfil de expressão", que aqui é usado de maneira intercambiável "perfil de expressão gênica" e "fingerprint" de uma célula refere-se a um conjunto de valores que representam os níveis de mRNA de um ou mais genes em uma célula. Um perfil de expressão contém, de preferência, valores representativos dos níveis de expressão de, pelo menos, 10 genes, especialmente de, pelo menos, 50, 100, 200 ou mais genes. Os perfis de expressão podem conter, também, um nível de mRNA de um gene que seja expresso em níveis similares em diversas células e condições (por exemplo, um gene de monitoramento remoto, como o GAPDH). Por exemplo, um perfil de expressão de uma célula doente de câncer se refere a um conjunto de valores que representam os níveis de mRNA de 10 ou mais genes em uma célula doente.

O termo "gene" se refere a uma seqüência de ácidos nucléicos que controla e codifica as seqüências necessárias à produção de um polipeptídeo ou precursor. O polipeptídeo pode ser codificado por uma seqüência completa ou por uma porção da seqüência codif icadora. O gene pode ser derivado, no todo ou em parte, de qualquer fonte conhecida incluindo plantas, fungos, animais, genoma ou episoma de bactérias, eucariontes, DNA nuclear ou plasmídeo, cDNA, DNA viral, ou DNA sintetizado quimicamente. Um gene pode conter uma ou mais modificações, seja nas regiões codificadoras ou nas não-traduzidas, as quais podem afetar a atividade biológica ou a estrutura química do produto expresso, a velocidade ou a forma de controle da expressão. Tais modificações incluem, entre outras, mutações, inserções, eliminações e substituições de um ou mais nucleotídeos. O gene pode constituir uma seqüência

codificadora ininterrupta ou incluir um ou mais introns, ligados pelas junções de processamento (splicing) apropriadas.

O termo "hibridização" se refere a qualquer processo pelo qual uma fita de ácido nucléico se liga a uma fita complementar, por meio do pareamento de bases. Por exemplo, dois ácidos nucléicos de fita simples "hibridizam" quando formam um conjunto de dupla fita. A região de formação de fita dupla pode incluir toda a extensão de um, ou dos dois ácidos nucléicos de fita simples, ou um ácido nucléico de fita simples completo e uma subseqüência de outro, ou ainda, a região de formação de dupla fita pode incluir uma subseqüência de cada um dos ácidos nucléicos. 0 termo "hibridização" também inclui a formação de duplex contendo alguns erros, desde que as duas fitas continuem formando uma dupla hélice. A expressão "condições estritas de hibridização" refere-se a condições, que resultam em hibridização essencialmente especifica.

O termo "isolado", como usado aqui, aplicado a ácidos nucléicos como o DNA ou o RNA, refere-se a moléculas separadas de outros DNAs ou RNAs, respectivamente, presentes na fonte natural da macromolécula. O termo "isolado" como usado aqui, também se refere a um ácido nucléico ou peptideo substancialmente livre de material celular ou viral, ou de meio de cultura - quando produzido por técnicas de DNA recombinante -, ou de precursores químicos ou outros reagentes - quando sintetizado quimicamente. Além disso, um "ácido nucléico isolado" pode incluir fragmentos de ácido nucléico, que não ocorram na natureza como fragmentos e que não seriam encontrados em estado natural. 0 termo "isolado" é usado aqui, também, para se referir a polipeptideos isolados de outras proteinas celulares, englobando tanto os purificados quanto os recombinantes.

- Os termos "marcador" e "marcador detectável", como utilizados aqui, referem-se a uma molécula passível de detecção, entre outros, isótopos radioativos; materiais fluorescentes e quimioluminescentes; substratos, co-fatores e inibidores de enzimas; corantes; íons metálicos; ligantes (p. ex., biotina ou haptenos), e assemelhados. 0 termo "fluofóro" refere-se a uma substância ou porção dela, capaz de exibir fluorescência na faixa detectável. Exemplos particulares de marcadores passíveis de serem usados na presente invenção incluem fluoresceína, rodamina, dansila, umbeliferona, vermelho do Texas, luminol, NADPH, alfa- e beta-galactosidase, e peroxidase da raiz forte.

Como usado aqui, o termo "nível de expressão" refere-se ao nível de expressão mensurável de um dado ácido nucléico. 0 nível de expressão de um ácido nucléico pode ser determinado por métodos bem conhecidos na área. 0 termo "expresso de modo diferencial" ou "expressão diferencial" refere-se a um aumento, ou a uma diminuição no nível mensurável de expressão de um dado ácido nucléico. Como usadas aqui, "expresso de modo diferencial" e "expressão diferencial" significam que a diferença no nível de expressão de um ácido nucléico em duas amostras usadas para comparação é, pelo menos, igual ou maior que 1,4 vezes, sendo ambas comparadas com a mesma amostra normal, usada como padrão. De acordo com a presente invenção, as expressões "expresso de modo diferencial" e "expressão diferencial" também significam uma diferença de 1,4 vezes, ou mais, de até 2, 5, 10, 20, 50 ou mais vezes, inclusive, no nivel de expressão de um ácido nucléico em duas amostras usadas para comparação. Também se diz que um ácido nucléico é "expresso de modo diferencial" em duas amostras, se uma delas não tem expressão detectável de um dado ácido nucléico, enquanto na outra o ácido nucléico é expresso em mais ou menos, pelo menos, 1,4 vezes. A expressão diferencial de uma seqüência de ácido nucléico é "inibida" se a diferença no nivel de expressão dele em duas ou mais amostras usadas para comparação, for alterada de modo que não haja mais uma diferença de pelo menos 1,4 vezes. A quantificação absoluta do nivel de expressão de um ácido nucléico pode ser obtida incluindo-se uma concentração conhecida de um ou mais ácidos nucléicos, usados como controle, e gerando-se uma curva-padrão baseada na quantidade do ácido nucléico usado como controle e extrapolando-se o nivel de expressão do ácido nucléico "desconhecido" pelas intensidades de hibridização deste em relação à curva-padrão.

Como aqui utilizado, o termo "ácido nucléico" refere-se a polinucleotideos como o ácido desoxirribonucléico (DNA) e, onde apropriado, ácido ribonucléico (RNA). Pode-se admitir também que o termo inclua, como equivalentes, análogos do RNA e do DNA feitos de análogos de nucleotideos e, se aplicáveis à concretização sendo descrita, polinucleotideos de fita simples (sense ou anti-sense) e de fita dupla. Cromossomos, cDNAs, mRNAs, rRNAs, e ESTs são exemplos representativos de moléculas que podem ser incluídas entre os ácidos nucléicos.

O termo "oligonucleotídeo" como utilizado aqui, se refere a uma molécula de ácido nucléico contendo, for exemplo, entre cerca de 10 até cerca de 1000 nucleotideos. Oligonucleotideos aplicáveis à presente invenção devem ter, preferencialmente, entre cerca de 15 até cerca de 150 , especialmente entre cerca de 150 e cerca de 1000 nucleotideos, em comprimento. O oligonucleotídeo pode ser de ocorrência natural ou sintético.

Esses nucleotideos podem ser preparados pelo método do fosforamidito (Beaucage and Carruthers, Tetrahedron Lett. 22:1859-62, 1981), pelo método do tri-éster (Matteucci, et al., J. Am. Chem. Soe. 103:3185, 1981), ou por quaisquer outros métodos químicos conhecidos.

Os termos "paciente" ou "indivíduo", como usados aqui, incluem os mamíferos (seres humanos e animais).

Como utilizado aqui, um ácido nucléico ou outra molécula ligada a um arranjo é chamada de "sonda" ou "sonda de captura." Quando um arranjo contém diversas sondas correspondentes a um gene, essas sondas são chamadas um "conjunto gene-sonda". Este pode consistir, por exemplo, cerca de 2 até cerca de 20 sondas, preferencialmente, de cerca de 2 até cerca de 10 sondas e, especialmente, de 5 sondas. O "perfil" do estado biológico de uma célula se refere aos níveis dos vários componentes da célula que, sabidamente, sofrem alteração em resposta a tratamentos com drogas e a outras perturbações do estado biológico da célula. Esses componentes incluem, por exemplo, níveis de RNA, níveis excessivos de proteína, ou níveis de atividade de proteína.

Os termos "proteína", "peptídeo" e "polipeptídeo" são usados aqui como sinônimos.

Um perfil de expressão em uma célula é "similar" ao de outra quando os níveis de expressão de genes nos dois perfis são suficientemente semelhantes, de tal modo que essa similaridade indique uma característica em comum, por exemplo, de um mesmo tipo de célula. Desse modo, os perfis de expressão de duas células são similares quando, pelo menos, 75% dos genes expressos na primeira são expressos na segunda em um nível que está dentro de um fator de cerca de dois em relação ao da primeira célula.

A expressão "molécula pequena," como usada aqui, refere- se a um composto com peso molecular menor que cerca de 5 kD, de preferência, menor que cerca de 4 kD. Podem ser consideradas moléculas pequenas os ácidos nucléicos, os peptídeos, os polipeptídeos, os peptidomiméticos, os carboidratos, os lipídios, e outras moléculas orgânicas ou inorgânicas. Diversas companhias farmacêuticas possuem bibliotecas abrangentes de misturas químicas e/ou biológicas - freqüentemente, extratos de fungos, bactérias ou algas -, que podem ser testadas com quaisquer dos ensaios da invenção a fim de identificar compostos capazes de modular uma bioatividade.

O termo "hibridização especifica" de uma sonda ao sítio- alvo de um modelo de ácido nucléico se refere à hibridização da sonda, predominantemente ao alvo, de modo que o sinal da hibridização possa ser interpretado claramente. Como descrito em detalhes neste texto, as condições que resultam em hibridização especifica variam, dependendo do tamanho da região de homologia, do conteúdo GC da região, e da temperatura de fusão ("Tm") do híbrido. Sendo assim, as condições de hibridização podem variar em conteúdo salino, acidez e temperatura das soluções de hibridização e de lavagem.

Uma "variante" de polipeptídeo é uma molécula polipeptídica que tem uma seqüência de aminoácidos onde um ou mais resíduos está alterada. A variante pode ter alterações "conservadas", em que o aminoácido é substituído por outro com estrutura ou propriedades químicas semelhantes (p/ex., substituição de leucina por isoleucina) . Ou pode ter alterações "não-conservadas" (p/ex., substituição de glicina por triptofano). Variações análogas de menor alcance podem incluir eliminações ou inclusões de aminoácidos, ou ambos. Diretrizes para determinar quais resíduos de aminoácidos podem ser substituídos, inseridos ou excluídos sem perda de atividade biológica ou imunológica podem ser obtidas pelo uso de programas de computador bem conhecidos como, por exemplo, o LASERGENE (DNASTAR). O termo "variante", quando utilizado no contexto de uma seqüência de polinucleotideos, pode englobar uma seqüência relacionada com a de um gene em particular ou com a seqüência que o codifica. Esta definição pode incluir também, por exemplo, variantes "alélicas", "de processamento", "de espécies" ou "polimórficas". Uma variante de processamento pode ter identidade significativa com uma molécula de referência, mas terá, em geral, um número maior ou menor de polinucleotideos devido ao processamento alternado de exons durante o splicing do mRNA. 0 polipeptideo correspondente pode possuir domínios funcionais adicionais ou não ter esses domínios.Variantes de espécies são seqüências polinucleotídicas que variam de uma espécie para outra. Os polipeptídeos resultantes terão, em geral, uma identidade significativa dos aminoácidos, em relação uns aos outros. Uma variante polimórfica é aquela relativa à seqüência polinucleotídica de um gene em particular, entre indivíduos de uma mesma espécie. Ela pode, também, incluir "polimorfismo de nucleotídeo único" (SNPs) em que a seqüência de polinucleotideos varia por uma base. A presença de SNPs pode indicar, por exemplo, uma certa população, um estado patológico, ou uma propensão para um estado patológico.

Um aspecto da invenção dirige-se à identificação de agentes capazes de modular a diferenciação e a proliferação de células caracterizadas por proliferação aberrante. Mais especificamente, a invenção se refere a métodos de rastreamento de compostos candidatos por sua habilidade em regular a expressão diferencial de seqüências de ácidos nucléicos. Ou seja, se uma seqüência de ácidos nucléicos for superexpressa em células de câncer, então, os compostos candidatos serão testados quanto à sua habilidade em diminuir a expressão; se uma seqüência de ácido nucléico for subexpressa nas células com câncer, então o composto candidato será avaliado quanto à sua capacidade de aumentar a expressão. Além disso, a invenção se refere a ensaios de rastreamento para identificar substâncias capazes de modular a atividade de um ou mais polipeptideos codificados pelas seqüências expressas de modo diferencial, aqui descritas. Sob este aspecto, a invenção apresenta ensaios para a determinação de compostos moduladores da expressão de ácidos nucléicos marcadores e/ou capazes de alterar a bioatividade do polipeptideo codificado.

Rastreamento para modulação de expressão diferencial

O rastreamento de drogas é realizado adicionando-se um composto-teste (p/ex., sorafenib e seus diaril-urea-derivados) a uma amostra de células e monitorando o efeito. Paralelamente, monitora-se uma outra amostra, que não recebeu o composto-teste, como controle. As células tratadas e as não-tratadas são comparadas por meio de qualquer critério fenotipico aplicável, entre eles análise microscópica; teste de viabilidade; capacidade de replicação; exame histológico; nivel de um dado RNA ou polipeptideo associados com as células; nivel de atividade enzimática expressa pelas células ou lisados celulares; e a capacidade das células de interagir com outras ou com compostos. Diferenças entre as células tratadas e as não-tratadas indicam efeitos atribuíveis ao composto-teste.

Efeitos desejáveis de um composto-teste incluem aqueles observados em qualquer fenótipo, atribuídos a uma seqüência de ácido nucléico marcador associada ao câncer. Como exemplo tem-se um composto-teste que limita o excesso de mRNA, limita a produção da proteína codificada, ou limita o efeito funcional da proteína. 0 efeito do composto-teste aparecerá ao se comparar os resultados observados nas células tratadas com os nas células não-tratadas.

A invenção, portanto, também inclui métodos de rastreamento de agentes p/ex., sorafenib e seus derivados diaril-urea), que inibam ou aumentem a expressão de ácidos nucléicos marcadores in vitro, compreendendo a exposição da célula ou tecido no qual o mRNA marcador (p/ex., VEGF ou VEGFR-2) é detectável em células cultivadas, a um agente, de modo a determinar se este é capaz de inibir ou favorecer a produção do mRNA; e compreendendo também a determinação do nível de mRNA nas células ou tecidos expostos, sendo que a diminuição no nível de mRNA após. a exposição da linhagem celular ao agente indica a inibição da produção do mRNA marcador, enquanto um aumento nos níveis de mRNA indica uma estimulação da produção do mRNA marcador.

Alternativamente, o método pode incluir o rastreamento in vitro de uma célula ou tecido, no qual a proteína marcadora é detectável; submete-se células cultivadas, nas quais esse marcador seja detectável, a um agente que se acredita inibir ou promover a produção da dita marcadora, e determina-se o nível da proteína marcadora nas células ou tecidos. Um decréscimo no nível da proteína marcadora após exposição das células ou do tecido ao agente é um indicativo da inibição da produção da proteína marcadora e aumento no nível dessa proteína, indicando um incremento em sua produção.

A invenção contempla também métodos de rastreamento in vivo de agentes inibidores ou ativadores da expressão de ácidos nucléicos marcadores, métodos esses caracterizados por expor um indivíduo que possua células tumorais, nas quais mRNA ou proteína marcadores são detectáveis, a um agente que, se acredita, inibe ou favorece a produção desses marcadores; os métodos compreendem ainda a determinação do nível do mRNA ou proteína marcadores nas células tumorais do mamífero exposto. Uma diminuição no nível de mRNA ou proteína marcadores após a exposição do indivíduo ao agente indica inibição da expressão do ácido nucléico marcador; aumento no nível do mRNA ou proteína marcadores indica a estimulação da expressão do marcador.

Sendo assim, a invenção apresenta um método caracterizado por incubar uma célula, que expressa ácidos nucléicos marcadores, com um composto-teste e medir o nível de mRNA ou proteína. A invenção compreende ainda, um método para determinação quantitativa do nível de expressão dos ácidos nucléicos marcadores em uma população de células, e um método para determinar se um agente é capaz de elevar ou diminuir o nível de expressão dos ácidos nucléicos marcadores em uma população de células. Este método compreende as etapas de: (a) preparação dos extratos celulares a partir das populações de células de controle e das tratadas pelo agente, (b) isolamento dos polipeptideos marcadores a partir dos extratos de células, e (c) quantificação (p/ex., em paralelo) da quantidade de um imunocomplexo formado entre o polipeptídeo marcador e um anticorpo específico para ele. Os polipeptideos da presente invenção também podem ser quantificados por meio de testes de sua bioatividade. Agentes que induzem um aumento na expressão do ácido nucléico marcador podem ser identificados pela sua capacidade de aumentar a quantidade do imunocomplexo formado na célula tratada, em comparação com a formada na célula de controle. De modo semelhante, agentes que diminuem a expressão de um ácido nucléico marcador podem ser identificados por sua capacidade de diminuir a quantidade de imunocomplexo formado no extrato da célula tratada, em comparação com as da célula-controle.

A presente invenção apresenta seqüências isoladas de ácidos nucléicos, que são reguladas de modo diferencial no câncer, e um método de identificação dessas seqüências. A presente invenção também apresenta um método de identificação de uma seqüência de nucleotídeos, que é regulada diferencialmente em um indivíduo com câncer, caracterizada por: hibridizar uma amostra de ácido nucléico correspondente ao RNA obtido do indivíduo, a uma amostra de ácido nucléico contendo uma ou mais moléculas de um ácido nucléico conhecido; e medir a hibridização da amostra de ácido nucléico a uma ou mais moléculas de um ácido nucléico de identidade conhecida, em que a diferença de duas vezes na hibridização da amostra em relação a outra, obtidá de um indivíduo sem câncer, indica a expressão diferencial da seqüência de nucleotídeos em um indivíduo com câncer.

No geral,a presente invenção apresenta um método para identificação de seqüências de ácido nucléico reguladas de modo diferencial em um indivíduo com câncer. O método compreende o isolamento de RNA mensageiro do indivíduo, geração de cRNA a partir da amostra de mRNA, hibridização do cRNA em um microarray contendo diversas moléculas de ácido nucléico associadas de modo estável e localizações distintas no arranjo, e identificação dos padrões de hibridização do cRNA no arranjo. De acordo com a presente invenção, diz-se que a molécula de ácido nucléico que se hibridiza em uma dada localização no arranjo é regulada de modo diferencial se o sinal da hibridização for, pelo menos, duas vezes maior, ou menor, do que o sinal de hibridização na mesma localização, em um arranjo idêntico, hibridizado com uma amostra de ácido nucléico obtida de um indivíduo que não tenha câncer.

Microarrays para Determinação do Nível de Expressão de Genes

A determinação dos níveis de expressão de um gene pode ser feita utilizando-se microarrays. Geralmente, isso envolve as seguintes etapas: (a) obtenção de uma amostra de mRNA de um indivíduo, e preparação de ácidos nucléicos marcados, a partir dela (os "ácidos nucléicos alvo" ou "alvos"); (b) colocar os ácidos nucléicos alvo com um arranjo, sob condições suficientes para que os ácidos se liguem às sondas correspondentes no arranjo, por exemplo, por hibridização ou ligação especifica; (c) remoção, opcional, dos alvos não- ligados do arranjo; (d) detecção dos alvos ligados, e (e) análise dos resultados usando, por exemplo, métodos computadorizados. Como usados aqui, os termos "sondas de ácido nucléico" ou "sondas" são ácidos nucléicos ligados ao arranjo, ao passo que "ácidos nucléicos alvo" são ácidos nucléicos hibridizados no arranjo.

Amostras de ácido nucléico de um indivíduo podem ser obtidas para testes por métodos "invasivos" ou "não- invasivos". Um método de coleta de amostras é dito "invasivo" quando envolve a obtenção de ácidos nucléicos a partir da pele ou de órgãos de um animal (incluindo murinos, humanos, ovinos, eqüinos, bovinos, suínos, caninos, ou felinos). Exemplos de métodos invasivos são a coleta de sangue ou de sêmen, biópsia com agulha, aspiração pleural, biópsia de cordão umbilical. Exemplos desses tipos de métodos são discutidos por Kim, et al., {J. Virol. 66:387 9-3882, 1992); Biswas, et al., (Ann. NY Acad. Sci. 590:582-583, 1990); e Biswas, et al., (J. Clin. Microbiol. 29:2228-2233, 1991).

Métodos de coleta "não-invasivos", ao contrário, são aqueles em que as moléculas de ácido nucléico são obtidas de uma superfície interna ou externa do animal. Exemplos desses métodos incluem "lavagem," recolhimento de lágrimas, de saliva, de urina, de fezes, de suor e de cabelo. Em uma concretização da presente invenção, uma ou mais células do indivíduo a ser testado são obtidas e o RNA é isolado dessas células. Em uma concretização preferida, obtém-se uma amostra de leucócitos do sangue periférico (LSPs, ou PBLs - do inglês, peripheral blood leukocytes) do indivíduo. Também é possível obter uma amostra de células do paciente e, em seguida, enriquecer a amostra com o tipo celular desejado. Por exemplo, células podem ser isoladas de outras por meio de diversas técnicas, como o isolamento pela ligação de um anticorpo ao epítopo na superfície do tipo de célula desejado. Quando as células desejadas estão em um tecido sólido, células particulares podem ser dissecadas, por exemplo, por microdissecção ou por microdissecção de captura a laser (LCM) (ver, p/ex., Bonner, et al. , Science 278:1481, 1997; Emmert-Buck, et al. , Science 274:998, 1996; Fend, et al., Am. J. Path. 154:61, 1999; e Murakami, et al. , Kidney Int. 58:1346, 2000) .

O RNA pode ser extraído de amostras de tecidos ou de células através de diversos métodos como, por exemplo, lise com tiocianato de guanidina seguido por centrifugação com CsCl (Chirgwin, et al. , Biochemistry 18:52 94-52 99, 1979). 0 RNA de células isoladas pode ser obtido como descrito nos métodos de preparação de bibliotecas de cDNA a partir de células isoladas (ver, p/ex., Dulac, Curr. Top. Dev. Biol. 36:245, 1998; Jena, et al., J. Immunol. Methods 190:199, 1996).

A amostra de RNA pode ser enriquecida para uma espécie em particular. Por exemplo, em uma concretização, poli (A)+ RNA pode ser isolado de uma amostra de RNA. Em outra concretização, a população de RNA pode ser enriquecida nas seqüências de interesse por síntese primer-specífica de cDNA, ou por rodadas múltiplas de amplificação linear baseada na síntese de cDNA e transcrição dirigida a template in vitro (ver, p/ex., Wang, et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86:9717, 1989; Dulac, et al., supra; Jena, et al., supra). Além disso, a população de RNA, enriquecida ou não em espécies ou seqüências particulares, pode ser amplificada através de uma variedade de métodos, entre os quais PCR; reação em cadeia de ligase (LCR) (ver, p/ex., Wu and Wallace, Genomics 4:560, 1989; Landegren, et al., Science 241:1077, 1988); replicação de seqüência auto-sustentável (SSR) {ver, p/ex., Guatelli, et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87:1874, 1990); amplificação de seqüência baseada em ácido nucléico (NASBA) e amplificação de transcrição (ver, p/ex., Kwoh, et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86:1173, 1989). Métodos de tecnologia PCR são bem conhecidos na área (ver, p/ex., PCR Technology: Principies and Applications for DNA Amplification (ed. H. A. Erlich, Freeman Press, N.Y., N.Y., 1992); PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (eds. Innis, et al., Academic Press, San Diego, Calif., 1990); Mattila, et al., Nucleic Acids Res. 19:4967, 1991; Eckert, et al., PCR Methods and Applications 1:17, 1991; PCR (eds. McPherson et al., IRL Press, Oxford); e U.S. Pat. No. 4, 683, 202). Métodos de amplificação são descritos, por exemplo, por Ohyama, et al., (BioTechniques 29:530, 2000); Luo, et al., (Nat. Med. 5:117, 1999); Hegde, et al., (BioTechniques 29:548, 2000); Kacharmina, et al., (Meth. Enzymol. 303:3, 1999); Livesey, et al., (Curr. Biol. 10:301, 2000); Spirin, et al. , (Invest. Ophtalmol. Vis. Sei. 40:3108, 1999); e Sakai, et al., (Anal. Biochem. 287:32, 2000). Amplificaçao de RNA e síntese de cDNA também podem ser conduzidas em células ín situ (ver, p/ex., Eberwine, et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89:3010, 1992).

As moléculas de ácido nucléico podem ser marcadas a fim de permitir a detecção da hibridização delas em um microarray. Ou seja, a sonda pode conter um membro de um sistema produtor de sinal sendo, assim, detectável diretamente ou por meio de ações combinadas com um ou mais membros adicionais de um sistema produtor de sinais. Por exemplo, os ácidos nucléicos podem ser marcados com dNTP marcado com f luorescência (ver, p/ex., Kricka, 1992, Nonisotopic DNA Probe Techniques, Academic Press San Diego, Calif.), dNTPs biotinilados ou rNTP seguido da adição de streptavidina marcada, ou de marcadores quimioluminescentes, ou de isótopos. Outro exemplo de

marcação são os "faróis moleculares" descritos em Tyagi and Kramer (Nature Biotech. 14:303, 1996). A hibridização pode ser determinada também, por exemplo, por ressonância de plasmon (ver, p/ex., Thiel, et al. Anal. Chem. 69:4948, 1997).

Em uma concretização, diversos conjuntos (p/ex., 2, 3, 4, 5, ou mais) de alvos de ácidos nucléicos são marcados e usados em uma reação de hibridação (análise "multiplex"). Por exemplo, um conjunto de ácidos nucléicos pode corresponder ao RNA de uma célula e outro conjunto de ácidos nucléicos pode corresponder ao RNA de outra. Conjuntos diversos de ácidos nucléicos podem ser marcados com marcadores diferentes, por exemplo, substâncias fluorescentes diferentes (p/ex., fluoresceina e rodamina) com espectros de emissão distintos, de modo a poderem ser distinguidos. Os conjuntos também podem ser misturados e hibridizados simultaneamente sobre um microarray (ver, p/ex., Shena, et al., Science 270:467-470, 1995).

Microarrays para uso conforme a presente invenção incluem uma ou mais sondas de genes característicos da eficácia de uma molécula pequena. Em uma concretização preferida, o

microarray contém sondas correspondentes a um ou mais genes selecionados de um grupo de genes que são regulados para mais, e outros que são regulados para menos nos casos de câncer. 0 microarray pode conter sondas correspondentes a, pelo menos 10, preferencialmente, pelo menos 20, pelo menos 50, pelo menos 100 ou pelo menos 1000 genes característicos da eficácia de uma molécula pequena.

Pode haver uma ou mais sondas correspondentes a cada gene no microarray. Por exemplo, um microarray pode conter de 2 a 20 sondas correspondentes a um gene e, de preferência, entre 5 e 10. As sondas podem corresponder à seqüência integral de RNA, ou a complementos dele, de genes característicos da eficácia de uma molécula pequena; ou a sonda pode corresponder a uma porção desse gene, porção esta de tamanho suficiente para permitir hibridização específica. Tais sondas podem conter entre cerca de 50 nucleotídeos até cerca de 100, 200, 500, ou 1000, ou até mais. Como descrito aqui em mais detalhes, microarrays podem conter sondas de oligonucleotídeos consistindo de cerca de 10 até 50 nucleotideos, preferencialmente de cerca de 15 até 30 e, especialmente, mais de 20-25 nucleotideos. As sondas são, de preferência, de fita simples e deverão ter complementaridade suficiente ao alvo, de modo a permitir o nível desejado de hibridização da seqüência específica.

Tipicamente, os arranjos usados na presente invenção terão uma densidade local maior que 100 sondas diferentes por cm2. De preferência, os arranjos terão uma densidade local maior que 500/cm2, especialmente, maior que cerca de 1000/cm2, e mais particularmente, maior do que cerca de 10.000/cm2. De preferência, os arranjos terão mais de 100 sondas diferentes em um único substrato, especialmente mais de 1000, ainda mais especialmente, mais de 10.000 e, particularmente, mais de 100.000 sondas diferentes em um único substrato.

Diversas configurações diferentes de microarrays e métodos para sua produção são conhecidos por pessoas versadas na técnica; elas podem ser encontradas nas patentes norte- americanas de n°: 5,242,974; 5,384,261; 5,405,783; 5,412,087;

5, 424, 186; 5,429,807 5,436,327 5,445,934 5,556,752 5, 405, 783; 5,412,087 5,424,186 5,429,807 5,436,327 5, 472, 672; 5,527,681 5,529,756 5,545,531 5,554,501 5, 561, 071; 5,571,639 5,593,839 5,624,711 5,700,637 5, 744, 305; 5,770,456 5,770,722 5,837,832 5,856,101 5, 874, 219; 5,885,837; 5,919,523; 6, 022,963; 6,077,674; 6, 156, 501; assim como em Shena, et al. , Tibtech 16:301, 1998 Duggan, et al. , Nat. Genet. 21:10, 1999; Bowtell, et al., Nat. Genet. 21:25, 1999; Lipshutz, et al. , 21 Nature Genet. 20-24, 1999; Blanchard, et al., 11 Biosensors and Bioelectronics, 687-90, 1996; Maskos, et al. , 21 Nucleic Aeids Res. 4663-69, 1993; Hughes, et al., Nat. Biotechol. (2001) 19:342; suas descrições são incorporadas a este documento por referência. Patentes descrevendo métodos de utilização de arranjos em diversas aplicações incluem as patentes norte-americanas de n° 5,143,854; 5,288,644; 5,324,633; 5,432,049; 5,470,710; 5,492,806; 5,503,980; 5,510,270; 5,525,464; 5,547,839; 5,580,732; 5,661,028; 5,848,659; e 5,874,219, as quais são incorporadas a este documento por referência.

Os arranjos incluem, preferencialmente, ácidos nucléicos de controle e referência. Ácidos nucléicos de controle incluem, por exemplo, genes procariontes como bioB, bioC e bioD, cre de bacteriófago Pl ou controles poliA, como dap, lys, phe, thr, e trp. Ácidos nucléicos de referência permitem a normalização dos resultados de um experimento para outro e a comparação de múltiplos experimentos em nivel quantitativo. Ácidos nucléicos de referência típicos incluem os genes de manutenção (housekeeping genes) de níveis de expressão conhecidos como, por exemplo, GAPDH, hexoquinase e actina.

Em uma concretização, um arranjo de oligonucleotídeos pode ser sintetizado sobre um suporte sólido. Exemplos desses suportes incluem vidro, plástico, polímeros, metais, metalóides, cerâmicas, materiais orgânicos, etc. Utilizando tecnologias de mascaramento de chip e química fotoprotetora, é possível gerar arranjos ordenados de sondas de ácido nucléico. Esses arranjos, conhecidos, por exemplo, como "chips de DNA" ou arranjos de polímero imobilizado em altíssima escala (arranjos "VLSIPS™") , podem incluir milhões de regiões de sonda definidas sobre um substrato com uma área de cerca de 1 cm2 a muitos cm2 incorporando, assim, de umas poucas até milhões de sondas (ver, p/ex., a patente norte-americana de n°. 5, 631, 734) .

A fim de comparar níveis de expressão, ácidos nucléicos marcados podem ser colocados em contato com um arranjo, sob condições adequadas para que haja ligação entre o ácido nucléico alvo e a sonda sobre o arranjo. Em uma concretização preferida, as condições de hibridização podem ser selecionadas para fornecer o nível desejado de especificidade da hibridização; ou seja, condições suficientes para que ocorra a hibridização entre os ácidos nucléicos marcados e as sondas no microarray.

Hibridização pode ser feita sob condições que permitam, essencialmente, a hibridização específica. O tamanho e o conteúdo em GC do ácido nucléico irão determinar o ponto de fusão térmica e, portanto, as condições de hibridização necessárias para se obter uma hibridização específica da sonda com o ácido nucléico alvo. Esses fatores são bem conhecidos por pessoas versadas na técnica e podem ser testados nos ensaios. Um guia abrangente de hibridização de ácido nucléico pode ser encontrado em Tijssen et al. (Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Vol. 24: Hibridização With Nucleic Acid Probes, Ρ. Tijssen, ed. Elsevier, Ν. Y., (1993)).

Os métodos descritos acima resultam na produção de padrões de hibridização de ácidos nucléicos alvos, marcados, na superfície do arranjo. Esses padrões podem ser visualizados, ou detectados, de diversas maneiras, sendo o método escolhido de acordo com o marcador do ácido nucléico alvo em particular. Meios de detecção representativos incluem contagem cintilográfica, auto-radiografia, medidas de fluorescência, análise colorimétrica, medidas de emissão de luz, espalhamento de luz e outros semelhantes.

Um desses métodos de detecção utiliza um analisador de arranjos disponível comercialmente (Affymetrix, Santa Clara, CA), por exemplo, o 417™ Arrayer, o 418™ Array Scanner, ou o Agilent GeneArray™ Scanner. Esse analisador é controlado por um sistema computadorizado através de uma interface e ferramentas de software amigáveis (easy-to-use). Os dados obtidos podem ser importados pelo próprio sistema ou lidos diretamente por diversos aplicativos. Dispositivos de análise preferidos estão descritos, por exemplo, nas patentes norte- americanas de n° 5,143,854 e 5,424,186.

Para sondas marcadas com materiais fluorescentes, as emissões de fluorescência em cada sítio de um arranjo transcrito podem ser, preferencialmente, detectadas por análise de microscopia confocal a laser. Alternativamente, pode-se utilizar um laser que permita a iluminação simultânea com os comprimentos de onda específicos dos dois fluoróforos, e a análise das emissões dos dois ao mesmo tempo (ver, p/ex., Shalon, et al. , Genome Res. 6:639-645, 1996) . Em uma concretização preferencial, os arranjos podem ser analisados com um analisador a laser fluorescente com estágio X-Y controlado por computador e uma objetiva de microscópio. Analisadores de fluorescência a laser são descritos em Shalon et al., supra.

Estão disponíveis diversos algoritmos para análise de dados de expressão genética, por exemplo, por tipo de comparações a realizar. Em certas concretizações, é desejável agrupar os genes que são co-regulados, o que permite a comparação de um grande número de perfis. Uma concretização preferida para identificação de tais grupos de genes envolve algoritmos de clustering (para revisões de algoritmos de clustering, ver, p/ex., Fukunaga, 1990, Statistical Pattern Recognition, 2nd Ed., Academic Press, San Diego; Everitt, 1974, Cluster Analysis, London: Heinemann Educ. Books; Hartigan, 1975, Clustering Algorithms, New York: Wiley; Sneath and Sokal, 1973, Numerical Taxonomy, Freeman; Anderberg, 1973, Cluster Analysis for Applications, Academic Press: New York).

Descoberta de Biomarcadores

Padrões de expressão podem ser usados para gerar um painel de biomarcadores passíveis de serem usados para prever a eficácia de um tratamento medicamentoso em pacientes. Os biomarcadores podem ser níveis de expressão genética em experimentos de microarray sobre RNA isolado de amostras biológicas, RNA isolado de amostras congeladas de biópsias de tumores, ou massas obtidas de proteínas séricas por espectrometria de massas.

Embora os mecanismos precisos para análise de dados dependam da natureza exata destes, um procedimento típico para desenvolvimento de um painel de biomarcadores é apresentado a seguir. Os dados (níveis de expressão genética ou espectro de massas) são obtidos para cada paciente, antes do tratamento.

À medida que o estudo avança, os pacientes são classificados de acordo com suas respostas ao tratamento: eficaz ou não- eficaz. Diversos níveis de eficácia podem ser acomodados em um modelo de dados, mas uma comparação binária é considerada ideal, particularmente se a população de pacientes for menor que algumas centenas. Assumindo-se que haja um número adequado de pacientes em cada classe, os dados de expressão de proteína e/ou gene podem ser analisados por diversas técnicas conhecidas. Várias dessas técnicas são derivadas da estatística tradicional, e do campo da aprendizagem máquina. Essas técnicas servem a dois propósitos:

1. Reduzir a dimensão dos dados - no caso do espectro de massas ou dos microarrays de expressão genética, os dados são reduzidos de vários milhares de pontos individuais para cerca de três a dez. Essa redução se baseia no poder de predição dos dados tomados em conjunto. 2. Treinamento - Esses três a dez dados são, então, utilizados para treinar vários algoritmos de aprendizagem, os quais "aprendem" a reconhecer, nesse caso, padrões de massas de proteínas ou expressão de genes que distinguem o tratamento medicamentoso eficaz do não-eficaz. Todas as amostras dos pacientes podem ser usadas para treinar os algoritmos.

Os algoritmos resultantes, treinados, são, então, testados a fim de se avaliar seu poder de predição. Tipicamente, quando se dispõe de menos de algumas centenas de exemplos de treinamento, faz-se alguma forma de validação cruzada. Como ilustração, considere uma validação de dez vezes; nesse caso, as amostras dos pacientes são atribuídas, aleatoriamente, a um dos dez blocos. Na primeira rodada de validação, as amostras de nove dos dez blocos são usadas no treinamento e os dados do décimo bloco são usados para testar o algoritmo. Este processo é repetido mais nove vezes utilizando-se, em cada uma delas, as amostras de um grupo diferente para o teste. Os resultados (previsões corretas e erradas) das dez rodadas são combinados e o poder de predição avaliado. Algoritmos diferentes, assim como painéis diferentes, podem ser comparados desta forma, para este estudo. A "melhor" combinação algoritmo/painel será, então, selecionada. Esse algoritmo "inteligente" poderá ser usado, então, em estudos futuros para selecionar os pacientes que, mais provavelmente, responderão ao tratamento.

Vários algoritmos se beneficiam de informações adicionais obtidas dos pacientes. Por exemplo, sexo ou idade podem ser usados para melhorar o poder de predição. Transformações de dados, como normalização e ajuste, também podem ser usadas para reduzir o "ruido". Devido a isso, um grande número de algoritmos pode ser treinado utilizando-se diversos parâmetros, a fim de otimizar o resultado. Se existir um fator preditivo nos dados, é possível que se desenvolva um algoritmo "inteligente" ótimo ou quase-ótimo. Se mais

amostras de pacientes se tornarem disponíveis, o algoritmo pode ser re-treinado para se beneficiar dos novos dados.

Como um exemplo da utilização da espectrometria de massa, plasma (1 μl) pode ser aplicado a um alvo SELDI hidrofóbico, lavado diversas vezes com água, e analisado por espectrometria de massas com a técnica SELDI-Tof. Esse procedimento pode ser repetido com 100 ou mais amostras de pacientes. Os perfis protéicos resultantes das intensidades de alguns dos 16.000 valores de m/z em cada amostra serão analisados estatisticamente a fim de identificar conjuntos de valores de m/z específicos, capazes de predizer a eficácia da droga. Experimentos idênticos com outros alvos SELDI, tais como troca iônica ou superfícies IMAC também podem ser feitos. Estes irão capturar diferentes subconjuntos de proteínas presentes no plasma. Além disso, o plasma pode ser desnaturado e pré- fracionado antes de ser aplicado no alvo SELDI.

Ensaios de Diagnóstico & Prognóstico

A presente invenção apresenta métodos para determinar se um indivíduo possui risco de desenvolver uma doença ou condição caracterizada pela proliferação indesejável de células, por meio da detecção de biomarcadores (p/ex., VEGF ou VEGFR, como VEGFR-2), ou seja, ácidos nucléicos e/ou polipeptideos marcadores do câncer.

Em aplicações clinicas, amostras de tecido humano podem ser analisadas quanto à presença e/ou ausência dos biomarcadores aqui identificados. Tais amostras podem ser núcleos de biópsia por agulha, amostras de ressecção cirúrgica, tecidos de linfonodos, ou soro. Por exemplo, esses métodos incluem a obtenção de uma biópsia, a qual é fracionada, opcionalmente, por seccionamento criostático a fim de enriquecer a população total de células com cerca de 80% de células tumorais. Em certas concretizações, ácidos nucléicos extraídos dessas amostras podem ser amplificados utilizando-se técnicas bem conhecidas. Os níveis de marcadores selecionados detectados serão comparados com grupos, estatisticamente válidos, de amostras de tecidos metastáticos, malignos não- metastáticos, benignos, ou normais.

Em uma concretização, o método de diagnóstico compreende determinar se um indivíduo possui um nível anormal de mRNA e/ou proteína dos biomarcadores (p/ex., VEGF ou VEGFR, como VEGFR-2, inclusive suas formas solúveis), por exemplo, por análise northern blot, transcrição reversa - reação em cadeia de polimerase (RT-PCR), hibridização in situ, imunoprecipitação, hibridização western blot, ou imunohistoquímica. De acordo com o método, pode-se obter células de um indivíduo, determinar os níveis de biomarcadores, proteína ou mRNA, e compará-los com os mesmos níveis em um indivíduo saudável. Um nível anormal de um polipeptídeo biomarcador ou de mRNA pode indicar câncer.

Dessa forma, sob um aspecto a invenção apresenta sondas e primers específicos apenas para os marcadores de ácido nucléico aqui descritos. Neste caso, as sondas de ácido nucléico contêm uma seqüência nucleotídica com comprimento de, pelo menos, 10 nucleotídeos, de preferência pelo menos 15, especialmente, 25, e mais particularmente, pelo menos 40 nucleotídeos, e toda ou quase toda a seqüência codificadora complementar à porção da seqüência codificadora da seqüência de um ácido nucléico marcador.

Em uma concretização, o método compreende o uso de uma sonda de ácido nucléico para determinar a presença de células cancerosas em tecido de um paciente. Especificamente, o método compreende:

1. fornecer uma sonda de ácido nucléico contendo uma seqüência nucleotídica com o comprimento de, pelo menos, 10 nucleotídeos, preferencialmente pelo menos 15 nucleotídeos, especialmente, 25 nucleotídeos, e mais especialmente, pelo menos 40 nucleotídeos, e toda ou quase toda a seqüência codificadora complementar à porção da seqüência codificadora de uma seqüência de ácido nucléico que seja expressa de modo diferencial em células tumorais;

2. obter uma amostra de tecido de um paciente que, potencialmente, contenha células cancerosas;

3. fornecer uma segunda amostra de tecido contendo células que são, substancialmente, não-cancerosas em sua totalidade;

4. colocar a sonda de ácido nucléico em contato, sob condições estringentes, com o RNA de cada uma das referidas primeira e segunda amostras (p/ex., em um northern blot ou em um ensaio de hibridização in situ); e

5. comparar (a) a quantidade de hibridização da sonda com o RNA da primeira amostra de tecido, com (b) a quantidade de hibridização da sonda com o RNA da segunda amostra de tecido em que uma diferença estatisticamente significativa entre as duas quantidades indica a presença de células cancerosas na primeira amostra de tecido.

Em um aspecto, o método contempla hibridização in situ com uma sonda derivada de uma dada seqüência de ácido nucléico marcador (p/ex., VEGF ou VEGFR-2). 0 método compreende colocar a sonda de hibridização marcada em contato com uma amostra de um dado tipo de tecido contendo células potencialmente cancerosas ou pré-cancerosas, bem como células normais, e determinar se a sonda marca certas células do tecido em um grau significativamente diferente (p/ex., por um fator de pelo menos dois, ou de pelo menos cinco, ou de pelo menos vinte, ou de pelo menos cinqüenta) do que aquele com o qual ela marca outras células do mesmo tipo de tecido. A invenção também inclui um método de determinação de fenótipo de uma célula-teste de um dado tecido humano, por exemplo, se a célula é (a) normal, ou (b) cancerosa ou pré- cancerosa, colocando em contato o mRNA da célula-teste com uma sonda de ácido nucléico com tamanho de, pelo menos, 12 nucleotideos, de preferência pelo menos 15 nucleotideos, especialmente pelo menos 25, e mais especialmente, pelo menos 40 nucleotideos, e toda ou quase toda a seqüência complementar à porção da seqüência codificadora de um ácido nucléico, e que seja expressa de modo diferencial em células tumorais, em comparação com células normais de um dado tipo de tecido; e determinar a quantidade aproximada de hibridização da sonda ao mRNA. Uma quantidade de hibridização maior ou menor do que a observada com o mRNA de uma célula normal do mesmo tipo de tecido indica que a célula-teste é cancerosa ou pré- cancerosa.

Alternativamente, os testes de diagnóstico acima podem ser conduzidos utilizando-se anticorpos para detectar a proteína codificada pela seqüência do ácido nucléico marcador (p/ex., VEGF ou sVEGFR-2). Sendo assim, em uma concretização, o teste incluirá colocar as proteínas da célula-teste em contato com um anticorpo específico para o gene de um dado ácido nucléico, sendo o ácido nucléico marcador aquele que é expresso em um dado nível controle em células normais do mesmo tipo de tecido da célula-teste; e determinar a quantidade aproximada de imunocomplexo formado entre o anticorpo e as proteínas da célula-teste, sendo que uma diferença estatisticamente significativa na quantidade deste complexo em comparação com a formada em uma célula normal do mesmo tipo de tecido é uma indicação de que a célula-teste é cancerosa ou pré-cancerosa. De preferência, o anticorpo é especifico para VEGF ou sVEGFR-2, especialmente para seu domínio extracelular.

O método para produção de anticorpos policlonais e/ou monoclonais que se ligam, especificamente, aos polipeptídeos utilizáveis na presente invenção é conhecido por pessoas versadas na técnica e pode ser encontrado, por exemplo, em Dymecki, et al., (J. Biol. Chem. 267:4815, 1992); Boersma & Van Leeuwen, (J. Neurosci. Methods 51:317, 1994); Green, et al., (Cell 28:477, 1982); e Arnheiter, et al., (Nature 294 :278, 1981).

Outro desses métodos inclui as etapas de: fornecer um anticorpo específico para o produto gênico da seqüência de um ácido nucléico marcador, sendo este gene presente em tecido canceroso de um dado tipo de tecido, em nível maior ou menor do que no mesmo tipo de tecido não-canceroso; obter, de um paciente, uma primeira amostra de tecido - de um dado tipo -, que, potencialmente, inclua células cancerosas; fornecer uma segunda amostra de tecido, do mesmo tipo (que pode ser do mesmo paciente ou de um controle normal, por exemplo, outro indivíduo ou células cultivadas), sendo que essa segunda amostra contém células normais e, essencialmente, não contém nenhuma célula cancerosa; colocar o anticorpo em contato com proteína (que pode ser parcialmente purificada; em células lisadas, mas não fracionadas, ou ín sítu) das duas amostras, sob condições que permitam a formação de um imunocomplexo entre o anticorpo e a seqüência de ácido nucléico marcador presente nas amostras; e comparar (a) a quantidade de imunocomplexo formado na primeira amostra, com (b) a quantidade de imunocomplexo formado na segunda amostra, onde uma diferença estatisticamente significativa, para menos, na quantidade de imunocomplexo formado na primeira amostra em relação ao formado na segunda, indica a presença de células cancerosas na primeira amostra de tecido.

A presente invenção apresenta, ainda, um método para determinar se uma amostra celular obtida de um indivíduo possui uma quantidade anormal do polipeptideo. Este método compreende (a) obtenção de uma amostra de células do indivíduo, (b) a determinação quantitativa da quantidade do polipeptideo marcador na amostra obtida, e (c) comparação da quantidade do polipeptideo marcador assim determinada, com um padrão conhecido, de modo a determinar se a amostra celular obtida possui uma quantidade anormal do polipeptideo marcador. Tais polipeptídeos podem ser detectados por ensaios imunohistoquímicos, ensaios de dot-blot, ELISA, e outros semelhantes.

Imunoensaios são comumente usados para quantificar os níveis de proteínas em amostras de células; várias outras técnicas de imunoensaios são conhecidas. A invenção não é limitada a um procedimento de ensaios e, portanto, pretende incluir procedimentos homogêneos e heterogêneos. Exemplos típicos de imunoensaios que podem ser realizados de acordo com a invenção incluem imunoensaio de polarização de fluorescência (FPIA), imunoensaio de fluorescência (FIA), imunoensaio enzimático (EIA), imunoensaio de inibição nefelométrica (ΝΙΑ), ensaio de imunoabsorção por ligação enzimática (ELISA), e radioimunoensaio (RIA). Uma porção indicadora, ou um grupo marcador podem ser ligados aos anticorpos do indivíduo e selecionados de modo a atender os requisitos dos vários usos do método, que são, freqüentemente, ditados pela disponibilidade de equipamentos e procedimentos de imunoensaios compatíveis. Técnicas gerais a serem usadas na realização dos diversos imunoensaios citados acima são conhecidas por pessoas com conhecimentos usuais da técnica.

Em outra concretização, o nível de produto codificado ou, alternativamente, o nível do polipeptídeo, em um fluido biológico (p/ex., sangue ou urina) de um paciente pode ser determinado como um modo de monitorar o nível de expressão da seqüência de ácido nucléico marcador nas células daquele paciente. Tal método deverá incluir as etapas de obtenção de uma amostra de fluido biológico do paciente, colocação da amostra (ou proteínas dela) em contato com um anticorpo específico para um polipeptídeo marcador codificado, e determinação da quantidade de um imunocomplexo formado pelo anticorpo, a qual indica o nível de produto marcador codificado na amostra. Essa determinação é particularmente instrutiva quando comparada com a quantidade de imunocomplexo formado pelo mesmo anticorpo em uma amostra-controle obtida de um indivíduo normal, ou em uma ou mais amostras colhidas anterior- ou posteriormente, da mesma pessoa. Em outra concretização, o método pode ser utilizado para determinar a quantidade de polipeptideo marcador presente em uma célula, a qual, por seu turno, pode ser correlacionada com o progresso de uma desordem hiperproliferativa. 0 nivel do polipeptideo marcador pode ser usado para prever se uma amostra celular contém células que são, ou têm predisposição a tornarem-se, células transformadas. Mais que isso, método em questão pode ser usado para avaliar o fenótipo de células que são, sabidamente, transformadas; esses resultados de fenotipagem são úteis no planejamento de um regime terapêutico especifico. Por exemplo, níveis muito altos de polipeptideo marcador em amostras de células são um diagnóstico poderoso e um marcador de um prognóstico de câncer. A observação dos níveis de polipeptideo marcador pode ser utilizada nas decisões relativas, por exemplo, ao uso de terapias mais agressivas.

Como dito acima, um aspecto da presente invenção refere- se a ensaios diagnósticos para determinar, no contexto de células isoladas de um paciente, se o nível de um polipeptideo marcador é, significativamente, reduzido na amostra. 0 termo "significativamente reduzido" refere-se ao fenótipo da célula que possui uma quantidade reduzida do polipeptideo marcador, em relação à célula normal de um tecido de origem semelhante. Por exemplo, uma célula pode ter menos que cerca de 50%, 25%, 10%, ou 5% do polipeptideo marcador em comparação com o teor em uma célula-controle normal. Em particular, o ensaio avalia o nível do polipeptideo marcador nas células-teste e, de preferência, compara o nível medido com o polipeptideo marcador detectado em, pelo menos, uma célula-controle; por exemplo, uma célula normal e/ou uma célula transformada de fenótipo conhecido.

De especial importância para a presente invenção é a capacidade de quantificar o nível do polipeptídeo marcador, determinado pelo número de células associadas com um nível normal ou anormal de polipeptídeo marcador. 0 número de células com fenótipo de um polipeptídeo marcador em particular pode, assim, ser correlacionado com o prognóstico do paciente. Em uma concretização da invenção, o fenótipo do polipeptídeo marcador de uma lesão é determinado como um percentual de células em uma biópsia, que tem níveis anormalmente altos/baixos de um polipeptídeo marcador. Tal expressão pode ser detectada por ensaios imunohistoquímicos, ensaios de dot- blot, ELISA, e outros semelhantes.

Quando forem usadas amostras de tecidos, a coloração imunohistoquímica pode ser utilizada para determinar o número de células contendo o fenótipo do polipeptídeo marcador. Para tal coloração, toma-se um pedaço de tecido da biópsia, ou outra amostra de tecido, e submete-se a hidrólise proteolítica usando agentes como, protease K ou pepsina. Em certas concretizações, pode ser desejável isolar uma fração nuclear da amostra de células e detectar o nível do polipeptídeo marcador da fração nuclear.

As amostras de tecidos são fixadas por tratamento com um reagente como formalina, glutaraldeído, metanol, ou semelhantes. As amostras são, então, incubadas com um anticorpo, de preferência monoclonal, com especificidade para ligação a polipeptideos marcadores. Este anticorpo pode ser conjugado a um marcador para subseqüente detecção da ligação. As amostras são incubadas por tempo suficiente para formação dos imunocomplexos. A ligação ao anticorpo é, então, detectada através do marcador conjugado ao anticorpo. Se o anticorpo não for marcado, um segundo anticorpo (marcado) deve ser usado; por exemplo, um que seja especifico para o isotipo do anticorpo anti-polipeptideo marcador. Exemplos de marcadores que podem ser empregados incluem os radionuclideos, os agentes de fluorescência e os de quimioluminescência, as enzimas, e assemelhados.

Quando forem empregadas enzimas, o substrato delas pode ser adicionado às amostras de modo a dar um produto colorido ou fluorescente. Exemplos de enzimas passíveis de uso nos conjugados incluem a peroxidase da raiz forte, a fosfatase alcalina, a malato desidrogenase, e semelhantes. Quando não forem comercialmente disponíveis, esses conjugados anticorpo- enzima podem ser facilmente produzidos por meio de técnicas conhecidas das pessoas versadas na técnica.

Em uma concretização, o ensaio é realizado como um dot blot. Esse ensaio tem aplicação, especialmente, quando são empregadas amostras de tecidos, uma vez que ele permite a determinação da quantidade média de um polipeptídeo marcador associado a uma célula isolada, por correlação entre a quantidade de polipeptídeo marcador no extrato livre de células, produzido a partir de um número pré-determinado de células.

É bem estabelecido na literatura sobre câncer que células tumorais do mesmo tipo (p/ex., células de tumor de mama e/ou cólon) podem não apresentar expressão uniformemente aumentada de oncogenes individuais, ou expressão uniformemente diminuída de genes supressores de tumor. Pode haver, também, níveis de expressão variáveis de um dado gene marcador, entre células de um dado tipo de câncer, enfatizando a necessidade de se disponibilizar uma bateria de testes em lugar de um teste único. Desse modo, em um aspecto a invenção disponibiliza uma bateria de testes que utilizam diversas sondas da invenção, a fim de melhorar a confiabilidade e/ou a precisão do teste diagnóstico.

Em uma concretização, a presente invenção também disponibiliza um método onde sondas de ácido nucléico são imobilizadas em um chip de DNA, em um arranjo organizado. Oligonucleotideos podem ser ligados a um suporte sólido, por diversos processos, incluindo litografia. Por exemplo, um chip pode reter até 250.000 oligonucleotídeos. Essas sondas de ácido nucléico contêm uma seqüência de nucleotídeos com tamanho de, pelo menos, 12 nucleotídeos, preferencialmente pelo menos cerca de 15 nucleotídeos, especialmente, pelo menos cerca de 25, e mais especialmente, pelo menos cerca de 40 nucleotídeos, e uma seqüência completa, ou quase completa, complementar a uma porção da seqüência codificadora da seqüência de ácido nucléico marcador, e que seja expressa de modo diferencial em células tumorais. A presente invenção apresenta vantagens significativas sobre os testes disponíveis para os vários cânceres, pois aumenta a confiabilidade deles ao disponibilizar um arranjo de ácidos nucléicos marcadores em um chip único.

0 método inclui a obtenção de uma biópsia, opcionalmente fracionada por seccionamento criostático para enriquecer a população total de células com cerca de 80% de células tumorais. O DNA ou RNA é, então, extraído, amplificado, e analisado com um chip de DNA para determinar a presença ou ausência de seqüências de ácido nucléico marcador.

Em uma concretização, as sondas de ácido nucléico são aplicadas sobre um substrato em um arranjo ou matriz bi- dimensional. Amostras de ácidos nucléicos podem ser marcadas e, então, hibridizadas às sondas. Ácidos nucléicos de dupla fita, contendo os ácidos nucléicos marcados da amostra, ligados às sondas de ácidos nucléicos, podem ser detectados uma vez que a porção não-ligada da amostra seja eliminada.

As sondas de ácidos nucléicos podem ser aplicadas sobre substratos incluindo vidro, nitrocelulose, etc. Essas sondas podem ser ligadas ao substrato por ligações covalentes ou por interações não-específicas, como as hidrofóbicas. Os ácidos nucléicos da amostra podem ser marcados usando marcadores radioativos, fluofóros, cromóforos, etc. Técnicas para construção de arranjos, e métodos para sua utilização estão descritos, por exemplo, em EP No. 0 799 897;

PCT No. WO 97/292 12; PCT No. WO 97127317; EP No. 0 785 280;

PCT No. WO 97/02357; U.S. Pat. No. 5, 593, 839; U.S. Pat. No.

5,578,832; EP No. 0 728 520; U.S. Pat. No. 5,599,695; EP No. O 721 016; U.S. Pat. No. 5,556,752; PCT No. WO 95/22058; e U.S. Pat. No. 5,631,734.

Além disso, arranjos podem ser usados para examinar a expressão diferencial de genes e determinar sua função. Por exemplo, arranjos de seqüências de ácidos nucléicos podem ser usados para determinar se qualquer uma das seqüências é expressa de modo diferencial entre células normais e cancerosas. Expressão aumentada de uma mensagem particular em uma célula de câncer, que não seja observada em uma célula normal correspondente, pode indicar uma proteína câncer- específica.

Em uma concretização, moléculas de ácido nucléico podem ser usadas para gerar microarrays sobre uma superfície sólida (p/ex., uma membrana) de modo que as moléculas de ácido nucléico "arranjadas" possam ser usadas para determinar se algum dos ácidos nucléicos é expresso de modo diferencial entre células ou tecidos normais e células ou tecidos cancerosos. Em uma concretização, as moléculas de ácido nucléico da invenção podem ser cDNA ou podem ser usadas para gerar moléculas de cDNA, que sejam, subseqüentemente, amplificadas por PCR e aplicadas sobre membranas de nylon. Essas membranas podem, então, reagir com moléculas radiomarcadas do ácido nucléico alvo obtido de amostras equivalentes de tecidos ou células cancerosos e normais. Métodos de geração de cDNA e preparação de microarrays são conhecidos das pessoas versadas na técnica e podem ser encontrados, por exemplo, em Bertucci, et al., (Hum. Mol. Genet. 8:2129, 1999); Nguyen, et al., (Genomics 29:207, 1995); Zhao, et al., (Gene 156:207); Gress, et al., (Mammalian Genome 3:609, 1992); Zhumabayeva, et al., (Biotechniques 30:158, 2001); e Lennon, et al., (Trends Genet. 7:314, 1991).

Ainda em outra concretização, a invenção contempla o uso de um painel de anticorpos, que são gerados contra os polipeptideos marcadores desta invenção. De preferência, os anticorpos são gerados contra VEGF ou sVEGFR-2. Tal painel de anticorpos pode ser usado como uma sonda diagnostica confiável para o câncer. O ensaio da presente invenção inclui colocar uma amostra de biópsia contendo células, por exemplo, de pulmão, em contato com um painel de anticorpos de um ou mais dos produtos codificados, a fim de determinar a presença ou ausência dos polipeptideos marcadores.

Os métodos de diagnóstico da invenção também podem ser empregados para acompanhamento do tratamento, por exemplo, a quantificação do nivel de polipeptideos marcadores pode ser um indicador da eficácia da terapia em uso, ou utilizada previamente, contra o câncer, bem como do efeito dessas terapias sobre o prognóstico do paciente. Além disso, os ácidos nucléicos ou polipeptideos marcadores podem ser usados como parte de um painel diagnóstico para detecção inicial, rastreamento de follow-up, detecção de recorrência, e monitoramento pós-tratamento quimioterápico ou cirúrgico.

Assim, a presente invenção disponibiliza ensaios diagnósticos e reagentes para detecção de ganho e/ou perda de polipeptideos marcadores de uma célula, a fim de auxiliar no diagnóstico e fenotipagem de desordens proliferativas oriundas, por exemplo, de transformação tumorigênica de células.

Os ensaios diagnósticos descritos acima podem ser adaptados para serem usados, também, como ensaios de prognóstico. Tal aplicação beneficia-se da sensibilidade dos testes da invenção para eventos que ocorrem em estágios característicos da progressão de um tumor. Por exemplo, um dado gene marcador pode ser regulado, para mais ou para menos, em um estágio bem inicial - talvez antes da célula ser levada irreversivelmente a se tornar maligna -, enquanto outro gene marcador pode ser, caracteristicamente, regulado para mais ou para menos em um estágio bem posterior. Tal método pode envolver as etapas de colocar o mRNA de uma célula-teste em contato com uma sonda de ácido nucléico derivada de um dado ácido nucléico marcador, o qual é expresso em níveis característicos, diferentes em células cancerosas ou pré- cancerosas em estágios distintos do desenvolvimento do tumor; e de determinar a quantidade aproximada de hibridização da sonda ao mRNA da célula, sendo tal quantidade uma indicação do nivel de expressão do gene na célula e, portanto, um indicador do estágio de progressão do tumor na célula. Alternativamente, o ensaio pode ser conduzido com um anticorpo específico para o produto gênico do ácido nucléico marcador em particular, posto em contato com as proteínas da célula-teste. Uma bateria destes testes mostrará, não só a existência e localização de um tumor, mas permitirá ao médico, também, selecionar o modo mais apropriado para o tratamento dele, e prever a probabilidade de sucesso desse tratamento.

Os métodos da invenção também podem ser usados para acompanhar o curso clínico de um tumor. Por exemplo, o ensaio da invenção pode ser aplicado a uma amostra de tecido de um paciente. Após o tratamento deste paciente contra o câncer, outra amostra de tecido é retirada e o teste repetido. Um tratamento bem sucedido resultará na remoção de todas as células que demonstraram expressão diferencial característica de células cancerosas ou pré-cancerosas, ou um aumento substancial na expressão do gene daquelas células, talvez alcançando ou mesmo ultrapassando os níveis normais.

Ensaios Preditivos

Testes feitos em laboratório, que podem prever os benefícios clínicos de um dado agente anti-câncer, melhorarão grandemente a gestão clínica de pacientes com câncer. A fim de avaliar esse efeito, um biomarcador associado a um agente anti-câncer pode ser analisado em uma amostra biológica (p/ex., amostra tumoral, plasma) antes, durante, e após o tratamento.

Por exemplo, a expressão do polipeptideo VEGF ou sVEGFR, preferencialmente sVEGFR-2, pode ser detectada no plasma.

Assim, mudanças na concentração plasmática basal desses polipeptideos podem ser monitoradas em pacientes com câncer. Por exemplo, níveis elevados de VEGF e níveis reduzidos de sVEGFR-2 podem ser associados à eficácia de sorafenib.

Além disso, os níveis do polipeptideo também podem ser monitorados por imunohistoquímica quantitativa, usando biópsias de tumores incorporados em parafina.

Outra abordagem para monitorar o tratamento é uma avaliação do espectro proteômico do soro. Especificamente, amostras de plasma podem ser submetidas à espectrometria de massas (p/ex., dessorção-ionização a laser realçado de superfície) e um espectro proteômico pode ser gerado para cada paciente. Um conjunto de espectros, derivados da análise do plasma dos pacientes antes e durante o tratamento podem ser analisados por um algoritmo iterativo de busca, que pode identificar um padrão proteômico que discrimina, completamente, as amostras tratadas e as não-tratadas. O padrão resultante pode, então, ser usado para prever os benefícios clínicos do tratamento a ser seguido.

Perfis globais de expressão gênica de amostras biológicas (p/ex., biópsias tumorais, amostras de sangue) e identificação de padrões obtidos da bioinformática podem ser utilizados para prever os benefícios clínicos e a sensibilidade, assim como o desenvolvimento de resistência a um agente anti-câncer. Por exemplo, RNA isolado de células derivadas do sangue de pacientes antes e durante o tratamento, podem ser usados para gerar perfis de expressão genética de células sangüíneas, usando tecnologia e algoritmos Affymetrix GeneChip. Esses perfis podem predizer, então, os benefícios clínicos do tratamento com um agente anti-câncer em particular.

Análise da composição bioquímica da urina por 1H-RMN ID (Ressonância Magnética Nuclear) também pode ser utilizada como um ensaio para previsão. Técnicas de reconhecimento de padrões podem ser usadas para avaliar a resposta metabólica ao tratamento com um agente anti-câncer e para correlacionar essa resposta com pontos clínicos conclusivos. Os metabólitos bioquímicos ou endógenos excretados na urina foram bem caracterizados por RMN de hidrogênio em indivíduos normais (Zuppi, et al., Clin Chim Acta 265:85-97, 1997). Esses metabólitos (cerca de 30-40) representam os sub-produtos das rotas metabólicas principais, como os ciclos do ácido cítrico e da uréia. Sabe-se que estímulos por drogas, doenças e fatores genéticos produzem alterações metabólicas específicas no perfil basal da urina, que são indicadores da duração e da magnitude da resposta metabólica ao estímulo. Essas análises são multi-variantes e, portanto, usam técnicas de reconhecimento de padrões para melhorar a interpretação dos dados. Perfis metabólicos urinários podem ser correlacionados com pontos clínicos conclusivos, para determinar benefícios clínicos.

Considera-se, sem maior elaboração, que uma pessoa versada na técnica pode, utilizando a descrição precedente, usar a invenção a seguir em toda a sua extensão. As concretizações específicas preferidas a seguir devem, portanto, ser consideradas como meramente ilustrativas, e não limitantes do restante do que foi apresentado nesse documento, sob qualquer aspecto.

No que foi apresentado e nos exemplos a seguir, todas as temperaturas estão indicadas em graus Celsius e não sofreram correção; todas as partes e porcentagens são por peso, salvo indicação em contrário.

EXEMPLOS

A invenção será explicada abaixo, com referência aos seguintes exemplos não-limitantes.

Introdução: O estudo TARGET de Fase III, é um estudo aleatório, controlado por placebo, conduzido com pacientes com câncer de célula renal avançado, e que investigou os efeitos de sorafenib na sobrevivência total. Um objetivo secundário deste estudo foi testar os efeitos do tratamento sobre bioraarcadores específicos, e avaliar a associação entre esses biomarcadores e a resposta dos pacientes. Métodos: Foram coletadas amostras para identificação dos biomarcadores candidatos, especificamente, amostras arquivadas de biópsias tumorais, sangue, plasma e urina. Todas as análises foram realizadas sob protocolos aprovados pela IRB. Amostras de tecidos foram analisadas por status de mutação do gene VHL (apenas para os pacientes que consentiram a análise genética) por seqüenciamento de DNA, e níveis de fosfo-ERK (pERK) por imunohistoquímica (IHC) . 0 mRNA foi isolado do sangue e analisado por microarrays para perfis de expressão gênica, que correlacionem com a resposta dos pacientes. Além disso, utilizou-se uma abordagem baseada na espectrometria de massa para testar plasma em relação a uma assinatura de proteína; urina foi analisada por 1H-RMN quanto a padrões de moléculas pequenas que se relacionem com a resposta dos pacientes. Amostras de plasma pré- e pós-tratamento foram analisadas por ELISA quanto a VEGF e VEGFR-2 solúvel (sVEGFR- 2). Alterações nessas moléculas, relacionadas com o tratamento com sorafenib foram investigadas.

Resultados: Em pacientes tratados com sorafenib, sVEGFR- 2 diminuiu no plasma, significativamente, após 3 semanas de tratamento (p < 2E~16) , e esse decréscimo continuou até a semana 8 do tratamento. Essa redução do sVEGFR-2 nos pacientes tratados com a droga foram fracamente relacionados com redução na lesão-alvo (p = 0, 028) . Não houve alteração nos níveis plasmáticos de sVEGFR-2 nos pacientes tratados com placebo ao longo do mesmo período. Os níveis de VEGF também foram analisados nos dois grupos de pacientes. Naqueles que receberam sorafenib, os níveis de VEGF aumentaram significativamente, em relação, ao nível basal, após três semanas de tratamento (p = 3,2 E"5), mas nenhum aumento foi observado entre os pacientes tratados com placebo. Nesse último grupo, os pacientes com nível basal de VEGF alto (>250 pg/mL) tiveram uma sobrevida sem progressão (PFS - do inglês, progression-free survival) , menor do que os que tinham nível inicial de VEGF baixo (<250 pg/mL) (p = 0, 030); já nos pacientes que receberam sorafenib, não se observou diferença significativa na PFS entre aqueles com níveis basais de VEGF altos e aqueles com níveis baixos. Coloração por pERK, por IHC, mostrou que a maioria das amostras dos pacientes tinha uma intensidade máxima de coloração alta (4+ em uma escala de 0 a 4 + ) . De modo semelhante, a maioria das amostras teve um percentual baixo (<25% de células tumorais coradas) de células tumorais coradas por pERK.

Realizou-se uma pesquisa para examinar os níveis de VEGF nos pacientes, a fim de identificar correlações com seus resultados clínicos.

As medidas de resultados dos pacientes que se mostraram úteis foram tempo até o óbito (TTD - do inglês, time to death) e sobrevivência sem progressão (PFS) , usando-se análise de regressão de Cox. Os níveis basais de VEGF foram medidos e suas alterações determinadas na semana 18 do tratamento. Os efeitos observados foram ajustados para idade, sexo, status ECOG ou índice Motzer. Esses ajustes foram mínimos. A relação de VEGF basal versus TTD é mostrada na Fig. 1 (análise Kaplan-Meyer) e a relação entre a alteração no VEGF na semana 18 versus TTD é apresentada na Fig. 2 (análise Kaplan-Meyer). Como mostrado nas figuras, níveis basais mais altos de VEGF correlacionam com menor tempo até o óbito (quando VEGF foi analisado como uma variável contínua). Aumentos maiores nos níveis de VEGF na semana 18 também correlacionam com menor tempo até o óbito (quando VEGF foi analisado como uma variável contínua).

A Fig. 1 é um gráfico de VEGF basal versus TTD;

A Fig. 2 é um gráfico de VEFG da ABL-Wk 18 versus TTD.

Acredita-se, sem maior elaboração, que uma pessoa versada na técnica pode, utilizando a descrição precedente, usar a invenção a seguir em toda a sua extensão. As concretizações específicas preferidas a seguir devem, portanto, ser consideradas como meramente ilustrativas, e não limitantes do restante do que foi apresentado nesse documento, sob qualquer aspecto.

Os exemplos anteriores podem ser repetidos com sucesso semelhante, substituindo-se os reagentes e/ou condições operacionais da presente invenção, descritos genérica- ou especificamente, por aqueles usados nos exemplos precedentes.

Da descrição feita, uma pessoa versada na técnica poderá, com facilidade, verificar as características essenciais desta invenção e, sem desviar-se do espirito e do escopo dela, efetuar diversas variações e alterações na invenção para adaptá-las a diferentes usos e condições.

Acredita-se que uma pessoa versada na técnica, utilizando as informações precedentes e aquelas disponíveis no estado da técnica, poderá utilizar a presente invenção em toda a sua extensão. Deve ficar claro a alguém versado na técnica, que alterações e modificações podem ser feitas nesta invenção sem afastar-se de seu espírito ou de seu escopo, como apresentados aqui. Os títulos dos tópicos neste documento pretendem ser uma orientação para encontrar certas informações na aplicação, mas não pretendem ser sua única fonte. Todas as publicações e patentes citadas acima são incorporadas aqui, por referência.

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Claims (50)

1. Método de monitoramento da resposta de um paciente com câncer, sendo tratado com sorafenib, caracterizado pelo fato de que compreende detectar o nivel ou a atividade de VEGF e/ou sVEGFR-2 em uma amostra de um paciente e comparar o referido nível com um padrão.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende detectar VEGF e/ou sVEGFR-2, a nível de mRNA, na referida amostra do paciente que está sendo tratado com sorafenib e no referido controle.

3. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende detectar VEGF e/ou sVEGFR-2, a nível de proteína, na referida amostra do paciente que está sendo tratado com sorafenib e no referido controle.

4. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o referido nível de mRNA é detectado pelo contato da referida amostra do paciente com um agente que liga especificamente no referido mRNA e pela mensuração da quantidade do agente especificamente ligado.

5. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o referido nível de proteína é detectado pelo contato da referida amostra do paciente com um agente de ligação específico para a referida proteína e pela mensuração da quantidade do agente especificamente ligado.

6. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o agente de ligação compreende pelo menos um polinucleotideo.

7. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o agente de ligação compreende pelo menos um anticorpo.

8. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a referida amostra do paciente compreende um fluido corpóreo.

9. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o referido nivel de mRNA é detectado por análise de Northern, RT-PCR ou microarranjo de cDNA.

10. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o nivel de proteína é detectado por imunomancheamento ("ímmunoblotting") , imunoprecipitação ou ensaio de ELISA.

11. Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o referido fluido corpóreo é sangue.

12. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o referido câncer é neoplasma primário ou tumor metastático.

13. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o referido câncer é carcinoma, linfoma, leucemia, mieloma, sarcoma, glioblastoma, astrocitoma, melanoma ou tumor de Wilms.

14. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o referido câncer é câncer de mama, câncer de trato respiratório, câncer cerebral, câncer de órgãos reprodutivos, câncer de trato digestivo, câncer de trato urinário, câncer de olhos, câncer de fígado, câncer de pele, câncer de cabeça e pescoço, câncer de tireóide, câncer de paratireóide, câncer sangüíneo ou câncer de músculos.

15. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o referido câncer de mama é carcinoma ductal invasivo, carcinoma lobular invasivo, carcinoma ductal in situ e carcinoma lobular in situ.

16. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o referido câncer de trato respiratório é carcinoma de células pequenas dos pulmões, carcinoma de células não pequenas dos pulmões, adenoma bronquial ou blastoma pleuropulmonar.

17. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o referido câncer cerebral é glioma hipoftálmico ou de tronco cerebral, astrocitoma cerebral ou cerebelar, meduloblastoma, ependimoma, tumor pineal ou neuroectodermal.

18. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o referido câncer de órgãos reprodutivos é câncer de próstata, câncer testicular, câncer endometrial, câncer cervical, câncer de ovários, câncer vaginal, câncer vulvar ou sarcoma de útero.

19. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o referido câncer de trato digestivo é câncer anal, câncer de cólon, câncer colorretal, câncer esofágico, câncer de vesicula biliar, câncer gástrico, câncer pancreático, câncer retal, câncer de intestino delgado ou câncer de glândulas salivares.

20. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o referido câncer de trato urinário é câncer de bexiga, câncer de pênis, câncer de rim, câncer pélvico, câncer de ureter ou câncer de uretra.

21. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o referido câncer de olhos é melanoma intraocular ou retinoblastoma.

22. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o referido câncer de fígado compreende carcinoma hepatocelular, colangiocarcinoma ou carcinoma hepatocelular misturado.

23. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o referido câncer de pele compreende carcinoma de célula escamosa, sarcoma de Kaposi, melanoma maligno, câncer de pele de células de Merkel ou câncer de pele de não melanoma.

24. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o referido câncer de cabeça e pescoço compreende câncer de laringe, câncer de hipofaringe, câncer de nasofaringe ou câncer de orofaringe, câncer de lábios ou câncer de cavidades orais.

25. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o referido câncer sangüíneo compreende linfoma relacionado com a AIDS, linfoma de não Hodgkin, linfoma de células T cutâneas, doença de Hodgkin, linfoma do sistema nervoso central, leucemia mielóide aguda, leucemia linfoblástica aguda, leucemia linfocitica crônica, leucemia mielógena crônica ou leucemia de células pilosas.

26. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o referido sarcoma compreende um sarcoma de tecido mole, osteosarcoma, histiocitoma fibroso maligno, linfossarcoma, rabdomiossarcoma, leucemia mielóide aguda, leucemia linfoblástica aguda, leucemia linfocitica crônica, leucemia mielógena crônica ou leucemia de células pilosas.

27. Método de monitoramento da resposta de um paciente em tratamento para carcinoma de célula renal pela administração de sorafenib, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) determinar o nivel de expressão do biomarcador VEGF e/ou sVEGFR-2 em uma primeira amostra de plasma retirada de um paciente antes do tratamento com sorafenib; (b) determinar o nivel de expressão de VEGF e/ou sVEGFR-2 em pelo menos uma segunda amostra de plasma retirada do paciente subseqüente ao tratamento inicial com sorafenib; e (c) comparar o nivel de expressão de VEGF e/ou sVEGFR-2 da segunda amostra com o nivel de expressão do biomarcador da primeira amostra; em que uma mudança no nivel de expressão de VEGF e/ou sVEGFR-2 da segunda amostra comparada com o nivel de expressão do referido VEGF e/ou sVEGFR-2 da primeira amostra indica a eficiência do tratamento com sorafenib.

28. Método de avaliação da condição de um paciente com câncer, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) determinar o nível de expressão de VEGF e/ou sVEGFR-2 de uma amostra biológica retirada de um paciente; (b) comparar o nível de expressão de VEGF e/ou sVEGFR-2 e testar com um ou mais dos seguintes: (i) níveis em uma amostra similar retirada de um ou mais indivíduos sem suspeita de ter câncer, (ii) níveis em uma amostra similar retirada de um ou mais indivíduos com suspeita de ter câncer, ou (iii) níveis em uma amostra similar retirada do paciente em outro momento, em que a diferença no nível de expressão de VEGF e/ou sVEGFR-2 na amostra (a) e uma ou mais comparações correlacionam com a condição do paciente no que diz respeito ao estado de doença e/ou mudanças esperadas no estado de doença.

29. Método de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato de que avaliar a condição do paciente inclui uma ou mais das seguintes: diagnosticar o estado da doença; monitorar o estado da doença em busca por mudanças; e prognosticar a mudança no estado da doença, com ou sem tratamento.

30. Método de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato de que a amostra biológica é selecionada a partir de sangue, fluido amniótico, plasma, soro, sêmen, medula óssea, urina ou biópsia de tecido.

31. Método de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato de que a amostra biológica é plasma.

32. Método de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato de que o câncer é (a) tumor sólido de mama, trato respiratório, cérebro, órgãos reprodutivos, trato digestivo, trato urinário, olho, fígado, pele, cabeça e pescoço, tireóide, paratireóide ou as diferentes metástases destes, (b) linfoma, (c) sarcoma ou (d) leucemia.

33. Método de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que o referido câncer de mama é carcinoma ductal invasivo, carcinoma lobular invasivo, carcinoma ductal in sítu e carcinoma lobular in situ.

34. Método de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que o referido câncer de trato respiratório é carcinoma de pequenas células de pulmão, carcinoma de células não pequenas de pulmão, adenoma brônquico ou blastoma pleuropulmonar.

35. Método de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que o referido câncer de cérebro é glioma de hipo-oftálmico e de tronco-cerebral, astrocitoma cerebral e cerebelar, meduloblastoma, ependimoma, tumor neuroectodérmico ou pineal.

36. Método de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que o referido câncer de órgão reprodutivo é câncer de próstata, de testículo, de endométrio, cervical, de ovário, vaginal, de vulva ou sarcoma de útero.

37. Método de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que o referido câncer de trato digestivo é anal, de colo, colo-retal, de esôfago, de vesícula biliar, gástrico, de pâncreas, retal, de intestino delgado ou câncer de glândula salivar.

38. Método de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que o referido câncer de trato urinário é de bexiga, de pênis, de rim, renal, pélvico, de ureter ou câncer de uretra.

39. Método de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que o referido câncer de olho é melanoma intraocular ou retinoblastoma.

40. Método de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que o referido câncer de fígado compreende carcinoma hepatocelular, colangiocarcinoma, carcinoma hepatocelular misto.

41. Método de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que o referido câncer de pele compreende carcinoma de célula escamosa, sarcoma de Kaposi, melanoma maligno, câncer de pele de células de Merkel ou câncer de pele não melanoma.

42. Método de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que o referido câncer de cabeça e pescoço compreende câncer de laringe, de hipofaringe, de nasofaringe, ou de orofaringe, câncer labial ou câncer na cavidade oral.

43. Método de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que o referido câncer de sangue compreende linfoma relacionado com AIDS, linfoma não Hodgkin, linfoma cutâneo de células T, doença de Hodgkin, linfoma de sistema nervoso central, leucemia mielóide aguda, leucemia Iinfoblástica aguda, leucemia linfocitica crônica, leucemia mielógena crônica ou leucemia de célula pilosa.

44. Método de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que o referido sarcoma compreende sarcoma de tecido mole, osteosarcoma, histiocitoma fibroso maligno, linfossarcoma, rabdomiossarcoma, leucemia mielóide aguda, leucemia Iinfoblástica aguda, leucemia linfocitica crônica, leucemia mielógena crônica, ou leucemia de célula pilosa.

45. Método de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato de que o referido câncer é um carcinoma celular renal.

46. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o paciente está sendo tratado com sorafenib.

47. Método para monitorar a resposta de um paciente, o qual está sendo tratado contra tumores sólidos com o composto N-[4-cloro-3-(trifluorometil)fenil]-N'-{4-[2- carbamoil-l-oxo-(4-piridiloxi)]fenil} uréia de acordo com a fórmula I abaixo ou sal, polimorfo, hidrato ou solvato farmaceuticamente aceitável do mesmo, ou uma combinação destes, <formula>formula see original document page 80</formula> caracterizado pelo fato de que compreende: (a) determinar o nível de expressão de VEGF e/ou sVEGFR-2 em uma amostra biológica obtida de um paciente; (b) determinar o nível de expressão de VEGF e/ou sVEGFR-2 em pelo menos uma segunda amostra biológica retirada do paciente subseqüente ao tratamento inicial com o composto da fórmula I ou sal, polimorfo, hidrato ou solvato farmaceuticamente aceitável do mesmo, ou uma combinação destes; e (c) comparar o nível de expressão de VEGF e/ou sVEGFR-2 da segunda amostra com o nível de expressão de VEGF e/ou sVEGFR-2 da primeira amostra; em que uma mudança no nível de expressão de VEGF e/ou sVEGFR-2 da segunda amostra comparada com o nível de expressão do referido VEGF e/ou sVEGFR-2 da primeira amostra indica a eficiência do tratamento com o composto da fórmula I ou sal, polimorfo, hidrato, ou solvato farmaceuticamente aceitável do mesmo, ou uma combinação destes.

48. Método de acordo com a reivindicação 47, caracterizado pelo fato de que a amostra biológica é selecionada a partir de sangue, fluido amniótico, plasma, soro, sêmen, urina, medula óssea ou uma biópsia de tecido.

49. Método de acordo com a reivindicação 47, caracterizado pelo fato de que a amostra biológica é plasma.

50. Método de acordo com a reivindicação 47, caracterizado pelo fato de que o câncer é um carcinoma de célula renal.