DE10208177A1

DE10208177A1 - Sequenz und Anwendungen des Tumor-Suppressors JASI

Info

Publication number: DE10208177A1
Application number: DE2002108177
Authority: DE
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2002-02-20
Filing date: 2002-02-20
Publication date: 2003-08-28

Description

Anwendungsgebiet

Die Erfindung betrifft ein Gen entsprechend dem Oberbegriff des Anspruchs 1.

Stand der Technik

Die Krebsentstehung kann auf den Verlust eines Allels eines Tumor-Suppressor Gens zurückzuführen sein. p53 ist ein Tumor-Suppressor, dessen Funktion in der Mehrzahl der bekannten Tumoren, z. B. Osteosarcoma, Brust- und Gehirntumoren, eingeschränkt ist. Tumor-Suppressoren regulieren den Zellzyklus und wirken negativ auf die Proliferation. Typischerweise sind Tumor Suppressorgene in Tumoren nicht oder nur zu einem geringeren Anteil exprimiert. Demzufolge werden Tumor-Suppressor Gene und Proteine in der Diagnose und Therapie von Tumoren eingesetzt.

Mention apoptosis

Nachteile des Standes der Technik

Es gibt nicht genügend Ansatzpunkte für die spezifische Tumortherapie und -diagnose. Es sind eine Reihe von Tumor-Suppressor Genen bekannt, z. B. Retinoblastoma, p53, WT-1, APC und DCC, die alle für eine bestimmte Subgruppe von Tumoren wichtig sind; viele andere Tumoren sind jedoch spezifischer Tumordiagnose und -therapie nicht zugänglich. Weiterhin sind die Mehrzahl aller Tumoren auf mehrere genetische Veränderungen zurückzuführen, von denen viele noch unbekannt sind. Eine Identifikation und Charakterisierung dieser weiteren Gene ist von direktem therapeutischen und diagnostischem Nutzen.

Aufgabe der Erfindung

Aufgabe der Erfindung ist es, die Entwicklung neuer Tumordiagnose und -therapieverfahren zu ermöglichen.

Lösung der Aufgabe

Diese Schwierigkeiten in der Tumordiagnose und -therapie werden durch die in den Ansprüchen dargelegten Anwendungen behoben.

Vorteile der Erfindung

Die Erfindung kann eingesetzt werden, um den programmierten Zelltod (Apoptose) und/oder die Zellproliferation durch Erhöhung der Expression und/oder Aktivität von JAS1 zu steigern. Das JAS1-vermittelte Apoptosepotential kann z. B. durch Substanzen oder Reagenzien reguliert werden, die in die Zelle eingebracht direkt oder indirekt die Expression und/oder Aktivität von JAS1 steigern. Eine Steigerung der Apoptose ist in Tumorzellen naheliegend. Steigerung der Apoptose in Zellkulturzellen kann darüber hinaus für die Analyse von pharmazeutisch wirksamen Substanzen eingesetzt werden, die die apoptotischen Signalübertragungswege steuern. Weiterhin kann die experimentelle Herabregulation der JAS1 Expression und/oder Aktivität in Zellkulturzellen zur Behinderung normaler apoptotischer Vorgänge führen. Ein solches System ist für die Erforschung und den Test des Potentials Tumor-induzierender Agenzien und Substanzen von Nutzen. Dieses System ist auch geeignet, Apoptosewege und deren Steuerung durch endogene und exogene Faktoren in normalen und neoplastischen Zellen aufzuklären.
Die Erfindung hat diagnostischen Wert, denn einfache immunhistochemische Färbungen von Zellen oder Geweben geben ein verläßliches Maß für den Prozentsatz der JAS1 exprimierenden Zellen. Solch ein Test, basierend auf spezifischen anti-JAS1 Antikörpern oder JAS1 Polynukleotiden oder anderen Standardtechniken, die auf JAS1 basieren, wird für die Bestimmung der apoptotischen Charakteristika von eukaryoten Zellen z. B. eines Gewebes nützlich sein. Darüber hinaus kann der Aktivitätszustand von JAS1 durch Antikörper, die spezifische posttranslationale Modifikationen wie Phosphorylierung, Methylierung, Acetylierung, Poly-ADP-Ribosylierung und andere detektieren, bestimmt werden. Solche Tests sind auch in wissenschaftlichen Anwendungen interessant.
Die Erfindung ist weiterhin nützlich für die Bestimmung onkogenen Potentials einer Zelle. Das Vorkommen von mono- oder biallelen Mutationen oder Deletionen des JAS1 Gens kann als Indiz einer gesteigerten Bereitschaft zur abnormalen Proliferation genutzt werden und derartige Tests in der Diagnostik von Tumoren Eingang finden.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist die Möglichkeit, durch genetische Suppressor Elemente, die von der DNA-Sequenz von JAS1 abgeleitet sind und typischerweise aus DNA, RNA oder modifizierten Formen bestehen und spezifisch an das natürliche Transkript binden, die Zelle in ihrer biologischen Funktion zu beeinflussen. Zu diesen biologischen Funktionen gehören die Inhibition von Apoptose, die Verzögerung von zellulärer Seneszenz, die Förderung von Zellwachstum unabhängig vom Kontakt zum Substrat, der Schutz einer Säugerzelle vor ionisierender Stahlung oder zytotoxischen Substanzen sowie der Inhibition der p53-vermittelten Transkription verschiedener Zielgene.

Beschreibung von Ausführungsbeispielen

Eine neue Screeningmethode, genannt Screening durch Festphasenphosphorylierung, wurde zur Idenifizierung neuer Substrate für Cyclin-aktivierte Kinasen eingesetzt. Bei diesem Verfahren wird eine Plasmid-Expressionsbibliothek auf Filter gespottet, die Expression der codierten Proteine induziert und die heterologen Proteine an die Membran gebunden. Auf dieser Membran werden potentielle Substrate durch Inkubation der Membran mit aktivem CyclinE/CDK2 Komplex und radioaktivem ATP identifiziert.
Mit Hilfe der Festphasenphosphorylierung wurden Klone identifiziert, die die in Abb. 1 und 2 wiedergegebene Sequenz enthielten. Mit Hilfe von Datenbankrecherchen wurde festgestellt, daß diese Klone eine bisher nicht bekannte Sequenz enthielten die für bisher nicht bekannte Proteine, die in den Abb. 3 und 4 wiedergegeben sind, kodieren. Das Gen und Protein wurde JAS1 genannt. Datenbankvergleiche ergaben eine begrenzte Homologie zu Regionen des bereits beschriebenen Tumor-Suppressors ING1 (US Patent 6117633).
Versuche mit gereinigtem JAS1 in vitro und überexprimierten JAS1 in Zellkultur bestätigten, daß JAS1 ein authentisches Substrat von CyclinE/CDK2 in vitro und in vivo ist. JAS1 wird dabei an einer Aminosäure, dem Threonin 152 phosphoryliert, wie durch Phosphorylierung artifiziell hergestellter Mutanten von JAS1 gezeigt werden konnte. Versuche in vivo zeigen zudem, daß auch andere posttranslationale Modifikationen durch weitere Kinasen, wie auch Methylierung, Acetylierung, Poly-ADP-Ribosylierung und Glykosylierung von JAS1 nicht ausgeschlossen werden können. Zumindest die Phosphorylierung von JAS1 am Threonin 152 ist dabei entscheidend für die biologische Funktion von JAS1 (siehe unten).
JAS1 bindet in vivo und in vitro an das Tumor-Suppressorprotein p53. Es ist bekannt, daß p53 maßgeblich an der Regulation vielerlei biologischer Prozesse beteiligt ist, insbesondere an der Detektion und zellulären Antwort auf zellulären Stress wie z. B. ionisierende Strahlung oder zytotoxische Agentien, der Regulation des programmierten Zelltodes (Apoptose), des Zellalterns (Seneszenz), des Zellwachstums unabhängig vom Substrat sowie der Regulation der Expression verschiedener Gene. Unsere Ergebnisse zeigen, daß überexprimiertes JAS1 im Zellkultursystem zu einer Verstärkung der p53-Effekte führt, insbesondere führt es zur überproportional gesteigerten Expression von p53-regulierten Genen. Dies konnte mit Reporterkonstrukten gezeigt werden, die natürliche (p21, mdm2) und künstliche Promotorsequenzen vor einem Luziferasegen enthalten. Diese Wirkung von JAS1 auf p53 wird dabei durch Cyclin E/CDK2 Kinase-Aktivität beeinträchtigt, wie durch Überexpression dieser Kinase in Reporter-Experimenten sowie durch gezielt eingebrachte Mutationen, die die Phosphorylierunsstelle T152 verändern, gezeigt werden konnte.
Wird die Threonin 152 Alanin Mutante von JAS1 zusammen mit den Onkogenen c-myc und aktiviertem ras in primäre Rattenzellen eingebracht, verringert es die zelluläre Transformation durch diese Onkogene. Daraus läßt sich ableiten, daß JAS1 eine in vivo tumorsupprimierende Wirkung hat, die von der Cyclin E/CDK2 Kinaseaktivität begrenzt wird. In Zellkultursystemen basierend auf Tumor-Zellinien konnte durch sog. Colony Formation Assays und die Mikroinjektion von Expressionsplasmiden darüber hinaus nachgewiesen werden, daß auch in etablierten Tumoren nicht modifiziertes JAS1 eine antiproliferative Wirkung aufweist. Verschiedenen natürlich vorkommenden Varianten von JAS1, die durch verschiedene Spleißvorgänge desselben Gens, Expression homologer Genvarianten oder posttranslationale Modifikationen entstanden, können dabei unterschiedliche biologische Funktionen zugeordnet werden. Auch andere Proteine, die JAS1 spezifisch in vivo binden, können dessen biologische Funktion tragen, verändern oder aufheben. Insbesondere zeigen die Versuche die Möglichkeit der Assoziation einer Variante von JAS1 mit zellulären Histon- Acetyltransferasen (HAT), während andere Varianten Histon-Deacetylasen oder Methylasen binden können.
Die Beeinflussung der zellulären JAS1-Aktivität kann weiterhin über dessen Expression erfolgen. Werden Moleküle in eine Tumorzelle eingebracht, die spezifisch die mRNA von Jas1 binden, führt dies zu einer Verringerung der translatierbaren Jas1 mRNA und damit zu verringerter zellulärer JAS1-Aktivität. Insbesondere können RNA oder DNA Moleküle oder Analoge, die mit der zellulären Jas1 mRNA stabile Hybride bilden, zur spezifischen Inaktivierung der Jas1 mRNA führen.

Claims

1. Ein Nukleinsäuremolekül, dadurch gekennzeichnet, daß es für das in Abb. 3 wiedergegebene Protein oder Teile davon kodiert.

2. Ein Nukleinsäuremolekül, dadurch gekennzeichnet, daß es für das in Abb. 4 wiedergegebene Protein oder Teile davon kodiert.

3. Ein Nukleinsäuremolekül, dadurch gekennzeichnet, daß es für ein Protein kodiert, das mindestens 30% Homologie mit dem in Abb. 3 oder 4 gezeigten hat.

4. Nukleinsäuremoleküle, dadurch gekennzeichnet, daß sie komplementär der in Abb. 1 oder 2 wiedergegebenen Nukleinsäure sind und mit dieser hybridisieren.

5. Nukleinsäuremoleküle, dadurch gekennzeichnet, daß sie sich von den in den Nukleinsäuren in den Ansprüchen 1-4 durch den degenerativen genetischen code unterscheiden.

6. Nukleinsäuremoleküle, dadurch gekennzeichnet, daß sie artifiziell erzeugte oder natürlich vorkommende Varianten und Allele der in den Ansprüchen 1-5 sind.

7. Ein Oligonukleotid, dadurch gekennzeichnet, daß es spezifisch mit den Nukleinsäuremolekülen in den Ansprüchen 1-6 hybridisiert.

8. Ein rekombinanter Vektor, dadurch gekennzeichnet, daß er Nukleinsäuren aus den Ansprüchen 1-6 oder Teile davon enthält.

9. Eine Wirtszelle, dadurch gekennzeichnet, daß sie genetisch modifiziert ist mit einer Nukleinsäure aus den Ansprüchen 1-6 oder mit einem Vektor aus Anspruch 8.

10. Eine Methode für die Produktion eines Proteins, dadurch gekennzeichnet, daß dieses Protein durch eine Nukleinsäure aus den Ansprüchen 1-6 kodiert wird und eine Wirtszelle aus Anspruch 9 derart kultiviert wird, daß das Protein exprimiert wird und aus der Zelle oder dem Kulturmedium isoliert werden kann.

11. Ein Protein, dadurch gekennzeichnet, daß es durch eine Nukleinsäure der Ansprüche 1-6 kodiert wird oder durch eine Methode aus Anspruch 10 erhalten werden kann.

12. Ein Antikörper, dadurch gekennzeichnet, daß er spezifisch ein Protein aus Anspruch 11 erkennt.

13. Eine pharmazeutische Mischung, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine Nukleinsäure aus den Ansprüchen 1-6 oder Teile davon oder ein Protein aus Anspruch 11 und optional zusätzlich pharmazeutisch akzeptable Träger enthält.

14. Der Gebrauch einer pharmazeutischen Mischung aus Anspruch 13 für die Bekämpfung von Krankheiten.

15. Ein Molekül, dadurch gekennzeichnet, daß es ein Antagonist zu dem in Anspruch 11 genannten Protein ist.

16. Eine pharmazeutische Mischung, dadurch gekennzeichnet, daß sie ein Molekül aus Anspruch 15 und optional zusätzlich pharmazeutisch akzeptable Träger enthält.

17. Der Gebrauch einer pharmazeutischen Mischung aus Anspruch 16 für die Bekämpfung von Krankheiten.

18. Eine diagnostische Anordnung, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine Nukleinsäure aus den Ansprüchen 1-6, ein Oligonukleotid aus dem Anspruch 7, ein Protein aus Anspruch 11, einen Antikörper aus Anspruch 12 und/oder einen Antagonisten aus Anspruch 15 enthält.

19. Eine Methode, die Bindung eines ersten Proteins an ein zweites Protein spezifisch zu stören oder zu fördern, dadurch gekennzeichnet, daß das erste Protein ein Protein des Anspruchs 11 und das zweite Protein das Tumor-Suppressorprotein p53 oder ein anderes an das Protein aus Anspruch 11 spezifisch bindendes Protein ist.

20. Peptide und Proteine, dadurch gekennzeichnet, daß die Peptide oder Proteine eine biologische Aktivität wie das Protein aus Anspruch 11 entfalten.

21. Eine Methode, die Proliferation von Zellen zu verändern, dadurch gekennzeichnet, daß die Methode auf der Veränderung der biologischen Funktion des Proteins aus Anspruch 11 beruht.

22. Methode, das onkogene Potential einer Zelle zu diagnostizieren oder zu beeinflussen, dadurch gekennzeichnet, daß die Methode auf der Verwendung von Nukleinsäuren aus den Ansprüchen 1-6, einem Protein des Anspruchs 11 und/oder spezifisch das Protein des Anspruchs 11 bindender Moleküle basiert.

23. Methode, die zelluläre Apoptose zu diagnostizieren oder zu beeinflussen, dadurch gekennzeichnet, daß die Methode auf der Verwendung von Nukleinsäuren aus den Ansprüchen 1-6, einem Protein des Anspruchs 11 und/oder spezifisch das Protein des Anspruchs 11 bindender Moleküle basiert.

24. Ein Verfahren zur Identifikation von Proteinen, dadurch gekennzeichnet, daß

a) eine Expressionbibliothek auf Filtern aufgebracht wird und die exprimierten Proteine durch Enzyme, insbesondere Kinasen, modifiziert werden

b) diese Modifikationen spezifisch nachgewiesen werden, insbesondere durch die Verwendung von radioaktiv markierten Vorstufen, spezifischer Antikörper und anderer spezifisch die Modifikation anzeigender Agenzien.