CN114144387A - 用于从微生物的不同群体中提取核酸分子的通用方法 - Google Patents

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Abstract

本文公开了从样品中的一种或多种类型的微生物的不同群体中提取遗传物质的方法。微生物可以是原核生物或真核生物，并且可以包含细菌、古细菌、真菌、原生动物、蠕虫、寄生虫、病毒、噬菌体等。可以从单个样品中进行提取，并且可以通过如qPCR、PCR、RFLP、SSCP、等位基因特异性PCR、靶向测序、下拉测序、全鸟枪法测序等分子方法或其它方法进行后续鉴定。还提供了方法，所述方法包含：从来自人受试者肠道的各种生物体，如真菌(即酵母菌)、动物细胞(家牛)、植物(例如，大麦)中提取核酸分子；从其执行宏基因组学分析；以及基于所述宏基因组学分析确定对所述受试者的益生菌治疗或饮食指导。

Description

用于从微生物的不同群体中提取核酸分子的通用方法
相关申请交叉引用
本申请根据35U.S.C.§119(e)要求于2018年10月26日提交的美国序列号62/751,484和于2019年4月2日提交的美国序列号16/373,387的优先权的权益，所述申请的全部内容通过引用以其整体并入本文。
技术领域
本发明总体上涉及基因组分析，并且更具体地涉及一种从生物样品中的微生物的不同群体中提取和分析与食物相关的核酸分子的方法。
背景技术
约100万亿个微生物生活在人体内和人体上，数目远远超过身体的大约10万亿个人细胞。这些通常无害的病毒、细菌和真菌被称为共生或互生生物体。共生生物体和互生生物体在许多方面有助于保持身体健康。生活在身体内和身体上的微生物中的所有微生物——共生的、互生的和致病的——一起被称为微生物群系，并且其平衡和相关代谢组与个体的健康状态密切相关，并且反之亦然。
核酸测序的进展为快速地且准确地鉴定和简要描述栖息肠道和皮下组织的微生物群系创造了机会。最佳菌群还与宿主免疫系统以协同方式相互作用，从而进一步传播其健康益处。个体的相关代谢组还可以通过基于质谱法的系统或使用基于基因组的代谢组建模
和通量平衡分析进行简要描述，并且用于制作健康的代谢组谱。所有这些方法都可以用于详细分析微生物群落的复杂性。
发明内容
本发明涉及一种从生物、环境、饮食补充剂或其它生态微生物生物体异质群体样品中的微生物的不同群体中提取核酸分子的方法，并且涉及核酸或提取物通过处理步骤和分析用于确定个体的益生菌定制的用途。特定于本发明的处理步骤包含RNA或DNA清理、碎片化、分离或消化；用于如PCR、qPCR、数字PCR或测序等下游应用的库或核酸制备；用于生物信息QC、过滤、比对或数据分割的预处理；用于微生物物种分类分配的宏基因组学或人基因组生物信息学管道；以及其它生物体比对、鉴定和变体解释。
本发明还描述了用于使用样品以进行DNA提取并且基于来自肉、植物、水果、蔬菜和/或这些生物体一起含有的微生物的数据库的食物DNA序列来确定食物消耗的通用方法。本文公开了从样品中的一种或多种类型的细胞或细胞组分的不同群体中提取遗传物质并且确定所消耗的食物和营养分解以改善健康和预防疾病的方法。
因此，在一个方面，本发明提供了一种用于制备样品以供分析的方法。所述方法包含：a)将样品与包括洗涤剂(例如，SDS)和螯合剂(例如，EDTA)的第一裂解溶液混合；b)将具有溶菌酶的第二裂解溶液加入步骤a)的混合物中；以及c)将包括离液剂(例如，尿素、乙酸锂、盐酸胍等)的第三裂解溶液加入步骤b)的混合物中。预处理步骤可以包含可以用于进一步优化核酸产率的物理裂解。机械裂解的实例包含超声处理、珠粒混合和珠磨机均质化。
在类似方面，所述方法包含：a)将如粪便样品等样品与液氮溶液混合；b)加入第一裂解溶液，所述第一裂解溶液包括洗涤剂和螯合剂(例如，SDS)和螯合剂(例如，EDTA)；以及c)加入第二裂解溶液，所述第二裂解溶液包含离液剂，例如，尿素、乙酸锂、盐酸胍。预处理步骤可以包含可以用于进一步优化核酸产率的物理裂解。机械裂解的实例包含超声处理、珠粒混合和珠磨机均质化。
在另一方面，本发明提供了一种确定受试者的食物消耗的方法。所述方法包含：a)从获得自受试者的粪便样品中提取遗传物质，所述遗传物质根据本公开的方法提取；以及b)使从第一样品中提取的遗传物质经受宏基因组学分析以确定受试者的食物消耗。在实施例中，所述方法进一步包含基于对食物消耗的分析来用益生菌或食品治疗受试者。
在另一方面，本发明提供了一种监测受试者的益生菌治疗的方法。所述方法包含：a)从存在于获得自受试者的第一样品中的任何微生物中提取遗传物质，所述遗传物质根据本公开的方法提取；b)使从第一样品中提取的遗传物质经受宏基因组学分析；c)用益生菌治疗受试者，并且然后以与从第一样品中提取遗传物质相同的方式从存在于从受试者获得的第二样品中的任何微生物中提取遗传物质；d)对从第二样品中提取的遗传物质进行宏基因组学分析；以及e)比较第一样品的宏基因组学分析的结果与第二样品的宏基因组学分析的结果。
在又另一方面，本发明提供了一种方法，所述方法包括使用或不使用另外的化学或基因测试根据肠道中检测到的益生菌生物体来计算益生菌评分。
在仍另一方面，本发明提供了一种方法，所述方法包括计算微生物群系的评分，所述评分用于评估微生物群系是否处于生态失调、中性或稳定。
本发明进一步提供了一种计算系统，其包括：存储器；以及耦接到所述存储器的一个或多个处理器，所述一个或多个处理器被配置成执行操作以执行本发明的方法。
本发明还提供了一种用于执行本发明的方法的自动化平台。
本发明提供了一种用于从生物、环境、饮食补充剂或其它生态微生物生物体异质群体样品中的不同微生物菌群中提取核酸的一体化方法。
在实施例中，本发明可以用于通过在益生菌和环境样品中分析相应的核酸来确定微生物的组合物和相对丰度。将DNA纯化并且用于下游以进行核酸分析(尤其是鉴定和相对丰度的宏基因组学分析)。
在又另一个方面，本发明提供了一种用于使用肠道微生物群系的益生菌、益生元或代谢物减少或消除机会性病原体或引起病症的肠道微生物的检测、诊断和/或治疗方法。
在仍另一个方面，本发明提供了表5-14中列出的菌株以任何组合一起或单独地用于减少引起疾病或病症的微生物的丰度的用途。
在另一个方面，本发明提供了一种方法，所述方法包含：a)测定来自受试者的样品的一个或多个胃肠道靶序列的表达水平；以及b)向所述受试者施用益生菌组合物。
在另一方面，本发明提供了一种系统，所述系统包含：a)探针组，所述探针组包括与一个或多个胃肠道靶序列的至少一部分杂交的多个多核苷酸；以及b)计算机可读介质，所述计算机可读介质对计算机模型或算法进行编码以在来自受试者的样品中分析与探针杂交的所述靶序列的表达水平和/或表达谱。
在仍另一方面，本发明提供了一种治疗胃肠道生态失调的方法，所述方法包含：a)测定来自受试者的样品的一个或多个胃肠道靶序列的表达水平；以及b)向所述受试者施用益生菌组合物。
在又另一方面，本发明提供了一种益生菌的组合物，其中所述组合物通过测定来自受试者的样品的一个或多个胃肠道靶序列的表达水平来确定，并且其中所述益生菌纠正所述受试者的胃肠道生态失调。
上述总体说明以及以下详细说明两者都是示例性的且仅是说明性的，并且旨在为如所要求保护的本发明提供进一步解释。包含任何附图以提供对本发明的进一步的理解，并且所述附图并入本说明书并构成其部分，说明本发明的若干实施例，并且连同描述一起用于解释本发明的原理。
附图说明
图1示出了在患者粪便样品中鉴定的最丰富的微生物。
图2A-2D示出了在患者样品中鉴定的一系列细菌、病毒、古细菌真核生物体。2A示出了在样品中鉴定的生物体中的所有生物体。2B示出了在样品中鉴定的一系列病毒。2C示出了在样品中鉴定出的一系列古细菌。2D示出了在样品中鉴定出的一系列真核生物体。
图3A-3D示出了在患者样品中鉴定的一系列细菌、病毒、古细菌真核生物体。3A示出了在样品中鉴定的生物体中的所有生物体。3B示出了在样品中鉴定的一系列病毒。3C示出了在样品中鉴定的一系列古细菌。3D示出了在样品中鉴定的一系列真核生物体。
图4A-4D示出了在患者样品中鉴定的一系列细菌、病毒、古细菌真核生物体。4A示出了在样品中鉴定的生物体中的所有生物体。4B示出了在样品中鉴定的一系列病毒。4C示出了在样品中鉴定的一系列古细菌。4D示出了在样品中鉴定的一系列真核生物。
图5示出了在患者粪便样品中鉴定的最不丰富的微生物。
图6示出了在患者样品中鉴定的益生菌。
图7示出了在患者样品中鉴定的益生菌。
图8示出了在受试者样品中鉴定的微生物的相对丰度与在一般群体中的微生物的相对丰度的比较。
图9是列出了以最高频率和最低频率出现在来自受试者的样品中的微生物的图表。
图10示出了在受试者的样品的微生物群系中发现的一系列独特的古细菌、细菌、真菌、原生动物和病毒的分解。
图11A-11C示出了在患者样品中鉴定的一系列软体动物类(Mollusca)、牛科(Bovidae)和百合纲(Liliopsida)生物体。11A软体动物。11B牛科。11C百合纲。
图12示出了对患有使用所公开的方法诊断的患有潜伏性乙型肝炎的受试者的微生物群系分析。
图13示出了在针对小肠细菌过度生长(SIBO)的药物干预之前和之后受试者的样品中的机会性病原体含量。
图14A-14C是用于创建健康参考概况的微生物群系概况的实例。
图15A-15B示出了在抗生素治疗之前、在抗生素治疗之后和在益生菌治疗之后受试者的益生菌概况和微生物概况。15A益生菌概况。15B微生物概况。
图16A-16E示出了受试者的微生物群系概况。16A是益生菌概况。16B是前10种微生物的列表。16C是其它重要肠道影响者的图表。16D是与健康参考相比的所关注属和科的比较。16E是检测的关键微生物的汇总。
图17A-17E示出了受试者的微生物群系概况。17A是检测的关键微生物的汇总。17B是前10种微生物的列表。17C是其它重要的肠道影响者的图表。17D是与健康参考相比的所关注属和科的比较。17E是益生菌概况。
图18A-18B示出了对受试者SG00095的微生物群系的分析。18A示出了鉴定的前10种微生物。18B示出了微生物与健康参考的比较。
图19A-19B示出了对受试者SG00443的微生物群系的分析。19A示出了鉴定的前10种微生物。19B示出了微生物与健康参考的比较。
图20A-20B示出了对受试者SG00216的微生物群系的分析。20A示出了鉴定的前10种微生物。20B示出了微生物与健康参考的比较。
图21A-21B示出了对受试者SG00346的微生物群系的分析。21A示出了鉴定的前10种微生物。21B示出了微生物与健康参考的比较。
图22A-22B示出了对受试者SG00279的微生物群系的分析。22A示出了鉴定的前10种微生物。22B示出了微生物与健康参考的比较。
图23A-23B示出了对受试者SG00210的微生物群系的分析。23A示出了鉴定的前10种微生物。23B示出了微生物与健康参考的比较。
具体实施方式
本发明提供了一种用于从样品中的一种或多种类型的微生物的不同群体中提取核酸分子的通用方法。微生物的类型包含：革兰氏阳性细菌、革兰氏阳性细菌孢子、革兰氏阴性细菌、古细菌、原生动物、蠕虫、藻类、真菌、真菌孢子、病毒、类病毒、噬菌体和轮虫。在一些实施例中，不同群体是同种类型的多种不同微生物，例如，革兰氏阳性细菌。在一些实施例中，不同群体是多种不同类型的微生物，例如，细菌(革兰氏阳性细菌、革兰氏阳性细菌孢子和/或革兰氏阴性)、真菌、病毒和噬菌体。
因为不同类型的微生物具有不同的组合物和机制来保护其自身的遗传物质，通常难以在不影响在同一生物样品中还提取一种类型的微生物的遗传物质的能力的情况下，从另一种类型的微生物中提取遗传物质。然而，本发明允许从样品中的不同类型的微生物中提取遗传物质，而不牺牲可以通过提取同一样品中的一种类型的微生物的遗传物质来从另一种类型的微生物获得的遗传物质的量。根据本发明，包括微生物的样品可以是生物样品、环境样品、人工产生的样品(例如，实验室测试或对照样品、益生菌组合物或补充剂的样品等)等。生物样品的实例包含组织样品、血液样品、血浆样品、脑脊液样品、尿液样品、粪便样品、从消化道获得的物质的样品、生物分泌物(例如，精液、阴道分泌物、母乳、眼泪、唾液等)等。可以将固体样品液化或与溶液混合，并且然后可以根据本发明提取存在于液化样品、混合物或从混合物中获得的溶液中的微生物的遗传物质。提取的遗传物质可以经受进一步的处理和分析，如纯化、扩增和测序。
在一些实施例中，使所提取的遗传物质经受宏基因组学分析，以例如鉴定从其中提取遗传物质的样品中的一种或多种类型的微生物。在另外的实施例中，可以对制备的从人粪便样品中提取的核酸物质执行完整的全基因组鸟枪法测序。制备包含用于去除有机溶剂、杂质、盐、苯酚的核酸清理反应和抑制污染物的其它工艺。另外的制备包含从每个样品制备的核酸库，其中gDNA经受修饰和/或扩增以制备样品以用于在测序平台上进行测序，如通过合成、纳米孔、长读段和/或CMOS电子测序方法进行的大规模平行测序。
如本文所公开的，本发明方法允许通过使微生物以特定顺序经受三种不同组合物来成功地从存在于同一样品中的一种或多种不同类型的微生物中提取遗传物质。根据本发明的方法包括首先裂解存在于样品中的任何革兰氏阴性细菌，然后消化存在于样品中的任何酵母和细菌的细胞壁的多糖组分，并且然后在第二步骤之后用离液剂破坏任何完整的细胞壁。
简而言之，在一个实施例中，第一步骤包括将样品与包括洗涤剂(例如，十二烷基硫酸钠(SDS)和螯合剂(例如，乙二胺四乙酸(EDTA))的第一裂解溶液混合，以裂解存在于样品中的任何革兰氏阴性细菌。第一裂解溶液可以进一步包含一种或多种缓冲液(例如，Tris)、一种或多种温和洗涤剂(例如，TritonTM X-100)和/或一种或多种蛋白酶(例如，蛋白酶K)。
在第一步骤之后，将样品与包括溶菌酶的第二裂解溶液混合，以消化存在于混合物中的任何酵母和细菌细胞壁的多糖组分。因为溶菌酶可以抑制第一裂解溶液的活性，所以重要的是在用第一裂解溶液处理样品之后，使样品与第二裂解溶液接触。
在用第二裂解溶液处理之后，将包括离液剂(例如，尿素、乙酸锂、盐酸胍等)的第三裂解溶液加入混合物中以破坏第二裂解溶液没有消化的任何细胞壁。第三裂解溶液可以包含如SDS等洗涤剂。
在一些实施例中，第一裂解溶液和第三裂解溶液两者均包括处于介于1％w/v与10％w/v之间的工作浓度的SDS。在一些实施例中，在用第三裂解溶液处理之后，用第四裂解溶液进一步处理混合物，所述第四裂解溶液包括离液剂(例如，尿素、乙酸锂、盐酸胍等)和蛋白酶K。在第三裂解溶液的离液剂是乙酸锂的一些实施例中，然后使混合物经受热休克处理并且然后可以用第四裂解溶液进行处理。
在某些方面，以下公开内容描述了用于一种使用样品以进行DNA提取并且基于来自肉、植物、水果、蔬菜和/或与这些生物体一起含有的微生物的数据库的食物DNA序列来确定食物消耗的通用方法。本文公开了从样品中的一种或多种类型的细胞或细胞组分的不同群体中提取遗传物质并且确定所消耗的食物和营养分解以改善健康和预防疾病的方法。
在一些实施例中，从消化道等中获得生物分泌物(例如，精液、阴道分泌物、母乳、眼泪、唾液、血液、尿液等)。可以将固体样品液化或与溶液混合，并且然后可以根据本发明或本领域已知的其它标准核酸提取方案来提取含有遗传物质的任何食物物品(如液化样品、混合物或从混合物中获得的溶液中的植物性食物(幼苗、叶、子叶、种子、胚乳、组织培养愈伤组织、根等)、动物性食物、基于真菌的或基于原生生物的食物)的遗传物质。在一些实施例中，所提取的遗传物质可以经受进一步的处理和分析，如纯化、扩增和测序。在一些实施例中，使所提取的遗传物质经受宏基因组学分析，以例如鉴定从其中提取遗传物质的样品中的一种或多种类型的生物体。
在一些实施例中，已经出于鉴定和在适当的种系发生内在分类学上为核酸分配由人或其它动物摄入的生物体或生物体组分的相对丰度的特定目的而定制宏基因组学分析将利用的数据库。在一些实施例中，另外的数据表或数据库可以用来查找生物体的相对丰度，以确定生物体的肠道样品的大量营养素作为对其饮食的表示。在一些实施例中，这种大量营养素分解可以包含脂肪、碳水化合物、蛋白质、维生素矿物质和任何大量营养素的子组分。
如本文所公开的，本发明方法允许通过使样品经受分离、纯化或用于捕获核酸的其它方法成功地从存在于同一样品中的一种或多种不同类型的生物体、生物体的细胞或细胞基质或细胞器中的一种或多种中提取遗传物质。根据本发明的方法包括裂解或破坏样品中的任何食物细胞，包含但不限于任何细胞壁和细胞膜、消化样品中存在的任何真菌、植物、哺乳动物或原生生物细胞的任何细胞壁或细胞膜的多糖或木质素组分以及在消化步骤之后用离液剂破坏任何完整的细胞壁。
本发明包含通过液氮闪冻和立即的机械破坏或研磨来物理地破坏食物细胞的细胞壁或细胞膜以使细胞壁分解并在化学裂解之前保持有害细胞酶失活的步骤。本发明包含包含包括将样品与包括洗涤剂(例如，十二烷基硫酸钠(SDS))和螯合剂(例如，乙二胺四乙酸(EDTA))的第一裂解溶液混合以裂解样品中存在的任何动物细胞的步骤。第一裂解溶液可以进一步包含一种或多种缓冲液(例如，Tris)、一种或多种温和洗涤剂(例如，TritonTMX-100，十六烷基三甲基溴化铵)和/或一种或多种蛋白酶(例如，蛋白酶K)。在特定实施例中，第一裂解溶液包括处于介于1％w/v与10％w/v之间的工作浓度的SDS。本发明包含包括将样品与包括离液剂(例如，尿素、乙酸锂、盐酸胍等)的第二裂解溶液混合的步骤。第二裂解溶液可以包含如SDS等洗涤剂。在特定示例实施例中，可以按任何特定顺序加入第一裂解溶液和第二裂解溶液。
在一些实施例中，本发明可以包含包括将样品与包括溶菌酶的第三裂解溶液混合以消化混合物中存在的任何真菌或细菌细胞壁的多糖组分的步骤。在一些实施例中，可以用第四裂解溶液进一步处理混合物，所述第四裂解溶液包括离液剂(例如，尿素、乙酸锂、盐酸胍等)和蛋白酶K。在第四裂解溶液的离液剂是乙酸锂的一些实施例中，可以然后使混合物经受热休克处理并且然后可以用第四裂解溶液进行处理。在特定示例实施例中，可以在任何点处将第三和/或第四溶液加入混合物中，以破坏未被任何先前裂解溶液消化的任何细胞壁。
在一些实施例中，如果样品具有或疑似具有细菌和/或真菌孢子，则可以在与第一裂解溶液接触之前使样品经受诱导孢子的细胞壁的萌发的预处理步骤。预处理步骤可以包括将样品与如温和洗涤剂(例如，吐温-80(Tween-80))等化学品混合以诱导萌发，或在诱导萌发的条件(例如，温度)下培养样品。在用化学品诱导萌发的一些实施例中，化学品优选地是不抑制、降低或修改第一裂解溶液、第二裂解溶液和第三裂解溶液的活性或有效性的化学品。
在一些实施例中，根据本发明的方法可以进一步包含一个或多个机械处理步骤，所述机械处理步骤通过包含超声处理、珠粒混合、珠磨机均质化、加压、微流化等的机械方法引起物理裂解。在一些实施例中，在使样品经受第一裂解溶液之前执行机械处理步骤。
在实施例中，根据本发明的方法能够从包含以下的各种微生物中提取核酸分子：酵母(即酵母菌(Saccharomyces spp.))、革兰氏阴性细菌(例如，不动杆菌(Acinetobacterspp.))、革兰氏阳性细菌(例如，双歧杆菌(Bifidobacterium spp.))、病毒(例如，核盘菌(Sclerotinia spp.))、孢子(芽孢杆菌(Bacillus spp.))、蠕虫(绦虫棘球(Echinococcusspp.))、原生动物(肉足纲(Sarcodina)——变形虫，例如，内阿米巴属(Entamoeba))和噬菌体(例如，乳杆菌属(Lactobacillus)噬菌体)。
在实施例中，根据本发明的方法能够从各种生物体中提取核酸分子，所述各种生物体包含真菌(即酵母菌)、动物细胞(家牛)、植物(例如，大麦)。
以下实例旨在说明而非限制本发明。
提取方法A
将范围为10mg到5000mg的样品加入无菌的2毫升(mL)微离心管中。可以任选地通过加入400微升(μL)的珠粒纯混合物并以8000rpm涡旋约30秒来执行珠击(bead beating)。然而，如果期望获得高分子量核酸，例如，基因组DNA，则优选地避免珠击。
第一裂解溶液处理步骤
为了裂解样品中的任何革兰氏阴性细菌，通过将约400μL消化缓冲液(1％w/vSDS、25mM Tris HCl、2.5mM EDTA、1％TritonTM X-100，pH 8)和约20μL蛋白酶K加入样品中并轻轻混合来使样品经受第一裂解溶液。然后将混合物在55℃下温育约30分钟。
第二裂解溶液处理步骤
为了裂解样品中的任何革兰氏阳性细菌，将包括糖苷水解酶(“溶菌酶”)的第二裂解溶液加入从第一裂解溶液处理步骤获得的混合物中，以得到1mg/mL的最终溶菌酶浓度并且pH为约8.0。可以从各种来源获得合适的糖苷水解酶，所述各种来源包含蛋清、眼泪或各种动物的粘液或唾液。然后将混合物在37℃下温育约1到24小时。
第三裂解溶液处理步骤
为了裂解样品中存在的任何真菌和/或酵母细胞，加入包括1M乙酸锂于蒸馏的无菌H2O中和5％w/v SDS的第三裂解溶液，以获得从第二裂解溶液处理步骤得到的混合物的约1:5稀释。将经过处理的混合物在70℃下温育15分钟，然后在95℃下热休克一分钟，并且然后通过置于22℃的水浴中使所述混合物升至室温。
由于第二裂解溶液处理步骤和第三裂解溶液处理步骤足以裂解噬菌体和病毒的外包衣，因此无需另外的步骤即可从样品中可能存在的噬菌体和病毒中提取遗传物质。
提取方法B
预裂解处理步骤
将100-200mg的样品加入无菌的2毫升(mL)微离心管中。加入500mL液氮并且允许样品冷冻30秒。然后在继续到下一步骤之前使用捣碎棒或锯齿状发生器探针彻底研磨样品。
第一裂解溶液处理步骤
为了裂解样品中的任何动物、真菌和原生生物食物细胞膜，通过将约400μL消化缓冲液(1％w/v SDS、25mM Tris HCl、2.5mM EDTA、1％TritonTM X-100、1.2M NaCl pH 8)和约20μL蛋白酶K加入样品中并轻轻混合来使样品经受第一裂解溶液。然后将混合物在55℃下温育约30分钟。
第二裂解溶液处理步骤
为了裂解样品中存在的任何真菌和/或酵母细胞，加入包括1M乙酸锂于蒸馏的无菌H2O中和5％w/v SDS的第二裂解溶液，以获得从第一裂解溶液处理步骤得到的混合物的约1:5稀释。将经过处理的混合物在70℃下温育15分钟，然后在95℃下热休克一分钟，并且然后通过置于22℃的水浴中使所述混合物升至室温。
核酸纯化
在一个实施例中，从经裂解的微生物中提取的遗传物质，即在经受第一裂解溶液处理步骤、第二裂解溶液处理步骤和第三裂解溶液处理步骤后存在于混合物中的核酸分子然后通过将混合物分到两个微离心管中而纯化到DNA和RNA纯化。通过加入约20μLRNAse A并且在室温下温育5分钟来从一个试管中提取DNA。使混合物穿过生物聚合物组织均质器柱。如果先前执行珠击，则优选地避免使混合物经受组织均质器柱。
然后将洗脱液以1000g离心5分钟。用约400μL的DNA裂解溶液(盐酸胍、Tris-EDTA和70％EtOH)和约20μL的蛋白酶K处理上清液、混合并且在55℃下温育10分钟。然后加入处于-22℃的EtOH，并且通过反相将混合物混合。可以使混合物经受本领域已知的一种或多种另外的DNA提取和纯化方法。
通过使混合物穿过生物聚合物组织均质器柱，从第二微离心管中提取RNA。再次，如果先前执行珠击，则优选地避免使混合物经受组织均质器柱。然后将洗脱液以1000g离心5分钟。用约40μL DNase I(1U)于25mM MgCl2溶液中处理上清液，并且然后在37℃下温育15分钟。然后使混合物经受异硫氰酸胍-苯酚-氯仿提取。可以使混合物经受本领域已知的一种或多种另外的RNA提取和纯化方法。
在一个实施例中，从经裂解的微生物中提取的遗传物质，即在经受第一裂解溶液处理步骤、第二裂解溶液处理步骤和预裂解处理步骤后存在于混合物中的核酸分子然后通过将混合物分到两个微离心管中而纯化到DNA和RNA纯化。通过加入约20μL RNAse A并且在室温下温育5分钟来从一个试管中提取DNA。
然后将洗脱液以1000g离心5分钟。用约400μL的DNA裂解溶液(盐酸胍、Tris-EDTA和70％EtOH)和约20μL的蛋白酶K处理上清液、混合并且在55℃下温育10分钟。然后加入处于-22℃的EtOH，并且通过反相将混合物混合。可以使混合物经受本领域已知的一种或多种另外的DNA提取和纯化方法。
从第二微离心管中提取RNA。然后将洗脱液以1000g离心5分钟。用约40μL DNase I(1U)于25mM MgCl2溶液中处理上清液，并且然后在37℃下温育15分钟。然后使混合物经受异硫氰酸胍-苯酚-氯仿提取。可以使混合物经受本领域已知的一种或多种另外的RNA提取和纯化方法。
在期望RNA分子的定量表达的一些实施例中，优选地使用RNA稳定缓冲液和珠击以确保RNA核酸分子的释放和有限的降解。
在期望提取高分子量核酸分子的一些实施例中，避免珠击和组织均质器柱并且执行苯酚-氯仿-醇提取而不是基于硅胶柱的提取。在一些实施例中，可以执行基于磁珠的核酸纯化。为了去除核酸的选择性分子量并纯化样品，可以执行基于琼脂糖凝胶的纯化和富集。
宏基因组学分析
在一个实施例中，制备经提取和经纯化的遗传物质以使用因美纳(Illumina)索引适配器进行测序，并且对其大小和量进行检查。对于少于50ng DNA的任何输入，在1与20个循环之间执行低循环PCR；否则，对于50ng核酸或更多，可以利用无PCR的库制备方法。使用Qiagen Gel Purification KitTM(马里兰州弗雷德里克的凯杰公司(Qiagen，Frederick，MD))执行凝胶纯化。使用QubitTM 2.0荧光计(加利福尼亚州卡尔斯巴德的生命科技公司(Life Technologies，Carlsbad，CA))对干净的PCR产物进行
定量。以等摩尔量合并样品。使用Fragment AnalyzerTM CE(爱荷华州埃姆斯的先进分析技术公司(Advanced Analytical Technologies Inc.，Ames IA))对库池进行大小验证，并使用QubitTM高灵敏度dsDNA试剂盒(加利福尼亚州卡尔斯巴德的生命技术公司)进行定量。稀释后，使1％到10％掺入PhiXTM V3库对照物(加利福尼亚州圣地亚哥因美纳公司(Illumina,San Diego CA))的池在等体积的0.1N NaOH中变性持续5分钟，然后在因美纳的HT1缓冲液中进一步稀释。将经过变性且掺有PhiXTM的池装载在具有因美纳测序引物的Illumina Next GenerationTM测序仪上，并且针对介于50到550个碱基设定配对末端读段或单个读段。
用于短插入片段(short insert)方法的范围为1000或更大的测序读段可以用于此方法。大插入片段方法(如Pac BioTM、NanoporeTM或其它下一个基因测序方法)可以使用<1000个测序读段。在分类分配之前执行生物信息学质量过滤。原始测序文件的质量修整可以包含去除测序衔接子或索引；基于质量评分(Q20>)、末端碱基对或信号强度来修整读段的3'端或5'端；基于质量评分、GC含量或未经比对碱基对来去除读段；去除固定数目的碱基对的重叠读段。使用定制的微生物基因组数据库对经过处理的测序文件进行比对，所述数据库由来自refseqTM、GreengeensTM、HMPTM、NCBITM、PATRICTM或其它公共/私有数据存储库或内部数据集组成。此数据库可以用作全基因组比对支架、k聚体片段比对或在宏基因组学和生物信息学领域中实践的其它方案。基于与数据库基因组相匹配的测序读段/片段的数量，分配生物体共有的或独特的分类学身份。此标识符可以是条形码、核苷酸序列或一些其它计算标签，所述计算标签将使匹配的测序读段与分类组内的生物体或菌株相关。一些标识符将属于更高阶并且将鉴定生物体的域、界、门、纲、目、科或属。
本发明能够鉴定物种内最低目菌株的生物体。
在实施例中，本发明包含对数据库内含有的一种或多种细菌进行鉴定和/或分析(图10)。一些选定的实例是克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)、动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)、乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)、印度不动杆菌(Acinetobacter indicus)、唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)、不动杆菌属(Acinetobacter)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、婴儿长双歧杆菌亚种(Bifidobacterium longum subspinfantis)、海氏肠球菌(Enterococcus hirae)、德氏乳酸杆菌亚种保加利亚乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii subsp bulgaricus)、肠球菌(Enterococcus)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、克雷伯氏菌(Klebsiella)和阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)菌株。
在实施例中，本发明包含对数据库内含有的一种或多种酵母进行鉴定和/或分析(图10)。一些选定的实例是鲍氏酵母菌(Saccharomyces sp.Boulardii)、库德里阿兹威酵母菌(Saccharomyces kudriavzevii)、巴氏酵母菌(Saccharomyces pastorianus)和酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)。
在实施例中，本发明包含对数据库内含有的一种或多种噬菌体或病毒进行鉴定和/或分析(图10)。一些选定的实例是芽孢杆菌噬菌体phi29、肠杆菌噬菌体HK022、乳杆菌噬菌体A2、埃希氏杆菌(Escherichia)噬菌体HK639、噬菌体cdtI、核盘菌分体病毒S区段2、伯克霍尔德氏菌(Burkholderia)噬菌体BcepMu、乳球菌噬菌体bIL311、肠球菌噬菌体phiFL4A和链球菌噬菌体SM1。
未来的数据库改进将增加或改善可以通过词方法检测的生物体。
在一个实施例中，制备经提取和经纯化的遗传物质以使用因美纳(Illumina)索引适配器进行测序，并且对其大小和量进行检查。可以执行低循环PCR或标准的无PCR方法。使用Qiagen Gel Purification KitTM(马里兰州弗雷德里克的凯杰公司)执行凝胶纯化。使用QubitTM 2.0荧光计(加利福尼亚州卡尔斯巴德的生命科技公司)对干净的PCR产物进行定量。以等摩尔量合并样品。使用Fragment AnalyzerTM CE(爱荷华州埃姆斯的先进分析技术公司)对库池进行大小验证，并使用QubitTM高灵敏度dsDNA试剂盒(加利福尼亚州卡尔斯巴德的生命技术公司)进行定量。稀释后，将10％的PhiXTM V3库对照物(加利福尼亚州圣地亚哥的因美纳公司)掺入物池在等量的0.1N NaOH中变性5分钟，然后在因美纳的HT1缓冲液中进一步稀释。将经过变性且掺有PhiXTM的池装载到具有因美纳测序引物的IlluminaTM下一代测序仪上，并且设定为150个碱基、配对末端读段。在分类分配之前执行生物信息学质量过滤。
使用表1确定个体已消耗了以下各项：
表1
Figure GDA0003493725430000131
监测大量营养素摄入和饮食指导
在一些实施例中，本发明可以用于监测受试者的食物摄入营养、数量和质量。例如，在用益生菌治疗之前，可以获得从受试者的消化道获得的样品，并且如本文所公开地提取其中的食物生物体的遗传物质并且使其经受宏基因组学分析。包含全参考基因组、部分参考基因组或不完整的参考基因组、RNA或核酸组分或片段的定制的食物特定数据库将通过生物信息学工具用于从测序中鉴定、定量和在分类学上分配核酸信息。其输出在下面的表2中例示并且含有对肠中的生物体的物种或生物体的细胞的鉴定。
表2
Figure GDA0003493725430000132
然后在用给定益生菌治疗期间和/或之后，可以从受试者的消化道获得第二样品，并对第二样品中的微生物的遗传物质进行提取并经受宏基因组学分析，将分析结果与第一样本的宏基因组学分析的结果进行比较。然后，基于比较结果，可以将食物生物体结果与微生物群系生物体结果进行比较，以了解与食物相关的微生物以及整体食物质量评估。在一些实施例中，这可以向生物体的物种提供以下信息：个体正在通过其食物来源摄入并且通过选择或直接修饰对所述物种进行的任何遗传修饰、突变或不规则性。
在一些实施例中，微生物群系分析的第二样品将使得能够检测食物生物体常见的微生物并且提供关于食物生物体健康的信息。在一些实施例中，人消耗的食物可以是常见食物来源(如鸡、牛、猪、或者甚至植物以及原生生物)的一部分，这些物种将被鉴定并与特定于其的微生物相匹配。在特定示例实施例中，可以在分析的第二肠道微生物群系样品中检测到可能具有鸡肉瘤病毒的鸡物种。在一些实施例中，所摄入食物生物体的健康可以通过对宿主生物体健康有负面影响的微生物的存在或不存在来确定。在特定示例实施例中，可以检测可能影响宿主生物体健康的疾病，如马的呼吸道疾病，即马科动物疱疹病毒(Equid herpesvirus)2。
在一些实施例中，本发明可以用于筛选给定受试者的肠道微生物群系，并且然后个性化定制使受试者在营养平衡、改善的肠道微生物概况和营养素吸收方面改善其健康质量的食物或饮食方案。
监测益生菌治疗
在一些实施例中，本发明可以用于监测受试者的益生菌治疗。例如，在用益生菌治疗之前，可以获得从受试者的消化道获得的样品，并且如本文所公开地提取其中的微生物的遗传物质并且使其经受宏基因组学分析。然后在用给定益生菌治疗期间和/或之后，可以从受试者的消化道获得第二样品，并如在本文公开的对第二样品中的微生物的遗传物质进行提取并经受宏基因组学分析，将分析结果与第一样本的宏基因组学分析的结果进行比较。然后，基于比较结果，可以修改受试者的益生菌治疗以获得受试者肠道中的微生物的期望群体。例如，可以向受试者施用包括期望在受试者的肠道中增加量的微生物的益生菌。
在一些实施例中，可以对粪便样品进行混合或培养以确定微生物粪便群落的代谢组学。代谢组学概况然后可以用于确定有益于个体的益生菌菌株。代谢组学概况的实例包含影响能量代谢、营养素利用、胰岛素耐受性、脂肪过多、血脂异常、炎症、短链脂肪酸、有机酸、细胞因子、神经递质化学品或表型的代谢组学概况并且可以包含其它代谢组学标志物。
微生物群系筛选和益生菌选择
本发明已经成功地用于确定各种可商购益生菌的微生物含量。另外，本发明的方法用于确定各种益生菌的微生物含量和受试者肠道中的微生物群系含量。在一个实施例中，基于受试者肠道中的微生物群系含量和其任何期望的变化，可以选择一种或多种含有期望增加的和/或维持在受试者的微生物群系健康方面的微生物的益生菌。在一个实施例中，基于受试者肠道中的微生物群系含量和其任何期望的变化，可以选择一种或多种含有期望增加的和/或维持在受试者的肠道平衡方面的微生物的益生菌，所述微生物与如通过来自个体的调查信息直接记录的或通过本发明的肠道生物体核酸分析来记录的、受试者从其食物来源中获取的大量营养素含量有关。
其中微生物群系表示其微生物群和其中含有的来自细菌、真菌、病毒、噬菌体和寄生虫的生物体的全貌。例如，使用本文所描述的方法，确定受试者的肠道微生物群系含有25％A和75％B，确定益生菌1含有75％A和25％B，并且确定益生菌2含有25％A和75％B。如果期望维持受试者的肠道微生物群系，则可以选择益生菌2以用于向受试者施用。然而，如果期望受试者肠道中A和B的量为50/50，则可以选择向受试者施用益生菌1和益生菌2两者。可替代地，可以选择益生菌1以向受试者施用，直到受试者的肠道中A和B的量达到50/50。在一些实施例中，可以个性化定制益生菌调配物，例如，含有相等的、变化的或不同量的A和B或其它益生菌菌株以用于向受试者施用。利用个体肠道中存在的微生物的相对丰度的计算模型将有助于确定微生物的类型、剂量和混合物，以包含在益生菌中。例如，如果确定与一般群体或先前微生物群系分析相比生物体A减少或不存在，则将提供将增加生物体A的浓度的益生菌或益生元。此益生元或益生菌可以是确切的生物体A或者支持生物体A生长的另一种生物体。给定的剂量应考虑个体中生物体的相对丰度、益生元/益生菌的性能特性，如生长速率、相容性、受体或受体密度、基因、或表达模式、或代谢组学产物。
个性化定制的益生菌的量可以不相等但是是基于从单独的肠道/粪便样品中检测到的相对丰度来调配的。这些调配物适合于将微生物群系调节到健康状态。微生物群系的健康状态通过使用现有的聚合私有和公共数据库(如metaHITTM、Human MicrobiomeProjectTM、American Gut ProjectTM等)来确定。当人没有已知问题并且健康状况良好时，还可以从血液生物标志物检查的角度单独确定健康状态，并且然后完成其完整的微生物群系概况。在完成一个或若干微生物群系特征之后，则可以了解所述个体的所发现的微生物的全部或部分的平均数，并且可以访问与所述平均数的差异以确定所述微生物是否处于生态失调。微生物群系概况可以聚合到组中，所述组然后被分配条形码以用于快速生物信息学分配。可以通过与从其收集样品的个体相关的单个或多个表型信息、诊断信息或人口统计学信息来创建组。通过使用如线性距离计算等统计模型、多样性值、如C4.5决策树等分类器、或主成分分析并且与由人类微生物群系计划或美国肠道计划定义的聚合已知群体(如“常量(normals)”)进行比较来从另一组确定独特的组。
因此，在一些实施例中，本发明可以用于筛选给定受试者的肠道微生物群系，并且然后基于受试者的肠道微生物群系为给定受试者个性化定制益生菌方案。
生态失调的治疗
在一些实施例中，本发明可以用于在导致受试者的微生物群从平衡的微生物群系转变为产生或可能产生负面的副作用、病症和/或疾病的微生物群系的事件后，将受试者的肠道菌群和/或动物群恢复到内稳态。健康状况可以包含但不限于从痤疮和过敏症到胃肠道疾病、肥胖症和癌症的各种状况。此类生态失调的一个实例是在肥胖症发作的情况下。已经示出，受试者肠道中的若干微生物菌株与受试者遭受的肥胖症或体重管理问题相关。参见例如Ley等人.(2005)《美国国家科学院院刊(PNAS USA)》102:11070-11075。例如，在肥胖的动物和人受试者中，拟杆菌属(Bacterides)门微生物和厚壁菌门微生物的比率在代谢性能中起重要作用。参见例如Turnbaugh等人.(2012)《公共科学图书馆期刊(PLOS ONE)》7:e41079。已知与肥胖症和体重管理问题相关的一些肠道微生物包含单形拟杆菌(Bacteroides uniformis)、嗜果胶拟杆菌(Bacteroides pectinophilus)、食葡糖罗斯氏菌(Roseburia inulinivorans)、史氏甲烷短杆菌(Methanobrevibacter smithii)和动物双歧杆菌。
因此，在一些实施例中，使用本文描述的方法确定受试者的肠道中的第一给定微生物和第二给定微生物的比率，并且然后如果比率是不期望的或异常的，则对受试者施用治疗以将比率修改为期望比率。在一些实施例中，使用本文描述的方法确定相对于受试者的肠道中所有微生物的总量的受试者的肠道中的第一给定微生物的量，并且然后如果第一给定微生物的相对量是不期望的或异常的，则对受试者施用治疗以将量修改为期望量。对所述受试者的肠道微生物群系进行重新测试可以用于很好地确定其是否遵循大量营养素和食物指导。此类治疗包含向受试者施用：含有期望在受试者的肠道中增加量的一种或多种微生物的益生菌、用于杀死或减缓期望在受试者的肠道中减少量的一种或多种微生物的生长的抗微生物剂，例如，抗生素、抗真菌剂、抗病毒剂等、支持健康肠道微生物群系的生长或维持的饮食和/或饮食补充剂，例如，益生元、镁、鱼油、L-谷氨酰胺、维生素D等。例如，Million等人.((2005)《国际肥胖期刊(Int.J.Obes.)》36:817-825)指示肥胖受试者的肠道微生物群富含罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)，并耗尽动物双歧杆菌和史氏甲烷短杆菌。因此，在使用本文所描述的方法确定受试者肠道中的罗伊氏乳杆菌、动物双歧杆菌和史氏甲烷短杆菌的量并且发现所述量是肥胖症相关肠道微生物群的典型量或指示量之后，可以向受试者施用含有动物双歧杆菌和史氏甲烷短杆菌以及相对很少量甚至没有罗伊氏乳杆菌的益生菌。在实施例中，肥胖受试者的肠道微生物群将受益于具有黄酮类、多酚和短链脂肪酸的食物。
微生物群系的评分
微生物群系特征评分总体上使用如表3所表示的类似的决策树、算法、人工智能、脚本或逻辑树。此系统将实现对帮助用户了解其肠道微生物群系的健康状况如何及其是否需要对发现的几个或很多挑战采取行动进行评分。挑战可以包含但不限于鉴定已知的病原生物体；对机会性病原体、已知在给予机会时引起致病性影响的潜在生物体进行计数和鉴定；缺乏对良好微生物环境而不是其组合物的支持，或缺乏关键菌株、总体多样性以及对在前10种中发现的独特生物体和或患病率大于0.1％的生物体进行计数。
根据样品分析的聚合来确定多样性截止值，并且在相对丰度为x下确定截止值。例如，如果x＝0.1％，则352个独特生物体组成平均健康概况。然后围绕此数字应用标准偏差，并且在曲线分析下使用高斯分布和百分位数，可以对数据库平均值与平均多样性数字的接近程度进行评分。多样性数字越低并且距离平均值越远，则微生物群系的评分就越低。数字越高并且多样性越大，则微生物群系的评分就越高。这种类型的评分类别以及益生菌评分将确定定制的数字和视觉计量评分，以了解所述益生菌的微生物群系的健康状况如何。以下包含了图形可视化的实例。其中低相当于低微生物群系质量，并且高相当于高微生物群系质量和评分。低->30(满分100)，中等>65(满分100)，高＝65或更高(满分100)。
下表3中包含了评分和益生菌公式算法的实例。表3可以表示为决策树、算法、人工智能、脚本或逻辑树。此类决策树、算法、人工智能、脚本或逻辑树的函数将是输出与检测到的益生菌有关的单独微生物群系的健康评分，并且为益生菌使用提供调配物和剂量建议。
下表4中阐述了可以将微生物分组的潜在类别的示例性列表。
表3
益生菌评分和调配物的示例决策表。
包含对益生菌菌株数据库、宏基因组学分析数据库和文献管理数据库的利用
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表4
从其中创建组的潜在类别
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Figure GDA0003493725430000221
以下提供了描述微生物群系群体和肠道微生物与疾病的连接的另外的表。
表5
可以用于恢复微生物生态系统的状况和概况的肠道细菌菌株列表
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表6
影响个体的微生物群系和肠健康的致病微生物的肠道细菌菌株列表
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表7-10
详细说明示例性粪便样品中的拟杆菌属、古细菌、真核生物、病毒和细菌的丰度的完整GutBusterTM报告的实例
表7
拟杆菌的丰度报告
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表8
古细菌的丰度报告
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表9
真核生物丰度报告
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表10
病毒丰度报告
Figure GDA0003493725430000632
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Figure GDA0003493725430000651
表11
细菌丰度报告
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表12
详细说明示例性粪便样品中发现的前10位生物体的丰度的GutBusterTM报告的实例
Figure GDA0003493725430000842
表13
详细说明示例性粪便样品中发现的影响者生物体的丰度的GutBusterTM报告的实例
Figure GDA0003493725430000851
Figure GDA0003493725430000861
表14
示例性粪便样品中发现的革兰氏阳性细菌的丰度的报告
Figure GDA0003493725430000862
Figure GDA0003493725430000871
表15
肠道微生物群系中发现的生物体的列表
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除非另有说明，否则在本申请中使用的所有科学和技术术语具有本领域常用的意义。
如本文所使用的，术语“受试者”包含人和非人动物。术语“非人动物”包含所有脊椎动物，例如，哺乳动物和非哺乳动物，如非人灵长类动物、马、绵羊、狗、牛、猪、鸡和其它两栖动物、爬行动物。
除非另有特别说明，否则单数的使用包含复数。如在说明书和所附权利要求中所使用的，单数形式“一个(a)”、“一种(an)”以及“所述(the)”可以包含复数指示物，除非上下文另外清楚地指明。使用“或”可以意指“和/或”，除非另外说明。如本文所使用的，“和/或”意指“和”或“或”。例如，“A和/或B”意指“A、B或A和B两者”，并且“A、B、C和/或D”意指“A、B、C、D或其组合”，并且所述“其组合”意指A、B、C和D的任何子集，例如，单个成员的子集(例如，A或B或C或D)、两个成员的子集(例如，A和B；A和C等)或三个成员的子集(例如，A、B和C；或A、B和D等)，或所有四个成员(例如，A、B、C和D)。
如本文所使用的，术语“样品”和“生物样品”是指适于本发明提供的方法的任何样品。细胞样品可以是任何样品，包含例如通过如受试者的活检等非侵入性或侵入性技术获得的肠样品或粪便样品。在一个实施例中，术语“样品”是指源自受试者的粪便物或肠组织的任何制备物。例如，使用本文所描述的非侵入性方法获得的细胞样品可以用于分离用于本发明的方法的核酸分子或蛋白质。
在实施例中，分析可以是针对任何单链或双链核酸，包含DNA、RNA、cDNA、miRNA、mtDNA。此核酸可以是任何长度，短到约5bp的寡核苷酸，到长到兆碱基或甚至更长。如本文所使用的，术语“核酸分子”意指单链、双链或三链DNA、RNA和其任何化学修饰。实际上，考虑了核酸的任何修饰。“核酸分子”几乎可以是任何长度，从10个、20个、30个、40个、50个、60个、75个、100个、125个、150个、175个、200个、225个、250个、275个、300个、400个、500个、600个、700个、800个、900个、1000个、1500个、2000个、2500个、3000个、3500个、4000个、4500个、5000个、6000个、7000个、8000个、9000个、10,000个、15,000个、20,000个、30,000个、40,000个、50,000个、75,000个、100,000个、150,000个、200,000个、500,000个、1,000,000个、1,500,000个、2,000,000个、5,000,000个或甚至更多个碱基的长度，到全长染色体DNA分子。对于分析基因表达的方法，从样品中分离的核酸通常是RNA。
当单链核酸分子可以基于鸟嘌呤(G)与胞嘧啶(C)进行碱基配对以及腺嘌呤(A)与胸腺嘧啶(T)或尿苷(U)进行碱基配对的能力来与其它核酸分子的全部或一部分进行碱基配对(杂交)以形成双螺旋(双链核酸分子)时，所述单链核酸分子与另一个单链核酸分子“互补”。例如，核苷酸序列5'-TATAC-3'与核苷酸序列5'-GTATA-3'互补。
如本文所使用的，“杂交”是指核酸链通过碱基配对与互补链结合的过程。杂交反应可以是敏感的和选择性的，使得甚至在所关注的特定序列以低浓度存在的样品中也可以鉴定所述特定序列。在体外情况下，合适的严格条件可以通过例如预杂交和杂交溶液中的盐或甲酰胺的浓度或通过杂交温度来限定，并且是本领域众所周知的。具体地，可以通过降低盐浓度、提高甲酰胺浓度或提高杂交温度来提高严格性。例如，在高严格条件下的杂交可以在约37℃到42℃下在约50％甲酰胺中发生。杂交可以在约30℃到35℃下，在约35％到25％甲酰胺中在降低的严格条件下发生。具体地，杂交可以在42℃下在50％甲酰胺、5XSSPE、0.3％SDS和200mg/ml剪切和变性的鲑鱼精子DNA中在高严格条件下发生。如上所述，杂交可以在降低的严格条件下发生，但在35℃的降低温度下在35％甲酰胺中发生。通过计算所关注核酸的嘌呤与嘧啶的比率并相应地调节温度，可以进一步缩小对应于特定严格性水平的温度范围。上述范围和条件的变化是本领域众所周知的。
如本文所使用的，术语“微生物群系”是指栖息在受试者的肠道中的微生物，包含细菌、病毒以及真菌、古细菌、原生动物、变形虫或蠕虫。
如本文所使用的，术语微生物(microbial)、微生物(microbe)或微生物(microorganism)是指任何微观生物体，包含原核生物或真核生物、孢子、细菌、古细菌、真菌、病毒或单细胞或多细胞原生生物。
按照功能组件和各种处理步骤部分地描述本发明。可以通过被配置成执行指定功能并实现各种结果的任何数量的组件、操作和技术来实现此类功能组件和处理步骤。例如，本发明可以采用可以执行各种功能的各种生物样品、生物标志物、元件、材料、计算机、数据源、存储系统和介质、信息收集技术和过程、数据处理标准、统计分析、回归分析等。另外，尽管在医学诊断背景下描述了本发明，但是本发明可以结合任何数量的应用、环境和数据分析来实践；本文描述的系统仅仅是本发明的示例性应用。
可以以任何合适的方式(例如使用在计算机系统上操作的计算机程序)实施根据本发明的各方面的用于数据分析的方法。根据本发明的各方面，可以结合计算机系统(例如包括处理器和随机存取存储器的常规计算机系统，如远程可访问的应用服务器、网络服务器、个人计算机或工作站)来实施示例性分析系统。计算机系统还适当地包含另外的存储器装置或信息存储系统，如大容量存储系统和用户界面，例如常规监测器、键盘和跟踪装置。然而，计算机系统可以包括任何合适的计算机系统和相关联设备，并且可以以任何合适的方式配置。在一个实施例中，计算机系统包括独立系统。在另一个实施例中，计算机系统是包含服务器和数据库的计算机网络的一部分。
可以在单个装置中实施或在多个装置中实施需要用于接收、处理和分析遗传信息的软件。可以通过网络来访问软件，使得信息的存储和处理相对于用户远程发生。根据本发明的各方面的分析系统和其各种元件提供了用于促进微生物群系分析的功能和操作，如数据收集、处理、分析、报告和/或诊断。本发明的分析系统维持与微生物群系和样品有关的信息并且促进分析和/或诊断。例如，在本实施例中，计算机系统执行计算机程序，所述计算机程序可以接收、存储、搜索、分析和报告与微生物群系有关的信息。计算机程序可以包括执行各种功能或操作的多个模块，如用于处理原始数据并生成补充数据的处理模块以及用于分析原始数据和补充数据以生成模型和/或预测的分析模块。
分析系统还可以提供各种另外的模块和/或单独功能。例如，分析系统还可以包含报告功能，例如以提供与处理和分析功能有关的信息。分析系统还可以提供各种行政和管理功能，如控制访问和执行其它行政功能。
提供以下实例以进一步展示本发明的实施例，但并不旨在限制本发明的范围。虽然以下实例是可能使用的典型实例，但也可以可替代地使用本领域的技术人员已知的其它程序、方法或技术。
在理解或完成本发明的公开内容所必须的程度上，本文提及的所有出版物、专利、专利申请以如同各自单独地如此并入一样的相同程度据此通过引用清楚地并入。
实例
实例1
微生物群系分析
使受试者经受微生物群系分析以产生微生物群系概况。使用收集卡/专用纸收集受试者粪便样品。收集卡/专用纸用于保存所有所关注物种(包含噬菌体和病毒的)的DNA。专有DNA提取方案用于从粪便样品中的细菌、真菌、病毒、噬菌体、古细菌和蠕虫中提取DNA。使DNA经受鸟枪法测序。发现全基因组鸟枪法测序比16S测序更灵敏。分析由全基因组鸟枪法测序得到的数据，以确定样品中细菌、真菌、病毒、噬菌体、古细菌和/或蠕虫的存在。内部工具以及内部参考基因组一起用于鉴定样品中存在的一系列生物体，并且将丰度水平与一般群体进行比较。内部工具建立在开源和内部生物信息学软件上。内部参考基因组建立在具有内部管理的公共数据库上。
图1示出了>50岁并且是补充剂用户的高蛋白质饮食受试者的微生物群系特征的高患病率生物体。在样品中鉴定出了一系列若干不同的病毒、古细菌和真核生物体，以及确定生物体的丰度水平(图2-4)。图2示出了18-50岁并且具有素食饮食的高碳水化合物饮食受试者的微生物群系特征的高患病率生物体(细菌、病毒、噬菌体和古细菌)。图3示出了18-50岁并且具有非素食饮食的高碳水化合物饮食受试者的微生物群系特征的高患病率生物体(细菌、病毒、噬菌体和古细菌)。图4示出了0-2岁并且具有素食非哺乳饮食的高乳制品蛋白饮食受试者的微生物群系特征的高患病率生物体(细菌、病毒、噬菌体和古细菌)。样品中鉴定的病毒的实例包含金色藻(Chrysochromulina ericina)病毒和智利大病毒(Megavirus chilensis)。样品中鉴定的古细菌生物体的实例包含石油甲烷绳菌属(Methanolinea petrolera)和地中海富盐菌。样品中鉴定的真核生物体的实例包含新型隐球菌(Cryprococcus neoformans)和加蓬疟原虫。图5示出了患病率最低的生物体和对受试者的微生物群系特征的机会性病原体的鉴定。进一步地，在受试者样品中鉴定了不同系列的益生菌，如长双歧杆菌和嗜酸乳杆菌(图6-7)。
进行比较以示出在受试者样品中鉴定的微生物的相对丰度与一般群体之间的差异(图8)。如图8所示，此受试者的微生物群系与一般群体的微生物群系基本上类似，其中最大的差异在于罗斯氏菌(Roseburia)的水平。进一步地，进行分析以鉴定在来自受试者的样品中鉴定的最频繁和最不频繁的微生物，以及从样品中鉴定的不同系列的古细菌、细菌、真菌、原生动物和病毒的数量(图9和图10)。图9示出了来自饮食补充剂混合培养物的微生物群系概况。图10示出了对存储在本发明的数据库中的一系列独特的各种微生物的分类。
实例2
微生物群系分析的特定受试者实例
一名受试者在提供用于微生物群系分析的样品之前进行了调查。所述受试者为亚裔，BMI为24.7，并且自我报告相对高的能级(即4/5)。所述受试者没有消耗具有其它营养补充剂的蛋白质奶昔。所述受试者报告具有低饮酒量水平(每周1杯葡萄酒/啤酒)并且不抽烟。所述受试者的饮食由鸡肉、猪肉、牛肉、米饭、蔬菜和海鲜组成。对受试者的样品进行分析以鉴定软体动物、牛科和百合纲生物体(图11A-C)。鉴定了与海鲜消耗有关的若干类型的软体动物生物体，包含地中海贻贝(Mytilus galloprovincialis)和虾夷扇贝(Mizuhopecten yessoensis)(图11A)。鉴定了与肉消耗有关的若干类型牛科生物体，包含摩佛伦羊(Ovis aries musimon)和家牛(图11B)。鉴定了与谷物消耗有关的若干类型百合纲生物体，包含芦笋(Asparagus officinalis)和菠萝(Ananas comosus)(图11C)。
一名受试者被评估为正常对照受试者。使用公开的方法诊断受试者患有潜伏性乙型肝炎感染(图12)。后来通过血液试验证实了此诊断。
另一名受试者诊断患有小肠细菌过度生长(SIBO)。在使用抗生素治疗之前和治疗两个月之后对受试者的样品进行了分析(图13)。结果表明，在抗生素治疗后，脆弱拟杆菌、普通拟杆菌、多形拟杆菌、内脏臭气杆菌(Odoribactor splanchnicus)水平降低，并且活泼瘤胃球菌(Ruminococcus gnavus)、艰难梭菌(Clostridoides difficile)和大肠杆菌水平升高。
实例3
个性化益生菌的使用和发展
新颖益生菌的分离和表征以及以单一分离物或以组合形式递送回个体以将肠、血液、皮肤、肺、生殖器、口腔微生物群系恢复到改善的健康状态，并且减少与慢性病状、疾病或病症相关的症状，并在个体化疗法、补充剂、治疗或医疗产品之前，利用分子、生化、免疫或其它化学技术以检测肠、血液、皮肤、肺、生殖器、口腔(微生物生态系统)组分。使用益生菌菌株、益生元、后生元(postbiotics)、草药(如姜黄、姜黄素、亚麻籽)、草药提取物(纤维、菊粉、淀粉)或其它生物分子来降低代谢物、益生菌或分子的浓度以改善健康。除了使用这些已知的益生菌菌株外，太阳基因组学公司(Sun Genomics)在本文中还描述了使用新的肠道细菌菌株来恢复不利于宿主(人、动物或其它生物体)的微生物生态系统的状况和概况的方法。以下是使用的生物体的表格列表，所述生物体可以使用的所述表格列表组合不限于但是作为实例，菌株ID、将此限定为健康的概况以及可以影响恢复肠健康、慢性病状、健康、疾病或病症的概况类型的一部分或单独使用。实现这种情况的一种机制是通过对构成肠道系统内衬的细胞的紧密细胞连接修复进行的，这种修复是通过由肠道系统或肠道系统内微生物释放的分子来介导的。此类分子包含被称为抗性淀粉的短链脂肪酸(SCFA)。抗性淀粉尤其与一种被称为丁酸盐的SCFA相关，所述丁酸盐对结肠细胞具有保护作用，并且与较少的遗传损害有关，丁酸盐还以其它方式保护细胞。这是抗性淀粉相对于寡糖和可溶性纤维的真正优势之一。其发酵过程确实会产生丁酸盐，但不会在抗性淀粉的水平。本文中的本发明描述了通过使用已经从微生物生态系统中分离和/或纯化的其它微生物或与其它生物分子(如益生元、后生元、草药或提取物)一起在物种和菌株水平上精确地确定微生物生态系统的生物体并调节其浓度的能力。具体地，单独使用生物体和分子或结合其它分子和生物体来调节特定微生物群系概况，其中组合微生物中的任何微生物也可以是单独或组合使用的主要菌株。下表列出了可能在领导菌株处作为实例使用的常见菌株，并且扩展到了所述菌株之外到尚未发布到公共数据库的其它菌株。此过程的关键是全基因组测序、16s/18s/ITS测序、PCR或其它分子或生化方法，这些方法分析样品的蛋白质、DNA或RNA，并将生物体的鉴定和分类从界分配到物种和菌株。此系统通常被称为生物信息学平台，所述生物信息学平台先前已经在美国专利第10,428,370号中行了描述。此生物信息学系统然后可以与个体数据库一起使用，所述个体用作参考集以帮助限定健康正常概况。参考集然后充当调节微生物群系所朝向的目标。在图1中，此处个体的健康正常概况定义为杂食动物的实例，然而如食草动物或占支配地位的食肉动物的概况等其它概况可以表示为健康标准。如地中海饮食、严格素食饮食、素食(和其所有衍生物)饮食、原始饮食、酮饮食、阿特金斯饮食、慢碳水化合物饮食或地理区域饮食等也可以具有限定健康标准的概况，这些概况用作参考以用单一菌株或菌株与1种或多种的组合、或用多组或单组具有单个菌株的多个组合或来自任何其它组合的菌株组调节微生物群系。
如先前所描述的，收集并进行处理受试者样品。分析受试者样本以开发物种的微生物群系概况和生物体水平。将概况与健康的参考微生物群系概况进行比较，以鉴定微生物群系中的任何不平衡。开发了包含新的细菌菌株的个性化益生菌组合以纠正这些不平衡。健康的参考概况(即健康的肠道微生物群系)被定义为具有高于10％的粪杆菌属(Faecalibacterium)；高于2％的甲酸芽殖菌(Gemmiger formicillis)；低于12％的普通拟杆菌和介于1与5％之间的脆弱拟杆菌；以及高于1％或更多的解纤维拟杆菌(Bacteroidescelluosilyticus)、粪便(faecis)拟杆菌和细金(finegoldi)拟杆菌，各自具有大量的高于0.1％的益生菌多样性的生物体，包含加氏乳杆菌、嗜酸乳杆菌；乳酸乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、假链状菌以及至少为1％或更高或总量高于2％的粪便罗斯氏菌(Rosburia faecis)、肠道(inteninalis)罗斯氏菌或食葡糖(inulinlvorans)罗斯氏菌，以及1％或更高的真杆菌属物种，如直肠真杆菌、霍氏真杆菌、挑剔真杆菌。缺乏或减少的肠杆菌科生物体(低于2％)，如埃希氏杆菌属、志贺氏杆菌属、沙门氏菌属、候选菌属和克雷伯氏菌属生物体。缺乏或减少的假单胞菌属(低于1％)生物体。图14A-C中示出了用于限定健康参考概况的微生物群系概况的实例。
一名受试者在抗生素治疗后分析。细菌两歧双歧杆菌(Bifidobacteriumbilidus)通常在阴道分娩时从母亲转移到婴儿，并且是建立和定殖婴儿微生物的关键。在此受试者没有进行哺乳时，在抗生素治疗之前或之后均未发现婴儿双歧杆菌，并且这些生物体通过母乳转移到婴儿并且是增加母乳营养益处的关键。抗生素后和益生菌后分析表明，治疗完全恢复益生菌概况，从而帮助减少机会性病原体的定殖(图15)。
发现另一名受试者在肠道影响者组中具有多于一种益生菌生物体，这表明所述受试者对寄生微生物具有某种免疫力。制定了益生菌方案以最大化受试者的益生菌概况(图16)。
一名受试者的微生物群系概况在DNA水平上鉴定可能与腹泻或更复杂的胃肠道问题相关的若干革兰氏阴性微生物。前十种的微生物概况表明，大肠杆菌组成受试者的微生物群系的几乎70％，相比而言，大肠杆菌组成健康参考概况的40-60％。这表明存在细菌过度生长(图17)。
使用所公开的方法，特定的益生菌组合已经与特定微生物群系概况相关。另外，已经鉴定受益于受益于特定益生菌治疗的疾病状况(表5)。例如，阿克曼菌属可以用于新陈代谢和体重减轻以治疗肥胖症和慢性疲劳。已经发现罗斯氏菌可用于治疗炎性肠病、肠易激综合征、艰难梭菌感染或其它肠道炎症问题、产丁酸盐菌以及可能的自身免疫问题。
进一步地，使用所公开的方法，已经鉴定了影响微生物群系和肠健康的微生物，其中若干微生物以前先前未描述过(表6)。例如，保加利亚拟杆菌(Bacteroides bulgatus)和/或脆弱拟杆菌与肠易激综合征相关。在另一个实例中，克雷伯氏菌、埃希氏杆菌、沙门氏菌和/或志贺氏杆菌可以用于诊断癌症。
实例4
个体微生物群系概况
使用先前描述的方法，已经开发了许多受试者微生物群系概况。图18-24中示出了受试者微生物群系概况的实例。在这些实例中，鉴定了前10种微生物并且与一般群体进行比较。
一个实例表明，受试者大肠杆菌组成微生物的46.68％，其中肺炎克雷伯氏菌是在样品中鉴定的次最普遍微生物(图18A)。有趣的是，分析表明与健康参考相比，受试者的肠杆菌水平显著增加(图18B)。
在另一个实例中，人体普氏菌(Prevotells copri)是最普遍的微生物，其次是普拉梭菌(图19A)。与健康参考相比，此受试者示出显著降低的拟杆菌属水平(图19B)。
在另外的实例中，普拉梭菌是最普遍的微生物，其次是普通拟杆菌(图20A)。与健康参考相比，此受试者示出显著增加的粪杆菌属水平(图20B)。
在另外的实例中，双环状瘤胃球菌(Ruminococcus birculans)是最普遍的微生物，其次是普拉梭菌(图21A)。与健康参考相比，此受试者示出显著增加的拟杆菌属和另枝菌属水平(图21B)。
在一个实例中，双环状瘤胃球菌是最普遍的微生物，其次是普拉梭菌(图21A)。与健康参考相比，此受试者示出显著增加的拟杆菌属和另枝菌属水平(图21B)。
在一个实例中，穗状丁酸弧菌是最普遍的微生物，其次是普拉梭菌(图22A)。与健康参考相比，此受试者示出显著增加的另枝菌属水平和显著降低的拟杆菌属水平(图22B)。
在一个实例中，普拉梭菌是最普遍的微生物，其次是嗜黏蛋白阿克曼菌(图23A)。与健康参考相比，此受试者示出显著增加的另枝菌属、粪杆菌属和副拟杆菌属水平和显著降低的拟杆菌属水平(图23B)。
尽管已经参考以上实例描述了本发明，但应当理解，修改和变化均涵盖在本公开的精神和范围之内。因此，本发明仅由以下权利要求限制。

Claims (73)

1.一种用于使用肠道微生物群系的益生菌、益生元或代谢物减少或消除机会性病原体或引起病症的肠道微生物的检测、诊断和/或治疗方法。
2.根据权利要求1所述的方法，其包括检测肠道微生物并且将所述微生物鉴定为机会性病原体或引起疾病的微生物。
3.根据权利要求1所述的方法，其包括检测肠道微生物并且将所述微生物分离。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述微生物来自受试者的样品。
5.根据权利要求4所述的方法，其进一步包括向受试者施用经过分离的微生物以减少或消除所述受试者的机会性病原体或引起病症的肠道微生物。
6.根据权利要求1所述的方法，其包括通过检测肠道微生物来诊断受试者的疾病或病症。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述疾病或病症选自自闭症谱系障碍、情绪障碍、慢性疲劳、感染、坏死、炎症、自身免疫、出血、体重减轻、代谢障碍、肠易激病症、1型或2型糖尿病、类风湿性关节炎、癌症和心血管病症。
8.根据权利要求1所述的方法，其中检测、诊断和/或治疗是针对来自表5或5的疾病或病症的。
9.根据权利要求4所述的方法，其进一步包括向受试者施用经过分离的微生物以治疗疾病或病症。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述疾病或病症选自自闭症谱系障碍、情绪障碍、慢性疲劳、感染、坏死、炎症、自身免疫、出血、体重减轻、代谢障碍、肠易激病症、1型或2型糖尿病、类风湿性关节炎、癌症和心血管病症。
11.根据权利要求9所述的方法，其中所述疾病或病症在表5或6中示出。
12.一种菌株的用途，其单独地或以任何组合用于减少受试者的引起疾病或病症的微生物的丰度，所述菌株选自表5到15中所示的菌株。
13.根据权利要求12所述的用途，其中所述疾病或病症在表5或6中示出。
14.根据权利要求12所述的用途，其中所述菌株是从受试者的肠道分离的。
15.根据权利要求12所述的用途，其中所述菌株包括以下中的一种或多种的任何组合：鲍氏梭菌(Clostridium bolteae)、乳酸双歧杆菌(Bifidobacterium lactis)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)、两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、加氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)、唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)和/或凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)。
16.一种肠道生物群系菌株的益生菌、益生元和/或代谢物的用途，其用于减少受试者的酵母菌属(Blastocystis genus)生物体的丰度，所述酵母菌属生物体引起胃肠道相关病症，包含感染、腹泻和/或生态失调。
17.根据权利要求16所述的用途，其中所述酵母菌是人酵母菌(B.hominis)。
18.一种益生菌菌株的用途，其用于减少受试者的刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)的丰度。
19.一种肠道生物群系菌株的益生菌、益生元和/或代谢物的用途，其用于减少受试者的肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumonia)的丰度。
20.根据权利要求19所述的用途，其中所述益生菌包括以下中的一种或多种：凝结芽孢杆菌、印度杆菌(Bacillus indicus)、地衣芽孢杆菌(Bacillus lichenformis)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)、两歧双歧杆菌、短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)、凝结双歧杆菌(Bifidobacterium coagilans)、婴儿双歧杆菌(Bifidobacterium infantis)、乳酸双歧杆菌、长双歧杆菌、枯草双歧杆菌(Bifidobacterium subtilis)、屎肠球菌(Enterococcus faecium)、嗜酸乳杆菌、保加利亚乳杆菌、干酪乳杆菌、德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)、加氏乳杆菌、瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)、乳酸乳杆菌(Lactobacillus lactis)、副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)、植物乳杆菌、罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)、鼠李糖乳杆菌、唾液乳杆菌、鲍氏酵母菌(Saccharomyces boulardii)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophiles)、布氏乳杆菌(Lactobacillus buchneri)、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)、卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)、链状双歧杆菌(Bifidobacterium catenulatum)和假小链双歧杆菌(Bifidobacteriumpseudocatenulatum)。
21.根据权利要求20所述的用途，其中益生菌生物体是短双歧杆菌。
22.一种肠道生物群系菌株的益生菌、益生元和/或代谢物的用途，其用于减少包含艰难梭菌(C.difficile)的机会性病原体的丰度。
23.根据权利要求22所述的用途，其中所述益生菌包括以下中的一种或多种：凝结芽孢杆菌、印度杆菌、地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、动物双歧杆菌、两歧双歧杆菌、短双歧杆菌、凝结双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、乳酸双歧杆菌、长双歧杆菌、枯草双歧杆菌、屎肠球菌、嗜酸乳杆菌、保加利亚乳杆菌、干酪乳杆菌、德氏乳杆菌、加氏乳杆菌、瑞士乳杆菌、乳酸乳杆菌、副干酪乳杆菌、植物乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、唾液乳杆菌、鲍氏酵母菌、嗜热链球菌、布氏乳杆菌、发酵乳杆菌、卷曲乳杆菌、链状双歧杆菌和假小链双歧杆菌。
24.根据权利要求23所述的用途，其中所述益生菌是鲍氏酵母菌。
25.一种肠道生物群系菌株的益生菌、益生元和/或代谢物的用途，其用于减少候选肠甲烷马赛球菌(Candidatus Methanomassillicoccus intestinalis)的丰度。
26.根据权利要求25所述的用途，其中所述益生菌包括以下中的一种或多种：凝结芽孢杆菌、印度杆菌、地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、动物双歧杆菌、两歧双歧杆菌、短双歧杆菌、凝结双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、乳酸双歧杆菌、长双歧杆菌、枯草双歧杆菌、屎肠球菌、嗜酸乳杆菌、保加利亚乳杆菌、干酪乳杆菌、德氏乳杆菌、加氏乳杆菌、瑞士乳杆菌、乳酸乳杆菌、副干酪乳杆菌、植物乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、唾液乳杆菌、鲍氏酵母菌、嗜热链球菌、布氏乳杆菌、发酵乳杆菌、卷曲乳杆菌、链状双歧杆菌和假小链双歧杆菌。
27.根据权利要求26所述的用途，其中所述益生菌是发酵乳杆菌。
28.一种益生菌产品，其包括如权利要求20所述的至少一种或多种生物体。
29.一种益生菌产品，其包括如权利要求23所述的至少一种或多种生物体。
30.一种益生菌产品，其包括如权利要求26所述的至少一种或多种生物体。
31.一种方法，其包括：
a)测定来自受试者的样品的一个或多个胃肠道靶序列的表达水平；以及
b)向所述受试者施用益生菌组合物。
32.根据权利要求31所述的方法，其中所述一个或多个胃肠道靶序列选自包括胃肠道特异性细菌、病毒、噬菌体、古细菌、真菌和/或真核物种的多核苷酸序列的数据库。
33.根据权利要求32所述的方法，其中所述真核物种选自由以下组成的组：蠕虫、酵母和原生动物寄生虫。
34.根据权利要求31所述的方法，其中所述受试者患有选自以下的疾病或病症：自闭症谱系疾病、情绪障碍、慢性疲劳、感染、坏死、炎症、自身免疫、出血、体重减轻、代谢障碍、肠易激病症、1型或2型糖尿病、类风湿性关节炎、癌症和心血管病症。
35.根据权利要求31所述的方法，所述受试者患有来自表5或6的疾病或病症。
36.根据权利要求31所述的方法，其中所述受试者患有克罗恩氏病(Crohn'sdisease)、狼疮、关节炎、乳糜泻(Celiac disease)、肥胖症、糖尿病、莱姆病(Lymedisease)、疟疾或急性腹泻。
37.根据权利要求31所述的方法，其中所述受试者当前正在经历或先前已经经历化疗。
38.根据权利要求31所述的方法，其中多核苷酸序列是DNA或RNA。
39.根据权利要求31所述的方法，其中与标准表达水平相比，所述一个或多个胃肠道靶序列的表达水平增加或减少。
40.根据权利要求31所述的方法，其中所述益生菌组合物将所述一个或多个胃肠道靶序列的表达水平纠正到标准表达水平或健康肠道微生物群系的表达水平。
41.根据权利要求40所述的方法，其中所述益生菌组合物纠正所述受试者的胃肠道生态失调。
42.根据权利要求31所述的方法，其中所述测定包括以下中的一个或多个：对所述一个或多个靶序列进行测序、确定DNA或RNA水平、确定蛋白质水平以及确定代谢物水平。
43.根据权利要求31所述的方法，其中所述样品是粪便、尿液、阴道样品或口腔样品。
44.一种系统，其包括：
a)探针组，所述探针组包括与一个或多个胃肠道靶序列的至少一部分杂交的多个多核苷酸；以及
b)计算机可读介质，所述计算机可读介质对计算机模型或算法进行编码以分析与来自受试者的样品中的探针杂交的所述靶序列的表达水平和/或表达谱。
45.根据权利要求44所述的系统，其中所述一个或多个胃肠道靶序列选自包括胃肠道特异性细菌、病毒、噬菌体、古细菌、真菌或真核物种的多核苷酸序列的数据库。
46.根据权利要求45所述的系统，其中所述真核物种选自由以下组成的组：蠕虫、酵母和原生动物寄生虫。
47.根据权利要求44所述的系统，其中所述一个或多个胃肠道靶序列来自表5到15中所示的生物体。
48.根据权利要求44所述的系统，其进一步包括计算机处理装置，所述计算机处理装置具有用于捕获和存储表达谱和的计算机可读存储器。
49.根据权利要求48所述的系统，其进一步包括由所述计算机处理装置执行以分析表达谱的软件模块、由所述计算机处理装置执行以将所述表达谱与标准品或对照物进行比较的软件模块和/或由所述计算机处理装置执行以确定靶标的表达水平的软件模块。
50.根据权利要求48所述的系统，其进一步包括用于从所述样品中分离所述一个或多个靶序列或探针的机器、用于对所述一个或多个靶序列或探针进行测序的机器和/或用于放大所述一个或多个靶序列或探针和/或与所述一个或多个靶序列或探针特异性结合的标记的机器。
51.根据权利要求48所述的系统，其进一步包括软件模块，所述软件模块由所述计算机处理装置执行以将对所述表达谱的分析传输到治疗所述受试者的个人或医疗专业人员。
52.根据权利要求44所述的系统，其中所述计算机模型或算法是线性的或非线性的。
53.根据权利要求44所述的系统，其中所述计算机模型或算法是机器学习算法。
54.根据权利要求44所述的系统，其中所述计算机模型或算法呈机器可读格式。
55.一种治疗胃肠道生态失调的方法，所述方法包括：
a)测定来自受试者的样品的一个或多个胃肠道靶序列的表达水平；以及
b)向所述受试者施用益生菌组合物。
56.根据权利要求55所述的方法，其中所述一个或多个胃肠道靶序列选自包括胃肠道特异性细菌、病毒、噬菌体、古细菌、真菌和/或真核物种的多核苷酸序列的数据库。
57.根据权利要求56所述的方法，其中所述真核物种选自由以下组成的组：蠕虫、酵母和原生动物寄生虫。
58.根据权利要求55所述的方法，其中所述受试者患有炎性肠病或病症、自身免疫性疾病或病症或代谢性疾病或病症；病毒、细菌、真菌或寄生虫感染；或癌症。
59.根据权利要求55所述的方法，其中所述受试者当前正在经历或先前已经经历化疗。
60.根据权利要求55所述的方法，其中所述受试者患有肠易激综合征。
61.根据权利要求60所述的方法，其中所述受试者当前正在经历使用治疗剂的治疗。
62.根据权利要求61所述的方法，其中所述治疗包括抗体、抗生素或自身免疫治疗。
63.根据权利要求62所述的方法，其中所述治疗剂是利福昔明(rifaxin)。
64.根据权利要求55所述的方法，其中与标准表达水平相比，所述一个或多个胃肠道靶序列的表达水平增加或减少。
65.根据权利要求55所述的方法，其中益生菌组合物将所述一个或多个胃肠道靶序列的表达水平纠正到具有健康肠道微生物群系的受试者的标准表达水平。
66.一种益生菌的组合物，其中所述组合物通过测定来自受试者的样品的一个或多个胃肠道靶序列的表达水平来确定，并且其中所述益生菌纠正所述受试者的胃肠道生态失调。
67.根据权利要求66所述的组合物，其中所述益生菌增加肠道微生物群系的有益微生物的谱系。
68.根据权利要求67所述的组合物，其中增加肠道微生物群系的严格厌氧菌。
69.一种菌株的用途，其单独地或以任何组合用于减少受试者的引起疾病或病症的微生物的丰度，所述菌株选自表5到15中所示的菌株。
70.一种选自表15中所示的菌株的用途，其单独地或以任何组合用于减少引起自闭症谱系障碍的包含鲍氏梭菌的微生物的丰度。
71.根据权利要求70所述的用途，其中所述菌株包括以下中的一种或多种：乳酸双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、长双歧杆菌、两歧双歧杆菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌、加氏乳杆菌、唾液乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、保加利亚乳杆菌和/或凝结芽孢杆菌。
72.一种治疗受试者的自闭症谱系障碍的方法，所述方法包括向所述受试者施用包含表15中所示的一个或多个菌株的益生菌以减少引起自闭症谱系障碍的包含鲍氏梭菌的微生物的丰度。
73.根据权利要求72所述的方法，其中所述菌株包括以下中的一种或多种：乳酸双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、长双歧杆菌、两歧双歧杆菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌、加氏乳杆菌、唾液乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、保加利亚乳杆菌和/或凝结芽孢杆菌。
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