CN116286798A - 一种适用于细菌dna提取纯化的试剂盒及方法 - Google Patents

一种适用于细菌dna提取纯化的试剂盒及方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种适用于细菌DNA提取纯化的试剂盒及方法，所述试剂盒包括：含有破碎珠的裂解液，磁珠，清洗液1，清洗液2与洗脱液。本发明的试剂盒与方法兼容革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的通用型DNA提取纯化，克服了现有细菌提取试剂盒针对阳性菌和阴性菌不同操作，阳性菌额外搭配试剂，分步加热等复杂步骤的一系列问题，同时全流程只需20‑30min，与过柱法相比较，本发明还摆脱了对高速离心机的依赖，有利于进一步集成批量化提取。

Description

一种适用于细菌DNA提取纯化的试剂盒及方法
技术领域
本发明涉及DNA提取纯化，尤其涉及一种适用于细菌DNA提取纯化的试剂盒及方法。
背景技术
核酸提取是指用物理，化学和生物的方法从样本中分离纯化出核酸的过程，提取后的核酸质量，纯度对下游的应用十分重要。传统的实验室方法有酚-氯仿法，碱裂解法，滤膜离心柱法等，传统方法操作复杂，污染概率高。现代的商品试剂盒主要是硅胶模离心柱法和磁珠法，硅胶模离心柱法提取产物一般浓度高，价格低廉，但是需要配合高速离心机使用，磁珠法容易实现自动化，也可以不依赖大型仪器设备，操作简单，提取产物与下游分子检测的兼容性也较好。
现有常规提取方法的流程为：1)离心富集细菌培养液；2)重悬液加入溶菌酶，37℃处理30分钟以上；3)加入蛋白酶K和缓冲液，70℃处理10分钟；4)加入无水乙醇混匀后离心，转入吸附柱；5)高速离心吸附柱，实用清洗液反复清洗数次，洗脱回收DNA。
病原体感染中除病毒外，细菌也是极其常见的一类，对于细菌的核酸提取，特别是革兰氏阳性细菌的提取，常见试剂盒都需额外借助蛋白酶K和溶菌酶两种酶中的一种或两种，由于两种酶的最佳活性温度不同，还需要分步添加操作，不同温度孵育，整个过程也变得繁琐，提取时间也很长。因此需要一款通用型提取试剂，步骤简单，免于加热，同时适用于革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性菌的快速提取。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种适用于细菌DNA提取纯化的试剂盒及方法，本发明的试剂盒与方法兼容革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的通用型DNA提取纯化，克服了现有细菌提取试剂盒针对阳性菌和阴性菌不同操作，阳性菌额外搭配试剂，分步加热等复杂步骤的一系列问题，同时全流程只需20-30min。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种适用于细菌DNA提取纯化的试剂盒，所述试剂盒包括：含有破碎珠的裂解液，磁珠，清洗液1，清洗液2与洗脱液，其中，裂解液中包括破碎珠，200-400mM的乙酸锂，1％-3％的SDS，100-500mM的氯化钠(，优选150mM)和1-50mM的EDTA，裂解液的pH为6.5-7.5。
作为本发明的一种优选方案，所述清洗液1包括1-100mM的Tris-HCl和1-10mM的EDTA清洗液1的pH为6.5-7.5。
作为本发明的一种优选方案，所述清洗液2包括1-100mM的Tris-HCl，1-10mM的EDTA和0-300mM的NaCl，清洗液2的pH为6.5-7.5。
作为本发明的一种优选方案，所述洗脱液包括1-100mM的Tris-HCl和0-5mM的EDTA，洗脱液的pH为7.5-8.5；或者，洗脱液为无核酸酶的水。
作为本发明的一种优选方案，所述磁珠包括氨基修饰，羧基修饰或硅羟基修饰，混合液浓度为20-100mg/mL。
在本发明中，乙酸锂主要用于弱化细胞壁，结合破碎珠使细菌充分破裂，更好的完成裂解；SDS作为变性剂，作用是使蛋白变性，充分释放缠绕其间的核酸，三者的结合EDTA用来螯合金属离子，抑制样本中的核酸酶对核酸的降解作用，氯化钠可以维持核酸结构的稳定，同时提供一个盐环境；Tris-HCl主要是提供缓冲环境。
上述所有试剂均使用超纯水配置后，使用直径0.22uM孔径过滤器过滤除杂质。
本发明还提供了一种适用于细菌DNA提取纯化的方法，采用上述的试剂盒，所述方法包括以下步骤：
1)取菌液样本1mL离心弃上清，得到菌体；
2)步骤1)得到的菌体内加入100-200μL裂解液和破碎珠，涡旋或震荡混匀；
3)转移所有液体至含有20μL磁珠的离心管内，涡旋或颠倒混匀15-25次，离心管瞬时离心放入磁力架内；
4)30sec后，弃掉液体，取500μL清洗液1和/或清洗液2重悬清洗磁珠，将离心管再次放入磁力架上；
5)重复步骤4)；
6)弃废液后，加入40-60μL洗脱液，涡旋洗脱，加热孵育；
7)将离心管转入磁力架吸附30sec，吸取上清，即为纯化后的DNA模板。
作为本发明的一种优选方案，步骤2)中，涡旋或震荡混匀的时间为5-20min。
作为本发明的一种优选方案，步骤3)中，涡旋或颠倒混匀的次数为15-25次。
作为本发明的一种优选方案，步骤6)中，加热孵育的温度为55℃。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1)本发明提供了一种兼容革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的细菌通用型DNA提取纯化方法，该方法克服了现有细菌提取试剂盒针对阳性菌和阴性菌不同操作，阳性菌额外搭配酶催化试剂，分步加热等复杂步骤的一系列问题，同时全流程只需20-30min，产物纯度高，可直接应用于下游PCR检测。
2)与过柱法相比较，本发明还摆脱了对高速离心机的依赖，有利于进一步集成批量化提取。
附图说明
图1是本发明的流程图。
图2是实施例1的荧光定量PCR检测结果。
图3是实施例2的荧光定量PCR检测结果。
图4是实施例3重复性试验检测结果。
图5是实施例4重复性试验检测结果。
具体实施方式
为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，但下述实施例仅仅为本发明的优选实施例，并非全部。基于实施方式中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得其它实施例，都属于本发明的保护范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本发明首先提供了一种适用于细菌DNA提取纯化的试剂盒，所述试剂盒包括：含有破碎珠的裂解液，磁珠，清洗液1，清洗液2与洗脱液，其中，裂解液中主要含有破碎珠，乙酸锂(200-400mM，更优选300mM)，SDS(1％-3％，更优选2％)，氯化钠(100-500mM，更优选150mM)和EDTA(1-50mM，更优选10mM)，pH＝7.2(6.5-7.5)。
优选地，清洗液1包括Tris-HCl(1-100mM，更优选10mM)和EDTA(1-10mM，更优选5mM)，pH＝7(6.5-7.5)。
优选地，清洗液2包括Tris-HCl(1-100mM，更优选10mM)，EDTA(1-10mM，更优选5mM)，NaCl(0-300mM，更优选100mM)，pH＝7(6.5-7.5)。
实际应用中，清洗液1和清洗液2可以相同，也可以不同。
优选地，洗脱液包括Tris-HCl(1-100mM，更优选5mM)和EDTA(0-5mM，更优选1mM)，pH＝8(7.5-8.5)；或者，洗脱液为无核酸酶的水。
优选地，磁珠包括但不限于氨基修饰，羧基修饰或硅羟基修饰，其混合液浓度为50mg/mL(20-100mg/mL)，用来捕获纯化核酸。
参见图1，本发明还提供了一种适用于细菌DNA提取纯化的方法，采用上述的试剂盒，所述方法包括以下步骤：
1)取菌液样本1mL离心弃上清，得到菌体；
2)步骤1)得到的菌体内加入100-200μL裂解液和破碎珠，涡旋或震荡混匀；
3)转移所有液体至含有20μL磁珠的离心管内，涡旋或颠倒混匀15-25次，离心管瞬时离心放入磁力架内；
4)30sec后，弃掉液体，取500μL清洗液1和/或清洗液2重悬清洗磁珠，将离心管再次放入磁力架上；
5)重复步骤4)；
6)弃废液后，加入40-60μL洗脱液，涡旋洗脱，加热孵育；
7)将离心管转入磁力架吸附30sec，吸取上清，即为纯化后的DNA模板。
实施例1
本实施例提供了适用于细菌DNA提取纯化的方法，包括：
1)取1mL的105CFU/mL和103CFU/mL的B群链球菌菌液各3份，10000rpm离心1min后弃上清。
2)加入100μL的裂解液和破碎珠。
3)涡旋20min后，将上清转移到含20μL磁珠的1.5mL离心管内，颠倒混匀20次后瞬时离心，转入磁力架吸附30sec。
4)弃废液后取下离心管，加入600μL清洗液2，颠倒混匀20次后瞬时离心，转入磁力架吸附30sec；其中，清洗液2为10mM的Tris-HCl和5mM的EDTA，pH＝7。
5)弃废液后取下离心管，加入60μL洗脱液，放入55℃金属浴孵育3min,期间涡旋震荡2-3次。
6)将离心管转入磁力架吸附30sec，吸取上清，即为纯化后的DNA模板。
将提取后的产物进行荧光定量PCR检测，结果参见图2，从图2可见，显示本发明的方法提取一致性较好。
实施例2
本实施例提供了适用于细菌DNA提取纯化的方法，包括：
1)取1mL分装的1000CFU/mL的B群链球菌6支，10000rpm离心一分钟后弃上清。
2)其中3支按照天根细菌提取试剂盒阳性菌操作步骤进行操作(DP302细菌提取试剂盒，为市购，不再赘述)，剩余3支分别加入100μL的裂解液和破碎珠。
3)涡旋20min后，将上清转移到含20μL磁珠的1.5mL离心管内，颠倒混匀20次后瞬时离心，转入磁力架吸附30sec。
4)弃废液后取下离心管，加入600μL清洗液1，颠倒混匀20次后瞬时离心，转入磁力架吸附30sec；其中，清洗液1为10mM的Tris-HCl和5mM的EDTA，pH＝7。
5)弃废液后取下离心管，加入600μL清洗液2，颠倒混匀20次后瞬时离心，转入磁力架吸附30sec；其中，清洗液2为10mM的Tris-HCl，5mM的EDTA和100mMNaCl，pH＝7。
6)弃废液后取下离心管，加入60μL洗脱液，放入55℃金属浴孵育3min,期间涡旋震荡2-3次。
7)将离心管转入磁力架吸附30sec，吸取上清，即为纯化后的DNA模板。
将两种方式提取的产物进行荧光定量PCR检测，结果见图3。
由图3可见，从PCR结果看，即便在1000CFU/mL革兰氏阳性菌液浓度下(偏低样本浓度)，本方式也能有效提取纯化菌液，且效果与对照试剂盒相当。
实施例3
本实施例提供了适用于细菌DNA提取纯化的方法，包括：
1)取106CFU/mL的B族链球菌菌液10μL分装3支。
2)加入100μL的裂解液和破碎珠，涡旋20min后，将上清转移到含20μL磁珠的1.5mL离心管内，颠倒混匀20次后瞬时离心，转入磁力架吸附30sec。
3)弃废液后取下离心管，加入600μL清洗液2，颠倒混匀20次后瞬时离心，转入磁力架吸附30sec；其中，清洗液2为10mM的Tris-HCl，5mM的EDTA和100mMNaCl，pH＝7。
4)弃废液后取下离心管，加入60μL洗脱液，放入55℃金属浴孵育3min,期间涡旋震荡2-3次。
5)将离心管转入磁力架吸附30sec，吸取上清，即为纯化后的DNA模板。
将提取后的产物进行荧光定量PCR检测，结果见图4，
由图4可见，本发明的方法稳定性好，可直接提取高浓度菌液，无需离心富集。
实施例1-3中用于PCR检测的引物探针如下：
B群链球菌：
SEQ ID NO.1，F：CGGTTAATGAGGCTATTACTAGTGTTGA；
SEQ ID NO.2，R：TGTTGAGTTGAAAAAGTGATTGCTT；
SEQ ID NO.3，P：FAM-CATTGCGTGCCAACCCTGAGACA-BHQ1。
实施例4
本实施例提供了适用于细菌DNA提取纯化的方法，包括：
1)取1mL分装的1000CFU/mL的大肠杆菌3支，10000rpm离心1min后弃上清。
2)菌体中分别加入100μL的裂解液和破碎珠。
3)涡旋15min后，将上清转移到含20μL磁珠的1.5mL离心管内，颠倒混匀20次后瞬时离心，转入磁力架吸附30sec。
4)弃废液后取下离心管，加入600μL清洗液2，颠倒混匀20次后瞬时离心，转入磁力架吸附30sec；其中，清洗液2为10mM的Tris-HCl和5mM的EDTA，pH＝7。
5)弃废液后取下离心管，加入60μL洗脱液，放入55℃金属浴孵育3min,期间涡旋震荡2-3次，
6)将离心管转入磁力架吸附30sec，吸取上清，即为纯化后的DNA模板。
将提取的产物进行荧光定量PCR检测，结果见图5。
由图5可见，本发明的方法对大肠杆菌也有较好的提取效果。
实施例4中用于大肠杆菌PCR检测的引物探针如下：
SEQ ID NO.4，F：AACTATGCCGGGATCCATCG；
SEQ ID NO.5，R：TCAACAGACGCGTGGTTACA；
SEQ ID NO.6，P：FAM-CGTAATGCTCTACACCACGC-BHQ1。
上述实施例不限于全部应用，本方式是细菌的通用型提取试剂，样本浓度也可以继续降低(未做探究)，对于低浓度样本的富集收集，后续裂解液可以进行冻干探究，直接用样本溶解裂解液干粉，可以进一步省略离心富集操作。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。

Claims (9)

1.一种适用于细菌DNA提取纯化的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：含有破碎珠的裂解液，磁珠，清洗液1，清洗液2与洗脱液，其中，裂解液中包括破碎珠，200-400mM的乙酸锂，1％-3％的SDS，100-500mM的氯化钠和1-50mM的EDTA，裂解液的pH为6.5-7.5。
2.根据权利要求1所述的一种适用于细菌DNA提取纯化的试剂盒，其特征在于，所述清洗液1包括1-100mM的Tris-HCl和1-10mM的EDTA清洗液1的pH为6.5-7.5。
3.根据权利要求1所述的一种适用于细菌DNA提取纯化的试剂盒，其特征在于，所述清洗液2包括1-100mM的Tris-HCl，1-10mM的EDTA和0-300mM的NaCl，清洗液2的pH为6.5-7.5。
4.根据权利要求1所述的一种适用于细菌DNA提取纯化的试剂盒，其特征在于，所述洗脱液包括1-100mM的Tris-HCl和0-5mM的EDTA，洗脱液的pH为7.5-8.5；或者，洗脱液为无核酸酶的水。
5.根据权利要求1所述的一种适用于细菌DNA提取纯化的试剂盒，其特征在于，所述磁珠包括氨基修饰，羧基修饰或硅羟基修饰，混合液浓度为20-100mg/mL。
6.一种适用于细菌DNA提取纯化的方法，其特征在于，采用权利要求1-5任一项所述的试剂盒，所述方法包括以下步骤：
1)取菌液样本1mL离心弃上清，得到菌体；
2)步骤1)得到的菌体内加入100-200μL裂解液和破碎珠，涡旋或震荡混匀；
3)转移所有液体至含有20μL磁珠的离心管内，涡旋或颠倒混匀15-25次，离心管瞬时离心放入磁力架内；
4)30sec后，弃掉液体，取500μL清洗液1和/或清洗液2重悬清洗磁珠，将离心管再次放入磁力架上；
5)重复步骤4)；
6)弃废液后，加入40-60μL洗脱液，涡旋洗脱，加热孵育；
7)将离心管转入磁力架吸附30sec，吸取上清，即为纯化后的DNA模板。
7.根据权利要求6所述的一种适用于细菌DNA提取纯化的方法，其特征在于，步骤2)中，涡旋或震荡混匀的时间为5-20min。
8.根据权利要求6所述的一种适用于细菌DNA提取纯化的方法，其特征在于，步骤3)中，涡旋或颠倒混匀的次数为15-25次。
9.根据权利要求6所述的一种适用于细菌DNA提取纯化的方法，其特征在于，步骤6)中，加热孵育的温度为55℃。
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