CN110249048A - 用于从样品中的一种或多种类型的微生物的多样性群体中提取核酸分子的通用方法 - Google Patents

用于从样品中的一种或多种类型的微生物的多样性群体中提取核酸分子的通用方法 Download PDF

Info

Publication number
CN110249048A
CN110249048A CN201780055836.3A CN201780055836A CN110249048A CN 110249048 A CN110249048 A CN 110249048A CN 201780055836 A CN201780055836 A CN 201780055836A CN 110249048 A CN110249048 A CN 110249048A
Authority
CN
China
Prior art keywords
sample
lysate
microorganism
probiotics
group
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201780055836.3A
Other languages
English (en)
Inventor
S·杰恩
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Solar Genomics Corp
Original Assignee
Solar Genomics Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Solar Genomics Corp filed Critical Solar Genomics Corp
Publication of CN110249048A publication Critical patent/CN110249048A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B20/00—ICT specially adapted for functional genomics or proteomics, e.g. genotype-phenotype associations
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2527/00—Reactions demanding special reaction conditions
    • C12Q2527/125—Specific component of sample, medium or buffer

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Evolutionary Biology (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
  • Theoretical Computer Science (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本文公开了从样品中的一种或多种类型的微生物的多样性群体中提取遗传物质的方法。微生物可为原核生物或真核生物，且可包括细菌、古生菌、真菌、原生动物、蛔虫、寄生虫、病毒、噬菌体以及其它微生物。可从单一样品中提取并且可通过诸如qPCR、PCR、RFLP、SSCP、等位基因特异性PCR、靶向测序、下拉测序、全基因组鸟枪测序或其它方法的分子方法进行后续鉴别。

Description

用于从样品中的一种或多种类型的微生物的多样性群体中提 取核酸分子的通用方法
相关申请案
本申请要求2016年9月15日提交的美国申请连续案No.62/395,316和2016年10月25日提交的美国申请连续案No.62/412,787在35U.S.C.§119(e)下的权益，所述申请连续案的全部内容以全文引用的方式并入本文中。
背景技术
发明领域
本发明通常涉及基因组分析，并且更具体来说涉及一种从生物样品中的多样性微生物群体中提取和分析核酸分子的方法。
发明背景
人体内以及人体上存活着约100万亿微生物，数量上大大地超过了身体的约10万亿个人类细胞。这些通常无害的病毒、细菌和真菌称为共栖或共生生物体。共栖和共生生物体以多种方式帮助我们的身体保持健康。人体内以及人体上存活的所有微生物–共栖、共生和病原性–称为微生物组，而且其平衡以及相关代谢组与个体的健康状态密切相关，反之亦然。
核酸测序的进步已为快速且准确地鉴别和描绘肠道和皮下组织中栖居的微生物组的概况创造了机会。最佳的植物群也以协同的方式与宿主免疫系统相互作用，进一步传播其健康益处。个体的相关代谢组也可通过基于质谱法的系统或使用基于基因组学的代谢组建模和通量平衡分析来描绘概况或用于形成健康代谢组概况。所有这些方法均可用于剖析微生物群落的复杂性。
发明内容
本发明涉及一种从生物补充剂、环境补充剂、膳食补充剂或其它生态微生物生物体异质群体样品中的微生物多样性群体中提取核酸分子的方法以及核酸或提取物通过加工步骤和分析来确定为个体定制益生菌的用途。本发明特定的加工步骤包括RNA或DNA清除、破碎、分离或消化；库或核酸制备以供下游应用，诸如PCR、qPCR、数字PCR或测序；预处理用于生物信息学QC、过滤、比对或数据隔离；宏基因组学或人类基因组生物信息学管线用于微生物物种分类任务；以及其它生物体比对、鉴别和变量解释。
因此，在一个方面，本发明提供一种用于制备供分析的样品的方法。所述方法包括：a)将样品与包含清洁剂(例如SDS)和螯合剂(例如EDTA)的第一裂解液混合；b)向步骤a)的混合物中添加具有溶菌酶的第二裂解液；以及c)向步骤b)的混合物中添加包含离液剂的第三裂解液，所述离液剂例如尿素、乙酸锂、盐酸胍等。预处理步骤可包括物理裂解，可用于进一步优化核酸产量。机械裂解的实例包括超声处理、珠混合和珠磨机均化。
另一方面，本发明提供一种监测对受试者的益生菌治疗的方法。所述方法包括：
从自所述受试者获得的第一样品中存在的任何微生物提取遗传物质，所述遗传物质根据权利要求1至11中任一项所述来提取，
使从所述第一样品提取的遗传物质经受宏基因组学分析，
用益生菌治疗所述受试者，且随后以与从所述第一样品提取遗传物质相同的方式从自所述受试者获得的第二样品中存在的任何微生物提取遗传物质，
对从所述第二样品提取的遗传物质进行宏基因组学分析，以及
将所述第一样品的宏基因组学分析与所述第二样品的宏基因组学分析的结果进行比较。
又一方面，本发明提供一种方法，所述方法包括在有或无额外的化学测试或基因测试的情况下由在肠道中检测的益生菌生物体来计算益生菌分数。
又一方面，本发明提供一种包括计算微生物组的分数的方法，所述分数用于评估所述微生物组是否处于生态失调、中性或稳定状态。
本发明还提供一种计算系统，所述计算系统包括：存储器；以及与所述存储器耦接的一个或多个处理器，所述一个或多个处理器被配置成执行用于进行本发明的方法的操作。
本发明还提供一种自动化平台，所述自动化平台用于进行本发明的方法。
本发明提供一种用于从来自生物补充剂、环境补充剂、膳食补充剂或其它生态微生物生物体异质群体样品的微生物多样性群体中提取核酸的一体化方法。
在实施方案中，本发明可用于通过在益生菌和环境样品中分析微生物各自的核酸来确定所述微生物的组成和相对丰度。将DNA纯化，且用于下游核酸分析(尤其是鉴别一种以上物种/亚种的基因组的宏基因组学分析)。
上文一般描述和下文详细描述都只是示例性和解释性的，且并不打算提供对所要求发明的进一步解释。包括任何附图用以提供对本发明的进一步理解，且并入说明书中并构成说明书的部分，说明本发明的几个实施方案以及与说明书一起用以解释本发明的原则。
附图说明
图1为说明人类的微生物组签名存在高患病率生物体的示意图(高蛋白饮食，>50岁，补充剂用户)。
图2A为说明人类的微生物组签名存在高患病率生物体(细菌)的示意图(高碳水化合物饮食，18-50岁，素食)。
图2B为说明人类的微生物组签名存在高患病率生物体(病毒和噬菌体)的示意图(高碳水化合物饮食，18-50岁，素食)。
图2C为说明人类的微生物组签名存在高患病率生物体(古生菌)的示意图(高碳水化合物饮食，18-50岁，素食)。
图2D为说明人类的微生物组签名存在高患病率生物体(真菌和其它真核生物)的示意图(高碳水化合物饮食，18-50岁，素食)。
图3A为说明人类的微生物组签名存在高患病率生物体(细菌)的示意图(高碳水化合物饮食，18-50岁，非素食)。
图3B为说明人类的微生物组签名存在高患病率生物体(病毒和噬菌体)的示意图(高碳水化合物饮食，18-50岁，非素食)。
图3C为说明人类的微生物组签名存在高患病率生物体(古生菌)的示意图(高碳水化合物饮食，18-50岁，非素食)。
图3D为说明人类的微生物组签名存在高患病率生物体(真菌和其它真核生物)的示意图(高碳水化合物饮食，18-50岁，非素食)。
图4A为说明人类的微生物组签名存在高患病率生物体(细菌)的示意图(高乳蛋白饮食，0-2岁，素食无护理)。
图4B为说明人类的微生物组签名存在高患病率生物体(病毒和噬菌体)的示意图(高乳蛋白饮食，0-2岁，素食无护理)。
图4C为说明人类的微生物组签名存在高患病率生物体(古生菌)的示意图(高乳蛋白饮食，0-2岁，素食无护理)。
图4D为说明人类的微生物组签名存在高患病率生物体(真菌和其它真核生物)的示意图(高乳蛋白饮食，0-2岁，素食无护理)。
图5为说明人类的微生物组签名存在较低患病率生物体以及鉴别机会致病菌的示意图。
图6为说明在人类的微生物组签名中检测到的典型益生菌的示意图。
图7为说明在人类的微生物组签名中检测到的典型益生菌的示意图。
图8为说明对于正常群体而言，显示个别相对丰度与数据库平均值的比较的示意性图表。
图9为列举通过本发明的方法由膳食补充剂混合培养物鉴别的生物体的表格。
图10是列举存储在本发明的数据库中的各种微生物独特种类的类别的表格。
具体实施方式
本发明提供一种用于从样品中一种或多种类型的微生物的多样性群体中提取核酸分子的通用方法。微生物的类型包括：革兰氏阳性细菌、革兰氏阳性细菌孢子、革兰氏阴性细菌、古生菌、原生动物、蛔虫、藻类、真菌、真菌孢子、病毒、类病毒、噬菌体和轮虫。在一些实施方案中，多样性群体是同一类型的多种不同的微生物，例如革兰氏阳性细菌。在一些实施方案中，多样性群体是多种不同类型的微生物，例如细菌(革兰氏阳性细菌、革兰氏阳性细菌孢子和/或革兰氏阴性)、真菌、病毒和噬菌体。
由于不同类型的微生物具有不同的组成和保护其自身遗传物质的机制，因此常常难以从一种类型的微生物提取遗传物质而不影响也从同一生物样品的另一种类型微生物中提取遗传物质的能力。然而，本发明使得可从样品中不同类型的微生物提取遗传物质，而不牺牲通过提取同一样品中一种类型微生物的遗传物质而可自另一种类型的微生物获得的遗传物质的量。根据本发明，包含微生物的样品可为生物样品、环境样品、人造样品(例如，实验室测试或对照样品、益生菌组合物或补充剂样品等)等。生物样品的实例包括组织样品、血液样品、血浆样品、脑脊液样品、尿液样品、粪便样品、自消化道获得的物质样品、生物分泌物(例如，精液、阴道分泌物、母乳、眼泪、唾液等)等。固体样品可液化或与溶液混合，且随后可根据本发明提取液化样品、混合物或自混合物获得的溶液中存在的微生物的遗传物质。提取的遗传物质可经受进一步加工和分析，诸如纯化、扩增和测序。
在一些实施方案中，使提取的遗传物质经受宏基因组学分析以例如鉴别提取遗传物质的样品中的一种或多种类型的微生物。在其它实施方案中，可对制备的从人类粪便样品提取的核酸物质进行完整的全基因组鸟枪测序。制备包括核酸清除反应以去除有机溶剂、杂质、盐、酚类和其它抑制加工的污染物。其它制备包括由每种样品制备核酸库，其中使gDNA经受修饰和/或扩增以准备样品用于在测序平台上进行测序，诸如通过合成、纳米孔、长读和/或CMOS电子测序方法的大规模平行测序。
如本文所公开，本发明的方法通过使同一样品中存在的一种或多种不同类型的微生物以特定的顺序经受三种不同的组合物而使得可从所述微生物中成功提取遗传物质。本发明的方法包括首先裂解样品中存在的任何革兰氏阴性细菌，紧接着消化样品中存在的任何酵母和细菌的细胞壁的多糖组分，且随后用离液剂破坏在第二步骤后仍完整的任何细胞壁。
简单来说，第一步骤包括使样品与包含清洁剂(例如，十二烷基硫酸钠(SDS))和螯合剂(例如，乙二胺四乙酸(EDTA))的第一裂解液混合来裂解样品中存在的任何革兰氏阴性细菌。第一裂解液还可包括一种或多种缓冲剂(例如，Tris)、一种或多种温和清洁剂(例如，Triton X-100)和/或一种或多种蛋白酶(例如，蛋白酶K)。
第一步骤后，使样品与包含溶菌酶的第二裂解液混合来消化混合物中存在的任何酵母和细菌细胞壁的多糖组分。由于溶菌酶可抑制第一裂解液的活性，因此重要的是在用第一裂解液处理样品后，使样品与第二裂解液发生接触。
在用第二裂解液处理后，向混合物中添加包含离液剂(例如，尿素、乙酸锂、盐酸胍等)的第三裂解液来破坏未被第二裂解液消化的任何细胞壁。第三裂解液可包括诸如SDS的清洁剂。
在一些实施方案中，第一裂解液和第三裂解液两者都包含工作浓度在1-10％w/v之间的SDS。在一些实施方案中，在用第三裂解液处理后，用包含离液剂(例如，尿素、乙酸锂、盐酸胍等)和蛋白酶K的第四裂解液进一步处理混合物。在第三裂解液的离液剂为乙酸锂的一些实施方案中，随后使混合物经受热激处理，并且随后可用第四裂解液进行处理。
在一些实施方案中，如果样品具有或疑似具有细菌和/或真菌孢子，则可使样品经受预处理步骤，所述预处理步骤诱导孢子的细胞壁在与第一裂解液接触之前萌发。预处理步骤可包括将样品与诸如温和清洁剂(例如吐温-80)的化学品混合以诱导萌发或在诱导萌发的条件(例如，温度)下培育样品。在用化学品诱导萌发的一些实施方案中，所述化学品优选为不抑制、减小或改变第一、第二和第三裂解液的活性或有效性的化学品。
在一些实施方案中，本发明的方法还可包括一个或多个通过机械方法致使物理裂解的机械处理步骤，所述机械方法包括超声处理、珠混合、珠磨机均化、加压、微流化等。在一些实施方案中，在使样品经受第一裂解液之前进行机械处理步骤。
本发明的方法能从各种微生物中提取核酸分子，所述微生物包括酵母(即，酵母属(Saccharomyces spp.))、革兰氏阴性细菌(例如，不动杆菌属(Acinetobacter spp.))、革兰氏阳性细菌(例如，双歧杆菌属(Bifidobacterium spp.))、病毒(例如，菌核病菌属(Sclerotinia spp.))、孢子(芽孢杆菌属(Bacillus spp.))、蛔虫、绦虫(棘球绦虫属(Echinococcus spp.))、原生动物(肉足纲(Sarcodina)–变形虫(例如内阿米巴属(Entamoeba)和噬菌体(例如，乳杆菌属(Lactobacillus)噬菌体)。
以下实施例欲说明本发明，但并非限制。
提取方法
向无菌的2毫升(mL)微型离心管中添加10mg至5000mg范围内的样品。可任选地通过添加400微升(μL)珠粒纯混合物并以8000rpm涡流约30秒钟进行珠磨。然而，如果想要获得高分子量的核酸(例如，基因组DNA)，则优选避免珠磨。
第一裂解液处理步骤
为裂解样品中的任何革兰氏阴性细菌，通过向样品中添加约400μL消化缓冲液(1％w/v SDS、25mM Tris HCl、2.5mM EDTA、1％trident-x 100，pH 8)和约20μL蛋白酶K使样品经受第一裂解液并轻柔混合。随后将混合物在55℃下培育约30分钟。
第二裂解液处理步骤
为裂解样品中的任何革兰氏阳性细菌，向自第一裂解液处理步骤获得的混合物中添加包含葡萄糖苷水解酶(“溶菌酶”)的第二裂解液以达到1mg/mL的最终溶菌酶浓度和约8.0的pH。合适的葡萄糖苷水解酶可自多种来源获得，包括各种动物的蛋白、眼泪或粘液或唾液。随后将混合物在37℃下培育约1至24小时的时间。
第三裂解液处理步骤
为裂解样品中存在的任何真菌和/或酵母细胞，添加在蒸馏无菌H2O和5％w/v SDS中包含1M乙酸锂的第三裂解液以获得由第二裂解液处理步骤产生的混合物的约1:5稀释液。将经过处理的混合物在70℃下培育15分钟，接着在95℃下热激一分钟且随后通过放置在22℃水浴中使其达到室温。
由于第二和第三裂解液处理步骤足以裂解噬菌体和病毒的外膜，因此不需要其它步骤来从样品中可能存在的噬菌体和病毒中提取遗传物质。
核酸纯化
随后将从裂解的微生物中提取的遗传物质，即混合物在经受第一、第二和第三裂解液处理步骤后存在的核酸分子，通过将混合物分在两个微型离心管中而纯化以用于DNA和RNA纯化。通过添加约20μL RNAse A并在室温下培育5分钟从一个管中提取DNA。使混合物穿过生物聚合物组织均化柱。如果先前进行了珠磨，则优选避免使混合物经受组织均化柱。
随后将洗出液以1000g离心5分钟。将上清液用约400μL DNA裂解液(盐酸胍、Tris-EDTA和70％EtOH)和约20μL蛋白酶K处理、混合且随后在55℃下培育10分钟。随后在-22℃下添加EtOH且通过倒置使混合物混合。混合物可经受本领域中已知的一种或多种其它DNA提取和纯化方法。
通过使混合物穿过生物聚合物组织均化柱从第二个微型离心管中提取RNA。再次，如果先前进行了珠磨，则优选避免使混合物经受组织均化柱。随后将洗出液以1000g离心5分钟。将上清液用约40μL DNase I(1U)在25mM MgCl2溶液中处理且随后在37℃下培育约15分钟。随后使混合物经受异硫氰酸胍-苯酚-氯仿提取。混合物可经受本领域中已知的一种或多种其它RNA提取和纯化方法。
在一些实施方案中，当需要定量表达RNA分子时，优选使用RNA稳定缓冲液和珠磨来确保RNA核酸分子的释放和有限降解。
在一些实施方案中，当需要提取高分子量核酸分子时，避免珠磨和组织均化柱并进行苯酚-氯仿-醇提取来代替基于硅胶柱的提取。
宏基因组学分析
准备好经过提取和纯化的遗传物质以供使用Illumina指数接头进行测序并检查其大小和量。对于小于50ng DNA的任何输入而言，进行1至20个循环之间的低循环PCR，否则对于50ng或更多核酸而言可使用库制备剂的无PCR方法。使用Qiagen胶凝纯化试剂盒TM(Qiagen,Frederick,MD)进行凝胶纯化。使用QubitTM 2.0荧光剂(Life Technologies,Carlsbad,CA)量化清洁的PCR产物。将样品以等摩尔量合并。使用片段分析仪TM CE(Advanced Analytical Technologies Inc.,Ames IA)对库集合的大小进行验证并使用QubitTM高敏感度dsDNA试剂盒(Life Technologies,Carlsbad,CA)进行量化。稀释后，将1％至10％增量的PhiXTM V3库对照物(Illumina,San Diego CA)集合在等体积的0.1NNaOH中变性5分钟，随后在Illumina的HT1缓冲剂中进一步稀释。将经过变性和PhiX增量的集合负载在具有Illumina测序引物的Illumina Next GenerationTM测序仪上，且对于50至550碱基之间设置配对末端或单一读数。
对于短插方法而言1000或更大范围内的测序读数可用于此方法。大的插入方法，诸如Pac BioTM、纳米孔TM或其它下一代基因测序方法可使用<1000个测序读数。在分类任务之前，进行生物信息学质量过滤。对原始测序文件的质量修整可包括去除测序接头或指数；基于质量分数(Q20>)、末端碱基对或信号强度修整读数的3’或5’末端；基于质量分数、GC含量或未对准碱基对去除读数；在设置编号的碱基对处去除重叠读数。使用由选自refseqTM、GreengeensTM、HMPTM、NCBITM、PATRICTM或其它公共/专用数据库或内部数据集的序列组成的定制微生物基因组数据库对经过处理的测序文档进行比对。此数据库可用作完整基因组比对支架、k聚体片段比对或在宏基因组学和生物信息学领域实践的其它方案。基于与数据库基因组匹配的测序读数/片段的数量，我们指定生物体所共有或特有的分类标识。此标识符可为条形码、核苷酸序列或将使匹配的测序读数与分类群中的生物体或菌株相关联的一些其它的计算标签。一些标识符可具有更高级别，并且将鉴别所述生物体的域、界、门、类、目、科或属。
本发明能够鉴别出物种中最低菌株等级的生物体。
在实施方案中，本发明包括鉴别和/或分析我们的数据库中所含的一种或多种细菌(图10)。一些选定的实例为克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)、动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)、乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)、印度不动杆菌(Acinetobacter indicus)、唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)、不动杆菌属(Acinetobacter)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、婴儿长双歧杆菌亚种(Bifidobacterium longum subspinfantis)、海氏肠球菌(Enterococcus hirae)、保加利亚乳杆菌亚种(Lactobacillusdelbrueckii subsp bulgaricus)、肠球菌属(Enterococcus)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)和阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)菌株。
在实施方案中，本发明包括鉴别和/或分析我们的数据库中所含的一种或多种酵母(图10)。一些选定的实例为布拉迪酵母属(Saccharomyces sp.Boulardii)、库德里夫氏酵母(Saccharomyces kudriavzevii)、巴斯德酵母(Saccharomyces pastorianus)和酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。
在实施方案中，本发明包括鉴别和/或分析我们的数据库中所含的一种或多种噬菌体或病毒(图10)。一些选定的实例为芽孢杆菌(Bacillus)噬菌体phi29、肠道菌噬菌体HK022、乳杆菌属(Lactobacillus)噬菌体A2、埃希氏杆菌属(Escherichia)噬菌体HK639、噬菌体cdtI、核盘菌属分病毒(Sclerotinia sclerotiorum partitivirus)S区段2、伯克氏菌属(Burkholderia)噬菌体BcepMu、乳球菌属(Lactococcus)原噬菌体bIL311、肠球菌属噬菌体phiFL4A和链球菌属(Streptococcus)噬菌体SM1。
未来的数据库改良将增加或改进可由此方法检测的生物体。
监测益生菌治疗
在一些实施方案中，本发明可用于监测对受试者的益生菌治疗。例如，在用益生菌治疗之前，可获得自受试者的消化道获得的样品并如本文所公开提取其中微生物的遗传物质并进行宏基因组学分析。接着在用给定益生菌治疗期间和/或之后，可自受试者的消化道获得第二样品且如本文所公开提取第二样品中的微生物的遗传物质并进行宏基因组学分析，将其结果与第一样品的宏基因组学分析的结果进行比较。随后，基于比较结果，可改变对受试者的益生菌治疗以在受试者的肠道中获得所需的微生物群体。例如，可向受试者施用包含在受试者的肠道中需要增加量的微生物的益生菌。
在一些实施方案中，可混合或培养粪便样品以用于确定微生物粪便群落的代谢组学。代谢概况随后可用于确定将有益于个体的益生菌菌株。代谢概况的实例包括影响能量代谢、养分利用、胰岛素耐受性、肥胖、血脂异常、炎症、短链脂肪酸、有机酸、细胞因子、神经递质、化学物质或表型的那些代谢概况，并且可包括其它代谢组学标志物。
微生物组筛选和益生菌选择
本发明已成功用于确定各种市售益生菌的微生物含量。另外，本发明的方法用于确定各种益生菌的微生物含量以及受试者肠道中的微生物组含量。基于受试者肠道中的微生物组含量以及其任何所需的变化，我们可选择一种或多种含有对于受试者的微生物组健康而言需要增加和/或维持的微生物的益生菌。其中，微生物组代表来自细菌、真菌、病毒、噬菌体和寄生虫的其微生物群和其中所含生物体的完整画面。例如，使用本文所述的方法，确定受试者的肠道微生物组含有25％A和75％B，确定益生菌1含有75％A和25％B，且确定益生菌2含有25％A和75％B。如果需要维持受试者的肠道微生物组，我们将选择益生菌2施用于受试者。然而，如果需要受试者肠道中A和B的量为50/50，我们可选择向受试者施用益生菌1和2两者。或者，我们可选择向受试者施用益生菌1直到受试者肠道中A和B的量达到50/50。在一些实施方案中，我们可定制益生菌配制物，例如含有等量、变化量或不同量的A和B或其它益生菌菌株，以供施用于受试者。利用个体肠道中存在的微生物的相对丰度的计算模型将有助于确定包括在益生菌中的微生物的类型、剂量和混合物。例如，如果确定与一般群体或先前的微生物组分析相比，生物体A减少或不存在，那么我们将提供将使生物体A的浓度增加的益生菌或益生元。此益生菌或益生菌可为确切的生物体A或将支持生物体A生长的另一种生物体。给与的剂量将考虑个体中生物体的相对丰度、益生元/益生菌的性能特征(诸如生长速率、相容性、受体密度)、基因或表达模式、或代谢组学产品。
定制的益生菌可并非等量，但基于由个体肠道/粪便样品检测的相对丰度来配制。这些配制物适合于将微生物组调整到健康状态。微生物组的健康状态通过使用现有的总体专用和公共数据库来确定，所述数据库诸如metaHITTM、人类微生物组项目TM、美国肠道项目TM等。当一个人并无已知问题并处于良好健康状态时，也可由血液生物标志物检查角度来个别地确定健康状态，并且随后完成其完整的微生物组概况。在完成一次或数次微生物组签名后，发现的一些/全部微生物的平均值可理解为可存取所述个别值和所述平均值的方差来确定其是否处于生态失调状态。微生物组概况可聚集成分组，随后可为所述分组分配条形码以供快速生物信息学分配。分组可由与收集样品的个体相关的单一或多个表型、诊断学或人口统计学信息来创建。可通过使用统计学模型(诸如直线距离计算)、多样性价值、分类器(诸如C4.5决策树或主成分分析)，并与诸如人类微生物组项目(HumanMicrobiome Project)或美国肠道项目(American Gut Project)定义的“正常”的总体已知群体进行比较，来从另一分组确定一个独特分组。
因此，在一些实施方案中，本发明可用于筛选给定受试者的肠道微生物组，且随后基于受试者的肠道微生物组为给定的受试者定制益生菌方案。
治疗生态失调
在一些实施方案中，本发明可用于使受试者的肠道菌群和/或动物群在引起受试者的微生物群从平衡的微生物组变为引起或可能引起不良副作用、病症和/或疾病的微生物组的事件后恢复体内平衡。健康条件可包括(但不限于)各种条件，从痤疮和过敏到胃肠道疾病、肥胖症和癌症。所述生态失调的一种实例是肥胖症发作的情形。受试者肠道中的几种微生物菌株已显示与受试者所遭遇的肥胖症或体重管理问题相关。例如参考Ley等人(2005)PNAS USA 102:11070-11075。例如，在肥胖动物和人类受试者中，细菌疹(Bacteride)与厚壁菌门(Firmicutes phyla)微生物的比率在代谢性能中具有重要作用。例如参考Turnbaugh等人(2012)PLOS ONE 7:e41079。已知与肥胖症和体重管理问题相关的一些肠道微生物包括单形拟杆菌(Bacteroides uniformis)、嗜果胶拟杆菌(Bacteroidespectinophilus)、食葡糖罗斯拜瑞氏菌(Roseburia inulinivorans)、史密斯产甲烷短杆菌(Methanobrevibacter smithii)和动物双歧杆菌。
因此，在一些实施方案中，使用本文所述的方法确定受试者肠道中第一给定微生物与第二给定微生物的比率，并且随后如果所述比率不理想或异常，则对所述受试者施用治疗以使所述比率改变为所需比率。在一些实施方案中，使用本文所述的方法确定受试者肠道中第一给定微生物相对于所述受试者肠道中所有微生物总量的量，并且随后如果第一给定微生物的相对量不理想或异常，则对所述受试者施用治疗以使所述量改变为所需量。所述治疗包括对受试者施用：在受试者肠道中的量需要增加的含有一种或多种微生物的益生菌、在受试者肠道中的量需要增加的用以杀死微生物或减缓微生物生长的抗微生物剂(例如，抗生素、抗真菌剂、抗病毒剂等)、支持健康肠道微生物组生长或维持的饮食和/或膳食补充剂(例如益生元、镁、鱼油、L-谷氨酰胺、维生素D等)等。例如，Million等人((2005)Int.J.Obes.36:817-825)表明，肥胖症受试者的肠道微生物群中富含罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)，而缺少动物双歧杆菌和史密斯产甲烷短杆菌。因此，在使用本文所述的方法确定受试者肠道中的罗伊氏乳杆菌、动物双歧杆菌和史密斯产甲烷短杆菌的量且发现所述量是肥胖症相关肠道微生物群所特有或指示肥胖症相关肠道微生物群之后，可向受试者施用含有动物双歧杆菌和史密斯产甲烷短杆菌以及相对少量至不含罗伊氏乳杆菌的益生菌。
对贵方的微生物组的计分
对微生物组签名的计分总体使用如表1中所示的类似的决策树、演算法、人工智能、脚本或逻辑树。此系统将使得可计分以有助于用户了解其肠道微生物组的健康状况以及其是否需要对发现的一些或多项挑战采取行动。挑战可包括(但不限于)鉴别已知的病原性生物体、对机会性致病菌(已知在给与机会时引起病原性作用的潜在生物体)进行计数和鉴别、缺乏对良好微生物环境的支持但其由关键菌株组成或缺乏关键菌株、在前10名中发现的独特生物体的总体多样性和数量和/或患病率大于0.1％的生物体。
在x相对丰度下由样品分析和截止值的总和来确定多样性截止值。例如，如果x＝0.1％，则352种独特生物体构成平均健康概况。接着对此数值施用标准偏差并使用高斯分布(Gaussian distribution)和曲线分析下的百分位数，我们可对平均多样性数值与我们的数据库平均值的接近程度进行计分。多样性数值越低，越远离平均值，则微生物组的计分越小。数值越高，多样性越大，则微生物组的计分越大。这种类型的计分分类与益生菌分数一起将确定数值和视觉测量分数以供客户了解其微生物组的健康状况。下文包括一种图形可视化的实例。其中，低相当于微生物组的质量低，且高相当于微生物组的质量和计分高。低->百分之30，中等>百分之65，高＝百分之65或更大。
下文表1中包括计分和益生菌公式算法的实例。表1可表示为决策树、算法、人工智能、脚本或逻辑树。所述决策树、算法、人工智能、脚本或逻辑树的函数将输出与所检测的益生菌相关的个别微生物组的健康状况分数并提供关于益生菌使用的推荐配方和剂量。
下文表2中列举可将微生物分组的潜在分类的示例列表。
表1：关于益生菌计分和调配的实例决策表。包括使用益生菌菌株数据库、宏基因组学分析数据库和文献内容管理数据库。
表2：创建分组的潜在分类
除非另外规定，否则本申请中使用的所有科学和技术术语均具有本领域中通常使用的含义。
如本文所用，术语“受试者”包括人类和非人类动物。术语“非人类动物”包括所有脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物，诸如非人类灵长动物，马、绵羊、狗、奶牛、猪、鸡和其它兽医受试者和测试动物。
除非特定描述，否则使用单数可包括复数。如说明书和随附权利要求书中所用，除非上下文中另外明确描述，否则单数形式的“一(a/an)”和“所述(the)”可包括多个提及物。除非另外描述，否则使用“或”意思是“和/或”。如本文所用，“和/或”意思是“和”或“或”。例如，“A和/或B”意思是“A、B或A和B”，且“A、B、C和/或D”意思是“A、B、C、D或其组合”以及所述“其组合”意思是A、B、C和D的任意子集，例如单成员子集(例如，A或B或C或D)、双成员子集(例如，A和B；A和C；等)或三成员子集(例如，A、B和C；或A、B和D；等)或全部四个成员(例如，A、B、C和D)。
如本文所用，术语“样品”和“生物样品”指的是适合本发明提供的方法的任何样品。细胞样品可为任何样品，例如包括通过非侵入性或侵入性技术，诸如对受试者的活组织检查获得的肠道或粪便样品。在一个实施方案中，术语“样品”指的是源自于受试者的粪便物或肠道组织的任何制剂。例如，使用本文所述的非侵入性方法获得的细胞样品可用于分离核酸分子或蛋白以用于本发明的方法。
在实施方案中，分析可针对任何核酸，包括DNA、RNA、cDNA、miRNA、mtDNA单链或双链。此核酸可为任意长度，短至约5bp的寡核苷酸，长至兆碱基或甚至更长。如本文所用，术语“核酸分子”意思是DNA、RNA、单链、双链或三链以及其任何化学修饰。实际上涵盖核酸的任何修饰。“核酸分子”可为几乎任何长度，长度为10、20、30、40、50、60、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、6000、7000、8000、9000、10,000、15,000、20,000、30,000、40,000、50,000、75,000、100,000、150,000、200,000、500,000、1,000,000、1,500,000、2,000,000、5,000,000或甚至更多个碱基，直至全长染色体DNA分子。对于分析基因表达的方法而言，由样品分离的核酸通常为RNA。
基于鸟嘌呤(G)与胞嘧啶(C)和腺嘌呤(A)碱基配对或与胸腺嘧啶(T)或尿苷(U)碱基配对的能力，当单链核酸分子可与另一核酸分子的全部或一部分碱基配对(杂交)形成双螺旋(双链核酸分子)时，其与另一单链核酸分子“互补”。例如，核苷酸序列5’-TATAC-3’与核苷酸序列5’-GTATA-3’互补。
如本文中所用，“杂交”指的是核酸链通过碱基配对与互补链结合的过程。杂交反应可为敏感性和选择性的，以便即使在以低浓度存在的样品中也可鉴别所关注的特定序列。在体外情形中，适当严格的条件可例如由预杂交和杂交溶液中的盐或甲酰胺的浓度或由杂交温度来定义，并且在本领域中已熟知。特定而言，可通过减小盐浓度、增加甲酰胺浓度或升高杂交温度来增加严格度。例如，可在约37℃至42℃下，在约50％甲酰胺中发生高严格条件下的杂交。可在约30℃至35℃下，在约35％至25％甲酰胺的降低严格度条件下发生杂交。特定而言，可在42℃下，在50％甲酰胺、5X SSPE、0.3％SDS以及200mg/ml剪切和变性鲑鱼精DNA的高严格度条件下发生杂交。可在如上文所述的降低严格度条件下，但在35℃的降低温度下，在35％甲酰胺中发生杂交。对应于特定严格度水平的温度范围可通过计算所关注核酸的嘌呤与嘧啶的比率并相应地调整温度来进一步缩窄。本领域中熟知关于上述范围和条件的变化。
如本文所用，术语“微生物组”指的是栖居在受试者肠道中的微生物，包括细菌、病毒和真菌、古生菌、原生动物、变形虫或蛔虫。
如本文所用，术语微生物(microbial/microbe/microorganism)指的是任何微小的生物体，包括原核生物或真核生物、孢子、细菌、原始细菌、真菌、病毒或原生生物，其为单细胞或多细胞的。
部分地根据功能组件和各种加工步骤来描述本发明。所述功能组件和加工步骤可通过被配置成用于执行规定的功能和实现各种结果的任意数量的组件、操作和技术来实现。例如，本发明可采用各种生物样品、生物标志物、元件、材料、计算机、数据源、存储系统和媒体、信息采集技术和方法、数据加工标准、统计学分析、回归分析等，其可执行多种功能。另外，尽管本发明是在医学诊断的情形下进行描述，但本发明可结合任意数量的应用、环境和数据分析来实践；本文所述的系统仅仅是本发明的示例应用。
根据本发明的各个方面进行数据分析的方法可通过任何合适的方式来实施，例如使用在计算机系统上操作的计算机程序。根据本发明的各个方面，一种示例性的分析系统可结合计算机系统来实施，所述计算机系统例如包含处理器和随机存取存储器的常规计算机系统，诸如可远程访问的应用服务器、网络服务器、个人计算机或工作站。计算机系统还适当地包括其它存储器装置或信息存储系统，诸如海量存储系统，以及用户界面，例如常规的显示器、键盘和跟踪装置。然而，计算机系统可包含任何合适的计算机系统和相关设备，而且可通过任何合适的方式来配置。在一个实施方案中，计算机系统包含独立系统。在另一个实施方案中，计算机系统是计算机网络的一部分，包括服务器和数据库。
用于接收、加工和分析遗传信息所需的软件可在单独装置中实施或在多个装置中实施。软件可通过网络存取，以便可相对于用户进行远端信息存储和加工。根据本发明各个方面的分析系统及其各个元件提供功能和操作以促进微生物组分析，诸如数据采集、加工、分析、报告和/或诊断。本发明的分析系统保留与微生物组和样品相关的信息并促进分析和/或诊断。例如，在本实施方案中，计算机系统执行计算机程序，其可接收、储存、搜索、分析和报告与微生物组相关的信息。计算机程序可包含执行各种功能或操作的多个模块，诸如用于加工原始数据和产生补充数据的加工模块以及用于分析原始数据和补充数据以产生模型和/或预测的分析模块。
分析系统也可提供各种其它模块和/或个别功能。例如，分析系统也可包括报告功能，例如提供与加工和分析功能相关的信息。分析系统也可提供各种管理和操纵功能，诸如控制存取和执行其它管理功能。
在理解或完成本发明公开内容所必需的程度上，本文提到的所有公布、专利和专利申请都以引用的方式明确并入本文中，其程度如同各自个别地并入一般。
尽管已参考以上实施例描述本发明，但应了解本发明的精神和范畴中涵盖修改和变化。因此，本发明仅受下文权利要求书的限制。

Claims (36)

1.一种用于制备供分析的样品的方法，所述方法包括
a)将所述样品与包含清洁剂和螯合剂的第一裂解液混合，
b)向步骤a)的所述混合物中添加具有溶菌酶的第二裂解液；以及
c)向步骤b)的所述混合物中添加包含离液剂的第三裂解液。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一裂解液还包含一种或多种缓冲剂、一种或多种温和清洁剂和/或一种或多种蛋白酶。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述第三裂解液还包含诸如SDS的清洁剂。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述第三裂解液包含工作浓度在约0.1-10％w/v之间的SDS。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述第三裂解液的所述离液剂为乙酸锂，且随后使所述混合物经受热激处理。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中在用所述第三裂解液处理后，用包含第二离液剂和蛋白酶K的第四裂解液处理所述混合物，所述第二离液剂可与所述第三裂解液的所述离液剂相同或不同。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述第二离液剂与所述第三裂解液的所述离液剂相同。
8.根据权利要求6所述的方法，其中所述第二离液剂与所述第三裂解液的所述离液剂不同。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中使所述样品经受预处理步骤，之后用所述第一裂解液进行处理，所述预处理步骤诱导所述样品中存在的任何细菌孢子和/或真菌孢子的萌发。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述预处理步骤包括将所述样品与诸如吐温-80的温和清洁剂混合。
11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，并且还包括引起物理裂解的机械处理步骤，所述机械处理步骤包括超声处理、珠混合、珠磨机均化、加压、微流化等。
12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，并且还包括使自其提取的任何遗传物质经受宏基因组学分析。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述样品为市售益生菌或膳食补充剂。
14.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述样品自受试者的肠道获得。
15.一种监测对受试者的益生菌治疗的方法，所述方法包括，
从自所述受试者获得的第一样品中存在的任何微生物提取遗传物质，所述遗传物质根据权利要求1至11中任一项所述来提取，
使从所述第一样品提取的所述遗传物质经受宏基因组学分析，
用益生菌治疗所述受试者且随后以与从所述第一样品提取遗传物质相同的方式从自所述受试者获得的第二样品中存在的任何微生物提取遗传物质，
对从所述第二样品提取的所述遗传物质进行宏基因组学分析，以及
将所述第一样品的所述宏基因组学分析与所述第二样品的所述宏基因组学分析的结果进行比较。
16.如权利要求15所述的方法，所述方法还包括改变所述益生菌治疗以在所述受试者体内获得所需的微生物群体。
17.如权利要求15-16中任一项所述的方法，所述方法还包括代谢组学标志物的分析以确定适当的益生菌治疗。
18.如权利要求15-17中任一项所述的方法，其中在使用抗生素、化学疗法、药物、环境变化、旅行、污染物消化、小肠或肠道梗塞、应力或可能发生微生物群体的破坏的其它作用后进行益生菌治疗。
19.如权利要求16所述的方法，其中微生物组的调节为当已知个体健康时，使所述个体返回先前的微生物群体中。
20.如权利要求16所述的方法，其中通过益生菌和/或益生元调节微生物组为使微生物组概况恢复为正常肠道，所述正常肠道已由内部数据库或由外部公共数据库定义。
21.如权利要求20所述的方法，其中正常被定义为与粪便物移植中所用的粪便物储库样品的微生物组概况类似，但用作益生菌/益生元以恢复生态失调。
22.如权利要求15所述的方法，其中宏基因组学分析包括使用具有生物体的基因组数据的数据库，所述数据库适用于鉴别所述生物体。
23.如权利要求22所述的方法，其中所述数据库可加工为全基因组、对于更高等级而言是共同的并且对于特定等级而言是特有的各种长度的k聚体或其它方式的条形码基因组以使它们与测序结果匹配。
24.如权利要求15所述的方法，其中宏基因组学分析包括对测序信息进行预处理，所述预处理选自消除重复、消除接头测序、消除5’或3’测序以改进碱基响应的质量，包括只有特定质量(即，Q20或更大)的碱基响应，过滤人为读数、创建配对读数或将它们分开，以及限制读数重叠。
25.如权利要求22所述的方法，其中宏基因组学分析包括通过使用软件或系统将测序信息与所述数据库进行比对，在所述软件或系统中，所述测序信息可分解成特定长度的k聚体、用作完整片段、架构并与大的参考基因组进行比对，或包括其它方法来创建对所鉴别的生物体、所鉴别的生物体的相对丰度、基因组大小、所比对的总片段、在菌株、物种、属、科、目、类、门、界或域中进行比对的独特片段的报告。
26.如权利要求15所述的方法，其中微生物组概况使得能够鉴别显示生态失调的疾病、病症或具体特征，其中可施用益生菌和/或膳食补充剂治疗来调节所述微生物组以改进基础概况。
27.如权利要求26所述的方法，其中基于人口统计学、表型或诊断学信息创建群组并对所述概况群组分配条形码。
28.如权利要求27所述的方法，其中使用统计学分析来确定所述个别微生物组概况与数据库中的已知群组的关系的密切程度。
29.如权利要求28所述的方法，其中统计学分析包括主成分分析和/或多因素分析，
30.如权利要求28所述的方法，其中对所述群组分配条形码以用于使人口统计学、表型、诊断学、疾病、病症或概况相关联。
31.一种方法，所述方法包括在有或无额外的化学测试或基因测试的情况下由在肠道中检测的益生菌生物体来计算益生菌分数。
32.如权利要求31所述的方法，其中所述分数代表在所述个体的微生物组概况中评估的类别的加权平均值。
33.一种包括计算微生物组的分数的方法，所述分数用于评估所述微生物组是否处于生态失调、中性或稳定状态。
34.如权利要求33所述的方法，其中所述分数是基于对病毒、细菌、真菌、古生菌、原生动物、变形虫或蛔虫的潜在病原性物种的检测来计算。
35.一种计算系统，所述计算系统包括：存储器；以及与所述存储器耦接的一个或多个处理器，所述一个或多个处理器被配置成执行用于进行根据权利要求15-34中任一项所述的方法的操作。
36.一种自动化平台，所述自动化平台用于进行如权利要求1-14中任一项所述的方法。
CN201780055836.3A 2016-09-15 2017-09-15 用于从样品中的一种或多种类型的微生物的多样性群体中提取核酸分子的通用方法 Pending CN110249048A (zh)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201662395316P 2016-09-15 2016-09-15
US62/395,316 2016-09-15
US201662412787P 2016-10-25 2016-10-25
US62/412,787 2016-10-25
PCT/US2017/051849 WO2018053308A1 (en) 2016-09-15 2017-09-15 Universal method for extracting nucleic acid molecules from a diverse population of one or more types of microbes in a sample

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN110249048A true CN110249048A (zh) 2019-09-17

Family

ID=61618934

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201780055836.3A Pending CN110249048A (zh) 2016-09-15 2017-09-15 用于从样品中的一种或多种类型的微生物的多样性群体中提取核酸分子的通用方法

Country Status (8)

Country Link
EP (1) EP3512946A4 (zh)
JP (1) JP2020500004A (zh)
KR (1) KR20190047023A (zh)
CN (1) CN110249048A (zh)
AU (1) AU2017328927B2 (zh)
CA (1) CA3036702A1 (zh)
IL (1) IL265285B (zh)
WO (1) WO2018053308A1 (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113322304A (zh) * 2021-06-19 2021-08-31 江苏先声医学诊断有限公司 一种应用于二代感染宏基因组检测的临床样本处理方法
CN116286798A (zh) * 2023-03-29 2023-06-23 杭州创新生物检控技术有限公司 一种适用于细菌dna提取纯化的试剂盒及方法

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2019247693A1 (en) * 2018-04-02 2020-11-19 Sun Genomics, Inc. Universal method for extracting nucleic acid molecules from a diverse population of one or more types of microbes in a sample
JP7295547B2 (ja) * 2018-11-13 2023-06-21 株式会社サイキンソー 腸内ｄｙｓｂｉｏｓｉｓ判定システム
CN111455021B (zh) * 2019-01-18 2024-06-04 广州微远医疗器械有限公司 去除宏基因组中宿主dna的方法及试剂盒
KR102548376B1 (ko) 2021-02-08 2023-06-26 경희대학교 산학협력단 장내 마이크로바이옴을 활용한 우울 불안 장애 진단 방법
CN114023389B (zh) * 2022-01-05 2022-03-25 成都齐碳科技有限公司 宏基因组数据的分析方法

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1996017933A2 (en) * 1994-12-09 1996-06-13 Takeda Chemical Industries, Ltd. Dna encoding a cell growth inhibiting factor and its product
CN1307644A (zh) * 1998-05-27 2001-08-08 贝茨迪尔博恩公司 用来检测纸制品及纸生产过程中孢子形成细菌的引物
US20060204978A1 (en) * 2004-10-18 2006-09-14 U.S. Genomics, Inc. Methods for isolation of nucleic acids from prokaryotic spores
WO2012159023A2 (en) * 2011-05-19 2012-11-22 Virginia Commonwealth University Gut microflora as biomarkers for the prognosis of cirrhosis and brain dysfunction
US20130079251A1 (en) * 2011-08-04 2013-03-28 Sage Science, Inc. Systems and Methods for Processing Fluids
WO2014188378A1 (en) * 2013-05-24 2014-11-27 Nestec S.A. Pathway specific markers for diagnosing irritable bowel syndrome
CN105593372A (zh) * 2013-06-18 2016-05-18 普罗皮肤检测股份有限公司 基于皮肤菌群的分析的定制皮肤护理品和个人护理品

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES8800957A1 (es) * 1985-02-22 1987-12-01 Monsanto Co Un metodo para la solubilizacion y renaturalizacion de proteina somatotropina
DE59511013D1 (de) * 1994-02-11 2005-09-22 Qiagen Gmbh Verfahren zur Trennung von Doppelstrang/Einzelstrangnukleinsäurestrukturen
US6197553B1 (en) * 1994-07-15 2001-03-06 Merck & Co., Inc. Method for large scale plasmid purification
JPH0947290A (ja) * 1994-12-09 1997-02-18 Takeda Chem Ind Ltd 新規ｄｎａおよびｄｎａ選別法
FR2844806B1 (fr) * 2002-09-20 2007-06-15 Centre Nat Rech Scient Systemes d'expression de proteines toxiques, vecteurs et procede de fabrication de proteines toxiques
FR2861085B1 (fr) * 2003-10-15 2006-01-27 Bertin Technologies Sa Methode d'extraction d'acides nucleiques et son application dans l'analyse de la population microbienne de l'air
EP1709197A4 (en) * 2003-12-30 2007-07-04 Sigma Aldrich Co RAPID PREPARATION OF NUCLEIC ACIDS BY ENZYMATIC DEPENDENCE

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1996017933A2 (en) * 1994-12-09 1996-06-13 Takeda Chemical Industries, Ltd. Dna encoding a cell growth inhibiting factor and its product
CN1307644A (zh) * 1998-05-27 2001-08-08 贝茨迪尔博恩公司 用来检测纸制品及纸生产过程中孢子形成细菌的引物
US20060204978A1 (en) * 2004-10-18 2006-09-14 U.S. Genomics, Inc. Methods for isolation of nucleic acids from prokaryotic spores
WO2012159023A2 (en) * 2011-05-19 2012-11-22 Virginia Commonwealth University Gut microflora as biomarkers for the prognosis of cirrhosis and brain dysfunction
US20140179726A1 (en) * 2011-05-19 2014-06-26 Virginia Commonwealth University Gut microflora as biomarkers for the prognosis of cirrhosis and brain dysfunction
US20130079251A1 (en) * 2011-08-04 2013-03-28 Sage Science, Inc. Systems and Methods for Processing Fluids
WO2014188378A1 (en) * 2013-05-24 2014-11-27 Nestec S.A. Pathway specific markers for diagnosing irritable bowel syndrome
CN105593372A (zh) * 2013-06-18 2016-05-18 普罗皮肤检测股份有限公司 基于皮肤菌群的分析的定制皮肤护理品和个人护理品

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113322304A (zh) * 2021-06-19 2021-08-31 江苏先声医学诊断有限公司 一种应用于二代感染宏基因组检测的临床样本处理方法
CN116286798A (zh) * 2023-03-29 2023-06-23 杭州创新生物检控技术有限公司 一种适用于细菌dna提取纯化的试剂盒及方法
CN116286798B (zh) * 2023-03-29 2024-04-02 杭州创新生物检控技术有限公司 一种适用于细菌dna提取纯化的试剂盒及方法

Also Published As

Publication number Publication date
EP3512946A4 (en) 2020-04-08
EP3512946A1 (en) 2019-07-24
JP2020500004A (ja) 2020-01-09
AU2017328927B2 (en) 2024-03-07
IL265285B (en) 2022-04-01
IL265285A (en) 2019-05-30
KR20190047023A (ko) 2019-05-07
AU2017328927A1 (en) 2019-04-04
WO2018053308A1 (en) 2018-03-22
CA3036702A1 (en) 2018-03-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10837046B2 (en) Universal method for extracting nucleic acid molecules from a diverse population of one or more types of microbes in a sample
CN110249048A (zh) 用于从样品中的一种或多种类型的微生物的多样性群体中提取核酸分子的通用方法
Fehlner-Peach et al. Distinct polysaccharide utilization profiles of human intestinal Prevotella copri isolates
Li et al. An integrated catalog of reference genes in the human gut microbiome
Jose et al. Comparison of microbiological and probiotic characteristics of lactobacilli isolates from dairy food products and animal rumen contents
Deusch et al. News in livestock research—use of Omics-technologies to study the microbiota in the gastrointestinal tract of farm animals
Bik Composition and function of the human-associated microbiota
CN114144387A (zh) 用于从微生物的不同群体中提取核酸分子的通用方法
CN108348167A (zh) 用于脑-颅面健康相关病症的源自微生物群系的诊断及治疗方法和系统
JP2024063020A (ja) 試料中の１つ以上の種類の微生物の多様な集団から核酸分子を抽出するための万能な方法
Amin et al. Metagenomic profiles of core and signature bacteria in the guts of white shrimp, Litopenaeus vannamei, with different growth rates
US20240218426A1 (en) Universal method for extracting nucleic acid molecules from a diverse population of one or more types of microbes in a sample
CN109266766A (zh) 肠道微生物作为胆管细胞癌诊断标志物的用途
Durban et al. Daily follow-up of bacterial communities in the human gut reveals stable composition and host-specific patterns of interaction
Sharma et al. Comparison of antimicrobial resistance and pan-genome of clinical and non-clinical Enterococcus cecorum from poultry using whole-genome sequencing
Arias et al. Combined use of 16S ribosomal DNA and automated ribosomal intergenic spacer analysis to study the bacterial community in catfish ponds
Skånseng et al. Effect of different feed structures and bedding on the horizontal spread of Campylobacter jejuni within broiler flocks
Jeyagowri et al. Phenotypic characterisation and molecular identification of potentially probiotic Lactobacillus sp. isolated from fermented rice
Kim et al. Differentiation of lacticaseibacillus zeae using pan-genome analysis and real-time pcr method targeting a unique gene
CN106795480A (zh) 类风湿性关节炎的生物标记物及其用途
Wang et al. Intestinal tract microbe communities associated with horseshoe crabs from Beibu Gulf, China
Buhnik-Rosenblau et al. Host genetics and gut microbiota
Sukumaran et al. Metagenomic Studies of the Gut Microbiota: The Snake Gut Microbiota as a Model Organism
Weiner et al. The importance of metagenomics research in human ecological niches and their role in the diagnosis of noninfectious diseases
Rousseau et al. High-throughput Techniques for Studying of Gut Microbiota

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: DE

Ref document number: 40014717

Country of ref document: HK

WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20190917