JP2007515957A - ガンの予示及び予後ならびにガン治療の監視のための方法 - Google Patents
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Abstract
本発明はバイオマーカーならびにガンの予示及び予後のためのバイオマーカーの使用ならびにガン処置の有効性の監視のためのバイオマーカーの使用に関する。特定的に、本発明はVEGFR2阻害剤に関するバイオマーカーとしてのスタンニオカルシンの使用に関する。
Description
本出願は、2003年12月12日に申請された米国暫定出願第60/529,438号明細書の利益を請求し、該明細書の記載事項は引用することによりその全体が本明細書の内容となる。
発明の分野
本発明はバイオマーカーならびにガンの予示及び予後のためのバイオマーカーの使用ならびにガン処置の有効性の監視のためのバイオマーカーの使用に関する。特定的に、本発明は脈管内皮成長因子受容体−2(VEGFR2)阻害剤に関するバイオマーカーとしてのスタンニオカルシン(stanniocalcin)の使用に関する。
本発明はバイオマーカーならびにガンの予示及び予後のためのバイオマーカーの使用ならびにガン処置の有効性の監視のためのバイオマーカーの使用に関する。特定的に、本発明は脈管内皮成長因子受容体−2(VEGFR2)阻害剤に関するバイオマーカーとしてのスタンニオカルシン(stanniocalcin)の使用に関する。
発明の背景
多くの疾患状態は、遺伝子DNAのコピー数における変化を介するか、あるいは特定の遺伝子の転写のレベルにおける変化を介する(例えば開始、RNA前駆体の準備、RNAプロセシングなどの抑制を介する)種々の遺伝子の発現レベルにおける差により特徴付けられる。例えば遺伝物質の喪失及び取得は悪性の転換及び進行において重要な役割を果たす。これらの取得及び喪失は少なくとも2種類の遺伝子、オンコジーン及び腫瘍サプレッサー遺伝子により推進されると思われる。オンコジーンは腫瘍発生の正の調節物質(regulators)であり、腫瘍サプレッサー遺伝子は腫瘍発生の負の調節物質である(非特許文献1;非特許文献2)。従って、調節されない成長を活性化する1つの機構は、オンコジーンタンパク質をコードする遺伝子の数が増加するか、又はこれらのオンコジーンの発現のレベルが向上することであり(例えば細胞もしくは環境の変化に反応して)、他の機構は、腫瘍サプレッサーをコードする遺伝物質を喪失するか、又は腫瘍サプレッサーをコードする遺伝子の発現のレベルが低下することである。このモデルは、神経膠腫進行と関連する遺伝物質の喪失及び取得により支持される(非特許文献3)。かくして特定の遺伝子(例えばオンコジーン又は腫瘍サプレッサー)の発現(転写)レベルにおける変化は、種々のガンの存在及び進行に関する道標として働く。
多くの疾患状態は、遺伝子DNAのコピー数における変化を介するか、あるいは特定の遺伝子の転写のレベルにおける変化を介する(例えば開始、RNA前駆体の準備、RNAプロセシングなどの抑制を介する)種々の遺伝子の発現レベルにおける差により特徴付けられる。例えば遺伝物質の喪失及び取得は悪性の転換及び進行において重要な役割を果たす。これらの取得及び喪失は少なくとも2種類の遺伝子、オンコジーン及び腫瘍サプレッサー遺伝子により推進されると思われる。オンコジーンは腫瘍発生の正の調節物質(regulators)であり、腫瘍サプレッサー遺伝子は腫瘍発生の負の調節物質である(非特許文献1;非特許文献2)。従って、調節されない成長を活性化する1つの機構は、オンコジーンタンパク質をコードする遺伝子の数が増加するか、又はこれらのオンコジーンの発現のレベルが向上することであり(例えば細胞もしくは環境の変化に反応して)、他の機構は、腫瘍サプレッサーをコードする遺伝物質を喪失するか、又は腫瘍サプレッサーをコードする遺伝子の発現のレベルが低下することである。このモデルは、神経膠腫進行と関連する遺伝物質の喪失及び取得により支持される(非特許文献3)。かくして特定の遺伝子(例えばオンコジーン又は腫瘍サプレッサー)の発現(転写)レベルにおける変化は、種々のガンの存在及び進行に関する道標として働く。
これらの種々の疾患(例えばガン)の処置のための治療として用いられる化合物は、おそらくこれらの遺伝子発現変化のいくらかもしくはすべてを逆転させる。従ってこれらの遺伝子の少なくともいくらかの発現変化を、そのような治療の有効性を監視するか、又は予示さえするための方法として用いることができる。結局、これらの遺伝子発現変化のいくらか又はすべてをバイオマーカー(biomarker)であると考えることができ、且つバイオマーカーとして使用することができる。拡大により、遺伝子産物をバイオマーカーとして使用することもできる。治療の有効性の監視又は予示(predict)に用いる他に、治療的投与に積極的に(positively)反応することが予示される患者及び非−反応状態に戻り得る患者を選ぶためにバイオマーカーを用いることもできる。これらの発現変化の分析を問題の標的組織(例えばガン)において、あるいはいずれかの代わりの細胞集団(例えば末梢血白血球)において行なうことができる。後者の場合、有効性(例えば腫瘍収縮又は非−成長)との遺伝子発現変化の関連性が、有効性に関するマーカーとして用いられるべき発現変化パターンに関して特に強くなければならない。
充実性腫瘍は、生き残り且つ成長するために、脈管形成のプロセスにより十分な新しい脈管系を取得して、栄養及び酸素を与えなければならない。成長し、侵襲する腫瘍に伴って見出される活性化内皮細胞上で発現される脈管内皮成長因子(VEGF)及びその受容体、脈管内皮成長因子受容体−2(VEGFR2,aka KDR)は、このプロセスのために絶対に必要である。VEGF/VEGFR2経路を介するシグナル伝達は、腫瘍脈
管形成の開始及び保持のための一次刺激(primary stimulus)である。VEGFのVEGFR2との相互作用の遮断又はVEGFR2のチロシンキナーゼ活性の阻害は、前臨床モデルにおいて生体内脈管形成及び腫瘍成長の両方を遮断する。そのようなモデルにおける腫瘍成長の完全な抑制が、優性の負のVEGF受容体(非特許文献4;非特許文献5;非特許文献6)及び遮断抗体(blocking antibodies)(非特許文献7;非特許文献8;非特許文献9;非特許文献10;非特許文献11;非特許文献12)ならびにVEGFR2キナーゼ活性の小分子阻害剤(非特許文献13;非特許文献14)を単一−薬剤治療として用いて示された。さらに、これは現存する抗ガン治療ならびに前臨床的開発における多くの薬剤と適合する独特の方法である。
管形成の開始及び保持のための一次刺激(primary stimulus)である。VEGFのVEGFR2との相互作用の遮断又はVEGFR2のチロシンキナーゼ活性の阻害は、前臨床モデルにおいて生体内脈管形成及び腫瘍成長の両方を遮断する。そのようなモデルにおける腫瘍成長の完全な抑制が、優性の負のVEGF受容体(非特許文献4;非特許文献5;非特許文献6)及び遮断抗体(blocking antibodies)(非特許文献7;非特許文献8;非特許文献9;非特許文献10;非特許文献11;非特許文献12)ならびにVEGFR2キナーゼ活性の小分子阻害剤(非特許文献13;非特許文献14)を単一−薬剤治療として用いて示された。さらに、これは現存する抗ガン治療ならびに前臨床的開発における多くの薬剤と適合する独特の方法である。
脈管内皮細胞上のVEGFR2を標的とすることは、これらの正常な細胞が、遺伝的に不安定な腫瘍と異なり、薬剤耐性になり難いという重要な利点を有する。さらにVEGFR2は、正常には静止内皮細胞上で発現されず、脈管形成刺激に反応して上方−調節される。この状況は、腫瘍−関連脈管内皮における薬剤標的の選択的発現の結果として、もしかすると好ましい治療指数を与える。さらにデータは、VEGFR2キナーゼ活性の小分子阻害剤がガンの処置における重要な治療機構であろうことも示唆している。
スタンニオカルシン−1(配列番号:1及び2)は、最初に骨の多い魚におけるカルシウム及びリン酸塩ホメオスタシスに含まれるホルモンとして同定された分泌糖タンパク質である(非特許文献15)。第2のスタンニオカルシン、スタンニオカルシン−2(配列番号:3及び4)も同定され、それはスタンニオカルシン−1に有意な類似性を示す(非特許文献16)。スタンニオカルシンはVEGFにより誘導される(非特許文献17)。スタンニオカルシンは脈管形成の試験管内モデルにおいて上方−調節され、その発現は結腸ガンの脈管系領域において強く、すべて腫瘍脈管形成におけるスタンニオカルシンに関する顕著な役割を示唆している(非特許文献18)。
Marshall著,Cell 64:1991年,313−326 Weinberg著,Science 254:1991年,1138−1146 Mikkelson,et al.著,J.Cellular Biochem.46:1991年,3−8 Millauer,et al.著,Cancer Res.56:1996年,1615−1620 Goldman,et al.著,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95:1998年,8795 Lin,et al.著,J.Natl.Cancer Inst.87:1995年,213−219 Kim,et al.著,Nature 362:1993年,841−844 Melnyk,et al.著,Cancer Res.56:1996年,921−924 Borgstrom,et al.著,Prostate 35:1998年,1−10 Warren,et al.著,J.Clin.Invest.95:1995年,1789−1797 Asano,et al.著,Cancer Res.55:1995年,5296−5301 Yuan,et al.著,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:1996年,14765−14770 Abstract,Boston Angiogenesis Conference,March 22−23,1999年 Xu,et al.著,Int.J.Oncol.16:1997年,445−454 Chang,et al.著,Mol.Cell.Endocrinol.112:1995年,241−247 Chang,et al.著,Mol.Cell.Endocrinol.141:1998年,95−99 Liu,et al.著,Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol.,epub Oct.2,2003年 Gerritsen,et al.著,Exp.Nephrol.10:2002年,114−119
Marshall著,Cell 64:1991年,313−326 Weinberg著,Science 254:1991年,1138−1146 Mikkelson,et al.著,J.Cellular Biochem.46:1991年,3−8 Millauer,et al.著,Cancer Res.56:1996年,1615−1620 Goldman,et al.著,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95:1998年,8795 Lin,et al.著,J.Natl.Cancer Inst.87:1995年,213−219 Kim,et al.著,Nature 362:1993年,841−844 Melnyk,et al.著,Cancer Res.56:1996年,921−924 Borgstrom,et al.著,Prostate 35:1998年,1−10 Warren,et al.著,J.Clin.Invest.95:1995年,1789−1797 Asano,et al.著,Cancer Res.55:1995年,5296−5301 Yuan,et al.著,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:1996年,14765−14770 Abstract,Boston Angiogenesis Conference,March 22−23,1999年 Xu,et al.著,Int.J.Oncol.16:1997年,445−454 Chang,et al.著,Mol.Cell.Endocrinol.112:1995年,241−247 Chang,et al.著,Mol.Cell.Endocrinol.141:1998年,95−99 Liu,et al.著,Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol.,epub Oct.2,2003年 Gerritsen,et al.著,Exp.Nephrol.10:2002年,114−119
本発明は、スタンニオカルシン及びVEGFR2の間の連関を記載する。すなわち、ガン細胞におけるスタンニオカルシン遺伝子の発現はVEGFR2阻害剤への暴露の後に改変されることが示された(図1)。従ってスタンニオカルシンは腫瘍進行及び分化に関する価値のあるバイオマーカーとして、ならびにVEGFR2阻害剤を用いる処置の有効性を監視するためのバイオマーカーとして働くことができる。
発明の概略
発明の概略
本発明はバイオマーカーならびにガンの予示及び予後のためのバイオマーカーの使用ならびにガン処置の有効性の監視のためのバイオマーカーの使用に関する。特定的に、本発明はVEGFR2阻害剤に関するバイオマーカーとしてのスタンニオカルシンの使用に関する。
さらに、本発明の目的は、ガンの予示、診断、予後及び治療のための方法及び試薬を提供することである。
本発明の1つの態様において、バイオマーカーは、薬剤への暴露の後に改変された発現を示す1種もしくはそれより多い遺伝子及び/又は遺伝子産物を含んでなる。さらなる態様において、薬剤はVEGFR2阻害剤であり、他の態様において、バイオマーカーはス
タンニオカルシンである。
タンニオカルシンである。
本発明の他の態様は、1種もしくはそれより多い遺伝子及び/又は遺伝子産物の発現のレベルを分析する段階を含んでなる組織又は細胞試料への薬剤の効果をスクリーニングする方法であり、ここで組織又は細胞試料中の遺伝子発現及び/又は遺伝子産物レベルは薬剤への暴露の前後に分析され、そして遺伝子及び/又は遺伝子産物の発現レベルにおける変動が薬剤効果の指標であるか、あるいは患者に診断を与えるか、又は処置への患者の反応を予示する。さらなる態様において、薬剤はVEGFR2阻害剤である。他の態様において、遺伝子又は遺伝子産物はスタンニオカルシンである。
本発明の他の側面は、1種もしくはそれより多い遺伝子及び/又は遺伝子産物の発現のレベルを分析する段階を含んでなる新規な薬剤を見出すための方法であり、ここで細胞の遺伝子発現及び/又は遺伝子産物レベルは薬剤への暴露の前後に分析され、そして遺伝子及び/又は遺伝子産物の発現レベルにおける変動が薬剤有効性の指標である。さらなる側面において、遺伝子又は遺伝子産物はスタンニオカルシンである。
本発明は、さらに、ガンを有する患者に試験化合物を投与し、そしてポリペプチドの活性を測定することを含んでなるガンの処置に有用な化合物の同定方法を提供し、ここでポリペプチドの活性における変化は試験化合物がガンの処置に有用であることの指標である。さらなる態様において、ポリペプチドはスタンニオカルシンであり、そして他の態様において、化合物はVEGFR2阻害剤である。
かくして、本発明は、例えば調節物質又はモジュレーター、例えばアゴニスト及びアンタゴニスト、部分的アゴニスト、逆アゴニスト、アクチベータ、コ−アクチベータ及び阻害剤として働くことができる化合物の同定にために用いられ得る方法を提供する。従って本発明はガンに関連するポリヌクレオチド又はポリペプチドの発現を調節するための試薬及び方法を提供する。ポリヌクレオチドの発現、安定性又は量あるいはポリペプチドの活性を調節する試薬はタンパク質、ペプチド、ペプチドミメティック、核酸、核酸類似体(例えばペプチド核酸、ロックド核酸(locked nucleic acid))又は小分子であることができる。
本発明は、1種もしくはそれより多い遺伝子及び/又は遺伝子産物の発現のレベルを分析する段階を含んでなる、患者に診断を与えるための方法も提供し、ここで正常な試料と患者の試料の遺伝子発現及び/又は遺伝子産物レベルが分析され、そして患者の試料中の遺伝子及び/又は遺伝子産物の発現レベルにおける変動が疾患の診断である。患者の試料には血液、羊水、血漿、精液、骨髄及び組織生検材料が含まれるが、これらに限られない。さらなる態様において、遺伝子又は遺伝子産物はスタンニオカルシンである。
本発明は、なおさらに、ガンを有すると思われる患者においてポリペプチドの活性を測定することを含んでなる、患者におけるガンの診断方法を提供し、ここでガンを有していると思われない人におけるポリペプチドの活性に対してポリペプチドの活性に差がある場合、患者はガンを有すると診断される。さらなる態様において、ポリペプチドはスタンニオカルシンである。
他の態様において、本発明は患者の試料中のガンの検出方法を提供し、その方法では患者の試料中のタンパク質と反応させるためにタンパク質に対する抗体が用いられる。なおさらなる態様において、抗体はスタンニオカルシンに特異的である。
本発明の他の側面は、1種もしくはそれより多い遺伝子及び/又は遺伝子産物の発現のレベルを分析する段階を含んでなる、正常な状態と疾患状態を区別するための方法であり
、ここで正常な組織及び疾患組織の遺伝子発現及び/又は遺伝子産物レベルが分析され、そして遺伝子及び/又は遺伝子産物の発現レベルにおける変動が疾患状態の指標である。さらなる側面において、遺伝子又は遺伝子酸物はスタンニオカルシンである。
、ここで正常な組織及び疾患組織の遺伝子発現及び/又は遺伝子産物レベルが分析され、そして遺伝子及び/又は遺伝子産物の発現レベルにおける変動が疾患状態の指標である。さらなる側面において、遺伝子又は遺伝子酸物はスタンニオカルシンである。
他の態様において、本発明は少なくとも1種の遺伝子の、正常な細胞に対する異常な(differential)発現の検出を含む、細胞の表現型の決定方法に関し、ここで遺伝子は正常な細胞と比較して異常に発現される。さらなる態様において、遺伝子はスタンニオカルシンをコードする。
さらに別の態様において、本発明は少なくとも1種のポリペプチドの、正常な細胞に対する異常な発現の検出を含む、細胞の表現型の決定方法に関し、ここでタンパク質は正常な細胞と比較して異常に発現される。さらなる態様において、タンパク質はスタンニオカルシンである。
他の態様において本発明は、少なくとも約10個、少なくとも約15個、少なくとも約25個又は少なくとも約40個の連続ヌクレオチドを有するヌクレオチド配列を含んでなる核酸プローブを準備し、患者から細胞の試料を得、場合によりすべてが実質的に非−ガン性である細胞の第2の試料を準備し、緊縮条件下で核酸プローブを該第1及び第2の細胞試料のそれぞれのmRNAと接触させ、(a)第1の細胞試料のmRNAとのプローブのハイブリッド形成の量を(b)第2の細胞試料のmRNAとのプローブのハイブリッド形成の量を比較することにより、患者からの細胞の表現型を決定するための方法に関し、ここで第2の細胞試料のmRNAとのハイブリッド形成の量と比較される時の第1の細胞試料のmRNAとのハイブリッド形成の量における差が第1の細胞試料中の細胞の表現型の指標である。さらなる態様において、核酸プローブはスタンニオカルシンをコードするヌクレオチド配列を含んでなる。
他の態様において本発明は、患者から単離される細胞の試料中の核酸のレベルを測定するためのプローブ/プライマーを含んでなる、ガン細胞又は組織の存在の同定のための試験キットを提供する。ある態様において、キットはさらにキットの使用のための指示書、細胞を懸濁させるか又は固定するための溶液、検出可能なタグ又は標識、核酸をハイブリッド形成し易くするための溶液、細胞のライシスのための溶液あるいは核酸の精製のための溶液を含むことができる。さらなる態様において、プローブ/プライマーはスタンニオカルシンをコードするヌクレオチド配列を含んでなる。
1つの態様において、本発明はあるタンパク質に関して特異的な抗体を含んでなるガン細胞もしくは組織の存在を同定するための試験キットを提供する。ある態様において、キットはさらにキットの使用のための指示書を含む。ある態様において、キットはさらに細胞を懸濁させるか又は固定するための溶液、検出可能なタグ又は標識、ポリペプチドを抗体の結合を受け易くするための溶液、細胞のライシスのための溶液あるいはポリペプチドの精製のための溶液を含むことができる。なおさらなる態様において、抗体はスタンニオカルシンに関して特異的である。
他の態様において本発明は、患者から単離される細胞の試料中の核酸のレベルを測定するためのプローブ/プライマーを含んでなる、ガン細胞もしくは組織における化合物又は治療の有効性を監視するための試験キットを提供する。ある態様において、キットはさらにキットの使用のための指示書、細胞を懸濁させるか又は固定するための溶液、検出可能なタグ又は標識、核酸をハイブリッド形成し易くするための溶液、細胞のライシスのための溶液あるいは核酸の精製のための溶液を含むことができる。さらなる態様において、プローブ/プライマーはスタンニオカルシンをコードするヌクレオチド配列を含んでなる。
1つの態様において本発明は、あるタンパク質に関して特異的な抗体を含んでなるガン細胞もしくは組織における化合物又は治療の有効性を監視するための試験キットを提供する。ある態様において、キットはさらにキットの使用のための指示書を含む。ある態様において、キットはさらに細胞を懸濁させるか又は固定するための溶液、検出可能なタグ又は標識、ポリペプチドを抗体の結合を受け易くするための溶液、細胞のライシスのための溶液あるいはポリペプチドの精製のための溶液を含むことができる。なおさらなる態様において、抗体はスタンニオカルシンに関して特異的である。
図の記述
図1.MDA−MB−231異種移植腫瘍におけるスタンニオカルシン−1及びスタンニオカルシン−2の発現へのVEGFR2阻害剤の効果。
図1.MDA−MB−231異種移植腫瘍におけるスタンニオカルシン−1及びスタンニオカルシン−2の発現へのVEGFR2阻害剤の効果。
図2A.100nMのVEGFR2阻害剤+/−VEGFで処理されたHMVEC細胞におけるスタンニオカルシン発現。
図2B.100nMのVEGFR2阻害剤+/−VEGFで処理されたHMVEC細胞におけるスタンニオカルシン発現の時間経過。
図3A.100nMのVEGFR2阻害剤+/−VEGFで処理されたHUVEC細胞におけるスタンニオカルシン発現の時間経過。
図3B.100nMのVEGFR2阻害剤+/−VEGFで処理されたHUVEC細胞におけるスタンニオカルシン発現。
発明の詳細な記述
本発明は、記載される特定の方法、案、細胞系、動物種もしくは属、構築物及び試薬に制限されず、従って変化し得ることが理解されねばならない。本明細書で用いられる用語は特定の態様を記述する目的のみのためであり、本発明の範囲を制限することは意図されておらず、本発明の範囲は添付の請求項によってのみ制限されるであろうことも理解されねばならない。
本発明は、記載される特定の方法、案、細胞系、動物種もしくは属、構築物及び試薬に制限されず、従って変化し得ることが理解されねばならない。本明細書で用いられる用語は特定の態様を記述する目的のみのためであり、本発明の範囲を制限することは意図されておらず、本発明の範囲は添付の請求項によってのみ制限されるであろうことも理解されねばならない。
本明細書及び添付の請求項で用いられる場合、単数形態「a」、「and」及び「the」は、状況が明らかに他のように指定していなければ、複数の言及を含むことに注意しなければならない。かくして例えば「a gene」への言及は1個もしくはそれより多い遺伝子への言及であり、当該技術分野における熟練者に既知のその同等事項を含み、以下同様である。
他にことわらなければ、本明細書で用いられるすべての技術的及び科学的用語は、本発明が属する技術分野における通常の熟練者が通常理解すると同じ意味を有する。本発明の実施又は試験において、本明細書に記載されるものに類似もしくはそれと同等のいずれの方法、装置及び材料も用いられ得るが、ここで好ましい方法、装置及び材料を記述する。
本明細書で挙げられるすべての公開文献及び特許は、例えば公開文献に記載され、現在記述されている発明と結びつけて用いることができる構築物及び方法を記述し、開示する目的のために、引用することによりその記載事項が本明細書の内容となる。上記及び本文を通じて議論される公開文献は、本出願の申請日時より前のそれらの開示に関してのみ示される。本明細書中のいずれも、先行発明の故にそのような開示に先行する資格が発明者等にないという承認とみなされるべきではない。
定義
簡便のために、明細書、実施例及び添付の請求項中で用いられるある用語及び句の意味を下記に示す。
簡便のために、明細書、実施例及び添付の請求項中で用いられるある用語及び句の意味を下記に示す。
アレー(例えばマイクロアレー)上の「アドレス」は、要素、例えばオリゴヌクレオチドがアレーの固体表面に結合する位置を指す。
本明細書で用いられる場合、「アゴニスト」という用語は、タンパク質の生物活性を模するか又は上方−調節する(例えば力を与えるか又は補足する)薬剤を指すものとする。アゴニストは、野生型タンパク質又は野生型タンパク質の少なくとも1つの生物活性を有するその誘導体であることができる。アゴニストは、遺伝子の発現を上方−調節するか、あるいはタンパク質の少なくとも1つの生物活性を向上させる化合物であることもできる。アゴニストは、ポリペプチドと他の分子、例えば標的ペプチド又は核酸との相互作用を向上させる化合物であることもできる。
本明細書で用いられる場合、「増幅」は核酸配列の追加のコピーの作製に関する。例えば当該技術分野で周知のポリメラーゼ連鎖反応(PCR)法を用いて増幅を行なうことができる。(例えばDieffenbach and Dveksler(1995) PCR Primer,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press,Plainview,N.Y.を参照されたい。)
本明細書で用いられる場合、「アンタゴニスト」は、タンパク質の少なくとも1つの生物活性を下方−調節する(例えば抑制又は阻害する)薬剤を指すものとする。例えばVEGFR2阻害剤はそのようなアンタゴニストの例である。アンタゴニストは、タンパク質と他の分子、例えば標的ペプチド又は酵素基質の間の相互作用を妨げるか又は低下させる化合物であることができる。アンタゴニストは遺伝子の発現を下方−調節するか、又は存在するタンパク質の発現量を減少させる化合物であることもできる。
本明細書で用いられる場合、「抗体」という用語は、例えばいずれかのイソタイプ(IgG、IgA、IgM、IgEなど)の抗体全体を含み、且つ脊椎動物(例えば哺乳類)タンパク質とやはり特異的に反応性のそのフラグメントを含むものとする。通常の方法を用いて抗体をフラグメント化することができ、且つ抗体全体に関して上記で記載したと同じ方法で利用性に関してフラグメントをスクリーニングすることができる。かくして該用語は、あるタンパク質と選択的に反応することができる抗体分子のタンパク質分解的に切断されたか、あるいは組換え的に調製された部分のセグメントを含む。そのようなタンパク質分解的及び/又は組換え的フラグメントの制限ではない例は、Fab、F(ab’)2、Fab’、Fv及びペプチドリンカーにより連結したV[L]及び/又はV[H]ドメインを含有する1本鎖抗体(scFv)を含む。scFv’sは共有結合的に、又は非−共有結合的に連結して2個もしくはそれより多い結合部位を有する抗体を形成することができる。本発明はポリクローナル、モノクローナル抗体又は他の精製された抗体の調製物ならびに組換え抗体を含む。
「アレー」又は「マトリックス」という用語は、装置上のアドレス可能な(addressable)位置又は「アドレス」の配置を指す。位置は二−次元アレー、三−次元アレー又は他のマトリックス形式で配置され得る。位置の数は数個から少なくとも数十万個の範囲であることができる。最も重要なことに、各位置は全体として独立した反応部位を示す。「核酸アレー」は核酸プローブ、例えばオリゴヌクレオチド又は遺伝子の比較的大きな部分を含有するアレーを指す。アレー上の核酸は、好ましくは1本鎖である。プローブがオリゴヌクレオチドであるアレーは「オリゴヌクレオチドアレー」又は「オリゴヌクレオチドチップ」と呼ばれる。本明細書で「バイオチップ」又は「生物学的チップ」とも呼ばれる「マイクロアレー」は、少なくとも約100個/cm2、そして好ましくは少なくとも約1000個/cm2の不連続領域の密度を有する領域のアレーである。マイクロ
アレー中の領域は典型的な寸法、例えば約10〜250μmの範囲内の直径を有し、大体同じ距離でアレー中の他の領域から隔てられる。
アレー中の領域は典型的な寸法、例えば約10〜250μmの範囲内の直径を有し、大体同じ距離でアレー中の他の領域から隔てられる。
互換的に用いられる「生物学的活性」又は「生物活性」又は「活性」又は「生物学的機能」は本明細書で、ポリペプチド(その本来のコンフォーメーションにあっても又は変性されたコンフォーメーションにあっても)あるいはそのいずれかの細分配列(subsequence)が直接又は間接的に行なうエフェクター又は抗原的機能を意味する。生物学的活性は、ポリペプチドへの結合、他のタンパク質又は分子への結合、DNA結合タンパク質、転写調節物質としての活性、損傷を受けたDNAに結合する能力などを含む。問題の(subject)ポリペプチドに直接影響を与えることにより、生物活性を調節することができる。あるいはまた、対応する遺伝子の発現を調節するようなことにより、ポリペプチドのレベルを調節することによって生物活性を改変することができる。
本明細書で用いられる場合、「生物学的試料」という用語は、生物からか又は生物の成分(例えば細胞)から得られる試料を指す。試料はいずれの生物学的組織又は流体のものであることもできる。試料は患者に由来する試料であることができる。そのような試料には痰、血液、血球(例えば白血球)、組織もしくは生検試料(例えば腫瘍生検材料)、尿、腹膜液及び胸膜液又はそれらからの細胞が含まれるが、これらに限られない。生物学的試料には組織の切片、例えば組織学的目的のために採取される凍結切片も含まれる。
「バイオマーカー」又は「マーカー」という用語は、広範囲の細胞−内及び−外事象ならびに生物−全体の生理学的変化を包含する。バイオマーカーは本質的にいずれの細胞機能の側面をも示すことができ、例えばこれらに限られないがシグナリング分子、転写因子、代謝産物、遺伝子転写物のレベルもしくはそれらの生産の速度ならびにタンパク質の翻訳−後変更を示すことができる。バイオマーカーは転写物レベルの全ゲノム分析又はタンパク質レベル及び/又は変更の全プロテオーム(proteome)分析を含むことができる。
バイオマーカーは、疾患を有する患者の化合物−処置された患細胞において、未処置の患細胞と比較して上方−もしくは下方−調節される遺伝子又は遺伝子産物も指すことができる。すなわち、遺伝子又は遺伝子産物は十分に処置細胞に特異的なので、場合により他の遺伝子又は遺伝子産物と組み合わせて、小分子の有効性の同定、予示又は検出にそれを用いることができる。かくしてバイオマーカーは患細胞における化合物の有効性あるいは化合物による処置に対するその患細胞の反応の特性を表す遺伝子又は遺伝子産物である。
2つの配列の塩基のそれぞれが適合する、すなわちWatson−Crick塩基対を形成できる場合、ヌクレオチド配列は他方のヌクレオチド配列に「相補的」である。「相補鎖(complementary strand)」という用語は本明細書で「相補鎖(complement)」という用語と互換的に用いられる。核酸鎖の相補鎖は、コーディング鎖の相補鎖又は非−コーディング鎖の相補鎖であることができる。
「遺伝子の検出薬剤」は、遺伝子又はそれに関連する他の生物学的分子、例えば遺伝子から転写されるRNA又は遺伝子によりコードされるポリペプチドを特異的に検出するために用いられ得る薬剤を指す。典型的な検出薬剤は、遺伝子に対応する核酸にハイブリッド形成する核酸プローブ及び抗体である。
「ガン」という用語は、充実性腫瘍、例えば乳房、気道、脳、生殖器、消化管、尿路、眼、肝臓、皮膚、頭及び頚部、甲状腺、上皮小体のガン及びそれらの遠隔転移を含むが、これらに限られない。該用語はリンパ腫、肉腫及び白血病も含む。
乳ガンの例には浸潤腺管ガン、浸潤小葉ガン、上皮内腺管ガン及び上皮内小葉ガンが含まれるが、これらに限られない。
気道のガンの例には小−細胞及び非−小−細胞肺ガンならびに気管支腺腫及び胸膜肺芽腫が含まれるが、これらに限られない。
脳のガンの例には脳幹及び眼下(hypophtalmic)神経膠腫、小脳及び大脳星状細胞腫、髄芽細胞腫、脳室上衣細胞腫ならびに神経外胚葉及び松果体腫瘍が含まれるが、これらに限られない。
男性の生殖器の腫瘍には前立腺及び精巣ガンが含まれるが、これらに限られない。女性の生殖器の腫瘍には子宮内膜、頚、卵巣、膣及び外陰ガンならびに子宮の肉腫が含まれるが、これらに限られない。
消化管の腫瘍には肛門、結腸、結腸直腸、食道、胆嚢、胃、膵臓、直腸、小腸及び唾液腺ガンが含まれるが、これらに限られない。
尿路の腫瘍には膀胱、陰茎、腎臓、腎盤、尿管及び尿道ガンが含まれるが、これらに限られない。
眼のガンには眼内黒色腫及び網膜芽腫が含まれるが、これらに限られない。
肝臓ガンの例には肝細胞ガン(線維層状変異体(fiblolamellar variant)を有するか、もしくは有していない肝細胞ガン)、胆管ガン(胆管内ガン)及び混合肝細胞胆管ガンが含まれるが、これらに限られない。
皮膚ガンには扁平上皮細胞ガン、カポージ肉腫、悪性黒色腫、メルケル細胞皮膚ガン及び非−黒色腫皮膚ガンが含まれるが、これらに限られない。
頭−及び−頚部ガンには咽頭/下咽頭/鼻咽頭/口腔咽頭ガンならびに口唇及び口腔ガンが含まれるが、これらに限られない。
リンパ腫にはAIDS−関連リンパ腫、非−ホジキンリンパ腫、皮膚T−細胞リンパ腫、ホジキン病及び中枢神経系のリンパ腫が含まれるが、これらに限られない。
肉腫には軟組織の肉腫、骨肉腫、悪性線維性組織球腫、リンパ肉腫及び横紋筋肉腫が含まれるが、これらに限られない。
白血病には急性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病及びヘアリー・セル白血病が含まれるが、これらに限られない。
「ガンの患細胞」は、ガンを有する患者中に存在する細胞を指す。それは、正常な細胞の変更された形態であり、ガンを有していない人に存在しない細胞あるいはガンを有していない人に対してガンを有する患者において有意により多いかもしくはより少ない数で存在する細胞である。
「同等の」という用語は、機能的に同等のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むと理解される。同等のヌクレオチド配列は、1個もしくはそれより多いヌクレオチド置換、付加又は欠失により異なる配列、例えば対立遺伝子変異体を含むことができる。
本明細書で細胞の「遺伝子発現分布」及び「指紋」と互換的に用いられる「発現分布」という用語は、細胞中の1個もしくはそれより多い遺伝子のmRNAレベルを示す1組の値を指す。発現分布は、好ましくは少なくとも約10個の遺伝子、好ましくは少なくとも約50、100、200又はそれより多い遺伝子の発現レベルを示す値を含んでなる。発現分布は、複数の細胞及び条件において類似のレベルで発現される遺伝子(例えばGAPDHのようなハウスキーピング遺伝子)のmRNAレベルも含んでなることができる。例えばガンの患細胞の発現分布は、患細胞中の10個もしくはそれより多い遺伝子のmRNAレベルを示す1組の値を指す。
「遺伝子」という用語は、ポリペプチドもしくは前駆体の生産のために必要な制御及びコーディング配列を含んでなる核酸配列を指す。ポリペプチドは全長コーディング配列により、又はコーディング配列のいずれかの部分によりコードされ得る。遺伝子は全体的に又は部分的に、植物、菌・カビ、動物、バクテリアゲノムもしくはエピソーム、真核、核もしくはプラスミドDNA、cDNA、ウイルスDNA又は化学的に合成されるDNAを含む、当該技術分野において既知のいずれの供給源に由来することもできる。遺伝子は、コーディングもしくは非翻訳領域中に、発現産物の生物学的活性もしくは化学構造、発現の速度又は発現制御の方法に影響を与え得る1つもしくはそれより多い変更を含有することができる。そのような変更には、1個もしくはそれより多いヌクレオチドの突然変異、挿入、欠失及び置換が含まれるが、これらに限られない。遺伝子は中断されないコーディング配列を構成することができるか、あるいはそれは適したスプラス結合(splice
junctions)により結合した1個もしくはそれより多いイントロンを含むことができる。
junctions)により結合した1個もしくはそれより多いイントロンを含むことができる。
「ハイブリッド形成」は、核酸の鎖が塩基対合を介して相補鎖と結合するいずれかのプロセスを指す。例えば2個の1本鎖核酸が2本鎖二重らせんを形成する場合、それらは「ハイブリッド形成する」。2本鎖の領域(the region of double−strandedness)は1本鎖核酸の一方もしくは両方の全長又は一方の1本鎖核酸のすべて及び他方の1本鎖核酸の細分配列を含むことができるか、あるいは2本鎖の領域は各核酸の細分配列を含むことができる。ハイブリッド形成は、ある誤対合を含有する二重らせんの形成も含み、但し2個の鎖は依然として2本鎖らせんを形成している。「緊縮ハイブリッド形成条件」は、本質的に特異的なハイブリッド形成を生ずるハイブリッド形成条件を指す。
本明細書でDNA又はRNAのような核酸に関して用いられる場合、「単離された」という用語は、巨大分子の天然の供給源中に存在する他のそれぞれDNAs又はRNAsから分離された分子を指す。本明細書で用いられる場合、「単離された」という用語は、細胞材料、ウイルス材料、組換えDNA法により生産される場合には培地あるいは化学的に合成される場合には化学的前駆体又は他の化学品を実質的に含まない核酸又はペプチドも指す。さらに、「単離された核酸」は、自然にはフラグメントとして存在せず、自然の状態では見い出されない核酸フラグメントを含むことができる。「単離された」という用語は本明細書で、他の細胞タンパク質を実質的に含まないポリペプチドを指すためにも用いられ、精製されたポリペプチド及び組換えポリペプチドの両方を包含するものとする。
本明細書で用いられる場合、「標識」及び「検出可能な標識」という用語は、放射性同位体、発蛍光団、化学発光部分、酵素、酵素基質、酵素補因子、酵素阻害剤、色素、金属イオン、リガンド(例えばビオチン又はハプテン)などを含むがこれらに限られない検出が可能な分子を指す。「蛍光物質(fluorescer)」という用語は、検出可能な領域内で蛍光を示すことができる物質又はその一部を指す。本発明で用いられ得る標識の特定の例にはフルオレセイン、ローダミン、ダンシル、ウンベリフェロン、テキサスレッド、ルミノール、NADPH、アルファ−ベータ−ガラクトシダーゼ及びホースラディッ
シュペルオキシダーゼが含まれる。
シュペルオキシダーゼが含まれる。
本明細書で用いられる場合、「発現のレベル」という用語は、与えられる核酸の測定可能な発現レベルをさす。核酸の発現のレベルは当該技術分野で周知の方法により決定される。「異常に発現される」又は「異常発現」という用語は、与えられる核酸の測定可能な発現レベルにおける向上又は低下を指す。既知の濃度の1種もしくはそれより多い標準核酸種を含め、標準核酸の量に基づいて標準曲線を形成し、「未知の」核酸種の発現レベルを標準曲線に関して未知の種のハイブリッド形成強度から外挿することにより、核酸の発現のレベルの絶対的定量を行なうことができる。
本明細書で用いられる場合、「核酸」という用語は、デオキシリボ核酸(DNA)及び適宜リボ核酸(RNA)のようなポリヌクレオチドを指す。該用語は、同等物質として、ヌクレオチド類似体から作られるRNAもしくはDNAの類似体ならびに記載されている態様に適用可能な場合、1本鎖(センスもしくはアンチセンス)及び2本鎖ポリヌクレオチドを含むことも理解されねばならない。染色体、cDNAs、mRNAs、rRNAs及びESTsは核酸と呼ぶことができる分子の典型的な例である。
本明細書で用いられる場合、「オリゴヌクレオチド」という用語は、例えば約10〜約1000個のヌクレオチドを含んでなる核酸分子を指す。本発明における使用のためのオリゴヌクレオチドは、長さが好ましくは約15〜約150個のヌクレオチド、より好ましくは約150〜約1000個のヌクレオチドである。オリゴヌクレオチドは天然に存在するオリゴヌクレオチド又は合成オリゴヌクレオチドであることができる。オリゴヌクレオチドはホスホルアミダイト法(Beaucage and Carruthers著,Tetrahedron Lett.22:1981年,1859−62)により、又はトリエステル法(Matteucci,et al.著,J.Am.Chem.Soc.103:1981年,3185)により、又は当該技術分野において既知の他の化学的方法により調製され得る。
本明細書で用いられる場合、「患者(patient)」又は「患者(subject)」という用語は哺乳類(例えば人間及びイヌ、ネコなどのような動物)を含む。
本明細書で用いられる場合、アレーに結合する核酸又は他の分子は「プローブ」又は「捕獲プローブ」と呼ばれる。アレーが1個の遺伝子に対応する数個のプローブを含有する場合、これらのプローブは「遺伝子−プローブセット」と呼ばれる。遺伝子−プローブセットは、例えば約2〜約20個のプローブ、好ましくは約2〜約10個のプローブそして最も好ましくは約5個のプローブから成ることができる。
細胞の生物学的状態の「分布(profile)」は、薬剤処置及び細胞の生物学的状態の他の変動に反応して変化することが知られている細胞の種々の要素のレベルを指す。細胞の要素には、例えばRNAのレベル、タンパク質存在量のレベル又はタンパク質活性レベルが含まれる。
「タンパク質」という用語は本明細書で、「ペプチド」及び「ポリペプチド」という用語と互換的に用いられる。
本明細書で用いられる場合、「小分子」は約5kD未満そして最も好ましくは約4kD未満の分子量を有する組成物を指す。小分子は核酸、ペプチド、ポリペプチド、ペプチドミメティック、炭水化物、脂質又は他の有機もしくは無機分子であることができる。多くの製薬会社は化学的及び/又は生物学的混合物、多くの場合は菌・カビ、バクテリア又は藻類抽出物の広範囲のライブラリを有し、生物活性を調節する化合物の同定のために本発
明のアッセイのいずれかを用いてそれをスクリーニングすることができる。
明のアッセイのいずれかを用いてそれをスクリーニングすることができる。
鋳型核酸の標的部位へのプローブの「特異的ハイブリッド形成」という用語は、ハイブリッド形成シグナルを明確に解明できるような、優勢的に(predominantly)標的へのプローブのハイブリッド形成を指す。本明細書でさらに記述される通り、特異的ハイブリッド形成を生ずるような条件は、相同の領域の長さ、領域のGC含有率及びハイブリッドの融解温度(「Tm」)に依存して変る。かくしてハイブリッド形成条件は塩含有率、酸性度ならびにハイブリッド形成溶液及び洗浄液の温度において変ることができる。
ポリペプチドの「変異体」は、1個もしくはそれより多いアミノ酸残基が改変されたアミノ酸配列を有するポリペプチドを指す。変異体は「保存的」変化を有することができ、その場合、置換されたアミノ酸は類似の構造的又は化学的性質を有する(例えばイソロイシンを用いるロイシンの置換)。変異体は「非保存的」変化(例えばトリプトファンを用いるグリシンの置換)を有することもできる。類似の比較的小さい変異は、アミノ酸欠失又は挿入あるいは両方を含むことができる。生物学的もしくは免疫学的活性をなくさずにどのアミノ酸残基を置換するか、挿入するか又は欠失させることができるかの決定における指針は、当該技術分野において周知のコンピュータープログラム、例えばLASERGENEソフトウェア(DNASTAR)を用いてみきわめることができる。
「変異体」という用語は、ポリヌクレオチド配列の範囲内で用いられる場合、特定の遺伝子の配列又はそのコーディング配列に関連するポリヌクレオチド配列を包含することができる。この定義は、例えば「対立遺伝子」、「スプライス」、「種」又は「多型性」変異体も含むことができる。スプライス変異体は関連する分子(reference molecule)に有意な同一性を有することができるが、一般にmRNAプロセシングの間のエキソンの交互スプライシングの故に、より多数もしくは少数のポリヌクレオチドを有するであろう。対応するポリペプチドは追加の機能性ドメイン又はドメインの不在を有することができる。種変異体は、1つの種から他の種で異なるポリヌクレオチド配列である。得られるポリペプチドは一般に、互いに対して有意なアミノ酸同一性を有するであろう。多型性変異体は、与えられる種の個体間での特定の遺伝子のポリヌクレオチド配列における変異である。多型性変異体は、ポリヌクレオチド配列が1個の塩基のみで異なる「単一ヌクレオチド多型性」(SNPs)も包含することができる。SNPsの存在は、例えばある集団、疾患状態又は疾患状態に関する傾向の指標であり得る。
本発明の側面は、異常な増殖を特徴とする細胞の分化及び増殖を調節することができる薬剤の同定を目的とする。さらに特定的に、本発明は候補化合物もしくは物質を、核酸配列の異常発現を調節するそれらの能力に関してスクリーニングする方法に関する。すなわち、核酸配列がガン細胞中で過剰発現される場合、候補化合物は発現を減少させるそれらの能力に関してスクリーニングされ、核酸配列がガン細胞中で過少発現される(underexpressed)場合、試験化合物は発現を増加させるその能力に関してスクリーニングされる。さらに本発明は、本明細書に記載される異常に発現される配列がコードする1種もしくはそれより多いポリペプチドの活性を調節する試験化合物もしくは物質の同定のためのスクリーニングアッセイに関する。これに関し、本発明はマーカー核酸の発現を調節する、及び/又はコードされるポリペプチドの生物活性を改変する化合物の決定のためのアッセイを提供する。
異常発現の調節のためのスクリーニング
薬剤スクリーニングは、細胞の試料に試験化合物(例えばVEGFR2阻害剤)を加え、効果を監視することにより行なわれる。試験化合物を与えられない平行試料も標準として監視する。次いで顕微鏡分析、生存性試験、複製能力、組織学的検査、細胞と関連する特定のRNA又はポリペプチドのレベル、細胞もしくは細胞ライセートが示す酵素活性のレベル及び他の細胞もしくは化合物と相互作用する細胞の能力を含むがこれらに限られない適した表現型基準により、処置細胞と未処置細胞を比較する。処置細胞と未処置細胞の間の差は、試験化合物に帰することができる効果を示す。
薬剤スクリーニングは、細胞の試料に試験化合物(例えばVEGFR2阻害剤)を加え、効果を監視することにより行なわれる。試験化合物を与えられない平行試料も標準として監視する。次いで顕微鏡分析、生存性試験、複製能力、組織学的検査、細胞と関連する特定のRNA又はポリペプチドのレベル、細胞もしくは細胞ライセートが示す酵素活性のレベル及び他の細胞もしくは化合物と相互作用する細胞の能力を含むがこれらに限られない適した表現型基準により、処置細胞と未処置細胞を比較する。処置細胞と未処置細胞の間の差は、試験化合物に帰することができる効果を示す。
試験化合物の所望の効果は、ガン−関連マーカー核酸配列により与えられるいずれかの表現型への効果を含む。例にはmRNAの過剰存在を制限する、コードされるタンパク質の生産を制限する、あるいはタンパク質の機能的効果を制限する試験化合物が含まれる。試験化合物の効果は、処置細胞と未処置細胞の間で結果を比較すると明らかとなるであろう。
かくして本発明は、試験管内で核酸マーカーの発現を妨げるか、もしくは増強する薬剤(例えばVEGFR2阻害剤)に関するスクリーニングの方法も包含し、その方法は、培養細胞中でマーカー核酸mRNA(例えばスタンニオカルシン)が検出可能である細胞もしくは組織を薬剤に暴露して、薬剤がmRNAの生産を妨げることができるか、又は増強することができるかを決定し;暴露された細胞もしくは組織中のmRNAのレベルを決定することを含んでなり、ここで薬剤への細胞系の暴露後のmRNAのレベルにおける低下はマーカー核酸mRNA生産の妨害の指標であり、mRNAレベルにおける向上はマーカーmRNA生産の増強の指標である。
あるいはまた、スクリーニング法は試験管内スクリーニングを含むことができ、その方法はマーカータンパク質が培養細胞中で検出可能である細胞もしくは組織をマーカータンパク質の生産を妨げるかもしくは増強すると思われる薬剤に暴露し;そして細胞もしくは組織中のマーカータンパク質のレベルを決定することを含んでなり、ここで細胞又は組織の薬剤への暴露後のマーカータンパク質のレベルにおける低下はマーカータンパク質生産の妨害の指標であり、マーカータンパク質のレベルの向上はマーカータンパク質生産の増強の指標である。
本発明は、マーカー核酸の発現を妨げるかもしくは増強する薬剤に関する生体内スクリーニング法も包含し、その方法はマーカーmRNAもしくはタンパク質が検出可能な腫瘍細胞を有する患者を、マーカーmRNAもしくはタンパク質の生産を妨げるかもしくは増強すると思われる薬剤に暴露し;暴露された哺乳類の腫瘍細胞中のマーカーmRNAもしくはタンパク質のレベルを決定することを含んでなる。薬剤への患者の暴露後のマーカーmRNAもしくはタンパク質のレベルにおける低下は、マーカー核酸発現の妨害の指標であり、マーカーmRNAもしくはタンパク質のレベルにおける向上は、マーカー核酸発現の増強の指標である。
従って本発明は、マーカー核酸を発現する細胞を試験化合物と一緒にインキュベーションし、mRNAもしくはタンパク質レベルを測定することを含んでなる方法を提供する。本発明はさらに、細胞集団におけるマーカー核酸の発現のレベルを定量的に決定するための方法ならびに薬剤が細胞集団においてマーカー核酸の発現のレベルを向上させることができるか又は低下させることができるかを決定するための方法を提供する。薬剤が細胞集団においてマーカー核酸の発現のレベルを向上させることができるか又は低下させることができるかを決定するための方法は、(a)標準細胞集団及び薬剤−処置された細胞集団からの細胞抽出物を調製し、(b)細胞抽出物からマーカーポリペプチドを単離し、そして(c)マーカーポリペプチドと該ポリペプチドに特異的な抗体の間に形成される免疫複合体の量を定量する(例えば平行に)段階を含んでなる。本発明のマーカーポリペプチドを、その生物活性に関してアッセイすることによって定量することもできる。マーカー核酸発現を増加させる薬剤を、標準細胞中で形成される免疫複合体の量と比較して処置細胞中で形成される免疫複合体の量を増加させるそれらの能力により同定することができる。
類似の方法で、マーカー核酸の発現を減少させる薬剤を、標準細胞と比較して処置細胞抽出物中で形成される免疫複合体の量を減少させるそれらの能力により同定することができる。
類似の方法で、マーカー核酸の発現を減少させる薬剤を、標準細胞と比較して処置細胞抽出物中で形成される免疫複合体の量を減少させるそれらの能力により同定することができる。
本発明は、ガン中で異常に調節される単離核酸配列及びそのような配列の同定方法を提供する。本発明は、ガンを有する患者において異常に調節されるヌクレオチド配列を同定するための方法を提供し、その方法は:患者から得られるRNAに対応する核酸試料を既知の正体の1種もしくはそれより多い核酸分子を含んでなる核酸試料にハイブリッド形成させ;そして既知の正体の1種もしくはそれより多い核酸分子への核酸試料のハイブリッド形成を測定することを含んでなり、ここで例えば既知の正体の1種もしくはそれより多い核酸分子への核酸試料のハイブリッド形成における、ガンを有していない人から得られる核酸試料に対する差がガンを有する患者におけるヌクレオチド配列の異常な発現の指標である。
一般に本発明は、患者からメッセンジャーRNAを単離し、mRNA試料からcRNAを生成させ、cRNAを、アレー上の不連続な位置と安定に会合した複数の核酸分子を含んでなるマイクロアレーにハイブリッド形成させ、そしてアレーへのcRNAのハイブリッド形成のパターンを同定することを含んでなる、ガンを有する患者において異常に調節される核酸配列の同定方法を提供する。本発明に従うと、アレー上の与えられる位置にハイブリッド形成する核酸分子は、ハイブリッド形成シグナルが、例えばガンを有していない人から得られる核酸試料とハイブリッド形成する同一のアレー上の同じ位置におけるハイブリッド形成シグナルより高いかもしくは低い場合、異常に調節されると言われる。
遺伝子の発現のレベルの決定のためのマイクロアレー
マイクロアレーを用いて遺伝子発現レベルの決定を行なうことができる。一般に以下の段階を含むことができる:(a)患者からmRNA試料を得、それから標識核酸を調製する(「標的核酸」又は「標的」);(b)例えばハイブリッド形成又は特異的結合により、標的核酸がアレー上の対応するプローブに結合するのに十分な条件下で、標的核酸をアレーと接触させる;(c)場合によりアレーから非結合標的を除去する;(d)結合標的を検出する;そして(e)例えばコンピューターに基づく分析法を用い、結果を分析する。本明細書で用いられる場合、「核酸プローブ」又は「プローブ」はアレーに結合する核酸であるが、「標的核酸」はアレーにハイブリッド形成する核酸である。
マイクロアレーを用いて遺伝子発現レベルの決定を行なうことができる。一般に以下の段階を含むことができる:(a)患者からmRNA試料を得、それから標識核酸を調製する(「標的核酸」又は「標的」);(b)例えばハイブリッド形成又は特異的結合により、標的核酸がアレー上の対応するプローブに結合するのに十分な条件下で、標的核酸をアレーと接触させる;(c)場合によりアレーから非結合標的を除去する;(d)結合標的を検出する;そして(e)例えばコンピューターに基づく分析法を用い、結果を分析する。本明細書で用いられる場合、「核酸プローブ」又は「プローブ」はアレーに結合する核酸であるが、「標的核酸」はアレーにハイブリッド形成する核酸である。
「侵襲的」又は「非−侵襲的」サンプリング手段を用い、調べられるべき患者から核酸試料を得ることができる。サンプリング手段が動物(ネズミ、人間、ヒツジ、ウマ、ウシ、ブタ、イヌ又はネコを含む)の皮膚又は器官内からの核酸の収集を含む場合、それは「侵襲的」であると言われる。侵襲的方法の例には、例えば血液収集、精液収集、針生検、胸膜吸引、臍帯生検が含まれる。そのような方法の例はKim,et al.,(J.Virol.66:1992年,3879−3882);Biswas,et al.,(Ann.NY Acad.Sci.590:1990年,582−583);及びBiswas,et al.,(J.Clin.Microbiol.29:1991年,2228−2233)により議論されている。
対照的に「非−侵襲的」サンプリング手段は、動物の内部もしくは外部表面から核酸分子を回収する手段である。そのような「非−侵襲的」サンプリング手段の例には、例えば「綿棒ふき取り」、涙、唾液、尿、便、汗(sweat)又は汗(perspiration)、毛髪の収集が含まれる。
本発明の1つの態様において、調べられるべき患者からの1種もしくはそれより多い細胞を得、細胞からRNAを単離する。好ましい態様において、患者から末梢血白血球(P
BLs)細胞の試料を得る。患者から細胞試料を得、次いで所望の細胞型に関して試料を濃縮することもできる。例えば、所望の細胞型の細胞表面上のエピトープに結合する抗体を用いる単離のような多様な方法を用い、細胞を他の細胞から単離することができる。所望の細胞が固体の組織中にある場合、例えば顕微解剖によるか又はレーザー捕獲顕微解剖(laser capture microdissection)(LCM)により特定の細胞を切開することができる(例えばBonner,et al.著,Science 278:1997年,1481;Emmert−Buck,et al.著,Science 274:1996年,998;Fend,et al.著,Am.J.Path.154:1999年,61;及びMurakami,et al.著,Kidney
Int.58:2000年,1346を参照されたい)。
BLs)細胞の試料を得る。患者から細胞試料を得、次いで所望の細胞型に関して試料を濃縮することもできる。例えば、所望の細胞型の細胞表面上のエピトープに結合する抗体を用いる単離のような多様な方法を用い、細胞を他の細胞から単離することができる。所望の細胞が固体の組織中にある場合、例えば顕微解剖によるか又はレーザー捕獲顕微解剖(laser capture microdissection)(LCM)により特定の細胞を切開することができる(例えばBonner,et al.著,Science 278:1997年,1481;Emmert−Buck,et al.著,Science 274:1996年,998;Fend,et al.著,Am.J.Path.154:1999年,61;及びMurakami,et al.著,Kidney
Int.58:2000年,1346を参照されたい)。
多様な方法、例えばグアニジウムチオシアナートライシス及びそれに続くCsCl遠心により、組織又は細胞試料からRNAを抽出することができる(Chirgwin,et
al.著,Biochemistry 18:1979年,5294−5299)。単一の細胞からのcDNAライブラリを調製するための方法に記載される通りに、単一の細胞からのRNAを得ることができる(例えばDulac著,Curr.Top.Dev.Biol.36:1998年,245;Jena,et al.著,J.Immunol.Methods 190:1996年,199を参照されたい)。
al.著,Biochemistry 18:1979年,5294−5299)。単一の細胞からのcDNAライブラリを調製するための方法に記載される通りに、単一の細胞からのRNAを得ることができる(例えばDulac著,Curr.Top.Dev.Biol.36:1998年,245;Jena,et al.著,J.Immunol.Methods 190:1996年,199を参照されたい)。
RNA試料を特定の種に関してさらに濃縮することができる。例えば1つの態様において、RNA試料からポリ(A)+RNAを単離することができる。他の態様において、プライマー−特異的cDNA合成又はcDNA合成に基づく複数回の(multiple rounds of)線状増幅及び鋳型−支配(template−directed)試験管内転写により、RNA集団を問題の配列に関して濃縮することができる(例えばWang,et al.著,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:1989年,9717;Dulac,et al.著,同上,Jena,et al.著,同上を参照されたい)。さらに、特定の種又は配列において濃縮されているかもしくはされていないRNAの集団を、例えばPCR;リガーゼ連鎖反応(LCR)(例えばWu and Wallace著,Genomics 4:1989年,560;Landegren,et al.著,Science 241:1988年,1077を参照されたい);自己−持続性配列複製(self−sustained sequence replication)(SSR)(例えばGuatelli et al.著,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:1990年,1874を参照されたい);核酸に基づく配列増幅(NASBA)及び転写増幅(例えばKwoh,et al.著,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:1989年,1173を参照されたい)を含む多様な増幅法によりさらに増幅することができる。PCR法に関する方法は当該技術分野において周知である(例えばPCR Technology:Principles and Applications for DNA Amplification(編集 H.A.Erlich,Freeman Press,N.Y.,N.Y.,1992年);PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications(編集 Innis,et al.,Academic Press,San Diego,Calif.,1990年);Mattila et al.著,Nucleic Acids Res.19:1991年,4967;Eckert,et al.著,PCR Methods and Applications 1:1991年,17;PCR(編集 McPherson et al.,IRL Press,Ocford);及び米国特許第4,683,202号明細書を参照されたい)。増幅の方法は、例えばOhyama,et al.,(BioTechniques 29:2000年,530);Luo,et al.,(Nat.Med.5:1999年,117);Hegde,et al.,(BioTechniques 29,2000年,548);Kacharmina,et al.,(Meth.Enzymol.303:1999年,3)Livesey,et al.,Curr.Biol.10:2000年,301);Spirin,et al.,(Invest.Ophtalmol.Vis.Sci.40:1999年,3108);及びSakai,et al.,(Anal.Biochem.287:2000年,32)により記載されている。RNA増幅及びcDNA合成を細胞中でその場で行なうこともできる(例えばEberwine,et al.著,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:1992年,3010を参照されたい)。
核酸分子のマイクロアレーへのハイブリッド形成の検出を可能にするために、核酸分子を標識することができる。すなわちプローブはシグナル形成系のメンバーを含んでなることができ、かくして直接もしくはシグナル形成系の1個もしくはそれより多い追加のメンバーとの組み合わせ作用を介して検出される。例えば蛍光標識されたdNTP(例えばKricka著,1992年,Nonisotopic DNA Probe Techniques,Academic Press San Diego,Califを参照されたい)、ビオチニル化dNTPs又はrNTP及びそれに続く標識ストレプタビジンの添加、化学発光標識又は同位体を用い、核酸を標識することができる。標識の他の例にはTyagi and Kramer(Nature Biotech.14:1996年,303)に記載されているような「分子標識(molecular beacons)」か゛含まれる。例えばプラスモン共鳴(plasmon resonance)によってハイブリッド形成を決定することもできる(例えばThiel,et al.著,Anal.Chem.69:1997年,4948を参照されたい)。
1つの態様において、標的核酸の複数(例えば2、3、4、5個又はそれより多く)の組を標識し、1回のハイブリッド形成反応において用いる(「多重(multiplex)」分析)。例えば1組の核酸が1個の細胞からのRNAに対応することができ、他の組の核酸が他の細胞からのRNAに対応することができる。複数の核酸の組を異なる標識、例えば別個の発光スペクトルを有してそれらを区別することができる異なる蛍光標識(例えばフルオレセインとローダミン)を用いて標識することができる。次いで組を混合し、1個のマイクロアレーに同時にハイブリッド形成させることができる(例えばShena,et al.著,Science 270:1995年,467−470を参照されたい)。
本発明に従って用いるためのマイクロアレーは、小分子の有効性の特性を表す1個もしくはそれより多い遺伝子のプローブを含む。好ましい態様において、マイクロアレーは、ガンにおいて上方−調節される遺伝子及びガンにおいて下方−調節される遺伝子より成る群から選ばれる1個もしくはそれより多い遺伝子に対応するプローブを含んでなる。マイクロアレーは、小分子の有効性の特性を表す少なくとも10個、好ましくは少なくとも20個、少なくとも50個、少なくとも100個又は少なくとも1000個の遺伝子に対応するプローブを含んでなることができる。
マイクロアレー上に、各遺伝子に対応する1個もしくは1個より多いプローブが存在することができる。例えばマイクロアレーは、1個の遺伝子に対応する2〜20個のプローブ、そして好ましくは約5〜10個のプローブを含有することができる。プローブは、小分子の有効性の特性を表す遺伝子の全長RNA配列又はその相補鎖に対応することができるか、あるいはプローブはその一部に対応することができ、その一部は特異的なハイブリッド形成を可能にするのに十分な長さのものである。そのようなプローブは約50個のヌクレオチドから約100、200、500又は1000個のヌクレオチドあるいは1000個より多いヌクレオチドを含んでなることができる。本明細書でさらに記載される通り、マイクロアレーは約10〜50個のヌクレオチド、好ましくは約15〜30個のヌクレオチドそしてより好ましくは約20〜25個のヌクレオチドから成るオリゴヌクレオチドプローブを含有することができる。プローブは、好ましくは1本鎖であり、所望のレベルの配列特異的ハイブリッド形成を与えるのに十分なその標的への相補性を有するであろう。
典型的に、本発明で用いられるアレーは、cm2当たり100個より高い異なるプローブの部位密度を有するであろう。好ましくは、アレーは500/cm2より高い、より好ましくは約1000/cm2より高い、そして最も好ましくは約10,000/cm2より高い部位密度を有するであろう。例えばアレーは1個の基質上に100個より多い異なるプローブ、より好ましくは1個の基質上に約1000個より多い異なるプローブ、さらにもっと好ましくは約10,000個より多い異なるプローブ、そして最も好ましくは100,000個より多い異なるプローブを有するであろう。
複数の異なるマイクロアレー立体配置(configurations)及びそれらの製造方法は当該技術分野における熟練者に既知であり、米国特許第:5,242,974;5,384,261;5,405,783;5,412,087;5,424,186;5,429,807;5,436,327;5,445,934;5,556,752;5,405,783;5,412,087;5,424,186;5,429,807,5,436,327;5,472,672;5,527,681;5,529,756;5,545,531;5,554,501;5,561,071;5,571,639;5,593,839;5,624,711;5,700,637;5,744,305;5,770,456;5,770,722;5,837,832;5,856,101;5,874,219;5,885,837;5,919,523;6,022,963;6,077,674;及び6,156,501号明細書;Shena,et al.著,Tibtech 16:1998年,301;Duggan,et al.著,Nat.Genet.21:1999年,10;Bowtell,et al.著,Nat.Genet.21:1999年,25;Lipshutz,et al.著,Nature Genet.21:1999年,20−24;Blanchard,et al.著,Biosensors and Bioelectronics,11:1996年,687−90;Maskos,et al.著,Nucleic Acids Res.21:1993年,4663−69;Hughes,et al.著,Nat.Biotechol.19:2001年,342に開示されており、これらの開示は引用することにより本明細書の内容となる。種々の用途におけるアレーの使用方法を記載する特許には:米国特許第5,143,854;5,288,644;5,324,633;5,432,049;5,470,710;5,492,806;5,503,980;5,510,270;5,525,464;5,547,839;5,580,732;5,661,028;5,848,659;及び5,874,219号明細書が含まれ、それらの開示は引用することにより本明細書の内容となる。
アレーは、好ましくは標準及び参照核酸を含む。標準核酸には、例えばbioB、bioC及びbioDのような原核遺伝子、P1バクテリオファージからのcre又はポリA標準、例えばdap、lys、phe、thr及びtrpが含まれる。参照核酸は、1つの実験から他の実験への結果の標準化及び定量的レベルでの複数の実験の比較を可能にする。典型的な参照核酸には既知の発現レベルのハウスキーピング遺伝子、例えばGAPDH、ヘキソキナーゼ及びアクチンが含まれる。
1つの態様において、固体支持体上でオリゴヌクレオチドのアレーを合成することができる。典型的な固体支持体にはガラス、プラスチック、ポリマー、金属、メタロイド、セラミック、有機物などが含まれる。チップマスキング法(chip masking technologies)及び光保護化学を用い、規定された(ordered)核酸プローブのアレーを形成することができる。例えば「DNAチップ」又は非常に大規模の固
定化ポリマーアレー(「VLSIPSTM」アレー)として既知のこれらのアレーは、約1cm2〜数cm2の面積を有する基質上に数百万個の区画されたプローブ領域を含むことができ、それにより数個から数百万個のプローブを導入することができる(例えば米国特許第5,631,734号明細書を参照されたい)。
定化ポリマーアレー(「VLSIPSTM」アレー)として既知のこれらのアレーは、約1cm2〜数cm2の面積を有する基質上に数百万個の区画されたプローブ領域を含むことができ、それにより数個から数百万個のプローブを導入することができる(例えば米国特許第5,631,734号明細書を参照されたい)。
発現レベルの比較のために、標識された核酸を、標的核酸とアレー上のプローブの結合に十分な条件下でアレーと接触させることができる。好ましい態様において、所望のレベルのハイブリッド形成特異性を与えるようなハイブリッド形成条件;すなわち標識核酸とマイクロアレー上のプローブの間のハイブリッド形成が起こるのに十分な条件を選ぶことができる。
本質的に特異的なハイブリッド形成を可能にする条件においてハイブリッド形成を行なうことができる。核酸の長さ及びGC含有率は熱的融点(thermal melting point)、かくして標的核酸へのプローブの特異的なハイブリッド形成を得るのに必要なハイブリッド形成条件を決定する。これらの因子は当該技術分野における熟練者に周知であり、アッセイにおいて調べることもできる。核酸のハイブリッド形成への広範囲な指針はTijssen,et al.(Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology,Vol.24:Hybridization With Nucleic Acid Probes,P.Tijssen編集.Elsevier,N.Y.,(1993))において見出すことができる。
上記の方法は、アレー表面上における標識された標的核酸のハイブリッド形成パターンの作製を生ずる。得られる標識された核酸のハイブリッド形成パターンを、標的核酸の特定の標識に基づいて選ばれる特定の検出法を用い、多様な方法で視覚化又は検出することができる。典型的な検出手段にはシンチレーションカウンティング、オートラジオグラフィー、蛍光測定、測色法、発光測定、光散乱などが含まれる。
1つのそのような検出法は、商業的に入手可能な(Affymetrix,Santa
Clara,CA)アレースキャナー、例えば417TM Arrayer、418TM Array Scanner又はAgilent GeneArrayTM Scannerを用いる。このスキャナーは、インターフェース及び使用が容易なソフトウェアツール(tools)を有するシステムコンピューターから制御される。出力を多様なソフトウェアアプリケーション(applications)中に直接移入することができるか、又はそれにより直接読むことができる。好ましい走査装置は例えば米国特許第5,143,854及び5,424,186号明細書に記載されている。
Clara,CA)アレースキャナー、例えば417TM Arrayer、418TM Array Scanner又はAgilent GeneArrayTM Scannerを用いる。このスキャナーは、インターフェース及び使用が容易なソフトウェアツール(tools)を有するシステムコンピューターから制御される。出力を多様なソフトウェアアプリケーション(applications)中に直接移入することができるか、又はそれにより直接読むことができる。好ましい走査装置は例えば米国特許第5,143,854及び5,424,186号明細書に記載されている。
蛍光標識されたプローブのために、転写物アレーの各部位における蛍光発光を、好ましくは走査型同焦点レーザー顕微鏡により検出することができる。あるいはまた、2つの発蛍光団に特異的な波長における同時の試料照射を可能にするレーザーを用いることができ、2つの発蛍光団からの発光を同時に分析することができる(例えばShalon,et al.著,Genome Res.6:1996年,639−645を参照されたい)。好ましい態様において、コンピューター制御X−Yステージ及び顕微鏡対物レンズを有するレーザー蛍光スキャナーを用いてアレーを走査することができる。蛍光レーザー走査装置は、Shalon,et al.著,同上に記載されている。
遺伝子発現データの分析のために種々のアルゴリズム、例えば実行のための比較(comparisons to perform)の型を利用できる。ある態様において、共−調節される遺伝子をグループ分けするのが望ましい。これは多数の側面の比較を可能にする。そのような遺伝子のグループを同定するための好ましい態様は、集落化アルゴリズ
ム(clustering algorithms)を含む(集落化アルゴリズムの概覧に関し、例えばFukunaga著,1990年,Statistical Pattern Recognition,2nd Ed.,Academic Press,San Diego;Everitt著,1974年,Cluster Analysis,London:Heinemann Educ.Books;Hartigan著,1975年,Clustering Algorithms,New York:Wiley;Sneath and Sokal著,1973年,Numerical Taxonomy,Freeman;Anderberg著,1973年,Cluster Analysis for Applications,Academic Press:New Yorkを参照されたい)。
ム(clustering algorithms)を含む(集落化アルゴリズムの概覧に関し、例えばFukunaga著,1990年,Statistical Pattern Recognition,2nd Ed.,Academic Press,San Diego;Everitt著,1974年,Cluster Analysis,London:Heinemann Educ.Books;Hartigan著,1975年,Clustering Algorithms,New York:Wiley;Sneath and Sokal著,1973年,Numerical Taxonomy,Freeman;Anderberg著,1973年,Cluster Analysis for Applications,Academic Press:New Yorkを参照されたい)。
バイオマーカー発見
発現パターンを用い、患者における薬剤処置の有効性を予示するために用いられ得るバイオマーカーのパネルを引き出すことができる。バイオマーカーは、生物学的試料から単離されるRNA、腫瘍生検の凍結試料から単離されるRNAについてのマイクロアレー実験からの遺伝子発現レベル又は血清における質量分析−由来タンパク質質量から成ることができる。
発現パターンを用い、患者における薬剤処置の有効性を予示するために用いられ得るバイオマーカーのパネルを引き出すことができる。バイオマーカーは、生物学的試料から単離されるRNA、腫瘍生検の凍結試料から単離されるRNAについてのマイクロアレー実験からの遺伝子発現レベル又は血清における質量分析−由来タンパク質質量から成ることができる。
データ分析に関する明確な機構はデータの正確な性質に依存するであろうが、バイオマーカーのパネルを引き出すための典型的な方法は以下の通りである。処置の前に各患者に関してデータ(遺伝子発現レベル又は質量スペクトル)を集める。研究が進行するとともに、患者の薬剤処置への反応に従って;有効又は無効としてそれらを分類する。データモデルにおいて多数のレベルの有効性を適応させることができるが、特に患者集団が数百未満の場合には、二元比較(binary comparison)が最適であると考えられる。各クラス中に十分な数の患者を仮定し、タンパク質及び/又は遺伝子発現データを当該技術分野において既知の複数の方法により分析することができる。方法の多くは従来の統計学ならびに機械学習(machine learning)の分野から誘導される。これらの方法は2つの目的に役立つ:
1.データの規模(dimensionality)の縮小−質量スペクトル又は遺伝子発現マイクロアレーの場合、データは何千個もの個々のデータ点から約3〜10個に縮小される。縮小は、1組として取られる場合のデータ点の予示力に基づく。
2.トレーニング−次いでこれらの3〜10個のデータ点を用いて多くの機械学習アルゴリズムをトレーニングし、それは次いで、この場合には有効な薬剤処置を無効から区別するタンパク質質量又は遺伝子発現のパターンを認識することを「学習する」。アルゴリズムのトレーニングのためにすべての患者の試料を用いることができる。
得られるトレーニングされたアルゴリズムを次いで試験し、それらの予示力を測定する。典型的には、何百より少ない(less than many hundreds of)トレーニング例が得られる場合、何らかの形態の交差−確認(cross−validation)が行なわれる。例えば10−倍交差確認を考えられたい。この場合、患者の試料を10個の入れ物の1個に無作為に指定する。1回目の確認において、9個の入れ物中の試料をトレーニングに用い、残る10番目の入れ物中の試料を用いてアルゴリズムを試験する。各回に異なる入れ物中の試料を試験のために除外しながら、これをさらに9回繰り返す。10回すべてからの結果(正しい予示及び過ち)を合わせ、次いで予示力を評価する。この方法で種々のアルゴリズムならびに種々のパネルを、この研究のために比較することができる。次いで「最良の」アルゴリズム/パネル組み合わせが選択されるであろう。この「スマート」アルゴリズムを次いで将来の研究において用い、処置に最も反応しそうな患者を選択することができる。
多くのアルゴリズムは、患者から得られる追加の情報から利益を得る。例えば予示力を向上させるために性別又は年令を用いることができる。また、標準化及び補整(smoothing)のようなデータ変換を用いてノイズを減少させることができる。この理由で、結果を最適化するために、多くの異なるパラメーターを用いて多数のアルゴリズムをトレーニングすることができる。データ中に予示パターンが存在する場合、おそらく最適又は最適に近い「スマート」アルゴリズムを開発することができる。もっと多数の患者の試料が利用可能になったら、アルゴリズムを再トレーニングして新しいデータを利用することができる。
質量分析を用いる例として、血漿(1μl)を疎水性SELDI−標的に適用し、水中で広範囲に洗浄し、質量分析計のSELDI−Tにより分析することができる。これを100個かもしくはそれより多い患者の試料について繰り返すことができる。薬剤有効性の予示である特定のm/z値の組を同定するために、各試料中の約16,000個のm/z値の強度から生ずるタンパク質分布を統計的に分析する。イオン−交換又はIMAC表面のような他のSELDI−標的を用いる同一の実験も行なうことができる。これらは血漿中に存在するタンパク質の種々のサブセットを捕らえるであろう。さらに、血漿を変性させ、SELDI標的上への適用の前に予備分別することができる。
診断及び予後アッセイ
本発明は、バイオマーカー(例えばスタンニオカルシン)、すなわちガンに関する核酸及び/又はポリペプチドマーカーの検出により、患者が望ましくない細胞増殖により特徴付けられる疾患又は状態を発症する危険にあるかどうかを決定するための方法を提供する。
本発明は、バイオマーカー(例えばスタンニオカルシン)、すなわちガンに関する核酸及び/又はポリペプチドマーカーの検出により、患者が望ましくない細胞増殖により特徴付けられる疾患又は状態を発症する危険にあるかどうかを決定するための方法を提供する。
臨床的用途において、本明細書で同定されるバイオマーカーの存在及び/又は不在に関してヒト組織試料をスクリーニングすることができる。そのような試料は針生検コア(needle biopsy cores)、外科的切開試料、リンパ節組織又は血清から成ることができる。例えばこれらの方法は、生検材料を得、それを場合により低温槽切片化(cryostat sectioning)により分別して腫瘍細胞を細胞集団全体の約80%まで濃縮することを含む。ある態様において、これらの試料から抽出される核酸を、当該技術分野において周知の方法を用いて増幅することができる。選ばれるマーカーの検出されるレベルを、転移性、非−転移性、悪性、良性又は正常な組織試料の統計的に正当な群と比較する。
1つの態様において診断法は、例えばノーザンブロット分析、逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応(RT−PCR)、その場ハイブリッド形成、免疫沈降、ウェスターンブロットハイブリッド形成又は免疫組織化学により、患者がバイオマーカー(例えばスタンニオカルシン)の異常なmRNA及び/又はタンパク質レベルを有するかどうかを決定することを含んでなる。該方法に従うと、患者から細胞を得、バイオマーカーのレベル、タンパク質もしくはmRNAレベルを決定し、健康な人におけるこれらのマーカーのレベルと比較することができる。異常なバイオマーカーのレベル、ポリペプチドもしくはmRNAレベルはおそらくガンの指標である。
従って1つの側面において、本発明は本明細書に開示される独特の核酸マーカーに特異的なプローブ及びプライマーを提供する。従って核酸プローブは、長さが少なくとも10個のヌクレオチド、好ましくは少なくとも15個のヌクレオチド、より好ましくは25個のヌクレオチドそして最も好ましくは少なくとも40個のヌクレオチドであるヌクレオチド配列且つマーカー核酸配列のコーディング配列の一部に相補的であるコーディング配列の最高で全部又はほとんど全部を含んでなる。
1つの態様において、方法は患者からの組織中におけるガン細胞の存在を決定するための核酸プローブの使用を含んでなる。例えば方法は:
1.例えば長さが少なくとも10個のヌクレオチド、少なくとも15個のヌクレオチド、少なくとも25個のヌクレオチド又は少なくとも40個のヌクレオチドであるヌクレオチド配列且つ核酸配列のコーディング配列の一部に相補的であり、腫瘍細胞中で異常に発現されるコーディング配列の最高で全部又はほとんど全部を含んでなる核酸プローブを準備し;
2.患者からおそらくガン細胞を含んでなる組織試料を得;
3.実質的にすべてが非−ガン性である細胞を含有する第2の組織試料を準備し;
4.緊縮条件下で核酸プローブを該第1及び第2の組織試料のそれぞれのRNAと接触させ(例えばノーザンブロット又はその場ハイブリッド形成アッセイにおいて);そして
5.(a)第1の組織試料のRNAとのプローブのハイブリッド形成の量を(b)第2の組織試料のRNAとのプローブのハイブリッド形成の量を比較する
ことを含んでなり;ここで第2の組織試料のRNAとのハイブリッド形成の量と比較される時の第1の組織試料のRNAとのハイブリッド形成の量における統計的に有意な差が第1の組織試料中におけるガン細胞の存在の指標である。
1.例えば長さが少なくとも10個のヌクレオチド、少なくとも15個のヌクレオチド、少なくとも25個のヌクレオチド又は少なくとも40個のヌクレオチドであるヌクレオチド配列且つ核酸配列のコーディング配列の一部に相補的であり、腫瘍細胞中で異常に発現されるコーディング配列の最高で全部又はほとんど全部を含んでなる核酸プローブを準備し;
2.患者からおそらくガン細胞を含んでなる組織試料を得;
3.実質的にすべてが非−ガン性である細胞を含有する第2の組織試料を準備し;
4.緊縮条件下で核酸プローブを該第1及び第2の組織試料のそれぞれのRNAと接触させ(例えばノーザンブロット又はその場ハイブリッド形成アッセイにおいて);そして
5.(a)第1の組織試料のRNAとのプローブのハイブリッド形成の量を(b)第2の組織試料のRNAとのプローブのハイブリッド形成の量を比較する
ことを含んでなり;ここで第2の組織試料のRNAとのハイブリッド形成の量と比較される時の第1の組織試料のRNAとのハイブリッド形成の量における統計的に有意な差が第1の組織試料中におけるガン細胞の存在の指標である。
1つの側面において方法は、与えられるマーカー核酸配列(例えばスタンニオカルシン)から誘導されるプローブを用いるその場ハイブリッド形成を含んでなる。方法は、標識されたハイブリッド形成プローブを、おそらくガンもしくは前−ガン細胞ならびに正常な細胞を含有する与えられる型の組織の試料と接触させ、そしてプローブが与えられる組織型のいくらかの細胞を、それが同じ組織型の他の細胞を標識する程度と有意に異なる程度まで標識するかどうかを決定することを含んでなる。
試験細胞のmRNAを、例えば長さが少なくとも12個のヌクレオチド、少なくとも15個のヌクレオチド、少なくとも25個のヌクレオチド又は少なくとも40個のヌクレオチドである核酸プローブならびに核酸配列のコーディング配列の一部に相補的であり、与えられる組織型の正常な細胞と比較して腫瘍細胞中で異常に発現される配列の最高で全部又はほとんど全部と接触させ;mRNAへのプローブのハイブリッド形成の大体の量を決定することにより、与えられるヒト組織からの試験細胞の表現型、例えば細胞が(a)正常であるか、又は(b)ガン性又は前ガン性であるかを決定する方法も本発明の範囲内であり、その組織型の正常な細胞のmRNAの場合に見られる量より多いかもしくは少ないハイブリッド形成の量が、試験細胞がガン性又は前ガン性であることの指標である。
あるいはまた、マーカー核酸配列(例えばスタンニオカルシン)によりコードされるタンパク質産物を検出する抗体を用い、上記の診断アッセイを行なうことができる。従って1つの態様において、アッセイは試験細胞のタンパク質を核酸の遺伝子産物に関して特異的な抗体と接触させ、マーカー核酸は試験細胞と同じ組織型の正常な細胞中である与えられる制御レベルで発現される核酸であり、そして抗体及び試験細胞のタンパク質により形成される免疫複合体の大体の量を決定することを含み、ここで同じ組織型の正常な細胞と比較される時の試験細胞のタンパク質と形成される免疫複合体の量における統計的に有意な差が、試験細胞がガン性又は前ガン性であることの指標である。好ましくは、抗体はスタンニオカルシンに関して特異的である。
本発明において有用なポリペプチドに特異的に結合するポリクローナル及び/又はモノクローナル抗体の調製方法は当該技術分野における熟練者に既知であり、例えばDymecki,et al.,(J.Biol.Chem.267:1992年,4815);Boersma & Van Leeuwen,(J.Neurosci.Methods 51:1994年,317);Green,et al.,(Cell 28:19
92年,477);及びArnheiter,et al.,(Nature,294:1981年,278)において見出すことができる。
92年,477);及びArnheiter,et al.,(Nature,294:1981年,278)において見出すことができる。
他のそのような方法は:マーカー核酸配列の遺伝子産物に関して特異的な抗体を準備し、遺伝子産物は同じ組織型の非−ガン性組織中における遺伝子産物のレベルより高いかもしくは低いレベルで、与えられる組織型のガン組織中に存在し;患者から与えられる組織型の組織の第1の試料を得、その試料はおそらくガン細胞を含み;同じ組織型の組織の第2の試料を準備し(それは同じ患者から又は正常な標準、例えば他の個体又は培養細胞からのものであることができる)、この第2の試料は正常な細胞を含有し、本質的にガン細胞を含有せず;抗体と試料中に存在するマーカー核酸配列産物の間の免疫複合体形成を可能にする条件下で、抗体を第1及び第2の試料のタンパク質(それは部分的に精製されているか、ライシスされたが分別されていない細胞中にあるか、又はその場で)と接触させ;そして(a)第1の試料中の免疫複合体形成の量を(b)第2の試料中の免疫複合体形成の量と比較する段階を含み、ここで第2の試料中の免疫複合体形成の量と比較される場合の第1の試料中の免疫複合体形成の量における統計的に有意な差が組織の第1の試料中におけるガン細胞の存在の指標である。
本発明は、さらに、患者から得られる細胞試料が異常な量のマーカーポリペプチドを有するかどうかを決定する方法を提供し、それは(a)患者から細胞試料を得、(b)そのようにして得られる試料中のマーカーポリペプチドの量を定量的に決定し、そして(c)そのようにして決定されるマーカーポリペプチドの量を既知の標準と比較し、それにより患者から得られる細胞試料が異常な量のマーカーポリペプチドを有するかどうかを決定することを含んでなる。そのようなマーカーポリペプチドは、免疫組織化学的アッセイ、ドット−ブロットアッセイ、ELISAなどにより検出することができる。
免疫検定は通常、細胞試料中のタンパク質のレベルの定量のために用いられ、多くの他の免疫検定法が当該技術分野で既知である。本発明は特定のアッセイ法に制限されず、従って均一及び不均一法の両方を含むことが意図されている。本発明に従って行なうことができる典型的な免疫検定には蛍光偏光免疫検定(FPIA)、蛍光免疫検定(FIA)、酵素免疫検定(EIA)、比濁分析的阻害免疫検定(nephelometric inhibition immunoassay)(NIA)、酵素−結合イムノソルベント検定(ELISA)及び放射線免疫検定(RIA)が含まれる。問題の抗体に指標部分又は標識基を結合させることができ、それは方法の種々の用途の要求を満たすように選ばれ、それは多くの場合にアッセイ装置及び適合する免疫検定法の利用性により支配される。上記の種々の免疫検定を行なう場合に用いられるべき一般的な方法は、当該技術分野における通常の熟練者に既知である。
他の態様において、その患者の細胞中のマーカー核酸配列の発現のレベルを監視する方法として、患者の生物学的流体(例えば血液又は尿)中のコードされる産物のレベルあるいはまたポリペプチドのレベルを決定することができる。そのような方法は、患者から生物学的流体の試料を得、コードされるマーカーポリペプチドに関して特異的な抗体と試料(又は試料からのタンパク質)を接触させ、そして抗体による免疫複合体形成の量を決定する段階を含み、免疫複合体形成の量が試料中のマーカーによりコードされる産物のレベルの指標である。正常な個体から採取される標準試料中、あるいは同じ人から前に又は後に得られる1個もしくはそれより多い試料中の同じ抗体による免疫複合体形成の量と比較される場合、この決定は特に役に立つ情報を与える(instructive)。
他の態様において、細胞中に存在するマーカーポリペプチドの量を決定するために方法を用いることができ、それを今度は過剰増殖障害の進行と関連付けることができる。細胞の試料が、形質転換された細胞であるか又はそれになる傾向がある細胞を含有するかどう
かを評価するために、マーカーポリペプチドのレベルを予示的に用いることができる。さらに、形質転換されることが既知の細胞の表現型を評価するために本方法を用いることができ、表現型決定(phenotyping)の結果は特定の治療的管理を計画する場合に有用である。例えば試料細胞中のマーカーポリペプチドの非常に高いレベルはガンに関する強力な診断及び予後マーカーである。マーカーポリペプチドレベルの観察を、例えばより積極的な治療の使用に関する決定において用いることができる。
かを評価するために、マーカーポリペプチドのレベルを予示的に用いることができる。さらに、形質転換されることが既知の細胞の表現型を評価するために本方法を用いることができ、表現型決定(phenotyping)の結果は特定の治療的管理を計画する場合に有用である。例えば試料細胞中のマーカーポリペプチドの非常に高いレベルはガンに関する強力な診断及び予後マーカーである。マーカーポリペプチドレベルの観察を、例えばより積極的な治療の使用に関する決定において用いることができる。
上記に示された通り、本発明の1つの側面は、患者から単離される細胞の範囲内で、マーカーポリペプチドのレベルが試料細胞中で有意に低下するかどうかを決定するための診断アッセイに関する。「有意に低下した」という用語は、細胞が類似の組織起源の正常な細胞に対して減少したマーカーポリペプチドの細胞量を有する細胞表現型を指す。例えば細胞は、正常な標準細胞のマーカーポリペプチドと比較して、約50%、25%、10%又は5%未満のマーカーポリペプチドを有することができる。特にアッセイは、試験細胞中のマーカーポリペプチドのレベルを評価し、測定されたレベルを少なくとも1個の標準細胞、例えば正常な細胞及び/又は既知の表現型の形質転換された細胞中で検出されるマーカーポリペプチドと比較する。
本発明に特に重要なのは、正常な又は異常なマーカーポリペプチドレベルと関連する細胞の数により決定されるマーカーポリペプチドのレベルを定量する能力である。特定のマーカーポリペプチド表現型を有する細胞の数を、次いで患者の予後と関連付けることができる。本発明の1つの態様において、ある損傷のマーカーポリペプチド表現型は、マーカーポリペプチドの異常に高い/低いレベルを有することが見出される細胞の、生検材料中のパーセンテージとして決定される。そのような発現は免疫組織化学的アッセイ、ドット−ブロットアッセイ、ELISAなどにより検出することができる。
組織試料が用いられる場合、免疫組織化学的染色を用い、マーカーポリペプチド表現型を有する細胞の数を決定することができる。そのような染色のために、生検材料又は他の組織試料から組織のマルチブロック(multiblock)を取り、プロテアーゼK又はペプシンのような薬剤を用いてタンパク質分解的加水分解に供することができる。ある態様において、試料細胞から核画分を単離し、核画分中のマーカーポリペプチドのレベルを検出するのが望ましいかも知れない。
組織試料はホルマリン、グルタルアルデヒド、メタノールなどのような試薬を用いる処理により固定される。次いで試料を、マーカーポリペプチドに関する結合特異性を有する抗体、好ましくはモノクローナル抗体と一緒にインキュベーションする。この抗体を、続く結合の検出のために標識に共役させることができる。試料は免疫複合体の形成に十分な時間、インキュベーションされる。この抗体に共役した標識のおかげで、次いで抗体の結合が検出される。抗体が標識されない場合、例えば抗−マーカーポリペプチド抗体のイソタイプに関して特異的な第2の標識抗体を用いることができる。用いられ得る標識の例には放射性核種、蛍光物質、化学発光物質、酵素などが含まれる。
酵素が用いられる場合、酵素に関する基質を試料に加え、着色もしくは蛍光産物を与えることができる。共役体において用いるのに適した酵素の例にはホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、マレートデヒドロゲナーゼなどが含まれる。商業的に入手可能でない場合、、そのような抗体−酵素共役体は当該技術分野における熟練者に既知の方法により容易に製造される。
1つの態様において、アッセイはドットブロットアッセイとして行なわれる。組織試料が用いられる場合にドットブロットアッセイは特別な用途を見出し、それは、あらかじめ決められた数の細胞から作られる無細胞抽出物中のマーカーポリペプチドの量を関連付け
ることにより1個の細胞に伴うマーカーポリペプチドの平均量を決定することをそれが可能にするからである。
ることにより1個の細胞に伴うマーカーポリペプチドの平均量を決定することをそれが可能にするからである。
同じ型の腫瘍細胞(例えば乳及び/又は結腸腫瘍細胞)が個々のオンコジーンの均一に増加した発現又は個々の腫瘍サプレッサー遺伝子の均一に減少した発現を示さないかも知れないことは、ガンの文献において十分に確立されている。ある与えられる型のガンの細胞の間でさえも、与えられるマーカー遺伝子の発現のレベルが異なり得、単独の試験ではなくて総合的な試験(a battery of tests)での信頼の必要性をさらに強調している。従って1つの側面において本発明は、診断試験の信頼性及び/又は精度を向上させるために、複数の本発明のプローブを用いる総合的な試験を提供する。
1つの態様において本発明は、組織されたアレー中のDNAチップ上に核酸プローブを固定化する方法も提供する。リソグラフィーを含む多様な方法により、オリゴヌクレオチドを固体支持体に結合させることができる。例えば1個のチップは最高で250,000個のオリゴヌクレオチドを保持することができる。これらの核酸プローブは、長さが少なくとも約12個のヌクレオチド、好ましくは少なくとも約15個のヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約25個のヌクレオチドそして最も好ましくは少なくとも約40個のヌクレオチドのヌクレオチド配列且つマーカー核酸配列のコーディング配列の一部に相補的であり、腫瘍細胞中で異常に発現される配列の最高で全部又はほとんど全部を含んでなる。本発明は種々のガンに関して利用できる試験を超える有意な利点を与え、それは、それが1個のチップ上に核酸マーカーのアレーを与えることにより試験の信頼性を向上させるからである。
方法は、生検材料を得、それを場合により低温槽切片化により分別して腫瘍細胞を細胞集団全体の約80%まで濃縮することを含む。次いでDNA又はRNAを抽出し、増幅し、DNAチップを用いて分析し、マーカー核酸配列の存在又は不在を決定する。
1つの態様において、核酸プローブを二−次元マトリックスまたはアレーにおいて基質上にスポットする。核酸の試料を標識し、次いでプローブにハイブリッド形成させることができる。試料の非結合部分を洗い流したら、プローブ核酸に結合した標識された試料核酸を含んでなる二本鎖核酸を検出することができる。
ガラス、ニトロセルロースなどを含む基質上にプローブ核酸をスポットすることができる。共有結合又は非−特異的相互作用、例えば疎水性相互作用により、プローブを基質に結合させることができる。放射性標識、発蛍光団、発色団などを用い、試料核酸を標識することができる。
アレーの構築方法及びこれらのアレーの使用方法は、例えば欧州特許第0 799 897号明細書;国際公開第97/29212号パンフレット;国際公開第97127317号パンフレット;欧州特許第0 785 280号明細書;国際公開第97/02357号パンフレット;米国特許第5,593,839号明細書;米国特許第5,578,832号明細書;欧州特許第0 728 520号明細書;米国特許第5,599,695号明細書;欧州特許第0 721 016号明細書;米国特許第5,556,752号明細書;国際公開第95/22058号パンフレット;及び米国特許第5,631,734号明細書に記載されている。
さらに、アレーを遺伝子の異常な発現を調べるために用いることができ、遺伝子の機能を決定するために用いることができる。例えば核酸配列のアレーを用い、正常な細胞とガン細胞の間で核酸配列のいずれかが異なって発現されるかどうかを決定することができる。対応する正常な細胞中で観察されないガン細胞における特定のメッセージの発現の増加は、ガン−特異的タンパク質を示すことができる。
1つの態様において、核酸分子を用いて固体表面(例えば膜)上にマイクロアレーを形成し、アレー化された(arrayed)核酸分子を正常な細胞もしくは組織及びガン細胞もしくは組織の間で核酸のいずれかが異なって発現されるかどうかを決定するために使用できるようにすることができる。1つの態様において、本発明の核酸分子は、続いてPCRにより増幅されてナイロン膜上にスポットされるべきcDNAであることができるか、あるいはcDNA分子の生成に用いることができる。次いで膜を、ガン性及び正常な組織又は細胞の同等の試料から得られる放射性標識された標的核酸分子と反応させることができる。cDNA生成及びマイクロアレー調製の方法は当該技術分野における熟練者に既知であり、例えばBertucci,et al.,(Hum.Mol.Genet.8:1999年,2129);Nguyen,et al.,(Genomics 29:1995年,207);Zhao,et al.,(Gene 156:207);Gress,et al.,(Mammalian Genome 3:1992年,609);Zhumabayeva,et al.,(Biotechniques 30:2001年,158);及びLennon,et al.,(Trends Genet.7:1991年,314)において見出すことができる。
さらに別の態様において本発明は、本発明のマーカーポリペプチドに対して作られる抗体のパネルの使用を包含する。好ましくは、抗体はスタンニオカルシンに対して作られる。そのような抗体のパネルを、ガンに関する信頼できる診断プローブとして用いることができる。本発明のアッセイは、細胞、例えば肺細胞を含有する生検試料を、1種もしくはそれより多いコードされる産物への抗体のパネルと接触させ、マーカーポリペプチドの存在又は不在を決定することを含んでなる。
本発明の診断法を処置への追跡として用いることもでき、例えばマーカーポリペプチドのレベルの定量は、現在用いられているか又は以前に用いられたガン治療の有効性ならびに患者の予後へのこれらの治療の効果の指標であることができる。
さらに、マーカー核酸又はマーカーポリペプチドを初期検出、追跡スクリーニング、再発(reoccurrence)の検出及び化学療法又は外科的処置に関する処置−後監視のための診断パネルの一部として用いることができる。
従って本発明は、細胞からのマーカーポリペプチドの取得及び/又は喪失を検出するための診断アッセイ及び試薬を、例えば細胞の腫瘍形成性形質転換から生ずる増殖障害の診断及び表現型決定を助けるために利用できるようにする。
上記の診断アッセイを、予後アッセイとして同様に用いられるべく適応させることができる。そのような用途は、腫瘍の進行中の特徴的段階に起こる事象への本発明のアッセイの感度を利用する。例えば与えられるマーカー遺伝子を非常に初期の段階に、おそらく細胞が不可逆的に悪性となるよう約束される前に上方−もしくは下方−調節することができ、他のマーカー遺伝子をずっとそれより遅い段階に初めて、特徴的に上方−もしくは下方−調節することができる。そのような方法は、試験細胞のmRNAを、腫瘍進行の異なる段階にガンもしくは前ガン細胞中で異なる特徴的レベルで発現される与えられたマーカー核酸から誘導される核酸プローブと接触させ、細胞のmRNAへのプローブのハイブリッド形成の大体の量を決定する段階を含み、そのような量が細胞中の遺伝子の発現のレベルの指標であり、かくして細胞の腫瘍進行の段階の指標である;あるいはまた、与えられるマーカー核酸の遺伝子産物に関して特異的な抗体を用い、試験細胞のタンパク質と接触させてアッセイを行なうことができる。総合的なそのような試験は、腫瘍の存在及び位置を開示するのみでなく、臨床医が腫瘍に最も適した処置の様式を選ぶこと及びその処置の成功の見込みを予示することを可能にもするであろう。
腫瘍の臨床的経過を追跡するために本発明の方法を用いることもできる。例えば本発明のアッセイを患者からの組織試料に適用することができる;ガンに関する患者の処置の後、他の組織試料を採取し、試験を繰り返す。成功裏の処置は、ガンもしくは前ガン細胞に特徴的な異常な発現を示すすべての細胞の除去あるいはそれらの細胞中の遺伝子の発現における、おそらく正常なレベルに近づくか又は越しさえする実質的な増加を生ずるであろう。
さらに別の態様において本発明は、患者がポリペプチド、好ましくはスタンニオカルシンの異常な活性と関連する疾患の発症に関する危険、例えばガンを発症する傾向にあるかどうかを決定するための方法を提供し、ここでポリペプチドの異常な活性は、(a)マーカーポリペプチドをコードする遺伝子の一体性に影響する改変又は(b)コードする核酸の誤−発現の少なくとも1つを特徴とする遺伝子損傷の存在又は不在の検出により特徴付けられる。例えば、(i)核酸配列からの1個もしくはそれより多いヌクレオチドの欠失、(ii)核酸配列への1個もしくはそれより多いヌクレオチドの付加、(iii)核酸配列の1個もしくはそれより多いヌクレオチドの置換、(iv)核酸配列の全体的染色体転位(gross chromosomal rearrangement)、(v)核酸配列のメッセンジャーRNA転写物のレベルにおける全体的改変、(vi)核酸配列の異常な変更、例えばゲノムDNAのメチル化パターンの異常な変更、(vii)遺伝子のメッセンジャーRNA転写物の非−野生型スプライシングパターンの存在、(viii)マーカーポリペプチドの非−野生型レベル、(ix)遺伝子の対立遺伝子喪失、ならびに/あるいは(x)マーカーポリペプチドの不適切な翻訳−後変更の少なくとも1つの存在を突き止めることにより、そのような遺伝子損傷を検出することができる。
本発明は、コードする核酸配列中の損傷の検出のためのアッセイ法を提供する。これらの方法には、配列分析、サザンブロットハイブリッド形成、制限酵素部位マッピングを含む方法及び分析されるべき核酸とプローブの間のヌクレオチド対合の存在の検出を含む方法が含まれるが、それらに限られない。
特定の疾患又は障害、例えば遺伝病又は障害は、ある遺伝子の多型領域の特定の対立遺伝子変異体と関連し、それは必ずしも突然変異タンパク質をコードしない。かくして患者における遺伝子の多型領域の特定の対立遺伝子変異体の存在は、患者を特定の疾患又は障害を発症し易くし得る。遺伝子中の多型領域は、個体(individuals)の集団において遺伝子のヌクレオチド配列を決定することにより、同定することができる。多型領域が同定されたら、個体、例えばガンのような特定の疾患を発症する個体の特定の集団を調べることにより、特定の疾患との連関を決定することができる。多型領域は遺伝子のいずれの領域にも、例えばエキソン、エキソンのコーディング又は非−コーディング領域、イントロン及びプロモーター領域中に位置し得る。
典型的な態様において、ある遺伝子又は自然に存在するその突然変異体のセンスもしくはアンチセンス配列あるいは問題の遺伝子もしくは自然に存在するその突然変異体に自然に伴う5’もしくは3’フランキング配列もしくはイントロン配列にハイブリッド形成することができるヌクレオチド配列の領域を含む核酸プローブを含んでなる核酸組成物を提供する。細胞の核酸をハイブリッド形成のために得られるようにし、プローブを試料の核酸と接触させ、試料核酸へのプローブのハイブリッド形成を検出する。そのような方法を用い、欠失、置換などを含むゲノムもしくはmRNAレベルにおける損傷又は対立遺伝子変異体を検出することができ、ならびにmRNA転写物レベルを決定することができる。
検出法の他の例は、突然変異又は多型部位に重なり、突然変異または多型領域の回りに
例えば約5、10、20、25又は30個のヌクレオチドを有するプローブを用いる対立遺伝子特異的ハイブリッド形成である。本発明の好ましい態様において、対立遺伝子突然変異体に特異的にハイブリッド形成できるいくつかのプローブを固相支持体、例えば「チップ」に結合させる。「DNAプローブアレー」とも命名されるオリゴヌクレオチドを含んでなるこれらのチップを用いる突然変異検出分析は、例えばCronin,et al.,(Human Mutation 7:1996年,244)に記載されている。1つの態様において、チップは遺伝子の少なくとも1つの多型領域のすべての対立遺伝子変異体を含んでなることができる。次いで固相支持体を試験核酸と接触させ、特異的プローブへのハイブリッド形成を検出する。従って、簡単なハイブリッド形成実験で、1個もしくはそれより多い遺伝子の多数の対立遺伝子変異体の正体を同定することができる。
例えば約5、10、20、25又は30個のヌクレオチドを有するプローブを用いる対立遺伝子特異的ハイブリッド形成である。本発明の好ましい態様において、対立遺伝子突然変異体に特異的にハイブリッド形成できるいくつかのプローブを固相支持体、例えば「チップ」に結合させる。「DNAプローブアレー」とも命名されるオリゴヌクレオチドを含んでなるこれらのチップを用いる突然変異検出分析は、例えばCronin,et al.,(Human Mutation 7:1996年,244)に記載されている。1つの態様において、チップは遺伝子の少なくとも1つの多型領域のすべての対立遺伝子変異体を含んでなることができる。次いで固相支持体を試験核酸と接触させ、特異的プローブへのハイブリッド形成を検出する。従って、簡単なハイブリッド形成実験で、1個もしくはそれより多い遺伝子の多数の対立遺伝子変異体の正体を同定することができる。
ある態様において、損傷の検出は、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)(例えば米国特許第4,683,195及び4,683,202号明細書を参照されたい)、例えばアンカーPCR又はRACE PCR、あるいはまたリガーゼ連鎖反応(LCR)(例えばLandegran,et al.著,Science 24:1988年,1077−1080;Nakazaw,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:1994年,360−364を参照されたい)におけるプローブ/プライマーの使用を含んでなり、それらの後者は遺伝子中の点突然変異の検出に特に有用であることができる(Abravaya,et al.著,Nuc.Acid Res.23:1995年,675−682)。例となる態様において、方法は(i)患者から細胞の試料を収集し、(ii)試料の細胞から核酸(例えばゲノム、mRNA又は両方)を単離し、(iii)ハイブリッド形成及び核酸の(存在するなら)増幅が起こるような条件下で、核酸配列に特異的にハイブリッド形成する1種もしくはそれより多いプライマーと核酸試料を接触させ、そして(iv)増幅産物の存在又は不在を検出するか、又は増幅産物のサイズを検出し、長さを標準試料と比較する段階を含んでなる。本明細書に記載される突然変異の検出のために用いられるいずれかの方法と結びつけて、予備的増幅段階としてPCR及び/又はLCRを用いるのが望ましいかも知れないと思われる。
別の増幅法は:自己持続性配列複製(Guatelli,et al.著,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:1990年,1874−1878)、転写増幅系(Kwoh,et al.著,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:1989年,1173−1177)、Q−ベータレプリカーゼ(Lizardi,et al.著,Bio/Technology 6:1988年,1197)あるいは他のいずれかの核酸増幅法及び続く当該技術分野における熟練者に周知の方法を用いる増幅された分子の検出を含む。これらの検出案は、核酸分子が非常に少数で存在する場合に、そのような分子の検出に特に有用である。
予示アッセイ
与えられる抗ガン剤からの臨床的利益を予示することができる実験室に基づくアッセイは、ガンを有する患者の臨床的処置を非常に強化するであろう。この効果を評価するために、抗ガン剤と関連するバイオマーカーを、処置の前、その間及びその後に生物学的試料(例えば腫瘍試料、血漿)中で分析することができる。
与えられる抗ガン剤からの臨床的利益を予示することができる実験室に基づくアッセイは、ガンを有する患者の臨床的処置を非常に強化するであろう。この効果を評価するために、抗ガン剤と関連するバイオマーカーを、処置の前、その間及びその後に生物学的試料(例えば腫瘍試料、血漿)中で分析することができる。
例えば、異種移植されたヒト腫瘍を有する実験室動物において、スタンニオカルシンの発現はVEGFR2阻害剤を用いる処置により改変する。ビヒクルで処置されたグループに対し、VEGFR2阻害剤で処置されたグループにおけるスタンニオカルシンの発現は減少した。
処置を監視するための他の方法は、血清プロテオームスペクトル(serum proteomic spectra)の評価である。特定的に、血漿試料を質量分析(例えば
表面−強化レーザー脱着及びイオン化)に供し、各患者に関してプロテオームスペクトルを形成することができる。処置の前及びその間の患者からの血漿の分析から誘導される1組のスペクトルを、反復探索アルゴリズムにより分析することができ、それは未処置試料から処置試料を完全に区別するプロテオームパターンを同定することができる。次いで得られるパターンを用い、処置に続く臨床的利益を予示することができる。
表面−強化レーザー脱着及びイオン化)に供し、各患者に関してプロテオームスペクトルを形成することができる。処置の前及びその間の患者からの血漿の分析から誘導される1組のスペクトルを、反復探索アルゴリズムにより分析することができ、それは未処置試料から処置試料を完全に区別するプロテオームパターンを同定することができる。次いで得られるパターンを用い、処置に続く臨床的利益を予示することができる。
生物学的試料(例えば腫瘍生検試料、血液試料)の全体的遺伝子発現分布測定(profiling)及びバイオインフォーマティクス(bioinformatics)−推進パターン同定を用い、臨床的利益及び感度ならびに抗ガン剤への耐性の発現を予示することができる。例えば、処置の前及びその間の患者からの全血に由来する細胞から単離されるRNAを用い、Affymetrix GeneChip法及びアルゴリズムを利用して血球遺伝子発現分布を作ることができる。これらの遺伝子発現分布は次いで、特定の抗ガン剤を用いる処置からの臨床的利益を予示することができる。
1D 1H−NMR(核磁気共鳴)による尿の生化学的組成物の分析も、予示アッセイとして用いることができる。抗ガン剤を用いる処置に対する代謝反応を評価するため、ならびにこの反応を臨床的終点と関連付けるために、パターン認識法を用いることができる。尿中で排出される生化学的又は内因性代謝産物は、正常な人に関してプロトンNMRにより十分に特性化されている(Zuppi,et al.著,Clin Chim Acta 265:1997年,85−97)。これらの代謝産物(約30〜40種)は、クエン酸及び尿素回路のような主要な代謝経路の副−産物に相当する。薬剤−、疾患−及び遺伝子的−刺激は、基準の尿分布における代謝−特異的変化を生ずることが示され、それは刺激への代謝反応の時間経過(timeline)及び大きさの指標である。これらの分析は多−変数(multi−variant)であり、従ってデータの解釈を向上させるためにパターン認識法を用いる。尿代謝分布を臨床的終点と関連付け、臨床的利益を決定することができる。
実施例
本明細書に記載される構造、材料、組成物及び方法は、本発明の典型的な例であることが意図されており、本発明の範囲は実施例の範囲により制限されないことが理解されるであろう。当該技術分野における熟練者は、開示される構造、材料、組成物及び方法を変動させて本発明を実施することができ、そのような変動は本発明の範囲内とみなされることがわかるであろう。
本明細書に記載される構造、材料、組成物及び方法は、本発明の典型的な例であることが意図されており、本発明の範囲は実施例の範囲により制限されないことが理解されるであろう。当該技術分野における熟練者は、開示される構造、材料、組成物及び方法を変動させて本発明を実施することができ、そのような変動は本発明の範囲内とみなされることがわかるであろう。
実施例1.腫瘍異種移植遺伝子発現分布測定案
A.腫瘍移植及び切除
11〜19週令の範囲であり、且つ約18〜25グラムの平均体重を有する雌のヌードマウスをこれらの研究で用いた。ヒト乳ガン(MDA−MB−231)ガン細胞系を組織培養において約70%密集まで成長させた。移植の日に細胞を収穫し(マウス当たり5x106個の細胞)、収穫の時点から移植の時点までHanks Balanced Salt Solution中に懸濁させ、移植の時点に各マウスに適した細胞接種材料の細胞懸濁液の0.2mlの注入を与えた。各マウスの右側腹部中に細胞を皮下注入し、成長に関して腫瘍を監視した。腫瘍が75〜125ミリグラムの大きさに達した時(移植から5日〜9日)、実施(staging)(投薬)の時点を決定した。次いで動物をVEGFR2阻害剤で処置した。VEGFR2阻害剤のために用いられるビヒクルはPEG/グリセリン(95:5)である。経口的投薬は、1日1回40mg/kgにおいて9日間であった。9日に、投薬から1、2、4及び8時間後にマウスを安楽死させ(euthanized)、3個の薬剤−処置された及び3個のビヒクル−処置された腫瘍を収穫し、即時凍結した(snap frozen)。
A.腫瘍移植及び切除
11〜19週令の範囲であり、且つ約18〜25グラムの平均体重を有する雌のヌードマウスをこれらの研究で用いた。ヒト乳ガン(MDA−MB−231)ガン細胞系を組織培養において約70%密集まで成長させた。移植の日に細胞を収穫し(マウス当たり5x106個の細胞)、収穫の時点から移植の時点までHanks Balanced Salt Solution中に懸濁させ、移植の時点に各マウスに適した細胞接種材料の細胞懸濁液の0.2mlの注入を与えた。各マウスの右側腹部中に細胞を皮下注入し、成長に関して腫瘍を監視した。腫瘍が75〜125ミリグラムの大きさに達した時(移植から5日〜9日)、実施(staging)(投薬)の時点を決定した。次いで動物をVEGFR2阻害剤で処置した。VEGFR2阻害剤のために用いられるビヒクルはPEG/グリセリン(95:5)である。経口的投薬は、1日1回40mg/kgにおいて9日間であった。9日に、投薬から1、2、4及び8時間後にマウスを安楽死させ(euthanized)、3個の薬剤−処置された及び3個のビヒクル−処置された腫瘍を収穫し、即時凍結した(snap frozen)。
B.RNA抽出及びcRNA調製
TRIzol試薬(Life Technologies,Rockville,MD)を用い、RNeasy案(Qiagen,Valencia,CA)を用いる修正売主案に従って、腫瘍外植片から全RNAを抽出した。Brinkmann PolytronPT10/35(Brinkmann,Westbury,NY)を用いる均質化及びクロロホルムを用いる相分離の後、試料をRNeasyカラムに適用した。RNase非−含有DNase Set(Qiagen,Valencia,CA)を用いてRNA試料をDNase Iで処理した。
TRIzol試薬(Life Technologies,Rockville,MD)を用い、RNeasy案(Qiagen,Valencia,CA)を用いる修正売主案に従って、腫瘍外植片から全RNAを抽出した。Brinkmann PolytronPT10/35(Brinkmann,Westbury,NY)を用いる均質化及びクロロホルムを用いる相分離の後、試料をRNeasyカラムに適用した。RNase非−含有DNase Set(Qiagen,Valencia,CA)を用いてRNA試料をDNase Iで処理した。
溶離及びUV分光光度法を用いる定量の後、RT−PCRのためのGibco Superscript II Choice Systemを用い、売主案に従って(Invitrogen,Carlsbad,CA)各試料を2本鎖cDNA中に逆転写した。
C.TaqMan分析のためのcDNA調製
RT−PCRのためのGibcoBRL Superscript II First
Strand Synthesis Systemを用い、売主案に従って(Life
Technologies,Rockville,MD)、各RNA試料を逆転写した。反応混合物中のRNAの最終的濃度は50ng/μLであった。50ngのランダムへキサマーを用いて逆転写を行なった。
RT−PCRのためのGibcoBRL Superscript II First
Strand Synthesis Systemを用い、売主案に従って(Life
Technologies,Rockville,MD)、各RNA試料を逆転写した。反応混合物中のRNAの最終的濃度は50ng/μLであった。50ngのランダムへキサマーを用いて逆転写を行なった。
D.蛍光プローブを用いるTaqMan定量分析
異種移植実験における内皮細胞はマウスに由来するので、マウススタンニオカルシン−1(配列番号:5及び6)及びスタンニオカルシン−2(配列番号:7及び8)への特異的なプライマー及びプローブを設計し、下記に挙げる:
異種移植実験における内皮細胞はマウスに由来するので、マウススタンニオカルシン−1(配列番号:5及び6)及びスタンニオカルシン−2(配列番号:7及び8)への特異的なプライマー及びプローブを設計し、下記に挙げる:
マウススタンニオカルシン−1
マウススタンニオカルシン−1前進プライマー:5’−(GAACCAGAAAAGCTAGTCAAGTGTGT)−3’
(配列番号:9)
マウススタンニオカルシン−1逆プライマー:5’−(GAGAAAAGAGAAAGAAAGTTTACTGAACT)−3’
(配列番号:10)
マウススタンニオカルシン−1プローブ:
5’−(FAM)−CAGAAGCCCAAAGTGGCAAATAGCTTATGAGAAT−(TAMRA)−3’
(配列番号:11)
マウススタンニオカルシン−1前進プライマー:5’−(GAACCAGAAAAGCTAGTCAAGTGTGT)−3’
(配列番号:9)
マウススタンニオカルシン−1逆プライマー:5’−(GAGAAAAGAGAAAGAAAGTTTACTGAACT)−3’
(配列番号:10)
マウススタンニオカルシン−1プローブ:
5’−(FAM)−CAGAAGCCCAAAGTGGCAAATAGCTTATGAGAAT−(TAMRA)−3’
(配列番号:11)
マウススタンニオカルシン−2
マウススタンニオカルシン−2前進プライマー:5’−(GTTGTATTGAATCGGCCGTGTA)−3’
(配列番号:12)
マウススタンニオカルシン−2逆プライマー:5’−(CCCCCCAACAGACCATACTTAA)−3’
(配列番号:13)
マウススタンニオカルシン−2プローブ:
5’−(FAM)−CTGTCTTCGGTCTGTGGAGTTAGTTGGTG−(TAMRA)−3’(配列番号:14)
マウススタンニオカルシン−2前進プライマー:5’−(GTTGTATTGAATCGGCCGTGTA)−3’
(配列番号:12)
マウススタンニオカルシン−2逆プライマー:5’−(CCCCCCAACAGACCATACTTAA)−3’
(配列番号:13)
マウススタンニオカルシン−2プローブ:
5’−(FAM)−CTGTCTTCGGTCTGTGGAGTTAGTTGGTG−(TAMRA)−3’(配列番号:14)
マウスベータ2−ミクログロブリン
マウスベータ2−ミクログロブリン前進プライマー:5’−(CCGAACATACTGAACTGCTACGTAAC)−3’
(配列番号:15)
マウスベータ2−ミクログロブリン逆プライマー:5’−(TTTCCCGTTCTTCAGCATTTG)−3’
(配列番号:16)
マウスベータ2−ミクログロブリンプローブ:
5’−(VIC)−CAGTTCCACCCGCCTCACATTGAAAT−(TAMRA)−3’(配列番号:17)
ここでFAM=6−カルボキシ−フルオレセイン
そしてTAMRA=6−カルボキシ−テトラメチル−ローダミン
である。
マウスベータ2−ミクログロブリン前進プライマー:5’−(CCGAACATACTGAACTGCTACGTAAC)−3’
(配列番号:15)
マウスベータ2−ミクログロブリン逆プライマー:5’−(TTTCCCGTTCTTCAGCATTTG)−3’
(配列番号:16)
マウスベータ2−ミクログロブリンプローブ:
5’−(VIC)−CAGTTCCACCCGCCTCACATTGAAAT−(TAMRA)−3’(配列番号:17)
ここでFAM=6−カルボキシ−フルオレセイン
そしてTAMRA=6−カルボキシ−テトラメチル−ローダミン
である。
各試料からの25ngの逆転写されたRNAにつき、定量実験を行なった。アッセイ反応混合物は以下の通りであった:
最終
TaqMan Universal PCR 1x
Master Mix(2x)
(PE Applied Biosystems,CA)
PDAR標準−18S RNA(20x) 1x
前進プライマー 300nM
逆プライマー 300nM
プローブ 200nM
cDNA 10ng
水 25μLまで
F.PCR条件:
1回: 50℃において2分間
95℃において10分間
40サイクル: 95℃において15秒間
60℃において1分間
最終
TaqMan Universal PCR 1x
Master Mix(2x)
(PE Applied Biosystems,CA)
PDAR標準−18S RNA(20x) 1x
前進プライマー 300nM
逆プライマー 300nM
プローブ 200nM
cDNA 10ng
水 25μLまで
F.PCR条件:
1回: 50℃において2分間
95℃において10分間
40サイクル: 95℃において15秒間
60℃において1分間
ABI Prism 7700 Sequence Detector(PE Applied Biosystems,CA)上で実験を行なった。実験の最後に、PCRの間に取得される蛍光データをABI Prism 7700使用者マニュアルに記載されている通りに処理した。デルタ−デルタCT法を用い、ベータ2−ミクログロブリンの値への標準化を用いて倍変化(fold change)を計算した。図1は、VEGFR2阻害剤への暴露に反応したマウススタンニオカルシン−1及びスタンニオカルシン−2遺伝子の発現変化を描述する。Y軸は、ビヒクル処置された腫瘍を有する動物に対する化合物−処置された腫瘍を有する動物におけるスタンニオカルシン−1及びスタンニオカルシン−2の発現の倍変化を描述する。X軸は、腫瘍試料が採取された9日における投薬後の、時における時間を描述する。
実施例2.試験管内内皮細胞遺伝子発現分布測定案
A.細胞系処理及びRNA収穫
プールされたヒト微小脈管内皮細胞(HMVECs)又はヒト臍静脈内皮細胞(HUVECs)を2個のT75フラスコとして購入した(Clonetics,Cambrex
Corporation,East Rutherford,NJ)。2%ゼラチンコーティングされたフラスコ上の完全Clonetics生育培地(EGF+5%FCS)中で、実験を行なうのに十分な数が得られるまで(それぞれ6継代未満における4個のフラスコ)細胞を拡大した(expanded)。処理の前に細胞をPBS中で2回(2x)洗浄し、基礎培地(EBM+0.2%内毒素非含有BSA)中で終夜欠乏させた(starved)。翌日、培地を除去し、25mlのEBM+BSAで置き換えた。VEGFR2阻害剤(薬剤)倍液をDMSO中で調製し、0.1%DMSO中の100nmの最終的濃度まで加えた。ヘパリンは1.5U/mlの最終的濃度で用いられた。VEGFの最終的濃度は10ng/mlであった。VEGF/ヘパリンを2時間加える前に30分間、薬剤/DMSOを加えた。VEGF/ヘパリンは、フラスコに加えられる前に5分間、氷上で予備インキュベーションされた。2時間後、培地を除去し、細胞をPBS中で2回洗浄し、トリプシン処理し、PBS中でさらに1回洗浄し、次いでQiagen RLT緩衝液中でライシスし、−80℃で保存した。続いてQiagen midi spinキットを介してRNAを単離し、OD260/280及びゲル視覚化及び/又はAgilentバイオアナライザーにより定量した。
A.細胞系処理及びRNA収穫
プールされたヒト微小脈管内皮細胞(HMVECs)又はヒト臍静脈内皮細胞(HUVECs)を2個のT75フラスコとして購入した(Clonetics,Cambrex
Corporation,East Rutherford,NJ)。2%ゼラチンコーティングされたフラスコ上の完全Clonetics生育培地(EGF+5%FCS)中で、実験を行なうのに十分な数が得られるまで(それぞれ6継代未満における4個のフラスコ)細胞を拡大した(expanded)。処理の前に細胞をPBS中で2回(2x)洗浄し、基礎培地(EBM+0.2%内毒素非含有BSA)中で終夜欠乏させた(starved)。翌日、培地を除去し、25mlのEBM+BSAで置き換えた。VEGFR2阻害剤(薬剤)倍液をDMSO中で調製し、0.1%DMSO中の100nmの最終的濃度まで加えた。ヘパリンは1.5U/mlの最終的濃度で用いられた。VEGFの最終的濃度は10ng/mlであった。VEGF/ヘパリンを2時間加える前に30分間、薬剤/DMSOを加えた。VEGF/ヘパリンは、フラスコに加えられる前に5分間、氷上で予備インキュベーションされた。2時間後、培地を除去し、細胞をPBS中で2回洗浄し、トリプシン処理し、PBS中でさらに1回洗浄し、次いでQiagen RLT緩衝液中でライシスし、−80℃で保存した。続いてQiagen midi spinキットを介してRNAを単離し、OD260/280及びゲル視覚化及び/又はAgilentバイオアナライザーにより定量した。
B.Affymetrix分析
試料を組織的に(organically)抽出し、エタノール沈殿させた。次いでRNA標識キット(Enzo Diagnostics,NY)を用いてビオチニル化ヌクレオチドを導入する試験管内転写反応において、約1μgのcDNAを用いた。得られるcRNAをRNeasyクリーンアッププロトコール(clean−up protocol)に供し、次いでUV分光光度法を用いて定量した。cRNA(15μg)を94℃においてMgOAc及びKOAcの存在下でフラグメント化させた。フラグメント化RNA(10μg)を各アレー上に、アレー当たり1個のcRNA試料で負荷した。Affymetrix GeneChip Hybridization Oven 640において、45℃において60rpmで回転させ、アレーを16時間ハイブリッド形成させた。
試料を組織的に(organically)抽出し、エタノール沈殿させた。次いでRNA標識キット(Enzo Diagnostics,NY)を用いてビオチニル化ヌクレオチドを導入する試験管内転写反応において、約1μgのcDNAを用いた。得られるcRNAをRNeasyクリーンアッププロトコール(clean−up protocol)に供し、次いでUV分光光度法を用いて定量した。cRNA(15μg)を94℃においてMgOAc及びKOAcの存在下でフラグメント化させた。フラグメント化RNA(10μg)を各アレー上に、アレー当たり1個のcRNA試料で負荷した。Affymetrix GeneChip Hybridization Oven 640において、45℃において60rpmで回転させ、アレーを16時間ハイブリッド形成させた。
C.Microarray Suite 5.0分析
ハイブリッド形成に続き、アレーをフィコエリトリン−共役ストレプタビジンで染色し、Agilent GeneArray Scanner中に置き、次いで488nmレーザーに暴露してフィコエリトリンを励起させた。Microarray Suite 5.0ソフトウェアは、アレーが発する光の強度を、遺伝子発現のレベルの指標である数値にデジタル的に(digitally)変換する。各アレーは1個の動物試料を表すので、処置された動物をビヒクル動物と比較し、遺伝子の相対的倍変化が得られる。少なくとも2−倍変化で増加するかもしくは減少する遺伝子を有意と考え、さらなる分析のために選んだ。
ハイブリッド形成に続き、アレーをフィコエリトリン−共役ストレプタビジンで染色し、Agilent GeneArray Scanner中に置き、次いで488nmレーザーに暴露してフィコエリトリンを励起させた。Microarray Suite 5.0ソフトウェアは、アレーが発する光の強度を、遺伝子発現のレベルの指標である数値にデジタル的に(digitally)変換する。各アレーは1個の動物試料を表すので、処置された動物をビヒクル動物と比較し、遺伝子の相対的倍変化が得られる。少なくとも2−倍変化で増加するかもしくは減少する遺伝子を有意と考え、さらなる分析のために選んだ。
D.TaqMan分析
ランダムヘキサマープライミング及びマイナスRT標準を含むSuperscriptポリメラーゼを用いるGibco cDNA合成キットを使用して、単離されたRNAからcDNAを合成した。PCRプライマーはPrimer Expressにより設計された。スタンニオカルシンプライマーは:
前進プライマー:5’−(TGA AGA CAC AGT CAG CAC AAT CA)−3’(配列番号:18)及び
逆プライマー:5’−(GGA AGA GGC TGG CCA TGT T)−3’(配列番号:19)
である。
ランダムヘキサマープライミング及びマイナスRT標準を含むSuperscriptポリメラーゼを用いるGibco cDNA合成キットを使用して、単離されたRNAからcDNAを合成した。PCRプライマーはPrimer Expressにより設計された。スタンニオカルシンプライマーは:
前進プライマー:5’−(TGA AGA CAC AGT CAG CAC AAT CA)−3’(配列番号:18)及び
逆プライマー:5’−(GGA AGA GGC TGG CCA TGT T)−3’(配列番号:19)
である。
それぞれ50μMにおけるプライマーのマスター混合物を調製した。ABI PRISM 7700 Sequence Detector上でSYBRグリーンプローブを用い、標準的なPCR条件により試料を分析した。標準化を課するための標準としてβ−アクチンを用いた。
図2Aは、VEGFで処置された後のHMVECsにおけるヒトスタンニオカルシン−1発現がほとんど20−倍誘導されることを示す。HMVECsがVEGF及びVEGFR2阻害剤の両方で処置されると、スタンニオカルシン発現は、細胞が阻害剤のみで処置される場合(すなわちVEGF添加なし)と同じレベルに減少する。
図2Bは、VEGF及び阻害剤の共−添加後の時間経過として設計された類似の実験を示す。Affymetrix及びTaqManデータの両方をプロットする。倍変化は、細胞が阻害剤−/+VEGFに暴露される時のスタンニオカルシン発現における差である。VEGFR2阻害剤は、VEGFにより誘導されるスタンニオカルシン発現を減少させる。
図3Aは、図2Bに関して上記で記載したと類似であるが、HUVECsを用いる時間経過である。TaqManデータのみを示す。図3Bは図3Aに描述されている実験と類似の第2の実験であるが、Affymetrix及びTaqManデータの両方がプロットされている。
Claims (26)
- 抗ガン剤の投与によりガンに関して処置されている患者の反応を監視する方法であって:
(a)抗ガン剤を用いる処置の前に患者から採取される第1の生物学的試料中の1種もしくはそれより多いバイオマーカーの発現のレベルを決定し;
(b)抗ガン剤を用いる初期処置後に患者から採取される少なくとも1つの第2の生物学的試料中のバイオマーカーの発現のレベルを決定し;そして
(c)第2の生物学的試料中のバイオマーカーの発現のレベルを第1の生物学的試料中のバイオマーカーの発現のレベルと比較する
段階を含んでなり;
ここで第1の生物学的試料中のバイオマーカーの発現のレベルと比較される第2の生物学的試料中のバイオマーカーの発現のレベルにおける変化が抗ガン剤を用いる処置の有効性を示す方法。 - 該抗ガン剤がVEGFR2阻害剤である請求項1の方法。
- 該バイオマーカーがスタンニオカルシンである請求項1の方法。
- スタンニオカルシンに関する核酸配列が配列番号:1又は3である請求項3の方法。
- スタンニオカルシンに関するアミノ酸配列が配列番号:2又は4である請求項3の方法。
- ガンの処置に有用な化合物の同定方法であって:
(a)化合物を用いる処置の前に細胞もしくは組織試料中の1種もしくはそれより多い遺伝子の発現のレベルを分析し;
(b)化合物を用いる処置後に細胞もしくは組織試料中の1種もしくはそれより多い遺伝子の発現のレベルを分析する
段階を含んでなり;
ここで遺伝子の発現レベルにおける変動が薬剤有効性の指標である方法。 - 遺伝子がスタンニオカルシンである請求項6の方法。
- スタンニオカルシンに関する核酸配列が配列番号:1又は3である請求項7の方法。
- スタンニオカルシンに関するアミノ酸配列が配列番号:2又は4である請求項7の方法。
- ガンの処置に有用な化合物の同定方法であって:
(a)化合物を用いる処置の前に細胞もしくは組織試料中の1種もしくはそれより多いポリペプチドの発現のレベルを分析し;
(b)化合物を用いる処置後に細胞もしくは組織試料中の1種もしくはそれより多いポリペプチドの発現のレベルを分析する
段階を含んでなり;
ここでポリペプチドの発現レベルにおける変動が薬剤有効性の指標である方法。 - ポリペプチドがスタンニオカルシンである請求項10の方法。
- スタンニオカルシンに関する核酸配列が配列番号:1又は3である請求項10の方法。
- スタンニオカルシンに関するアミノ酸配列が配列番号:2又は4である請求項10の方法。
- 抗ガン剤の投与に対する患者の反応を予示する方法であって:
(a)抗ガン剤を用いる処置の前に患者から採取される第1の生物学的試料中の1種もしくはそれより多いバイオマーカーの発現のレベルを決定し;
(b)患者から採取される少なくとも1つの第2の生物学的試料中の1種もしくはそれより多いバイオマーカーの発現のレベルを決定し、ここで第2の生物学的試料は抗ガン剤に暴露され;そして
(c)第2の生物学的試料中の1種もしくはそれより多いバイオマーカーの発現のレベルを第1の生物学的試料中の1種もしくはそれより多いバイオマーカーの発現のレベルと比較する
段階を含んでなり;
ここで第1の生物学的試料中の1種もしくはそれより多いバイオマーカーの発現のレベルと比較される第2の生物学的試料中の1種もしくはそれより多いバイオマーカーの発現のレベルにおける変化が抗ガン剤への患者の反応を予示する方法。 - 該抗ガン剤がVEGFR2阻害剤である請求項14の方法。
- 該バイオマーカーがスタンニオカルシンである請求項14の方法。
- スタンニオカルシンに関する核酸配列が配列番号:1又は3である請求項16の方法。
- スタンニオカルシンに関するアミノ酸配列が配列番号:2又は4である請求項16の方法。
- プライマー又はプローブが少なくとも15個のヌクレオチドを含んでなる、核酸配列の発現レベルを測定するためのプライマー又はプローブを含んでなるキット。
- 核酸配列がスタンニオカルシンをコードする請求項19のキット。
- スタンニオカルシンに関する核酸配列が配列番号:1又は3である請求項20のキット。
- 組織又は細胞試料を懸濁させるかもしくは固定するための溶液、細胞のライシスのための溶液、ハイブリッド形成溶液、核酸の単離のための溶液、標準試料ならびにキットの使用のための指示書から選ばれる1種もしくはそれより多い構成要素をさらに含んでなる請求項19のキット。
- あるタンパク質に関して特異的な抗体を含んでなるキット。
- 抗体がスタンニオカルシンに対して特異的である請求項23のキット。
- スタンニオカルシンに関するアミノ酸配列が配列番号:2又は4である請求項24のキット。
- 組織又は細胞試料を懸濁させるかもしくは固定するための溶液、細胞のライシスのための溶液、基質、緩衝試薬、ブロッカー試薬、ブロッティング試薬、標準試料ならびにキットの使用のための指示書をさらに含んでなる請求項20のキット。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US52943803P | 2003-12-12 | 2003-12-12 | |
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