JP2021520191A - 試料中の1つ以上の種類の微生物の多様な集団から核酸分子を抽出するための万能な方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2018年4月2日に出願された米国特許出願第62/651,620号に対する米国特許法第119条に基づく利益を主張する。先行出願の開示は、本出願の一部とみなされ、参照により本出願の開示に組み込まれる。
本発明は、概して、ゲノム解析に関し、より具体的には、生体試料中の微生物の多様な集団から食物に関連する核酸分子を抽出および解析する方法に関する。
人体の約10兆個のヒト細胞をはるかに上回る数で、約100兆個の微生物が、人体の内外に生息している。これらの通常は無害なウイルス、細菌および真菌は、共生または相利共生生物と称される。共生または相利共生生物は、様々な方法で私たちの身体を健康に保つのに役立つ。共生または相利共生、および病原性的に体の内外に生息する全ての微生物はまとめて、マイクロバイオームと称され、それらの平衡状態および関連するメタボロームは、個体の健康状態と密接に関連し、逆もまた同様である。
本発明は、試料中の1つ以上の種類の微生物の多様な集団から核酸分子を抽出するための万能な方法を提供する。微生物の種類には、グラム陽性細菌、グラム陽性細菌胞子、グラム陰性細菌、古細菌、原生動物、寄生蠕虫、藻類、真菌、真菌胞子、ウイルス、ウイロイド、バクテリオファージ、およびワムシが含まれる。いくつかの実施形態では、多様な集団は、同じ種類の複数の異なる微生物、例えばグラム陽性細菌である。いくつかの実施形態では、多様な集団は、複数の異なる種類の微生物、例えば細菌(グラム陽性細菌、グラム陽性細菌胞子および/またはグラム陰性)、真菌、ウイルス、およびバクテリオファージである。
10mg〜5000mgの試料を滅菌2ミリリットル(mL)マイクロ遠心チューブに添加した。ビーズビーティングを、400マイクロリットル(μL)のビーズ純粋混合物を添加し、8000rpmで約30秒間ボルテックスすることによって、任意選択的に実行してもよい。しかしながら、高分子量核酸、例えばゲノムDNAを得ることが望ましい場合、ビーズビーティングは好ましくは回避される。
試料中の任意のグラム陰性細菌を溶解するために、試料に約400μLの消化緩衝液(1%w/vSDS、25mMのTrisHCl、2.5mMのEDTA、1%のTriton(商標)X−100、pH8)および約20μLのプロテイナーゼKを添加することによって、試料を第1の溶解液に供し、穏やかに混合した。次いで、混合物を55℃で約30分間インキュベートした。
試料中の任意のグラム陽性細菌を溶解するために、グルコシドヒドラーゼ(「リゾチーム」)を含む第2の溶解液を第1の溶解液処理ステップから得られた混合物に添加して、最終リゾチーム濃度1mg/mLおよびpH約8.0を得た。好適なグルコシドヒドロラーゼは、様々な動物の卵白、涙、または粘液もしくは唾液を含む様々な供給源から得ることができる。次いで、混合物を37℃で約1〜24時間インキュベートした。
試料中に存在する任意の真菌細胞および/または酵母細胞を溶解するために、蒸留滅菌H2O中1Mの酢酸リチウムおよび5%w/vのSDSを含む第3の溶解液を添加して、第2の溶解液処理ステップから生じる混合物の約1:5の希釈液を得た。処理された混合物を70℃で15分間インキュベートし、続いて95℃で1分間ヒートショックにかけ、次いで22℃の水浴に入れることによって室温にした。
溶解前処理ステップ
100〜200mgの試料を滅菌2ミリリットル(mL)マイクロ遠心チューブに添加した。液体窒素500mLを加え、試料を30秒間凍結させる。次に、ペレットペッスルまたはのこぎり波発生器(saw−tooth generator)プローブを使用して、次のステップに進む前に試料を完全に粉砕する。
試料中の任意の動物、真菌、および原生動物食物細胞膜を溶解するために、試料に約400μLの消化緩衝液(1%w/vSDS、25mMのTrisHCl、2.5mMのEDTA、1%のTriton(商標)X−100、1.2MのNaCl pH8)および約20μLのプロテイナーゼKを添加することによって、試料を第1の溶解液に供し、穏やかに混合した。次いで、混合物を55℃で約30分間インキュベートした。
試料中に存在する任意の真菌細胞および/または酵母細胞を溶解するために、蒸留滅菌H2O中の1M酢酸リチウムおよび5%w/vのSDSを含む第2の溶解液を添加して、第1の溶解液処理ステップから生じる混合物の約1:5の希釈液を得た。処理された混合物を70℃で15分間インキュベートし、続いて95℃で1分間ヒートショックにかけ、次いで22℃の水浴に入れることによって室温にした。
一実施形態では、溶解微生物から抽出された遺伝物質、すなわち、第1、第2、および第3の溶解液処理ステップに供された後に混合物中に存在する核酸分子は、次に混合物を2つのマイクロ遠心チューブに分割することによってDNAおよびRNA精製物に精製した。約20μLのRNAse Aを添加し、室温で5分間インキュベートすることによって、DNAを1つのチューブから抽出した。混合物を生体高分子組織ホモジナイザカラムに通した。ビーズビーティングを前もって実行した場合、混合物を組織ホモジナイザカラムにかけることは、回避することが好ましい。
一実施形態では、抽出および精製された遺伝物質をIlluminaインデックスアダプタを使用してシークエンシングのために調製し、サイズおよび量をチェックした。低サイクルPCRは、50ng未満のDNAの任意の投入に対して1〜20サイクルで実行され、それ以外の場合は、50ng以上の核酸に対して、PCRフリーのライブラリ調製方法を利用することができる。ゲル精製は、Qiagen Gel Purification Kit(商標)(Qiagen,Frederick,MD)を用いて実行した。クリーンPCR産物を、Qubit(商標)2.0フルオロメータ(Life Technologies,Carlsbad,CA)を用いて定量化した。試料を等モル量で組み合わせた。ライブラリプールを、Fragment Analyzer(商標)CE(Advanced Analytical Technologies Inc.,Ames IA)を使用してサイズ検証し、Qubit(商標)High Sensitivity dsDNAキット(Life Technologies,Carlsbad,CA)を使用して定量化した。希釈後、1%〜10%のPhiX(商標)V3ライブラリ対照(Illumina,San Diego CA)のスパイク、プールを0.1N NaOHの等しい体積で5分間変性させ、次いでIlluminaのHT1緩衝液中でさらに希釈した。変性およびPhiX(商標)スパイクしたプールをIlluminaシークエンシングプライマーを有するIllumina Next Generation(商標)シーケンサにロードし、50〜550塩基、ペアードエンドまたはシングルリードに設定した。
いくつかの実施形態では、本発明は対象における食物により摂取する栄養、量、および質をモニターするために使用され得る。例えば、プロバイオティクスでの治療の前に、対象の消化管から得られた試料が取得され、本明細書に開示されるようにその中の食物生物の遺伝物質が抽出され、メタゲノミクス解析に供され得る。全体の、部分的な、または不完全な参照ゲノム、RNA、または核酸成分または断片で構成されるカスタマイズされた食物固有のデータベースは、シークエンシングから核酸情報を同定、定量化、および分類学的に割り当てるために、バイオインフォマティクスツールによって利用される。その出力は、以下の表2に例示され、腸内にいた生物の種または生物の細胞の同定を含む。
いくつかの実施形態では、本発明は対象におけるプロバイオティクス治療をモニターするために使用され得る。例えば、プロバイオティクスでの治療の前に、対象の消化管から得られた試料を取得し、本明細書に開示されるように、その中の微生物の遺伝物質を抽出し、メタゲノミクス解析に供することができる。次いで、所与のプロバイオティクスでの治療中および/または治療後、第2の試料が対象の消化管から得られおよび第2の試料中の微生物の遺伝物質が本明細書に開示されるように抽出され、メタゲノミクス解析に供され得、その結果が、第1の試料のメタゲノミクス解析の結果と比較される。次いで、比較結果に基づいて、対象のプロバイオティクス治療を改変して、対象の腸内に所望の微生物集団を得ることができる。例えば、その量が対象の腸内で増加するそのことが所望される微生物を含むプロバイオティクスを対象に投与してもよい。
本発明は、様々な市販のプロバイオティクスの微生物含有量を決定するために成功裏に使用された。さらに、本発明の方法を使用して、様々なプロバイオティクスの微生物含有量および対象の腸内のマイクロバイオーム含有量を決定する。一実施形態では、対象の腸内のマイクロバイオーム含有量およびそれに対する任意の所望の変化に基づいて、対象のマイクロバイオームの健康において増加および/または維持されることが所望される微生物を含有する1つ以上のプロバイオティクスを選択できる。一実施形態では、対象の腸内のマイクロバイオーム含有量およびそれに対する任意の所望の変更に基づいて、個体からの直接的調査情報によって、または本発明による腸内生物核酸解析によって記録される、それらの食物源から得られる主要栄養素含有量に関連して、対象の腸内バランスにおいて増加および/または維持されることが所望される微生物を含有する1つ以上のプロバイオティクスを選択することができる。
いくつかの実施形態では、本発明は、対象の微生物叢がバランスの取れたマイクロバイオームから、負の副作用、障害、および/または疾患を引き起こしているか、または引き起こし得るものに移行した事象の後に、対象の腸内フローラおよび/またはファウナを恒常性に回復させるために使用され得る。健康状態としては、ニキビおよびアレルギーから、胃腸疾患、肥満および癌まで、様々な状態が挙げられるが、これらに限定されない。そのようなディスバイオシスの一例は、肥満の発症の場合である。対象の腸内のいくつかの微生物株は、対象がおかれている肥満または体重管理の問題と関連することが示されている。例えば、Ley,et al.(2005)PNAS USA 102:11070−11075を参照されたい。例えば、肥満動物およびヒト対象において、バクテロイデス(Bacterides)対ファーミキューテス(Firmicutes)門微生物の比は、代謝性能において重要な役割を果たす。例えば、Turnbaugh,et al.(2012)PLOS ONE 7:e41079を参照されたい。肥満および体重管理の問題に関連することが知られているいくつかの腸内微生物には、バクテロイデス・ユニフォルミス(Bacteroides uniformis)、バクテロイデス・ペクチノフィラス(Bacteroides pectinophilus)、ロゼブリア・イヌリニボランス(Roseburia inulinivorans)、メタノブレビバクター・スミジイ(Methanobrevibacter smithii)およびビフィドバクテリウム・アニマリスが含まれる。
全体的なマイクロバイオームシグネチャのスコア付けは、表3に表されるように、類似の決定木、アルゴリズム、人工知能、スクリプト、または論理木を使用する。このシステムは、ユーザが自分の腸内マイクロバイオームがどれほど健康であるか、そして見出されたいくつかまたは多くの課題に対処する必要があるかを理解するのに役立つスコアを可能にする。課題には、限定されないが、既知の病原性生物の同定、日和見病原体の数および同定、機会が与えられたときに病原性影響を引き起こすことが知られている潜在的生物、良好な微生物環境に対する支持が欠如しているがそれらの組成または主要株の欠如、全体的な多様性、およびトップ10に見出される独自の生物の数、ならびにまたは0.1%を超える保有率を有する生物、が含まれ得る。
Claims (35)
- a)試料を液体窒素溶液と混合することと、
b)第1の溶解液を添加することであって、前記第1の溶解液が、界面活性剤およびキレート剤を含む、前記添加することと、
c)第2の溶解液を添加することであって、前記第2の溶解液が、カオトロピック剤を含む、前記添加することと
を含む、方法。 - 前記試料と液体窒素溶液との前記混合が、前記試料と前記液体窒素との混合物を粉砕することをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記第1の溶解液が、1つ以上の緩衝液、1つ以上のマイルドな界面活性剤、および/または1つ以上のプロテアーゼをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記第1の溶解液の前記界面活性剤が、SDSを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記SDSの濃度が、約10%である、請求項4に記載の方法。
- 前記カオトロピック剤が、酢酸リチウムを含む、請求項1に記載の方法。
- 試料、液体窒素、前記第1の溶解液、および前記第2の溶解液の混合物が、熱ショック処理にさらに供される、請求項6に記載の方法。
- 前記試料が、前記第1の溶解液で処理する前に前処理ステップに供され、前記前処理ステップが、前記試料中に存在する任意の細菌胞子および/または真菌胞子の発芽を誘発する、請求項1に記載の方法。
- 前記前処理ステップが、前記試料をTween−80と混合することを含む、請求項8に記載の方法。
- 物理的溶解を引き起こす機械的処理ステップをさらに含み、前記機械的処理ステップが、超音波処理、ビーズ混合、ビーズミル均質化、加圧、顕微溶液化、またはこれらの組み合わせを含む、請求項1に記載の方法。
- 任意の抽出された遺伝物質をメタゲノミクス解析に供することをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記試料が、対象の腸から得られる、請求項1に記載の方法。
- 前記メタゲノミクス解析が、前記対象が摂取した1つ以上の食物を同定する、請求項11に記載の方法。
- 前記メタゲノミクス解析が、前記対象が摂取した1つ以上の主要栄養素を同定する、請求項11に記載の方法。
- 前記メタゲノミクス解析に基づいて前記対象のプロバイオティクス治療を決定することをさらに含む、請求項11に記載の方法。
- 前記メタゲノミクス解析に基づいて前記対象の食事指針を決定することをさらに含む、請求項11に記載の方法。
- 対象の摂食量を決定する方法であって、
a)前記対象から得られた大便試料から遺伝物質を抽出することであって、前記遺伝物質が請求項1にしたがって抽出される、前記抽出することと、
b)前記対象の前記摂食量を決定するために、前記第1の試料から抽出された前記遺伝物質をメタゲノミクス解析に供することと
を含む、前記方法。 - 前記対象を、前記摂食量の解析に基づいてプロバイオティクスまたは食物で治療することをさらに含む、請求項17に記載の方法。
- 生物のゲノムデータを有するデータベースであって、そのような生物の同定に有用なデータベースの使用を、メタゲノム解析が含む、請求項17に記載の方法。
- 前記データベースが、全ゲノムとして、より高いオーダーに共通でありかつ特定のものに固有の様々な長さのk−merとして、またはゲノムをバーコード化してそれらをシークエンシング結果に一致させる他の手段として処理され得る、請求項19に記載の方法。
- メタゲノム解析が、
重複を除去すること、アダプタシークエンシングを除去すること、ベースコールのクオリティを向上させるために5’または3’シークエンシングを除去して特定のクオリティ(すなわち、Q20以上)のベースコールのみを含むこと、ヒトリードをフィルタリングすること、ペアードリードを作成またはそれらを分離すること、リードのオーバーラップを制限すること
から選択されるシークエンシング情報の前処理を含む、請求項17に記載の方法。 - シークエンシング情報が、特定の長さのk−merに分割されてもよく、完全な断片として使用されてもよく、大規模レファレンスゲノムに対してスキャフォールディングおよびアライメントされてもよい、ソフトウェアまたはシステム
の使用により、前記シークエンシング情報を前記データベースにアライメントさせること、または、
同定された生物、同定された生物の相対的存在量、ゲノムサイズ、アライメントされた総計の断片、株か、種か、属か、科か、目か、綱か、門か、界か、もしくはドメインかにアライメントされた固有の断片、のレポートを作成するための、他の方法
を、メタゲノム解析が含む、請求項19に記載の方法。 - マイクロバイオームプロファイルが、ディスバイオシスを示す疾患、障害、または特異的なシグネチャの同定を可能にし、前記マイクロバイオームを調節して前記根底にあるプロファイルを改善するために、プロバイオティクスおよび/または栄養補助治療を適用することができる、請求項17に記載の方法。
- グループが、人口統計学的情報、表現型情報、または診断情報に基づいて作成され、およびそのプロファイルグループにバーコードが割り当てられる、請求項23に記載の方法。
- 統計解析が、個々のマイクロバイオームプロファイルがデータベース内の既知のグループとどの程度密接に関連しているかを決定するために使用される、請求項24に記載の方法。
- 対象のプロバイオティクス治療をモニタリングする方法であって、
a)前記対象から得られた第1の試料中に存在する任意の微生物から遺伝物質を抽出することであって、前記遺伝物質が請求項1にしたがって抽出される、前記抽出することと、
b)前記第1の試料から抽出された前記遺伝物質をメタゲノミクス解析に供することと、
c)前記対象をプロバイオティクスで治療し、次いで、前記第1の試料からの前記遺伝物質の抽出と同様に前記対象から得られた第2の試料中に存在する任意の微生物から遺伝物質を抽出することと、
d)前記第2の試料から抽出された前記遺伝物質に対してメタゲノミクス解析を実行することと、
e)前記第1の試料の前記メタゲノミクス解析の結果を、前記第2の試料の前記メタゲノミクス解析の結果と比較することと
を含む、前記方法。 - 前記対象内で所望の微生物集団を得るために、前記プロバイオティクス治療を改変することをさらに含む、請求項26に記載の方法。
- 適切なプロバイオティクス治療を決定するために、メタボロ−ムマーカーの解析をさらに含む、請求項26に記載の方法。
- プロバイオティクス治療が、抗生物質、化学療法、医薬品の使用、環境変化、旅行、汚染物質消化、腸管もしくは腸の梗塞、ストレス、または前記微生物集団の破壊が生じ得る他の作用の後に行われる、請求項26に記載の方法。
- マイクロバイオームの調節が、個体を、前記個体が健康であることが分かっていたときの以前の微生物集団に戻すことである、請求項27に記載の方法。
- プロバイオティクスおよび/またはプレバイオティクスによるマイクロバイオームの調節が、データベースによって内部的にまたは公開データベースによって外部的に定義された正常な腸にマイクロバイオームプロファイルを復元することである、請求項27に記載の方法。
- 糞便移植に使用されるが、ディスバイオシスを回復させるためのプロバイオティクス/プレバイオティクスとして使用される、糞便物質リポジトリ試料のマイクロバイオームプロファイルに類似するものとして、正常が定義される、請求項31に記載の方法。
- メモリと、前記メモリに結合された1つ以上のプロセッサとを含むコンピューティングシステムであって、前記1つ以上のプロセッサが、請求項17に記載の方法を実行するための操作を実行するように構成される、前記コンピューティングシステム。
- メモリと、前記メモリに結合された1つ以上のプロセッサとを含むコンピューティングシステムであって、前記1つ以上のプロセッサが、請求項26に記載の方法を実行するための操作を実行するように構成される、前記コンピューティングシステム。
- 請求項1に記載の方法を実行するための自動プラットフォーム。
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