KR20200140303A

KR20200140303A - 샘플에서 1종 이상의 유형의 미생물의 다양한 집단으로부터 핵산 분자를 추출하는 방법

Info

Publication number: KR20200140303A
Application number: KR1020207031144A
Authority: KR
Inventors: 수니어 제인
Original assignee: 썬 제노믹스 인코포레이티드
Priority date: 2018-04-02
Filing date: 2019-04-02
Publication date: 2020-12-15
Also published as: GB2587545B; AU2019247693A1; GB2587545A; CA3095745A1; GB202017361D0; JP2021520191A; IL277682A; CN112204139A; SG11202009744WA; WO2019195342A1; EP3775197A1

Abstract

본 명세서에는 샘플에서 1종 이상의 유형의 미생물의 다양한 집단으로부터 유전 물질을 추출하는 방법이 개시된다. 미생물은 원핵생물 또는 진핵생물일 수 있고, 박테리아, 고세균, 진균, 원생동물, 장내 기생충, 기생충, 바이러스, 파지 등을 포함할 수 있다. 추출은 단일 샘플로부터 기원될 수 있고, 후속 식별은 분자 방법, 예컨대, qPCR, PCR, RFLP, SSCP, 대립유전자 특이적 PCR, 표적화 서열결정, 풀 다운 서열결정, 전체 샷건 서열결정 또는 다른 방법을 통해서 이루어질 수 있다. 또한 인간 대상체의 소화관으로부터의 진균(즉, 사카로마이세스 종), 동물 세포(유럽 가축우), 식물(예컨대, 호르데움 불가래)을 비롯한 다양한 유기체로부터 핵산 분자를 추출하는 단계, 이로부터 메타게노믹스 분석을 수행하는 단계 및 메타게노믹스 분석에 기초하여 대상체에 대한 프로바이오틱 치료 또는 규정식 지침을 결정하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.

Description

샘플에서 1종 이상의 유형의 미생물의 다양한 집단으로부터 핵산 분자를 추출하는 방법

관련 출원의 상호 참조

본 출원은 2018년 4월 2일자로 출원된 미국 출원 시리얼 번호 62/651,620에 대한 35 U.S.C. §119(e) 하의 이익을 주장한다. 이 선행 출원의 개시내용은 본 출원의 개시내용의 일부인 것으로 간주되며 본 출원의 개시내용에 참조에 의해 원용된다.

기술 분야

본 발명은 일반적으로 게놈 분석에 관한 것으로, 특히, 생물학적 샘플에서 다양한 미생물 집단으로부터 식품과 연관된 핵산 분자를 추출 및 분석하는 방법에 관한 것이다.

약 100조 종의 미생물이 인간 신체 내에서 그 상에서 살고 있고, 신체의 대략 10조개의 인간 세포를 훨씬 능가한다. 이러한 일반적으로 무해한 바이러스, 박테리아 및 진균을 편리공생(commensal) 또는 상리공생(mutualistic) 유기체라 지칭한다. 편리공생 유기체 및 상리공생 유기체는 우리의 신체를 다양한 방식으로 건강하게 유지시키는 것을 돕는다. 함께 신체 내에서 그리고 신체 상에서 살고 있는 미생물 - 편리공생, 상리공생 및 병원성 종 - 전부는 마이크로바이옴(microbiome)이라 지칭되고, 이의 동등하고 연관된 대사체는 개체의 건강 상태와 밀접하게 관련되고, 그 역도 가능하다.

핵산 서열결정(sequencing)에서의 발전은 소화관 및 피하 조직에 살고 있는 마이크로바이옴을 신속하고 정확하게 식별 및 프로파일링하는 기회를 생성하였다. 최적의 균총은 또한 상승작용 방식으로 숙주 면역계와 상호작용하여, 이의 건강 이점을 추가로 전파시킨다. 개체의 연관된 대사체는 또한 질량-분광분석법 기반 시스템에 의해서 또는 게노믹-기반 대사체 모델링 및 플럭스-균형 분석을 사용함으로써 프로파일링될 수 있고, 건강한 대사체 프로파일을 제조하는 데 사용될 수 있다. 이러한 모든 방법은 미생물 공동체의 복잡성을 해부하는 데 사용될 수 있다.

본 발명은 생물학, 환경, 식이 보충제 또는 다른 생태계 미생물 유기체 이종 집단 샘플에서 다양한 미생물 집단으로부터 핵산 분자를 추출하는 방법 및 처리 단계를 통해서 핵산 또는 추출물을 사용하는 방법 및 개체에 대한 프로바이오틱 맞춤화(probiotic customization)의 결정을 위한 분석 방법에 관한 것이다. 본 발명에 특이적인 처리 단계는 RNA 또는 DNA 세정, 단편화, 분리 또는 소화, 하류 적용, 예컨대, PCR, qPCR, 디지털 PCR 또는 서열결정을 위한 라이브러리 또는 핵산 제조; 바이오인포매틱 QC, 여과, 정렬, 또는 데이터 구분(segregation)을 위한 사전가공; 미생물 종 분류학 배정을 위한 메타게노믹스(metagenomics) 또는 인간 게놈 바이오인포매틱스(bioinformatics) 파이프라인, 및 다른 유기체 정렬, 식별, 및 변이체 해석을 포함한다.

본 발명은 또한 육류, 식물, 과일, 채소 및/또는 이러한 유기체와 함께 함유된 미생물의 데이터베이스로부터의 식품 DNA 서열에 기초한 식품 소비의 결정 및 DNA 추출용 샘플을 이용하는 범용 방법을 기재한다. 본 명세서에는 샘플에서 1종 이상의 유형의 세포 또는 세포 성분의 다양한 집단으로부터 유전 물질(genetic material)을 추출하고 건강 개선 및 질환 예방을 위한 소비된 식품 및 영양분 성분을 결정하는 방법이 개시되어 있다.

따라서, 일 양상에서, 본 발명은 분석용 샘플을 제조하는 방법을 제공한다. 해당 방법은 a) 샘플을 세정제, 예를 들어, SDS, 및 킬레이터, 예를 들어, EDTA를 포함하는 제1 용해 용액과 혼합하는 단계; b) 단계 a)의 혼합물에 라이소자임을 갖는 제2 용해 용액을 첨가하는 단계; 및 c) 단계 b)의 혼합물에, 카오트로프제(chaotropic agent), 예를 들어, 유레아, 아세트산리튬, 구아니딘 염산 등을 포함하는 제3 용해 용액을 첨가하는 단계를 포함한다. 사전처리 단계는 핵산 수율을 추가로 최적화하는 데 사용될 수 있는 물리적 용해를 포함할 수 있다. 기계적 용해의 예는 초음파처리, 비드 혼합 및 비드 밀 균질화를 포함한다.

유사한 양상에서, 본 발명은 a) 샘플, 예컨대, 대변 샘플을 액체 질소 용액과 혼합하는 단계; b) 제1 용해 용액을 첨가하는 단계(제1 용해 용액은 세정제 및 킬레이터, 예컨대, SDS 및 킬레이터, 예컨대, EDTA를 포함함); 및 c) 제2 용해 용액을 첨가하는 단계(제2 용해 용액은 카오트로프제, 예컨대, 유레아, 아세트산리튬, 구아니딘 염산을 포함함)를 포함한다. 사전처리 단계는 핵산 수율을 추가로 최적화하는 데 사용될 수 있는 물리적 용해를 포함할 수 있다. 기계적 용해의 예는 초음파처리, 비드 혼합 및 비드 밀 균질화를 포함한다.

다른 양상에서, 본 발명은 대상체의 식품 소비를 결정하는 방법을 제공한다. 해당 방법은 a) 대상체로부터 얻어진 대변 샘플로부터 유전 물질을 추출하는 단계로서, 상기 유전 물질은 본 개시내용의 방법에 따라 추출되는, 상기 추출하는 단계; 및 b) 제1 샘플로부터 추출된 유전 물질을 메타게노믹스 분석에 적용하여 대상체의 식품 소비를 결정하는 단계를 포함한다. 실시형태에 있어서, 상기 방법은 식품 소비의 분석에 기초하여 프로바이오틱 또는 식품 원료로 대상체를 치료하는 단계를 더 포함한다.

다른 양상에서, 본 발명은 대상체의 프로바이오틱 치료를 모니터링하는 방법을 제공한다. 방법은, a) 대상체로부터 얻어진 제1 샘플 중에 존재하는 임의의 미생물로부터 유전 물질을 추출하는 단계로서, 상기 유전 물질은 본 개시내용의 방법에 따라서 추출되는, 상기 추출하는 단계, b) 제1 샘플로부터 추출된 유전 물질을 메타게노믹스 분석에 적용시키는 단계, c) 대상체를 프로바이오틱으로 치료하고, 이어서 제1 샘플로부터의 유전 물질의 추출과 동일한 방식으로, 대상체로부터 얻어진 제2 샘플 중에 존재하는 임의의 미생물로부터 유전 물질을 추출하는 단계, d) 제2 샘플로부터의 상기 추출된 유전 물질에 대해 메타게노믹스 분석을 수행하는 단계, 및 e) 제1 샘플의 메타게노믹스 분석의 결과를 제2 샘플의 메타게노믹스 분석의 결과와 비교하는 단계를 포함한다.

추가의 또 다른 양상에서, 본 발명은 추가적인 화학 또는 유전자 검사와 함께 또는 이것 없이 소화관에서 검출된 프로바이오틱 유기체로부터 프로바이오틱 점수를 계산하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.

추가의 또 다른 양상에서, 본 발명은 마이크로바이옴에 대한 점수를 계산하는 단계를 포함하며, 해당 점수는 마이크로바이옴이 군집붕괴(dysbiosis)인지, 중성인지 또는 안정적인지의 여부를 평가하는 데 사용된다.

본 발명은 메모리; 및 메모리에 결합된 하나 이상의 프로세서로서, 상기 하나 이상의 프로세서는 본 발명의 방법을 수행하기 위한 작동을 수행하도록 구성된, 상기 프로세서를 포함하는 컴퓨팅 시스템을 추가로 제공한다.

본 발명은 또한 본 발명의 방법을 수행하기 위한 자동화 플랫폼(automated platform)을 제공한다.

본 발명은 생물학적, 환경, 식이 보충제 또는 다른 생태계 미생물 유기체 불균질 집단 샘플로부터의 다양한 미생물 균총으로부터 핵산을 추출하는 올-인-원(all-in-one) 방법을 제공한다.

실시형태에서, 본 발명은 프로바이오틱스 및 환경 샘플에서, 이의 각각의 핵산을 분석함으로써, 미생물의 조성 및 상대적인 풍부도(relative abundance)를 결정하는 데 사용될 수 있다. DNA는 핵산 분석(특히 메타게노믹스 분석, 여기서 1종 초과의 종/하위종의 게놈이 식별됨)을 위해서 정제되고, 하류에서 사용된다.

상기 일반적인 설명 및 하기 상세한 설명 둘 모두는 단지 예시 및 설명이고, 청구된 바와 같은 본 발명의 추가 설명을 제공하도록 의도된다. 임의의 첨부 도면은 본 발명의 원칙을 설명하기 위해 제공된 설명과 함께, 본 발명의 추가 이해를 제공하기 위해서 포함되고, 본 명세서의 부분에 편입되고, 본 명세서의 부분을 구성하고, 본 발명의 몇몇 실시형태를 도시한다.

도 1은 인간(고 단백질 식이, 50세 초과, 보충제 사용자)의 마이크로바이옴 특징의 높은 출현율 유기체의 존재를 도시한 개략도.
도 2a는 인간(고 탄수화물 식이, 18 내지 50세, 채식주의자 식이)의 마이크로바이옴 특징의 높은 출현율 유기체(박테리아)의 존재를 도시한 개략도.
도 2b는 인간(고 탄수화물 식이, 18 내지 50세, 채식주의자 식이)의 마이크로바이옴 특징의 높은 출현율 유기체(바이러스 및 파지)의 존재를 도시한 개략도.
도 2c는 인간(고 탄수화물 식이, 18 내지 50세, 채식주의자 식이)의 마이크로바이옴 특징의 높은 출현율 유기체(고세균)의 존재를 도시한 개략도.
도 2d는 인간(고 탄수화물 식이, 18 내지 50세, 채식주의자 식이)의 마이크로바이옴 특징의 높은 출현율 유기체(진균 및 다른 진핵생물)의 존재를 도시한 개략도.
도 3a는 인간(고 탄수화물 식이, 18 내지 50세, 비채식주의자 식이)의 마이크로바이옴 특징의 높은 출현율 유기체(박테리아)의 존재를 도시한 개략도.
도 3b는 인간(고 탄수화물 식이, 18 내지 50세, 비채식주의자 식이)의 마이크로바이옴 특징의 높은 출현율 유기체(바이러스 및 파지)의 존재를 도시한 개략도.
도 3c는 인간(고 탄수화물 식이, 18 내지 50세, 비채식주의자 식이)의 마이크로바이옴 특징의 높은 출현율 유기체(고세균)의 존재를 도시한 개략도.
도 3d는 인간(고 탄수화물 식이, 18 내지 50세, 비채식주의자 식이)의 마이크로바이옴 특징의 높은 출현율 유기체(진균 및 다른 진핵생물)의 존재를 도시한 개략도.
도 4a는 인간(고 유제품 단백질 식이, 0 내지 2세, 채식주의자 비간호)의 마이크로바이옴 특징의 높은 출현율 유기체(박테리아)의 존재를 도시한 개략도.
도 4b는 인간(고 유제품 단백질 식이, 0 내지 2세, 채식주의자 비간호)의 마이크로바이옴 특징의 높은 출현율 유기체(바이러스 및 파지)의 존재를 도시한 개략도.
도 4c는 인간(고 유제품 단백질 식이, 0 내지 2세, 채식주의자 비간호)의 마이크로바이옴 특징의 높은 출현율 유기체(고세균)의 존재를 도시한 개략도.
도 4d는 인간(고 유제품 단백질 식이, 0 내지 2세, 채식주의자 비간호)의 마이크로바이옴 특징의 높은 출현율 유기체(진균 및 다른 진핵생물)의 존재를 도시한 개략도.
도 5는 인간의 마이크로바이옴 특징의 기회감염성 병원균의 식별 및 더 낮은 우세 유기체의 존재를 도시한 개략도.
도 6은 인간의 마이크로바이옴 특징에서 검출된 전형적인 프로바이오틱스를 도시한 개략도.
도 7은 인간의 마이크로바이옴 특징에서 검출된 전형적인 프로바이오틱스를 도시한 개략도.
도 8은 정상 집단에 대한 데이터베이스 평균에 대한 개인의 상대적인 풍부도의 비교를 나타낸 도식적인 그래프 플랫.
도 9는 식이 보충제 혼합된 배양물로부터의 본 발명의 방법을 통해서 식별된 유기체를 언급한 표.
도 10은 본 발명의 데이터베이스에 저장된 다양한 미생물의 고유한 종의 분류를 언급한 표.
도 11은 본 발명의 일 실시형태에서 개체로부터의 예시적인 인구통계학 정보를 예시한 도면.
도 12는 본 발명의 일 실시형태에서 해산물과 관련하여 검출된 예시적인 유기체를 예시한 도면.
도 13은 본 발명의 일 실시형태에서 포유류 육류와 관련하여 검출된 예시적인 유기체를 예시한 도면.
도 14는 본 발명의 일 실시형태에서 곡물과 관련하여 검출된 예시적인 유기체를 예시한 도면.

본 발명은 샘플에서 1종 이상의 유형의 미생물의 다양한 집단으로부터 핵산을 추출하는 범용 방법을 제공한다. 미생물의 유형은 그램-양성 박테리아, 그램-양성 박테리아 포자, 그램-음성 박테리아, 고세균, 원생동물, 장내 기생충(Helminths), 해조류, 진균, 진균 포자, 바이러스, 바이로이드, 박테리오파지 및 원충류(rotifer)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 다양한 집단은 동일한 유형, 예컨대, 그램-양성 박테리아의 복수의 상이한 미생물이다. 일부 실시형태에서, 다양한 집단은 미생물, 예컨대, 박테리아(그램-양성 박테리아, 그램-양성 박테리아 포자 및/또는 그램-음성), 진균, 바이러스 및 박테리오파지의 복수의 상이한 유형이다.

상이한 유형의 미생물은 상이한 조성 및 그들 자신의 유전 물질을 보호하기 위한 기전을 갖기 때문에, 동일한 생물학적 샘플에서 또 다른 유형의 미생물의 유전 물질을 또한 추출하는 능력을 손상시키지 않으면서 하나의 유형의 미생물로부터 유전 물질을 추출하는 것은 종종 어렵다. 그러나, 본 발명은 동일한 샘플에서 또 다른 유형의 미생물의 유전 물질을 추출함으로써, 하나의 유형의 미생물로부터 얻어질 수 있는 유전 물질의 양을 희생시키지 않으면서 샘플에서 상이한 유형의 미생물로부터 유전 물질을 추출하는 것을 가능하게 한다. 본 발명에 따르면, 미생물을 포함하는 샘플은 생물학적 샘플, 환경 샘플, 인공적으로 생성된 샘플(예컨대, 실험실 시험 또는 대조군 샘플, 프로바이오틱 조성물 또는 보충제의 샘플 등) 등일 수 있다. 생물학적 샘플의 예는 조직 샘플, 혈액 샘플, 혈장 샘플, 뇌척수액 샘플, 소변 샘플, 대변 샘플, 소화관으로부터 얻어진 물질의 샘플, 생물학적 분비물(예컨대, 정액, 질 분비물, 모유, 눈물, 타액) 등을 포함한다. 고체 샘플은 액화될 수 있거나 용액과 혼합될 수 있고, 이어서, 액화된 샘플, 혼합물 또는 혼합물로부터 얻어진 용액 중에 존재하는 미생물의 유전 물질은 본 발명에 따라서 추출될 수 있다. 추출된 유전 물질은 추가의 처리 및 분석, 예컨대, 정제, 증폭 및 서열결정에 적용될 수 있다.

일부 실시형태에서, 추출된 유전 물질은, 예를 들어, 해당 유전 물질이 추출된 샘플에서 미생물의 1종 이상의 유형을 식별하기 위해서 메타게노믹스 분석에 적용된다. 추가적인 실시형태에서, 전체 완전 게놈 샷건 서열결정이 인간 대변 샘플로부터의 제조된 추출된 핵산 물질에 대해 수행될 수 있다. 제조는 유기 용매, 불순물, 염, 페놀을 제거하기 위한 핵산 세정 반응 및 오염물을 저해하는 다른 공정을 포함한다. 추가적인 제조는 각각의 샘플로부터의 핵산 라이브러리 프렙(library prep)을 포함하는데, 여기서 gDNA는 변형 및/또는 증폭에 적용되어 서열결정 플랫폼 상에서의 서열결정, 예컨대, 합성에 의한 초병렬(massively parallel) 서열결정, 나노포어, 긴 판독 및/또는 CMOS 전자장치, 서열결정 방법을 위한 샘플을 프렙핑한다.

본 명세서에 개시된 바와 같이, 본 발명의 방법은 미생물을 3종의 상이한 조성물에 특정 순서로 적용함으로써 동일한 샘플 중에 존재하는 미생물의 1종 이상의 상이한 유형으로부터 유전 물질을 성공적으로 추출하는 것을 가능하게 한다. 본 발명에 따른 방법은 샘플 중에 존재하는 임의의 그램-음성 박테리아의 제1 용해를 포함하고, 이것 이후에 샘플 중에 존재하는 임의의 효모 및 박테리아의 다당류 성분을 소화시키고, 이어서 제2 단계 이후에 온전한 임의의 세포벽을 카오트로프제를 사용하여 파괴한다.

간략하면, 일 실시형태에서, 제1 단계는 샘플을, 세정제(예컨대, 도데실황산나트륨(SDS)) 및 킬레이터(예컨대, 에틸렌다이아민테트라아세트산(EDTA))를 포함하는 제1 용해 용액과 혼합하여 샘플 중에 존재하는 임의의 그램-음성 박테리아를 용해시키는 것을 포함한다. 제1 용해 용액은 1종 이상의 완충제(예컨대, Tris), 1종 이상의 순한 세정제(예컨대, Triton™ X-100), 및/또는 1종 이상의 프로테아제(예컨대, 프로테이나제 K)를 추가로 포함할 수 있다.

제1 단계 후에, 샘플을 라이소자임을 포함하는 제2 용해 용액과 혼합하여 혼합물 중에 존재하는 임의의 효모 및 박테리아 세포벽의 다당류 성분을 소화시킨다. 라이소자임은 제1 용해 용액의 활성도를 저해할 수 있기 때문에, 샘플과 제2 용해 용액의 접촉은 샘플을 제1 용해 용액으로 처리한 후에 일어나는 것이 중요하다.

제2 용해 용액으로의 처리 후, 카오트로프제(예컨대, 유레아, 아세트산리튬, 구아니딘 염산 등)를 포함하는 제3 용해 용액을 혼합물에 첨가하여 제2 용해 용액에 의해서 소화되지 않은 임의의 세포벽을 파괴한다. 제3 용해 용액은 세정제, 예컨대, SDS를 포함할 수 있다.

일부 실시형태에서, 제1 용해 용액과 제3 용해 용액은 둘 다 SDS를 1-10% w/v의 작업 농도로 포함한다. 일부 실시형태에서, 제3 용해 용액으로 처리 후, 혼합물은 카오트로프제(예컨대, 유레아, 아세트산리튬, 구아니딘 염산 등) 및 프로테이나제 K를 포함하는 제4 용해 용액으로 더 처리된다. 제3 용해 용액의 카오트로프제가 아세트산리튬인 일부 실시형태에서, 혼합물은 이어서 열 충격 처리에 적용되고, 이어서 제4 용해 용액으로 처리될 수 있다.

소정의 양상에서, 이하의 개시내용은, 육류, 식물, 과일, 채소 및/또는 이들 유기체와 함께 함유된 미생물의 데이터베이스로부터 식품 DNA 서열에 기초한 식품 소비의 결정 및 DNA 추출을 위하여 대변 샘플을 사용하는 범용 방법을 기술한다. 본 명세서에서는, 샘플에서 1종 이상의 세포 또는 세포 성분의 다양한 집단으로부터 유전 물질을 추출하고 건강의 개선 및 질환의 예방을 위하여 소비된 식품 및 영양분 성분을 결정하는 방법이 개시되어 있다.

일부 실시형태에서, 생물학적 분비물(예컨대, 정액, 질 분비물, 모유, 눈물, 타액, 혈액, 소변 등)은 소화관 등으로부터 얻어진다. 고형 샘플은 용액과 액화 또는 혼합될 수 있고, 이어서 액화된 샘플, 혼합물 또는 혼합물로부터 얻어진 용액 중의 식물 기반(묘목(seedlings), 잎, 떡잎, 종자, 배젖, 조직 배양 캘러스(tissue culture callus), 뿌리 등), 동물 기반, 진균 기반 또는 원생생물 기반 식품과 같은 유전 물질을 함유하는 임의의 식품 품목의 유전 물질은 본 발명, 또는 당업계에 공지된 기타 표준 핵산 추출 프로토콜에 따라서 추출될 수 있다. 일부 실시형태에서, 추출된 유전 물질은 정제, 증폭 및 서열결정과 같은 추가의 처리 및 분석에 적용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 추출된 유전 물질은, 예를 들어, 유전 물질이 추출되는 샘플에서 1종 이상의 유기체를 식별하기 위하여 메타게노믹스 분석에 적용된다.

일부 실시형태에서, 메타게놈 분석이 이용할 데이터베이스는, 적절한 계통발생론 내에, 인간 또는 기타 동물에 의해 섭취된 유기체 및 유기체의 성분의 상대적인 풍부도로 핵산을 식별하고 분류학적으로 배정할 특정 목적을 위하여 맞춤화되었다. 일부 실시형태에서 추가의 데이터 테이블 또는 데이터베이스가 유기체의 소화관 샘플의 다량 영양소 함량을 이의 식이의 묘사로서 결정하기 위하여 유기체의 상대적인 풍부도의 룩업으로서 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 이 다량 영양소 성분은 지방, 탄수화물, 단백질, 비타민 미네랄, 및 임의의 다량 영양소의 하위성분을 포함할 수 있다.

본 명세서에서 개시된 바와 같이, 본 발명의 방법은, 샘플을 단리, 정제, 또는 핵산을 포획하기 위한 기타 방법에 적용시킴으로써 도일 샘플에 존재하는 1종 이상의 상이한 유기체, 1종 이상의 유기체의 세포, 또는 세포 기질 또는 세포소기관(organelle)으로부터 유전 물질의 성공적인 추출을 허용한다. 본 발명에 따른 방법은, 임의의 세포벽 및 세포막을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 샘플에서 임의의 식품 세포를 용해 또는 파괴하는 단계, 샘플에 존재하는 임의의 진균, 식물, 포유류 또는 원생생물의 임의의 세포벽 또는 막의 다당류 또는 리그닌 성분을 소화하는 단계, 및 카오트로프제에 의해 소화 후에 온전한 임의의 세포벽을 파괴시키는 단계를 포함한다.

본 발명은 세포벽을 파쇄하여 화학적 용해 전에 유해한 세포 효소를 비활성 상태로 유지하도록 직접적인 기계적 파괴 또는 분쇄 및 액체 질소 순간 냉동(flash freezing)에 의해 식품 세포의 세포벽 또는 막을 물리적으로 파괴하는 단계를 포함한다. 본 발명은 샘플을 세정제(예컨대, 도데실황산나트륨(SDS)) 및 킬레이터(예컨대, 에틸렌다이아민테트라아세트산(EDTA))를 포함하는 제1 용해 용액과 혼합하여 샘플 중에 존재하는 임의의 동물 세포를 용해시키는 단계를 포함한다. 제1 용해 용액은 1종 이상의 완충제(예컨대, Tris), 1종 이상의 순한 세정제(예컨대, Triton™ X-100, 세틸트라이메틸암모늄 브로마이드) 및/또는 1종 이상의 프로테아제(예컨대, 프로테이나제 K)를 더 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, 제1 용해 용액은 SDS를 작업 농도 1-10% w/v로 포함한다. 본 발명은 샘플을 카오트로프제(예컨대, 유레아, 아세트산리튬, 구아니딘 염산 등)를 포함하는 제2 용해 용액과 혼합하는 것을 포함하는 단계를 포함한다. 제2 용해 용액은 세정제, 예컨대, SDS를 포함할 수 있다. 특정 예시적인 실시형태에서, 제1 및 제2 용해 용액은 임의의 특정 순서로 첨가될 수 있다.

일부 실시형태에서, 본 발명은 샘플을 라이소자임을 포함하는 제3 용해 용액과 혼합하여 해당 혼합물에 존재하는 임의의 진균 또는 박테리아 세포벽의 다당류 성분을 소화시키는 것을 포함하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 혼합물은 카오트로프제(예컨대, 유레아, 아세트산리튬, 구아니딘 염산 등) 및 프로테이나제 K를 포함하는 제4 용해 용액으로 더 처리될 수 있다. 제4 용해 용액의 카오트로프제가 아세트산리튬인 일부 실시형태에서, 혼합물은 이어서 열 충격 처리에 적용될 수 있고, 이어서 제4 용해 용액으로 처리될 수 있다. 특정 예시적인 실시형태에서, 제3 및/또는 제4 용액은 임의의 지점에서 혼합물에 첨가되어 임의의 이전의 용해 용액에 의해 소화되지 않은 임의의 세포벽을 파괴할 수 있다.

일부 실시형태에서, 샘플이 박테리아 및/또는 진균 포자를 갖거나 이를 갖는 것으로 의심되면, 샘플을 제1 용해 용액과 접촉시키기 전에 포자의 세포벽의 발아를 유도하는 전처리 단계에 적용할 수 있다. 전처리 단계는 샘플을 화학물질, 예컨대, 순한 세정제, 예컨대, Tween-80과 혼합하여, 발아를 유도하거나 발아를 유도하는 조건(예컨대, 온도) 하에서 샘플을 성장시키는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 발아가 화학물질로 유도되는 경우, 화학물질은 바람직하게는 제1, 제2 및 제3 용해 용액의 활성도 또는 효과를 저해, 감소 또는 변경시키지 않는 것이다.

일부 실시형태에서, 본 발명에 따른 방법은 초음파처리, 비드 혼합, 비드 밀 균질화, 가압, 미세유동화 등을 비롯한 기계적 방법에 의해서 물리적 용해를 유발하는 하나 이상의 기계적 처리 단계를 더 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 기계적 처리 단계는 샘플을 제1 용해 용액에 적용하기 전에 수행된다.

실시형태에서, 본 발명에 따른 방법은 효모(즉, 사카로마이세스 종(Saccharomyces spp.)), 그램-음성 박테리아(예컨대, 아시네토박터 종(Acinetobacter spp.)), 그램-양성 박테리아(예컨대, 비피도박테륨 종(Bifidobacterium spp.), 바이러스(예컨대, 스클레로티니아 종(Sclerotinia spp.)), 포자(바실루스 종(Bacillus spp.)), 장내 기생충(촌충 에키노코쿠스 종(tapeworm Echinococcus spp.)), 원생동물(육질충류(Sarcodina) - 아메바, 예를 들어, 엔트아메바(Entamoeba)) 및 파지(예컨대, 락토바실루스 파지)를 비롯한 다양한 미생물로부터 핵산 분자를 추출할 수 있다.

실시형태에서, 본 발명에 따른 방법은 진균(즉, 사카로마이세스 종), 동물 세포(유럽 가축우(Bos taurus)), 식물(예컨대, 호르데움 불가래(Hordeum vulgare))을 비롯한 다양한 유기체로부터 핵산 분자를 추출할 수 있다.

하기 실시예는 본 발명을 제한하는 것이 아니라 예시하도록 의도된다.

추출 방법 A

다양한 10㎎ 내지 5000㎎의 샘플을 멸균 2 밀리리터(㎖)의 마이크로 원심분리관에 첨가하였다. 400 마이크로리터(㎕)의 비드 순수한 혼합물을 첨가하고, 약 30초 동안 8000rpm에서 보텍싱함으로써 비드 비팅(bead beating)을 임의로 수행할 수 있다. 그러나, 고분자량 핵산, 예컨대, 게놈 DNA가 얻어지도록 하는 것이 바람직한 경우, 비드 비팅은 바람직하게는 회피된다.

제1 용해 용액 처리 단계

샘플 중의 임의의 그램-음성 박테리아를 용해시키기 위하여, 약 400㎕의 소화 완충제(1% w/v의 SDS, 25mM의 Tris HCl, 2.5mM의 EDTA, 1%의 Triton™ X-100, pH 8) 및 약 20㎕의 프로테이나제 K를 샘플에 첨가함으로써 샘플을 제1 용해 용액에 적용하고, 온화하게 혼합하였다. 이어서, 혼합물을 약 30분 동안 55℃에서 인큐베이션시켰다.

제2 용해 용액 처리 단계

샘플 중의 임의의 그램-양성 박테리아를 용해시키기 위하여, 글루코시드 하이드롤라제("라이소자임")를 포함하는 제2 용해 용액을 제1 용해 용액 처리 단계로부터 얻어진 혼합물에 첨가하여 1㎎/㎖의 최종 라이소자임 농도 및 약 8.0의 pH를 제공하였다. 적합한 글루코시드 하이드롤라제는 다양한 동물의 난백, 눈물, 점액 또는 타액을 비롯한 다양한 공급원으로부터 얻어질 수 있다. 이어서 혼합물을 약 1 내지 24시간의 기간 동안 37℃에서 인큐베이션시켰다.

제3 용해 용액 처리 단계

샘플 중에 존재하는 임의의 진균 및/또는 효모 세포를 용해시키기 위하여, 멸균 증류 H2O 및 5% w/v SDS 중의 1M 아세트산리튬을 포함하는 제3 용해 용액을 첨가하여 제2 용해 용액 처리 단계로부터 얻어진 혼합물의 약 1:5 희석물을 얻었다. 처리된 혼합물을 15분 동안 70℃에서 인큐베이션시키고 나서, 95℃에서 1분 동안 열 충격 처리하고, 이어서 22℃ 수욕 중에 넣음으로써 실온으로 만들었다.

제2 및 제3 용해 용액 처리 단계는 박테리오파지 및 바이러스의 외피를 용해시키기에 충분하기 때문에, 샘플 중에 존재할 수 있는 박테리오파지 및 바이러스로부터 유전 물질을 추출하기 위하여 추가적인 단계는 필요하지 않다.

추출 방법 B

예비-용해 처리 단계

100 내지 200㎎의 샘플을 멸균 2 밀리리터(㎖)의 마이크로 원심분리관에 첨가하였다. 500㎖의 액체 질소를 첨가하고, 30초 동안 샘플을 냉동시킨다. 이어서, 펠릿 페스틀(pellet pestle) 또는 톱니 생성기 프로브를 이용해서, 다음 단계로 계속 진행하기 전에 샘플을 철저하게 분쇄하였다.

제1 용해 용액 처리 단계

샘플 중의 임의의 동물, 진균 및 원생생물 식품 세포막을 용해시키기 위하여, 약 400㎕의 소화 완충제(1% w/v의 SDS, 25mM의 Tris HCl, 2.5mM의 EDTA, 1%의 Triton™ X-100, 1.2M NaCl pH 8) 및 약 20㎕의 프로테이나제 K를 샘플에 첨가함으로써 샘플을 제1 용해 용액에 적용하고, 온화하게 혼합하였다. 이어서, 혼합물을 약 30분 동안 55℃에서 인큐베이션시켰다.

제2 용해 용액 처리 단계

샘플 중에 존재하는 임의의 진균 및/또는 효모 세포를 용해시키기 위하여, 멸균 증류 H2O 및 5% w/v SDS 중의 1M 아세트산리튬을 포함하는 제2 용해 용액을 첨가하여 제1 용해 용액 처리 단계로부터 얻어진 혼합물의 약 1:5 희석물을 얻었다. 처리된 혼합물을 15분 동안 70℃에서 인큐베이션시키고 나서, 95℃에서 1분 동안 열 충격 처리하고, 이어서 22℃ 수욕 중에 넣음으로써 실온으로 만들었다.

핵산 정제

이어서, 용해된 미생물로부터 추출된 유전 물질, 즉, 제1, 제2 및 제3 용해 용액 처리 단계에 적용된 후 혼합물 중에 존재하는 핵산 분자를, 혼합물을 2개의 마이크로원심분리관에 나눔으로써 DNA 및 RNA 정제로 정제하였다. 약 20㎕의 RNAse A를 첨가하고, 5분 동안 실온에서 인큐베이션시킴으로써 DNA를 하나의 관으로부터 추출하였다. 혼합물을 바이오폴리머 조직 균질화기 칼럼(biopolymer tissue homogenizer column)을 통해 유동시켰다. 비드 비팅이 이전에 수행되었다면, 조직 균질화기 칼럼에 혼합물을 적용하는 것은 바람직하게는 회피된다.

이어서, 용출액을 1000g에서 5분 동안 원심분리하였다. 상청액을 약 400㎕의 DNA 용해 용액(구아니딘 HCl, Tris-EDTA 및 70% EtOH) 및 약 20㎕의 프로테이나제 K로 처리하고, 혼합하고, 이어서 55℃에서 10분 동안 인큐베이션시켰다. 이어서, -22℃에서 EtOH를 첨가하고, 뒤집어서 혼합물을 혼합하였다. 혼합물을 관련 기술 분야에 공지된 하나 이상의 추가적인 DNA 추출 및 정제 방법에 적용하였다.

혼합물을 바이오플리머 조직 균질화기 칼럼을 통해서 유동시킴으로써 RNA를 제2 마이크로원심분리관으로부터 추출하였다. 재차, 비드 비팅이 이전에 수행되었다면, 조직 균질화기 칼럼에 혼합물을 적용하는 것은 바람직하게는 회피된다. 이어서, 용출액을 1000g에서 5분 동안 원심분리하였다. 상청액을 25mM의 MgCl2의 용액 중의 약 40㎕의 DNase I(1U)로 처리하고, 이어서 37℃에서 약 15분 동안 인큐베이션시켰다. 이어서, 혼합물을 산 구아니디늄 티오사이아네이트-페놀-클로로폼 추출에 적용하였다. 혼합물은 관련 기술 분야에 공지된 하나 이상의 추가적인 RNA 추출 및 정제 방법에 적용될 수 있다.

일 실시형태에서, 용해된 미생물로부터 추출된 유전 물질, 즉, 제1, 제2 및 예비 용해 처리 단계에 적용된 후 혼합물 중에 존재하는 핵산 분자를, 혼합물을 2개의 마이크로원심분리관에 나눔으로써 DNA 및 RNA 정제로 정제하였다. 약 20㎕의 RNAse A를 첨가하고 5분 동안 실온에서 인큐베이션함으로써 DNA를 하나의 관에 추출하였다.

제2 마이크로원심분리관으로부터 RNA를 추출하였다. 이어서, 용출액을 1000g에서 5분 동안 원심분리하였다. 상청액을 25mM MgCl2의 용액 중 약 40㎕의 DNase I(1U)로 처리하고, 이어서 37℃에서 약 15분 동안 인큐베이션시켰다. 이어서, 혼합물을 산 구아니디늄 티오사이아네이트-페놀-클로로폼 추출에 적용하였다. 혼합물은 관련 기술 분야에 공지된 하나 이상의 추가적인 RNA 추출 및 정제 방법에 적용될 수 있다.

일부 실시형태에서, RNA 분자의 정량적 발현이 바람직한 경우, RNA 핵산 분자의 방출 및 제한된 분해를 보장하기 위해서 RNA 안정화 완충제 및 비드 비팅의 사용이 바람직하다.

고분자량 핵산 분자의 추출이 바람직한 일부 실시형태에서, 비드 비팅 및 조직 균질화 칼럼이 회피되고, 실리카 칼럼 기반 추출 대신에 페놀-클로로폼-알코올 추출이 수행된다. 일부 실시형태에서 자석 비드 기반 핵산 정제가 수행될 수 있다. 핵산의 선택적 분자량을 제거하고 샘플을 정제하기 위하여, 에어로졸 겔 기반 정제 및 풍부화가 수행될 수 있다.

메타게노믹스 분석

일 실시형태에서, 추출되고 정제된 유전 물질은 Illumina 인덱스 어댑터(index adaptor)를 이용해서 서열결정을 위하여 준비하고, 크기조절 및 양을 위하여 점검하였다. 50ng 미만의 DNA의 임의의 투입량의 경우 저 사이클 PCR을 1 내지 20회 사이클에서 수행하였고, 다르게는 50ng 이상의 핵산의 경우 라이브러리 프렙의 PCR-Free 방법을 사용할 수 있다. Qiagen Gel Purification Kit™(Qiagen사, 미국 메릴랜드주 프레드릭 소재)를 사용하여 겔 정제를 수행하였다. 깨끗한 PCR 산물을 Qubit™ 2.0 플루오로메터(Fluorometer)(Life Technologies사, 미국 캘리포니아주 칼스배드 소재)를 사용하여 정량하였다. 샘플을 등몰량으로 합쳤다. 라이브러리 풀(library pool)은 Fragment Analyzer™ CE(Advanced Analytical Technologies Inc., 아이오와주 아메스 소재)를 사용하여 검증되고, Qubit™ High Sensitivity dsDNA 키트(Life Technologies사, 미국 캘리포니아주 칼스배드 소재)를 사용하여 정량된 크기였다. PhiX™ V3 라이브러리 대조군(Illumina사, 캘리포니아주 샌디에이고 소재)의 희석, 1% 내지 10% 스파이크 후, 풀을 5분 동안 동일 부피의 0.1N NaOH로 변성시키고, 이어서 Illumina의 HT1 완충제로 추가로 희석시켰다. 변성되고 PhiX™-스파이킹된 풀을 Illumina 서열결정 프라이머를 사용하는 Illumina Next Generation™ 서열결정기(Sequencer) 상에 적재하고 50 내지 550개 염기, 양단부(paired-end) 또는 단일 판독물(single read)에 대해서 설정하였다.

짧은 삽입 방법을 위해서 1000개 이상의 범위의 서열결정 판독물을 이러한 방법을 위해서 사용할 수 있다. 큰 삽입 방법, 예컨대, Pac Bio™, Nanopore™, 또는 다른 차세대 서열결정 방법은 1000개 미만의 서열결정 판독물을 사용할 수 있다. 바이오인포매틱스 품질 필터링을 분류학 배정 전에 수행하였다. 원시(raw) 서열결정 파일의 품질 트리밍(trimming)은 서열결정 어댑터 또는 인덱스의 제거; 품질 점수(Q20>), 단부의 염기쌍 또는 신호 강도를 기반으로 하는 3' 또는 5' 단부의 트리밍; 품질 점수, GC 내용물 또는 비정렬 염기쌍을 기반으로 하는 판독물의 제거; 설정된 수의 염기쌍에서의 중첩 판독물의 제거를 포함할 수 있다. 처리된 서열결정 파일의 정렬을 refseq™, Greengeens™, HMP™, NCBI™, PATRIC™ 또는 다른 공공/개인 소유의 데이터 레퍼토리로부터의 서열로 이루어진 시판 미생물 게놈 데이터베이스 또는 인-하우스 데이터 세트를 사용하여 행하였다. 이러한 데이터베이스는 전체 게놈 정렬 스캐폴드, k-량체 단편 정렬 또는 메타게노믹스 및 바이오인포매틱스 분야에서 실시되는 다른 방법으로서 사용될 수 있다. 데이터베이스 게놈을 매칭시키는 서열결정 판독물/단편의 수를 기반으로 하지 않고, 본 발명자들은 유기체에 일반적인 또는 고유한 분류학 아이덴티티를 배정하였다. 이러한 식별인자는 바코드, 뉴클레오타이드 서열 또는 매칭된 서열결정 판독물을 분류학 군 내의 유기체 또는 균주에 회합시킬 일부 다른 컴퓨터 조작 태그(computational tag)일 수 있다. 일부 식별인자는 더 높은 차수의 것일 것이고, 유기체의 도메인, 계, 문, 강, 목, 과 또는 속을 식별할 것이다.

본 발명은 종 내의 균주의 가장 낮은 차수의 유기체를 식별할 수 있다.

실시형태에서, 본 발명은 본 발명자들의 데이터베이스 내에 함유된 1종 이상의 박테리아의 식별 및/또는 분석을 포함한다(도 10). 일부 선택된 예는 바실루스 클라우시이(Bacillus clausii), 비피도박테륨 아니말리스(Bifidobacterium animalis), 페디오코쿠스 에시디락티시(Pediococcus acidilactici), 아시네토박터 인디쿠스(Acinetobacter indicus), 락토바실루스 살리바리우스(Lactobacillus salivarius), 아시네토박터(Acinetobacter), 바실루스 아밀로리퀘파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens), 락토바실루스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus), 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 락토바실루스 플란타럼(Lactobacillus plantarum), 비피도박테륨 롱검 아종 인판티스(Bifidobacterium longum subsp infantis), 엔테로코쿠스 히래(Enterococcus hirae), 락토바실루스 델브루엑키 아종 불가리쿠스(Lactobacillus delbrueckii subsp bulgaricus), 엔테로코쿠스(Enterococcus), 락토바실루스 람노수스(Lactobacillus rhamnosus), 락토코쿠스 락티스(Lactococcus lactis), 슈도모나스 스투체리(Pseudomonas stutzeri), 락토바실루스 아시도필루스(Lactobacillus acidophilus), 클렙시엘라(Klebsiella) 및 엔테로박터 클로아캐(Enterobacter cloacae) 균주이다.

실시형태에서, 본 발명은 본 발명자들의 데이터베이스 내에 함유된 1종 이상의 효모의 식별 및/또는 분석을 포함한다(도 10). 일부 선택된 예는 사카로마이세스 종 불라디(Saccharomyces sp. Boulardii), 사카로마이세스 쿠드리아브제비(Saccharomyces kudriavzevii), 사카로마이세스 파스토리아누스(Saccharomyces pastorianus) 및 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)이다.

실시형태에서, 본 발명은 본 발명자들의 데이터베이스 내에 함유된 1종 이상의 파지 또는 바이러스의 식별 및/또는 분석을 포함한다(도 10). 일부 선택된 예는 바실루스 파지 phi29, 엔테로박테리아 파지 HK022, 락토바실루스 파지 A2, 에쉐리키아 파지 HK639, 파지 cdtI, 스클레로티니아 스클레로티오룸 파티티바이러스 S 세그먼트(Sclerotinia sclerotiorum partitivirus S segment) 2, 부르크홀데리아 파지 브셉무(Burkholderia phage BcepMu), 락토코쿠스 프로파지(Lactococcus prophage) bIL311, 엔테로코쿠스 파지 phiFL4A 및 스트렙토코쿠스 파지 SM1이다.

미래의 데이터베이스 개선이 이 방법에 의해서 검출될 수 있는 유기체를 증가 또는 개선시킬 것이다.

일 실시형태에서, 추출되고 정제된 유전 물질은 Illumina 인덱스 어댑터를 이용해서 서열결정을 위하여 준비하고, 크기조절 및 양을 위하여 점검하였다. 저 사이클 PCR 또는 표준 PCR-free 방법이 수행될 수 있다. Qiagen Gel Purification Kit™(Qiagen사, 미국 메릴랜드주 프레드릭 소재)를 사용하여 겔 정제를 수행하였다. 깨끗한 PCR 산물을 Qubit™ 2.0 플루오로메터(Life Technologies사, 미국 캘리포니아주 칼스배드 소재)를 사용하여 정량하였다. 샘플을 등몰량으로 합쳤다. 라이브러리 풀은 Fragment Analyzer™ CE(Advanced Analytical Technologies Inc., 아이오와주 아메스 소재)를 사용하여 검증되고, Qubit™ High Sensitivity dsDNA 키트(Life Technologies사, 미국 캘리포니아주 칼스배드 소재)를 사용하여 정량된 크기였다. PhiX™ V3 라이브러리 대조군(Illumina사, 캘리포니아주 샌디에이고 소재)의 희석, 10% 스파이크 후, 풀을 5분 동안 동일 부피의 0.1N NaOH로 변성시키고, 이어서 Illumina의 HT1 완충제로 추가로 희석시켰다. 변성되고 PhiX™-스파이킹된 풀을 Illumina 서열결정 프라이머를 사용하는 Illumina Next Generation™ 서열결정기 상에 적재하고 150개 염기, 양단부 판독물에 대해서 설정하였다. 바이오인포매틱스 품질 필터링은 분류학 배정 전에 수행되었다.

표 1을 사용하여, 본 발명자들은 개체가 하기를 소비한 것을 결정하고 있다:

다량 영양소 섭취 및 식이 지침의 모니터링

일부 실시형태에서, 본 발명은 대상체에서의 식품 섭취 영양분, 양 및 품질을 모니터링하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 프로바이오틱에 의한 치료 전에, 대상체의 소화관으로부터 얻어진 샘플이 얻어질 수 있고, 그 안의 식품 유기체의 유전 물질이 본 명세서에 개시된 바와 같이 추출되어 메타게노믹스 분석에 적용될 수 있다. 완전, 부분 또는 불완전 참조 게놈, RNA, 또는 핵산 성분 또는 단편으로 구성된 맞춤화된 식품 특이적 데이터베이스는 서열결정으로부터의 핵산 정보를 식별하고, 정량하고 분류학적으로 배정하기 위하여 바이오인포매틱스 툴에 의해 활용될 것이다. 그 결과는 이하의 표 2에 예시되고 소화관에 있던 유기체의 종 또는 유기체의 세포의 식별을 포함한다.

이어서, 주어진 프로바이오틱에 의한 처리 동안 그리고/또는 후에, 제2 샘플은 대상체의 소화관으로부터 얻어질 수 있고, 제2 샘플에서 미생물의 유전 물질이 추출되어 메타게노믹스 분석에 적용되고, 그 결과는 제1 샘플의 메타게노믹스 분석의 결과와 비교된다. 이어서, 비교 결과에 기초하여, 식품 유기체 결과는 식품과 관련된 미생물 및 전체 식품 품질 평가를 이해하기 위하여 마이크로바이옴 유기체 결과와 비교될 수 있다. 일부 실시형태에서, 이것은 개체가 이의 식품 공급원으로 통해서 섭취하는 유기체의 종, 및 선택 또는 직접 변형에 의해 종에 대한 임의의 유전자 변형, 돌연변이 또는 불규칙성에 대한 정보를 제공할 수 있다.

일부 실시형태에서, 마이크로바이옴 분석의 제2 샘플은 식품 유기체에 공통인 미생물의 검출을 가능하게 할 것이고, 식품 유기체의 건강에 대한 정보를 제공할 것이다. 일부 실시형태에서, 인간에 의해 소비된 식품은 닭, 소, 돼지 또는 심지어 식물, 및 종들이 식별되고 이들에 특이적인 미생물에 정합될 것인 원생생물과 같은 통상의 식품의 일부일 수 있다. 특정 예시적인 실시형태에서, 닭 육종 바이러스를 가질 수 있는 닭 종은 분석된 두 번째 소화관 마이크로바이옴 샘플에서 검출될 수 있다. 일부 실시형태에서, 섭취된 식품 유기체의 건강은 숙주 유기체의 건강에 부정적으로 영향을 미치는 미생물의 존재 유무에 의해 결정될 수 있다. 특정 예시적인 실시형태에서, 숙주 유기체의 건강에 영향을 미칠 수 있는 질환, 예컨대, 말의 호흡기 질환인 말 헤르페스바이러스가 검출될 수 있다.

일부 실시형태에서, 본 발명은 주어진 대상체의 소화관 마이크로바이옴을 스크리닝하고, 이어서 영양학적 균형, 개선된 미생물 소화관 프로파일 및 영양분의 흡수의 관점에 대해서 대상체의 건강 품질을 개선시킬 수 있는 식품 또는 식이 요법을 주문 제작하는데 사용될 수 있다.

프로바이오틱 치료의 모니터링

일부 실시형태에서, 본 발명을 사용하여 대상체에서 프로바이오틱 치료를 모니터링할 수 있다. 예를 들어, 프로바이오틱으로의 치료 이전에, 대상체의 소화관으로부터 얻어진 샘플을 얻고, 그 중의 미생물의 유전물질을 본 명세서에 개시된 바와 같이 추출하고, 메타게노믹스 분석에 적용할 수 있다. 이어서 주어진 프로바이오틱으로의 치료 동안 및/또는 치료 후에, 제2 샘플을 대상체의 소화관으로부터 얻고, 제2 샘플 중의 미생물의 유전 물질을 본 명세서에 개시된 바와 같이 추출하고, 메타게노믹스 분석에 적용할 수 있고, 그 결과를 제1 샘플의 메타게노믹스 분석의 결과와 비교한다. 이어서, 비교 결과에 기초하여, 대상체의 프로바이오틱 치료를 변형시켜 대상체의 소화관에서 미생물의 목적하는 집단을 얻을 수 있다. 예를 들어, 대상체의 소화관에서 양이 증가되는 것이 바람직한 미생물을 포함하는 프로바이오틱을 대상체에게 투여할 수 있다.

일부 실시형태에서, 미생물 대변 군집의 대사체의 결정을 위해서 대변 샘플을 혼합하거나 또는 배양할 수 있다. 이어서, 대사체 프로파일을 사용하여 개체에 이익이 될 프로바이오틱 균주를 결정할 수 있다. 대사체 프로파일의 예는 에너지 대사, 영양분 이용, 인슐린 내성, 비만, 이상지질혈증, 염증, 단쇄 지방산, 유기산, 사이토카인, 신경전달물질 화학물질 또는 표현형에 영향을 미치는 것을 포함하고, 다른 대사체 마커를 포함할 수 있다.

마이크로바이옴 스크리닝 및 프로바이오틱 선택

본 발명은 다양한 상업적으로 입수 가능한 프로바이오틱스의 미생물 함량을 결정하는 데 성공적으로 사용되었다. 추가로, 본 발명의 방법은 대상체의 소화관에서 다양한 프로바이오틱스의 미생물 함량 및 마이크로바이옴 함량을 결정하는 데 사용된다. 일 실시형태에서, 대상체의 소화관에서의 마이크로바이옴 함량 및 이에 대한 임의의 목적하는 변화를 기초로, 대상체의 마이크로바이옴 건강에서 증가 및/또는 유지되는 것이 바람직한 미생물을 함유하는 1종 이상의 프로바이오틱스를 선택할 수 있다. 일 실시형태에서, 대상체의 소화관에서의 마이크로바이옴 함량 및 이에 대한 임의의 목적하는 변화를 기초로, 직접 개체로부터의 설문조사 정보에 의해 또는 소화관 유기체 핵산 분석의 본 발명에 의해 기록된 바와 같은 식품 공급원으로부터 얻어지는 다량 영양소 함량과 관련하여 대상체의 소화관의 균형에서 증가 및/또는 유지되는 것이 바람직한 미생물을 함유하는 1종 이상의 프로바이오틱스를 선택할 수 있다.

마이크로바이옴이 이의 미생물총(microbiota)의 전체 그림을 나타내는 경우, 유기체는 박테리아, 진균, 바이러스, 파지 및 기생충으로부터 그들 내에 함유된다. 예를 들어, 본 명세서에 기술된 방법을 사용하여, 대상체의 소화관 마이크로바이옴은 25%의 A 및 75%의 B를 함유하는 것으로 결정되고, 프로바이오틱 1은 75%의 A 및 25%의 B를 함유하는 것으로 결정되고, 프로바이오틱 2는 25%의 A 및 75%의 B를 함유하는 것으로 결정된다. 대상체의 소화관 마이크로바이옴이 유지되는 것이 바람직한 경우, 대상체에게 투여하기 위해서 프로바이오틱 2를 선택하는 것이 바람직할 것이다. 그러나, 대상체의 소화관에서 A 및 B의 양이 50/50인 것이 바람직하면, 대상체에게 투여하기 위해서 프로바이오틱스 1 및 2를 둘 다 선택할 수 있다. 대안적으로, 대상체의 소화관에서 A 및 B의 양이 50/50에 도달할 때까지 대상체에게 투여하기 위해서 프로바이오틱 1을 선택할 수 있다. 일부 실시형태에서, 대상체에게 투여하기 위해서, 예컨대, 동일한, 가변적인 또는 다양한 양의 A 및 B 또는 다른 프로바이오틱 균주를 함유하는 프로바이오틱 제형을 주문에 따라 변경할 수 있다. 개체의 소화관에 존재하는 미생물의 상대적인 풍부도를 사용하는 계산 모델은 프로바이오틱에 포함시키기 위해서 미생물의 유형, 용량 및 칵테일을 결정하는 것을 도울 것이다. 예를 들어, 유기체 A가 일반 집단 또는 이전 마이크로바이옴 분석에 비해서 감소되거나 부재하는 것으로 결정되면, 본 발명자들은 유기체 A의 농도를 증가시킬 프로바이오틱 또는 프리바이오틱(prebiotic)을 제공할 것이다. 이러한 프리바이오틱 또는 프로바이오틱은 추출물 유기체 A 또는 유기체 A의 성장을 지지할 또 다른 유기체일 수 있다. 주어진 용량은 개체에서 유기체의 상대적인 풍부도, 프리바이오틱/프로바이오틱의 성능 특징, 예컨대, 성장률, 상용성, 수용체 또는 수용체 밀도, 유전자 또는 발현 패턴 또는 대사체 산물을 고려한다.

주문에 따라 변경된 프로바이오틱스는 동일한 양으로 존재하지 않을 수 있지만, 개체의 소화관/대변 샘플으로부터 검출된 상대적인 풍부도를 기초로 제형화된다. 이러한 제형은 마이크로바이옴을 건강한 상태로 조정하도록 맞춰진다. 마이크로바이옴의 건강한 상태는 기존의 집합체 개인 및 공공 데이터베이스, 예컨대, metaHIT™, Human Microbiome Project™, American Gut Project™ 등의 사용에 의해서 결정된다. 건강한 상태는, 또한 인간이 알려진 문제를 갖지 않고, 양호한 건강 상태로 존재하는 경우, 개별적으로 혈액 바이오마커 확인 관점으로부터 결정될 수 있고, 이어서 이의 전체 마이크로바이옴 프로파일이 완결된다. 하나 또는 몇몇의 마이크로바이옴 특징이 완결된 후, 이어서 발견된 미생물 중 일부/전부의 평균이 그 개체에 대해서 이해될 수 있고, 그 평균으로부터의 변화를 이용하여 이들이 군집붕괴 상태로 존재하는지의 여부를 결정할 수 있다. 마이크로바이옴 프로파일은 군으로 집합되며, 이어서 신속한 바이오인포매틱 배정을 위해서 바코드를 배정한다. 군은 샘플이 수집된 개체에 관련된 단일 또는 다중 표현형, 진단, 또는 인구학 정보에 의해서 생성될 수 있다. 고유한 군은 통계학적 모델, 예컨대, 선형 거리 계산, 다중도 값, 분류인자, 예컨대, C4.5 결정 트리, 또는 주성분 분석을 사용하고, 집합체 공지된 집단, 예컨대, Human Microbiome Project 또는 American Gut Projec에 의해서 정의된 "정상"과 비교함으로써 또 다른 군으로부터 결정될 수 있다.

따라서, 일부 실시형태에서, 본 발명은 주어진 대상체의 소화관 마이크로바이옴을 스크리닝하고, 이어서 대상체의 소화관 마이크로바이옴을 기초로 주어진 대상체에 대한 프로바이오틱 요법을 주문에 따라 변경하는 데 사용될 수 있다.

군집붕괴의 치료

일부 실시형태에서, 본 발명은, 대상체의 미생물총이 균형을 이룬 마이크로비움으로부터 부정적인 부작용, 장애 및/또는 질환을 유발하거나 또는 이를 유발할 수 있는 것으로 이동된 사건 후에, 대상체의 소화관 균총 및/또는 파우나(fauna)를 항상성으로 회복시키는 데 사용될 수 있다. 건강 상태는 위장 질병, 비만 및 암을 통한, 여드름 및 알레르기로부터의 다양한 상태를 포함할 수 있지만 이들로 제한되지 않는다. 이러한 군집붕괴의 일례는 비만의 발병의 경우이다. 대상체의 소화관 내의 몇몇 미생물 균주는 대상체가 앓고 있는 비만 또는 체중 관리 문제와 연관된 것으로 밝혀져 있다(예컨대, 문헌[Ley, et al. (2005) PNAS USA 102:11070-11075] 참고). 예를 들어, 비만인 동물 및 인간 대상체에서, 박테리데스(Bacterides) 대 퍼미큐티스 문(Firmicutes phyla) 미생물의 비는 대사 성능에 중요한 역할을 한다(예컨대, 문헌[Turnbaugh, et al. (2012) PLOS ONE 7:e41079] 참고). 비만 및 체중 관리 문제와 연관되어 있다고 공지된 일부 소화관 미생물은 박테로이데스 유니포미스(Bacteroides uniformis), 박테로이데스 펙티노필루스(Bacteroides pectinophilus), 로세부리아 이눌리니보란스(Roseburia inulinivorans), 메타노브레비박터 스미티(Methanobrevibacter smithii) 및 비피도박테륨 아니말리스(Bifidobacterium animalis)를 포함한다.

따라서, 일부 실시형태에서, 대상체의 소화관 중의 주어진 제1 미생물 대 주어진 제2 미생물의 비는 본 명세서에 기술된 방법을 사용하여 결정되고, 그 비가 바람직하지 않거나 비정상이면, 그 비를 목적하는 비로 변형시키기 위해서 대상체에게 치료제가 투여된다. 일부 실시형태에서, 대상체의 소화관 중의 미생물 전부의 총량에 대한 대상체의 소화관 중의 주어진 제1 미생물의 양은 본 명세서에 기술된 방법을 사용하여 결정되고, 주어진 제1 미생물의 상대적인 양이 바람직하지 않거나 비정상이면, 그 양을 목적하는 양으로 변형시키기 위해서 대상체에게 치료제가 투여된다. 이러한 치료는 대상체에게, 대상체의 소화관에서 양이 증가되는 것이 바람직한 1종 이상의 미생물을 함유하는 프로바이오틱, 대상체의 소화관에서 양이 감소되는 것이 바람직한 미생물 또는 미생물들을 사멸시키거나 그의 성장을 둔화시키기 위한 항미생물제, 예를 들어, 항생제, 항진균제, 항바이러스제 등, 건강한 소화관 마이크로바이옴의 성장 또는 유지를 지지하는 식이 및/또는 식이 보충제, 예를 들어, 프리바이오틱, 마그네슘, 어유, L-글루타민, 비타민 D 등을 투여하는 것을 포함한다. 이들의 소화관 바이크로비옴의 재검사는 이들이 다량 영양소 및 식품 지침을 잘 고수하는지를 결정하는데 사용될 수 있다. 이러한 치료는 대상체에게, 대상체의 소화관에서 양이 증가되는 것이 바람직한 1종 이상의 미생물을 함유하는 프로바이오틱, 대상체의 소화관에서 양이 감소되는 것이 바람직한 미생물 또는 미생물들을 사멸시키거나 그의 성장을 둔화시키기 위한 항미생물제, 예를 들어, 항생제, 항진균제, 항바이러스제 등, 건강한 소화관 마이크로바이옴의 성장 또는 유지를 지지하는 식이 및/또는 식이 보충제, 예를 들어, 프리바이오틱, 마그네슘, 어유, L-글루타민, 비타민 D 등을 투여하는 것을 포함한다. 예를 들어, Million 등((2005) Int. J. Obes. 36:817-825)]은, 비만인 대상체의 소화관 미생물총이 락토바실루스 루테리(Lactobacillus reuteri)가 풍부하고, 비피도박테륨 아니말리스 및 메타노브레비박터 스미티가 고갈되어 있음을 나타낸다. 따라서, 본 명세서에 기술된 방법을 사용하여 대상체의 소화관에서 락토바실루스 루테리, 비피도박테륨 아니말리스 및 메타노브레비박터 스미티의 양을 결정하고, 그 양이 비만-연관된 소화관 미생물총에 대해서 전형적이거나 이를 나타낸다는 것을 발견한 후, 대상체에게는, 비피도박테륨 아니말리스 및 메타노브레비박터 스미티를 함유하고 락토바실루스 루테리를 비교적 적게 내지 전혀 함유하지 않는 프로바이오틱이 투여될 수 있다. 실시형태에서, 비만인 대상체의 소화관 미생물총은 플라보노이드, 폴리페놀 및 단쇄 지방산을 가진 식품으로부터 이익을 얻을 것이다.

개인의 마이크로바이옴의 점수화

마이크로바이옴 특징 전체의 점수화는 표 3에 나타낸 바와 같은 유사한 결정 트리, 알고리즘, 인공 지능, 스크립트 또는 로직 트리를 사용한다. 이러한 시스템은 그들의 소화관 마이크로바이옴이 얼마나 건강한지 그리고 그들이 발견된 적은 또는 많은 시험감염에 대해서 조치가 취해질 필요가 있는지를 사용자가 이해하는 것을 돕는 점수를 가능하게 할 것이다. 시험감염(Challenge)은 공지된 병원성 유기체의 식별, 기회감염성 병원균의 계수 및 식별, 기회가 주어지는 경우 병원성 영향을 유발한다고 공지된 잠재하는 유기체, 이의 조성이 아닌 양호한 미생물 환경을 위한 지지의 부족 또는 주요 균주의 부족, 상위 10개에서 발견되는 고유한 유기체의 전체 다양성 및 계수치 또는 0.1% 초과의 출현율을 갖는 유기체를 포함할 수 있지만 이들로 제한되지 않는다.

다양성 컷 오프는 샘플 분석의 집합체로부터 결정되었고, 컷오프는 x 상대적 풍부도로 결정된다. 예를 들어, x가 0.1%이면, 352종의 고유한 유기체가 평균 건강한 프로파일을 구성한다. 이어서, 이러한 수를 중심으로 표준 편차를 적용하고, 가우시안 분포 및 곡선 분석하 백분율을 사용하여, 본 발명자들은 본 발명자들의 데이터베이스 평균으로부터의 평균 다양성 수에 얼마나 근접한지를 점수매길 수 있다. 개인의 다양성 수가 낮을수록 그리고 평균값으로부터 추가로 멀어지면, 마이크로바이옴이 저 낮게 점수매겨질 것이다. 수가 높을수록 그리고 다양성이 클수록 마이크로바이옴이 더 높게 점수매겨질 것이다. 프로바이오틱 점수와 함께 이러한 유형의 점수화 카테코리는 마이크로비움이 얼마나 건강한지를 이해하기 위해서 관습에 대해서 수치 및 시각적으로 측정된 점수를 결정할 것이다. 그래프 가시화의 예가 하기에 포함된다. 저(low) 낮은 마이크로바이옴 품질과 동일한 경우, 고(high)는 높은 마이크로바이옴 품질 및 점수와 동일하다. 저 - 100종 중 30종 초과, 중간 100종 중 65종 초과, 고 100종 중 65종 초과.

점수화 및 프로바이오틱 제제 알고리즘의 예는 하기 표 3에 포함되어 있다. 표 3은 결정 트리, 알고리즘, 인공 지능, 스크립트 또는 로직 트리로서 표현될 수 있다. 이러한 결정 트리, 알고리즘, 인공 지능, 스크립트 또는 로직 트리의 함수는 검출된 프로바이오틱스와 관련하여 개체 마이크로비움의 건강함의 점수를 산출하고, 프로바이오틱 사용을 위한 제형 및 투여 권고사항을 제공한다.

미생물을 무리화할 수 있는 가능한 카테고리의 예시적인 목록을 하기 표 4에 언급한다.

본 출원에서 모든 과학 용어 및 기술 용어는 달리 명시되지 않는 한 관련 기술 분야에서 일반적으로 사용되는 의미를 갖는다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "대상체"는 인간 및 비인간 동물을 포함한다. 용어 "비인간 동물"은 모든 척추동물, 예를 들어, 포유동물 및 비포유동물, 예컨대, 비인간 영장류, 말, 양, 개, 소, 돼지, 닭, 및 다른 수의학 대상체 및 시험 동물을 포함한다.

단수의 사용은 달리 구체적으로 언급되지 않는 한 복수를 포함할 수 있다. 본 명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용되는 바와 같이, 단수 형태는 그 문맥이 달리 나타내지 않는 한 복수의 대상을 포함할 수 있다. "또는"의 사용은 달리 언급되지 않는 한 "및/또는"을 의미할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "및/또는"은 "및" 또는 "또는"을 의미한다. 예를 들어, "A 및/또는 B"는 "A, B 또는 A와 B 둘 모두" 및 "A, B, C 및/또는 D"는 "A, B, C, D 또는 이들의 조합"을 의미하고, 상기 "이들의 조합"은 A, B, C 및 D의 임의의 하위세트를 의미하고, 예를 들어, 단일 구성원 하위세트(예컨대, A 또는 B 또는 C 또는 D), 2개 구성원의 하위세트(예컨대, A와 B; A와 C 등), 또는 3개 구성원의 하위세트(예컨대, A, B 및 C; 또는 A, B 및 D 등), 또는 모든 4개의 구성원(예컨대, A, B, C 및 D)을 의미한다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "샘플" 및 "생물학적 샘플"은 본 발명에 의해서 제공된 방법에 적합한 임의의 샘플을 지칭한다. 세포 샘플은, 예를 들어, 비침습적 또는 침습적 기술, 예컨대, 대상체의 생검에 의해서 수득된 소화관 또는 대변 샘플을 비롯한 임의의 샘플일 수 있다 일 실시형태에서, 용어 "샘플"은 대상체의 대변 또는 소화관 조직으로부터 유래된 임의의 제제를 지칭한다. 예를 들어, 본 명세서에 기술된 비침습적 방법을 사용하여 수득된 세포 샘플을 사용하여 본 발명의 방법을 위한 핵산 분자 또는 단백질을 단리할 수 있다.

실시형태에서, 분석은 DNA, RNA, cDNA, miRNA, mtDNA, 단일 또는 이중 가닥을 비롯한 임의의 핵산을 사용할 수 있다. 이러한 핵산은 임의의 길이를 가질 수 있고, 약 5bp만큼 짧은 올리고에서 메가베이스 또는 심지어는 더 긴 길이일 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "핵산 분자"는 DNA, RNA, 단일 가닥, 이중 가닥 또는 삼중 가닥 및 이들의 임의의 화학적 변형을 의미한다. 핵산의 사실상 임의의 변형이 고려된다. "핵산 분자"는 10, 20, 30, 40, 50, 60, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10,000, 15,000, 20,000, 30,000, 40,000, 50,000, 75,000, 100,000, 150,000, 200,000, 500,000, 1,000,000, 1,500,000, 2,000,000, 5,000,000개 또는 심지어는 더 긴 길이의 염기, 전장 염색체 DNA 분자까지의 거의 모든 길이일 수 있다. 유전자의 발현을 분석하는 방법의 경우, 샘플로부터 단리된 핵산은 전형적으로 RNA이다.

단일 가닥 핵산 분자는, 사이토신(C)과 염기쌍을 형성하는 구아닌(G)의 능력, 및 티민(T) 또는 우리딘(U)과 염기쌍을 형성하는 아데닌(A)의 능력을 기초로, 그것이 다른 핵산 분자의 전부 또는 일부와 염기쌍을 형성(혼성화)하여 이중 헬릭스(이중 가닥 핵산 분자)를 형성할 수 있는 경우 또 다른 이중 가닥 핵산 분자에 대해서 "상보성"이다. 예를 들어, 뉴클레오타이드 서열 5'-TATAC-3'는 뉴클레오타이드 서열 5'-GTATA-3'에 상보성이다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이 "혼성화"는 핵산 가닥이 염기쌍 형성을 통해서 상보성 가닥과 결합하는 과정을 지칭한다. 혼성화 반응은 민감성이고 선택적이어서, 관심대상 특정 서열은 그것이 샘플 중에 낮은 농도로 존재하는 경우에도 식별될 수 있다. 시험관내 상황에서, 적합한 엄격한 조건이 예를 들어, 사전혼성화 및 혼성화 용액 중의 염 또는 폼아마이드의 농도에 의해서 또는 혼성화 온도에 의해서 정의될 수 있고, 이는 관련 기술 분야에 널리 공지되어 있다. 특히, 엄격성은 염의 농도를 감소시키거나, 폼아마이드의 농도를 증가시키거나 또는 혼성화 온도를 증가시킴으로써 증가될 수 있다. 예를 들어, 고 엄격성 조건 하에서의 혼성화는 약 37℃ 내지 42℃에서 약 50%의 폼아마이드에서 수행될 수 있다. 혼성화는 약 30℃ 내지 35℃에서 약 35% 내지 25%의 폼아마이드에서 감소된 엄격성 조건 하에서 수행될 수 있다. 특히, 혼성화는 42℃에서, 50%의 폼아마이드, 5X SSPE, 0.3%의 SDS, 및 200㎎/㎖의 절단되고 변성된 연어 정자 DNA에서 고 엄격성 조건 하에서 수행될 수 있다. 혼성화는 35℃의 감소된 온도에서 35%의 폼아마이드 중에서인 것을 제외하고는 상기에 기술된 바와 같은 감소된 엄격성 조건 하에서 수행될 수 있다. 특정 수준의 엄격성에 상응하는 온도 범위는 관심대상 핵산의 퓨린 대 피리미딘 비를 계산하고, 이에 따라서 온도를 조정함으로써 추가로 좁아질 수 있다. 상기 범위 및 조건에 대한 변화는 관련 기술 분야에 널리 공지되어 있다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "마이크로바이옴"은 대상체의 소화관에 서식하는 박테리아, 바이러스 및 진균, 고세균, 원생동물, 아메바, 또는 장내 기생충을 비롯한 미생물을 지칭한다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 미생물(microbial), 미생물(microbe) 또는 미생물(microorganism)은 원핵생물 또는 진핵생물, 포자, 박테리아, 고세균, 진균, 바이러스, 또는 원생생물, 단세포생물 또는 다세포생물을 비롯한 임의의 미세 유기체를 지칭한다.

본 발명은 기능성 성분 및 다양한 처리 단계의 면에서 부분적으로 설명된다. 이러한 기능성 성분 및 처리 단계는 명시된 기능을 수행하고, 다양한 결과를 달성하도록 구성된 임의의 수의 성분, 작업 및 기술에 의해서 인식될 수 있다. 예를 들어, 본 발명은 다양한 생물학적 샘플, 바이오마커, 요소, 물질, 컴퓨터, 데이터 공급원, 저장 시스템 및 미디어, 정보 수집 기술 및 공정, 데이터 프로세싱 기준, 통계학적 분석, 회귀 분석 등을 사용할 수 있고, 이들은 다양한 함수를 수행할 수 있다. 또한, 본 발명은 의학 진단 내용으로 기술되어 있지만, 본 발명은 임의의 수의 응용, 환경 및 데이터 분석과 함께 실시될 수 있고; 본 명세서에 기술된 시스템은 본 발명에 대한 단지 예시적인 응용이다.

본 발명의 다양한 양상에 따른 분석 데이터를 위한 방법은, 예를 들어, 컴퓨터 시스템 상에서 작동하는 컴퓨터 프로그램을 사용하여 임의의 적합한 방식으로 구현될 수 있다. 본 발명의 다양한 양상에 따른, 예시적인 분석 시스템은 컴퓨터 시스템, 예를 들어, 프로세서 및 랜덤 액세스 메모리를 포함하는 종래의 컴퓨터 시스템, 예컨대 원격으로 접근 가능한 응용 서버, 네트워크 서버, 개인 컴퓨터 또는 워크스테이션과 함께 구현될 수 있다. 컴퓨터 시스템은 또한 적합하게는 추가적인 메모리 장치 또는 정보 저장 시스템, 예컨대, 매스 저장 시스템 및 사용자 인터페이스, 예를 들어, 종래의 모니터, 키보드 및 트래킹 장치를 포함할 수 있다. 그러나, 컴퓨터 시스템은 임의의 적합한 컴퓨터 시스템 및 관련 장비를 포함할 수 있고, 임의의 적합한 방식으로 구성될 수 있다. 일 실시형태에서, 컴퓨터 시스템은 독립형 시스템을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 컴퓨터 시스템은 서버 및 데이터베이스를 비롯한 컴퓨터 네트워크의 일부이다.

유전 정보를 수용하고, 프로세싱하고, 분석하는 데 필요한 소프트웨어는 단일 장치에서 구현될 수 있거나 복수의 장치에서 구현될 수 있다. 소프트웨어는 네트워크를 통해 접근 가능하여 정보의 저장 및 프로세싱이 사용자에 대해서 원격으로 수행될 수 있다. 본 발명의 다양한 양상에 따른 분석 시스템 및 이의 다양한 요소는 마이크로바이옴 분석, 예컨대, 데이터 수집, 프로세싱, 분석, 보고 및/또는 진단을 가능하게 하기 위한 기능 및 작업을 제공한다. 본 분석 시스템은 마이크로바이옴 및 샘플에 관련된 정보를 유지하고, 분석 및/또는 진단을 가능하게 한다. 예를 들어, 본 실시형태에서, 컴퓨터 시스템은 마이크로바이옴과 관련된 정보를 수용, 저장, 탐색, 분석 및 보고하는 컴퓨터 프로그램을 실행한다. 컴퓨터 프로그램은 다양한 기능 또는 작업을 수행하는 다중 모듈, 예컨대, 원시 데이터(raw data)를 프로세싱하고 보충 데이터를 생성시키기 위한 프로세싱 모듈 및 원시 데이터 및 보충 데이터를 분석하여 모델 및/또는 예측을 생성시키는 분석 모듈을 포함할 수 있다.

분석 시스템은 또한 다양한 추가 모듈 및/또는 개별 기능을 제공할 수 있다. 예를 들어, 분석 시스템은 또한 예를 들어, 프로세싱 및 분석 기능에 관련된 정보를 제공하기 위해서, 보고 기능을 포함할 수 있다. 분석 시스템은 또한 다양한 행정 및 관리 기능을 제공할 수 있고, 예컨대, 접근을 제어하고, 다른 행정 기능을 수행할 수 있다.

본 발명의 개시내용을 이해하게 완결하는 데 필요한 정도로, 본 명세서에 언급된 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 각각이 개별적으로 편입된 것과 동일한 정도로 본 명세서에 참고로 포함된다.

본 발명은 상기 실시예를 참고로 기술되었지만, 변형 및 변경은 본 발명의 사상 및 범주 내에 포함되는 것으로 이해될 것이다. 따라서, 본 발명은 하기 청구범위에 의해서만 제한된다.

Claims

방법으로서,
a) 샘플을 액체 질소 용액과 혼합하는 단계;
b) 제1 용해 용액을 첨가하는 단계로서, 상기 제1 용해 용액은 세정제 및 킬레이터를 포함하는, 상기 제1 용해 용액을 첨가하는 단계; 및
c) 제2 용해 용액을 첨가하는 단계로서, 상기 제2 용해 용액은 카오트로프제(chaotropic agent)를 포함하는, 상기 제2 용해 용액을 첨가하는 단계
를 포함하는, 방법.
제1항에 있어서, 상기 샘플을 액체 질소 용액과 혼합하는 단계는 상기 샘플과 상기 액체 질소 혼합물을 분쇄(grinding)하는 것을 더 포함하는, 방법.
제1항에 있어서, 상기 제1 용해 용액은 1종 이상의 완충제, 1종 이상의 순한 세정제 및/또는 1종 이상의 프로테아제를 더 포함하는, 방법.
제1항에 있어서, 상기 제1 용해 용액의 상기 세정제는 SDS인, 방법.
제4항에 있어서, 상기 SDS의 농도는 약 10%인, 방법.
제1항에 있어서, 상기 카오트로프제는 아세트산리튬을 포함하는, 방법.
제6항에 있어서, 샘플, 액체 질소, 상기 제1 용해 용액 및 상기 제2 용해 용액의 혼합물은 열 충격 처리(heat shock treatment)에 더 적용되는, 방법.
제1항에 있어서, 상기 샘플은 상기 제1 용해 용액으로의 처리 전에 전처리 단계에 적용되되, 상기 전처리 단계는 상기 샘플 중에 존재하는 임의의 박테리아 포자 및/또는 진균 포자의 발아(germination)를 유도하는, 방법.
제8항에 있어서, 상기 전처리 단계는 상기 샘플을 Tween-80과 혼합하는 것을 포함하는, 방법.
제1항에 있어서, 물리적 용해를 유발하는 기계적 처리 단계를 더 포함하되, 상기 기계적 처리 단계는 초음파처리, 비드 혼합, 비드 밀 균질화, 가압, 미세유동화 또는 이들의 조합을 포함하는, 방법.
제1항에 있어서, 임의의 추출된 유전 물질을 메타게노믹스 분석(metagenomics analysis)에 적용시키는 단계를 더 포함하는, 방법.
제1항에 있어서, 상기 샘플은 대상체의 소화관으로부터 얻어지는, 방법.
제11항에 있어서, 상기 메타게노믹스 분석은 상기 대상체가 소비한 1종 이상의 식품을 식별하는, 방법.
제11항에 있어서, 상기 메타게노믹스 분석은 상기 대상체가 소비한 1종 이상의 다량 영양소를 식별하는, 방법.
제11항에 있어서, 상기 메타게노믹스 분석에 기초하여 상기 대상체에 대한 프로바이오틱 치료(probiotic treatment)를 결정하는 단계를 더 포함하는, 방법.
제11항에 있어서, 상기 메타게노믹스 분석에 기초하여 상기 대상체에 대한 규정식 지침을 결정하는 단계를 더 포함하는, 방법.
대상체의 식품 소비를 결정하는 방법으로서,
a) 대상체로부터 얻어진 대변 샘플로부터 유전 물질을 추출하는 단계로서, 상기 유전 물질은 제1항에 따라 추출되는, 상기 추출하는 단계; 및
b) 제1 샘플로부터 추출된 상기 유전 물질을 메타게노믹스 분석에 적용하여 상기 대상체의 식품 소비를 결정하는 단계를 포함하는, 방법.
제17항에 있어서, 식품 소비의 분석에 기초하여 프로바이오틱 또는 식품 원료로 상기 대상체를 치료하는 단계를 더 포함하는, 방법.
제17항에 있어서, 메타게놈 분석은 이러한 유기체의 식별에 유용한 유기체의 게놈 데이터를 갖는 데이터베이스의 사용을 포함하는, 방법.
제19항에 있어서, 상기 데이터베이스는 전체 게놈, 더 높은 차수에 일반적이고 특이적 하나에 고유한 다양한 길이의 k-량체, 또는 이들을 서열결정 결과와 매칭시키기 위한 바코딩 게놈의 다른 수단으로서 처리될 수 있는, 방법.
제17항에 있어서, 메타게노믹 분석(metagenomic analysis)은 중복의 제거, 어댑터 서열결정의 제거, 특정 품질(즉, Q20 이상)의 염기 호출(base call)만을 포함하는, 염기 호출의 품질을 개선시키기 위한 5' 또는 3' 서열결정의 제거, 인간 판독물(human read)의 필터링, 쌍을 이룬 판독물(paired reads)의 생성 또는 이들의 분리, 및 판독물의 중첩 제한으로부터 선택된 서열결정 정보의 사전처리를 포함하는, 방법.
제19항에 있어서, 메타게노믹 분석은 서열결정 정보를 소프트웨어 또는 시스템의 사용에 의해서 상기 데이터베이스에 정렬하는 단계로서, 상기 서열결정 정보는 특정 길이의 k-량체로 파괴되고, 전체 단편으로서 사용되고, 스캐폴딩되고, 큰 참조 게놈에 정렬되는, 상기 정렬하는 단계, 또는 식별된 유기체의 리포트, 식별된 유기체의 상대적인 풍부도(relative abundance), 게놈 크기, 정렬된 총 단편, 균주, 종, 속, 과, 목, 강, 문, 계 또는 도메인에서 정렬된 고유한 단편을 생성하기 위한 다른 방법을 포함하는, 방법.
제17항에 있어서, 마이크로바이옴 프로파일(microbiome profile)은 군집붕괴(dysbiosis)를 나타내는 질환, 장애 또는 특이적 특징의 식별을 가능하게 하되, 프로바이오틱 및/또는 식이 보충제 치료는 상기 마이크로바이옴을 조정하여 근본적인 프로파일을 개선시키기 위해서 적용될 수 있는, 방법.
제23항에 있어서, 군은 인구학, 표현형 또는 진단 정보 및 프로파일의 상기 군에 배정된 바코드를 기준으로 생성되는, 방법.
제24항에 있어서, 통계학적 분석은 개체 마이크로바이옴 프로파일이 데이터베이스에서 공지된 군에 얼마나 밀접하게 관련되는지를 결정하는 데 사용되는, 방법.
대상체의 프로바이오틱 치료를 모니터링하는 방법으로서,
a) 대상체로부터 얻어진 제1 샘플 중에 존재하는 임의의 미생물로부터 유전 물질을 추출하는 단계로서, 상기 유전 물질은 제1항에 따라서 추출되는, 상기 추출하는 단계;
b) 상기 제1 샘플로부터 추출된 상기 유전 물질을 메타게노믹스 분석에 적용시키는 단계;
c) 상기 대상체를 프로바이오틱으로 치료하고, 이어서 상기 제1 샘플로부터의 유전 물질의 상기 추출과 동일한 방식으로, 상기 대상체로부터 얻어진 제2 샘플 중에 존재하는 임의의 미생물로부터 유전 물질을 추출하는 단계;
d) 상기 제2 샘플로부터의 추출된 유전 물질에 대해 메타게노믹스 분석을 수행하는 단계; 및
e) 상기 제1 샘플의 상기 메타게노믹스 분석의 결과를 상기 제2 샘플의 상기 메타게노믹스 분석의 결과와 비교하는 단계를 포함하는, 프로바이오틱 치료를 모니터링하는 방법.
제26항에 있어서, 상기 프로바이오틱 치료를 변형하여 상기 대상체 내에서 목적하는 미생물 집단을 얻는 단계를 더 포함하는, 프로바이오틱 치료를 모니터링하는 방법.
제26항에 있어서, 대사체 마커(metabolomic marker)를 분석하여 적절한 프로바이오틱 치료를 결정하는 단계를 더 포함하는, 프로바이오틱 치료를 모니터링하는 방법.
제26항에 있어서, 프로바이오틱 치료는 항생제, 화학요법, 약제, 환경 변화, 트래블링(traveling), 오염물 소화, 장 또는 소화관의 경색, 스트레스, 또는 미생물 집단의 붕괴가 일어날 수 있는 다른 효과의 사용에 이어서 일어나는, 프로바이오틱 치료를 모니터링하는 방법.
제27항에 있어서, 마이크로바이옴의 조정은 개체를, 상기 개체가 건강한 것으로 알려진 때의 미생물의 이전 집단으로 복귀시키는 것인, 프로바이오틱 치료를 모니터링하는 방법.
제27항에 있어서, 프로바이오틱 및/또는 프리바이오틱(prebiotic)에 의한 마이크로바이옴의 조정은, 마이크로바이옴 프로파일을, 데이터베이스에 의해서 내부에서 또는 공공 데이터베이스에 의해서 외부에서 정의된 정상 소화관(normal gut)으로 회복시키는 것인, 프로바이오틱 치료를 모니터링하는 방법.
제31항에 있어서, 정상은, 군집붕괴를 회복시키기 위하여 프로바이오틱/프리바이오틱으로서 사용되지만, 대변 이식물에 사용된 대변 저장소 샘플의 상기 마이크로바이옴 프로파일과 유사한 것으로 정의되는, 프로바이오틱 치료를 모니터링하는 방법.
컴퓨팅 시스템으로서, 메모리; 및 상기 메모리에 결합된 하나 이상의 프로세서를 포함하되, 상기 하나 이상의 프로세서는 제17항의 방법을 수행하기 위한 작동(operation)을 수행하도록 구성된, 컴퓨팅 시스템.
컴퓨팅 시스템으로서, 메모리; 및 상기 메모리에 결합된 하나 이상의 프로세서를 포함하되, 상기 하나 이상의 프로세서는 제26항의 방법을 수행하기 위한 작동을 수행하도록 구성된, 컴퓨팅 시스템.
제1항의 방법을 수행하기 위한 자동화 플랫폼(automated platform).