DE10149947A1 - Mikrofluidisches Extraktionsverfahren - Google Patents

Mikrofluidisches Extraktionsverfahren

Info

Publication number
DE10149947A1
DE10149947A1 DE10149947A DE10149947A DE10149947A1 DE 10149947 A1 DE10149947 A1 DE 10149947A1 DE 10149947 A DE10149947 A DE 10149947A DE 10149947 A DE10149947 A DE 10149947A DE 10149947 A1 DE10149947 A1 DE 10149947A1
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
carrier
target molecules
molecules
sample
receptors
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
DE10149947A
Other languages
English (en)
Inventor
Cord F Staehler
Peer F Staehler
Manfred Mueller
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Febit Holding GmbH
Original Assignee
Febit Ferrarius Biotechnology GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=7702023&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=DE10149947(A1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Febit Ferrarius Biotechnology GmbH filed Critical Febit Ferrarius Biotechnology GmbH
Priority to DE10149947A priority Critical patent/DE10149947A1/de
Priority to EP02781236A priority patent/EP1436609B1/de
Priority to DE50213370T priority patent/DE50213370D1/de
Priority to AU2002349344A priority patent/AU2002349344A1/en
Priority to US10/492,014 priority patent/US7320862B2/en
Priority to AT02781236T priority patent/ATE426158T1/de
Priority to EP09002448A priority patent/EP2065702B1/de
Priority to PCT/EP2002/011383 priority patent/WO2003031965A2/de
Priority to AT09002448T priority patent/ATE545019T1/de
Publication of DE10149947A1 publication Critical patent/DE10149947A1/de
Priority to US11/946,666 priority patent/US7901886B2/en
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • BPERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82NANOTECHNOLOGY
    • B82YSPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y30/00Nanotechnology for materials or surface science, e.g. nanocomposites
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12QMEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
    • C12N15/1006Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers
    • BPERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01JCHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00277Apparatus
    • B01J2219/00279Features relating to reactor vessels
    • B01J2219/00281Individual reactor vessels
    • B01J2219/00286Reactor vessels with top and bottom openings
    • BPERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01JCHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00277Apparatus
    • B01J2219/00351Means for dispensing and evacuation of reagents
    • B01J2219/00427Means for dispensing and evacuation of reagents using masks
    • B01J2219/00434Liquid crystal masks
    • BPERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01JCHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00277Apparatus
    • B01J2219/00351Means for dispensing and evacuation of reagents
    • B01J2219/00436Maskless processes
    • BPERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01JCHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00277Apparatus
    • B01J2219/00497Features relating to the solid phase supports
    • B01J2219/00527Sheets
    • BPERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01JCHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00277Apparatus
    • B01J2219/0054Means for coding or tagging the apparatus or the reagents
    • B01J2219/00572Chemical means
    • B01J2219/00576Chemical means fluorophore
    • BPERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01JCHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00583Features relative to the processes being carried out
    • B01J2219/00585Parallel processes
    • BPERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01JCHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00583Features relative to the processes being carried out
    • B01J2219/00596Solid-phase processes
    • BPERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01JCHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00583Features relative to the processes being carried out
    • B01J2219/00603Making arrays on substantially continuous surfaces
    • B01J2219/00605Making arrays on substantially continuous surfaces the compounds being directly bound or immobilised to solid supports
    • BPERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01JCHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00583Features relative to the processes being carried out
    • B01J2219/00603Making arrays on substantially continuous surfaces
    • B01J2219/00605Making arrays on substantially continuous surfaces the compounds being directly bound or immobilised to solid supports
    • B01J2219/00614Delimitation of the attachment areas
    • B01J2219/00617Delimitation of the attachment areas by chemical means
    • B01J2219/00619Delimitation of the attachment areas by chemical means using hydrophilic or hydrophobic regions
    • BPERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01JCHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00583Features relative to the processes being carried out
    • B01J2219/00603Making arrays on substantially continuous surfaces
    • B01J2219/00605Making arrays on substantially continuous surfaces the compounds being directly bound or immobilised to solid supports
    • B01J2219/00623Immobilisation or binding
    • B01J2219/00626Covalent
    • BPERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01JCHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00583Features relative to the processes being carried out
    • B01J2219/00603Making arrays on substantially continuous surfaces
    • B01J2219/00605Making arrays on substantially continuous surfaces the compounds being directly bound or immobilised to solid supports
    • B01J2219/00623Immobilisation or binding
    • B01J2219/0063Other, e.g. van der Waals forces, hydrogen bonding
    • BPERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01JCHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00583Features relative to the processes being carried out
    • B01J2219/00603Making arrays on substantially continuous surfaces
    • B01J2219/00659Two-dimensional arrays
    • BPERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01JCHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00583Features relative to the processes being carried out
    • B01J2219/00603Making arrays on substantially continuous surfaces
    • B01J2219/00675In-situ synthesis on the substrate
    • BPERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01JCHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/0068Means for controlling the apparatus of the process
    • B01J2219/00686Automatic
    • B01J2219/00689Automatic using computers
    • BPERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01JCHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/0068Means for controlling the apparatus of the process
    • B01J2219/00702Processes involving means for analysing and characterising the products
    • B01J2219/00704Processes involving means for analysing and characterising the products integrated with the reactor apparatus
    • BPERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01JCHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00709Type of synthesis
    • B01J2219/00711Light-directed synthesis
    • BPERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01JCHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00718Type of compounds synthesised
    • B01J2219/0072Organic compounds
    • B01J2219/00722Nucleotides
    • BPERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01JCHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00718Type of compounds synthesised
    • B01J2219/0072Organic compounds
    • B01J2219/00725Peptides
    • BPERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01JCHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00718Type of compounds synthesised
    • B01J2219/0072Organic compounds
    • B01J2219/00727Glycopeptides
    • BPERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01JCHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00718Type of compounds synthesised
    • B01J2219/0072Organic compounds
    • B01J2219/00729Peptide nucleic acids [PNA]
    • GPHYSICS
    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02Column chromatography

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Condensed Matter Physics & Semiconductors (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Composite Materials (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Extraction Or Liquid Replacement (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Extraktionsverfahren zur Isolierung von Zielmolekülen aus einer Probe unter Verwendung eines mikrofluidischen Trägers.

Description

  • Die Erfindung betrifft ein Extraktionsverfahren zur Isolierung von Zielmolekülen aus einer Probe unter Verwendung eines mikrofluidischen Trägers.
  • Die selektive Extraktion von Molekülen ist für viele Arbeitsgebiete in der Biochemie, Biologie und Medizin ein zentraler und wichtiger Prozess. Zu diesen Arbeitsgebieten gehört die Extraktion und Aufreinigung von Nukleinsäuren, Proteinen, Zuckern und weiteren biochemischen funktionellen Molekülen.
  • Auch in der Genetik spielen biochemische Methoden zur Extraktion von bestimmten Molekülen, Verbindungen oder Stoffklassen eine wichtige Rolle. Besondere Bedeutung kommt dabei der Aufreinigung von Nukleinsäuren, meist DNA und RNA, zu. Wesentliche Schritte der Rekombinationstechnik setzen die Isolation und Reinigung von bestimmten Nukleinsäuren, z. B. von Plasmid-DNA, voraus. Auch die Konstruktion von Gen-Bibliotheken aus messenger-RNA (mRNA), die eine zentrale Bedeutung in der Gentechnik hat, ist auf die Isolation einer gewünschten RNA- Population angewiesen. Aus solchen Bibliotheken werden Gene oder Genfragmente "gefischt", um sie weiter untersuchen oder manipulieren zu können.
  • Biochemische, biologische und medizinische Analyseverfahren lassen sich durch Miniaturisierung und Parallelisierung in ihrer Effizienz und Aussagekraft enorm steigern. Solche Miniaturisierungen betreffen z. B. die Analyse von genetischem Material mit Hilfe von Hybridisierungsexperimenten auf DNA-Mikroarrays. Durch Entwicklung von Mikroarrays aus geeigneten DNA-Sonden als Rezeptoren lassen sich ganze Genome und Transkriptome analysieren. Für die Herstellung und Anwendung der Mikroarrays spielen Extraktionsverfahren eine wichtige Rolle und sind zugleich ein wichtiger Kostenfaktor, wenn es sich um solche Mikroarrays handelt, bei der die entsprechenden DNA-Polymersonden unabhängig vom Reaktionsträger synthetisiert ("off chip" Synthese) und dann auf den Reaktionsträger aufgebracht werden. Neben den recht weit verbreiteten DNA-Mikroarrays sind auch Verfahren miniaturisiert und parallelisiert worden, die dem Screening nach Molekülen mit besonderen Eigenschaften dienen, z. B. Ribozymen. Weitere Beispiele für Rezeptoren auf Mikroarrays sind Proteine und solche Moleküle, die in der Natur nicht vorkommen, wie z. B. Peptidnukleinsäuren (PNA). Viele solcher Assay- Formate werden unter der Rubrik Biochips zusammengefasst. Für nahezu alle diese Assay-Formate und Biochips sind die Isolation und Reinigung des Probenmaterials zentrale Prozesse der Probenvorbereitung.
  • Mikroreaktionstechniken können mit solchen Mikroarrays gekoppelt werden, um sowohl bei Probenvorbereitung als auch bei Herstellung des eigentlichen Arrays zu schnellen und effizienten Systemen zu kommen. Dies schließt auch die Verwendung von mikrofluidischen Verfahren mit ein.
  • Für die biochemische Isolation von Nukleinsäuren stehen zahlreiche Methoden zur Verfügung. Die Methoden erlauben zwar die Isolation und gegebenenfalls auch Aufreinigung von RNA oder DNA über ihre biophysikalischen Eigenschaften, sind dabei aber völlig unspezifisch in Bezug auf die Sequenz des Nukleinsäurestranges.
  • So können aus Gesamt-RNA, die unterschiedliche Sorten RNA enthält, mRNA-Moleküle relativ spezifisch isoliert werden, indem man auf einer festen Phase, z. B. Latex-Beads, Magnet-Beads, Controlled Pore Glass- Beads oder der Matrix einer Säule Poly-Thymidin Stränge (poly-T Stränge) immobilisiert. Diese Poly-T Stränge hybridisieren nach Zugabe von Gesamt- RNA mit dem Poly-Adenin (poly-A) Schwanz von mRNA-Molekülen und erlauben das Abtrennen der nichtgebundenen RNA-Moleküle. Die mRNA- Moleküle werden dann isoliert, indem der Puffer entsprechend so geändert wird, dass die Hybridisierung zugunsten von Einzelsträngen aufgehoben wird. Die frei werdenden mRNA-Moleküle kann man anschließend eluieren.
  • Der Informationsgehalt einer solchen Isolationsmatrix ist vergleichsweise gering, da nur zwei Kategorien von Zielmolekülen unterschieden werden können, nämlich mit oder ohne poly-A Schwanz.
  • Im Falle von Isolationsverfahren für Proteine verhält es sich zumeist ähnlich. So werden Immunglobuline häufig durch eine Isolationsmatrix in einer Säule mit immobilisiertem Protein A (aus Staphylococcus aureus) isoliert (Brown et al., Biochem. Soc. Transactions (England) 26 (1998), 249). In anderen Versionen des Verfahrens werden Antikörper für eines oder wenige Zielmoleküle an die Isolationsmatrix gebunden.
  • Solche Isolationsverfahren werden allgemein als Affinitätschromatographie bezeichnet. Ein Nachteil dieser Verfahren besteht darin, dass keine parallele selektive Isolation unterschiedlicher Zielmoleküle möglich ist.
  • US-Patent 6,013,440 beschreibt ein Verfahren zur Herstellung einer Affinitätsmatrix, wobei ein Satz unterschiedlicher Nukleinsäuresonden auf einem festen Träger immobilisiert wird, um auf diese Weise Zielnukleinsäuren einer noch unbekannten Sequenz aus einer Probe anzureichern. Neben anderen Nachteilen ist hervorzuheben, dass das vorgeschlagene Verfahren flächige Träger als Isolationsmatrix verwendet, die nur eine ungünstige Elution erlauben. Auch mit diesem Verfahren können somit die aus dem Stand der Technik bekannten Nachteile nicht beseitigt werden.
  • Mit der vorliegenden Erfindung werden ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Verfügung gestellt, bei denen ein mikrofluidischer Träger als Isolationsmatrix verwendet wird, der eine selektive Isolation von bestimmten biochemischen funktionellen Molekülen (Zielmolekülen), insbesondere eine selektive parallele Isolation mehrerer Spezies von Zielmolekülen, aus einem Gemisch erlaubt. Das Verfahren beinhaltet eine selektive Isolation von biochemisch funktionellen Zielmolekülen durch Bindung an ein Substrat mit immobilisierten Rezeptoren als Interaktionspartner. Die Funktionalität eines Zielmoleküls ist durch seine Fähigkeit zur selektiven Bindung an einen für das Zielmolekül spezifischen Rezeptor, vorzugsweise durch bioaffine Wechselwirkungen, wie Hybridisierung, Rezeptor-Lingand-Bindung, Antigen-Antikörper-Bindung, Saccharid-Lectin-Bindung etc. definiert.
  • Das erfindungsgemäße Verfahren bedient sich dazu der Bereitstellung eines mikrofluidischen Trägers mit einem Array selektiv bindender Rezeptoren bzw. Fängersonden als Isolationsmatrix für die Zielmoleküle. In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt eine in situ Synthese der Rezeptoren . auf oder in dem mikrofluidischen Reaktionsträger. Diese Vorgehensweise bei der Herstellung der Isolationsmatrix erlaubt bei Einsatz entsprechender Verfahren für die in situ Synthese einen sehr hohen Informationsgehalt der Isolationsmatrix. Im Fall von Nukleinsäuren als Zielmoleküle kann ein geeignetes System für die in situ Synthese der entsprechenden Fängersonden Tausende von definierten Sequenzen an der Isolationsmatrix herstellen. Somit wird durch die Erfindung ein Weg eröffnet, um gezielt Hunderte bis Tausende von individuellen DNA- oder RNA-Molekülen gezielt aus einem Gemisch zu extrahieren.
  • Der die immobilisierten Rezeptoren enthaltende Träger kann z. B. zum Einsatz kommen in der akademischen Forschung, der Grundlagenforschung, der industriellen Forschung, in der Qualitätskontrolle, in der Pharmaforschung, in der Biotechnologie, in der klinischen Forschung, in der klinischen Diagnostik, in Screening-Verfahren, in der patientenindividuellen Diagnostik, in klinischen Studien, in der Forensik, für genetische Tests, wie Elternschaftsbestimmungen, in der Tier- und Pflanzenzucht oder im Umweltmonitoring.
  • Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur Isolierung von Zielmolekülen aus einer Probe, umfassend die Schritte:
    • a) Bereitstellen eines mikrofluidischen Trägers mit einem Array von mehreren verschiedenen frei wählbaren Rezeptoren, die auf jeweils unterschiedlichen Positionen auf dem oder im Träger immobilisiert sind,
    • b) Leiten einer Probe, die zu isolierende Zielmoleküle enthält, durch den mikrofluidischen Träger, unter Bedingungen, bei denen Zielmoleküle spezifisch an die auf dem Träger immobilisierten Rezeptoren binden können,
    • c) Entfernen von nichtgebundenem Material aus der Probe vom Träger und
    • d) Eluieren der an den Träger gebundenen Zielmoleküle.
  • Die durch das erfindungsgemäße Verfahren isolierten Zielmoleküle werden vorzugsweise aus biologischen Polymeren, wie Nukleinsäuren, z. B. doppelsträngigen oder einzelsträngigen DNA-Molekülen, z. B. genomischen DNA-Molekülen oder cDNA-Molekülen, oder RNA-Molekülen, Polypeptiden, wie etwa Proteinen, Glykoproteinen, Lipoproteinen, Nukleoproteinen etc., Peptiden und Sacchariden ausgewählt.
  • Bevorzugt handelt es sich bei den Zielmolekülen um Nukleinsäuren und die Rezeptoren auf dem mikrofluidischen Träger werden aus dazu komplementären Hybridisierungssonden ausgewählt. Bei den Hybridisierungssonden kann es sich ebenfalls um Nukleinsäuren, insbesondere DNA-Moleküle, jedoch auch um Nukleinsäureanaloga, wie Peptidnukleinsäuren (PNA), Locked-Nukleinsäuren (LNA) etc. handeln. Die Hybridisierungssonden haben vorzugsweise eine Länge entsprechend 10-100 Nukleotiden und müssen nicht durchgängig aus Bausteinen mit Basen bestehen, d. h. sie können beispielsweise auch abasische Bausteine, Linker, Spacer etc. enthalten. Die Hybridisierungssonden können am 3'-Ende, 5'- Ende oder dazwischen oder an mehreren Positionen am Träger gebunden sein.
  • Die Rezeptoren können auf dem mikrofluidischen Träger durch nichtkovalente oder kovalente Wechselwirkungen immobilisiert werden. Vorzugsweise erfolgt eine kovalente Immobilisierung, besonders bevorzugt über bi- oder polyfunktionelle Spacermoleküle. Alternativ ist eine Immobilisierung über elektrostatische Wechselwirkungen oder bioaffine Wechselwirkungen, z. B. Streptavidin/Biotin, Avidin/Biotin etc. bevorzugt.
  • Ein anderes bevorzugtes Beispiel für Rezeptoren sind Peptide. Desweiteren können selbstverständlich auch niedermolekulare Substanzbibliotheken als Rezeptoren eingesetzt werden.
  • Vorzugsweise werden die auf dem Träger immobilisierten Rezeptoren, z. B. die Hybridisierungssonden, durch in situ Synthese, z. B. durch schrittweisen Aufbau aus Synthesebausteinen, auf dem Träger erzeugt und sind damit frei wählbar. Die Bausteine für diese in situ Synthese können Monomere der betreffenden Stoffklasse sein, also im Fall von Nukleinsäuren z. B. Nukleotidbausteine. Es kann sich aber auch um komplexere Bausteine handeln, so z. B. Oligonukleotide oder Oligopeptide aus mehreren, z. B. 2, 3, oder 4, Monomereinheiten.
  • Die für das erfindungsgemäße Verfahren verwendete Probe ist vorzugsweise eine komplexe Probe, d. h. die Zielmoleküle müssen aus einer Vielzahl ähnlicher Molekülspezies selektiv isoliert werden. Die Probe kann eine biologische Probe sein, z. B. eine Probe aus einem biologischen Organismus, z. B. aus einer Körperflüssigkeit, eine Probe aus einer Zell- oder Mikroorganismenkultur etc. Weiterhin kann die Probe auch aus synthetischen Quellen, z. B. aus einer Synthesevorrichtung, stammen, oder ein Gemisch aus biologischem und synthetischem Material sein.
  • Die Probe kann vor dem Aufbringen auf den Träger gegebenenfalls prozessiert werden, z. B. durch enzymatische Reaktion, wie Amplifikation, Restriktionsspaltung, Markierung, Transkription, Translation, Fraktionierung, Vorreinigung etc. Die zu isolierenden Zielmoleküle können somit in markierter oder unmarkierter Form vorliegen.
  • Das erfindungsgemäße Verfahren wird bevorzugt an strukturierten Trägern, besonders bevorzugt an Trägern mit Kanälen, z. B. mit geschlossenen Kanälen, durchgeführt. Die Kanäle sind beispielsweise Mikrokanäle mit einem Querschnitt von 10-10 000 µm. Beispiele für geeignete Träger mit Kanälen sind in WO 00/13017 und WO 00/13018 beschrieben.
  • Vorzugsweise werden Träger verwendet, die zumindest teilweise im Bereich der Positionen mit den immobilisierten Rezeptoren optisch transparent oder/und elektrisch leitfähig sind.
  • Der für das erfindungsgemäße Verfahren eingesetzte mikrofluidische Träger enthält einen Array mit mehreren verschiedenen Rezeptoren, z. B. mit mindestens 10 und vorzugsweise mindestens 20 verschiedenen Rezeptoren. Die Rezeptoren werden vorzugsweise in situ schrittweise durch orts- oder/und zeitspezifisches Immobilisieren von Rezeptorbausteinen an den jeweils vorbestimmten Positionen auf dem oder im Träger aufgebaut.
  • An einer vorbestimmten Position kann nur eine einzige von Rezeptorspezies bzw. Rezeptorsequenz oder ein Gemisch von mehreren verschiedenen Rezeptorspezies bzw. Rezeptorsequenzen immobilisiert oder synthetisiert werden. Beispielsweise kann man Gemische von Rezeptorspezies verwenden, die für das gleiche zu extrahierende Zielmolekül spezifisch sind, z. B. ein Satz von verschiedenen Hybridisierungssonden für die Extraktion einer einzigen bestimmten Ziel-Nukleinsäure.
  • Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich insbesondere zum Einsatz als integriertes Synthese-Analyse(ISA)-Verfahren, d. h. ein Träger kann nach bestimmten Vorgaben in situ hergestellt und anschließend für einen Extraktionszyklus verwendet werden. Daran können sich gegebenenfalls weitere Synthese-Extraktions-Zyklen analog dem in WO 00/13018 beschriebenen ISA-Prinzip anschließen. Auf diese Weise lassen sich mit einem Träger auch sehr unterschiedliche Moleküle, wie mRNA-Moleküle oder DNA-Sequenzen, extrahieren. Darüber hinaus ist eine Umstellung auf neue Extraktionsziele mit einem einzigen Träger möglich. Das Verfahren ist gut automatisierbar und kann mit weiteren nachfolgenden Prozessierungsschritten, wie einer Amplifikationsreaktion, z. B. unter Verwendung eines PCR-Thermocyclers, einer Detektion oder einer in vitro Translation kombiniert werden. Für diese nachfolgenden Prozessierungsschritte kann ein gemeinsamer, integrierter Reaktionsträger Anwendung finden.
  • Der Träger kann außer den eigentlichen Synthese/Reaktionsbereichen noch weitere mikrofluidische Funktionen bzw. Elemente beinhalten, wie etwa zusätzliche Reaktionsräume, z. B. für Enzymreaktionen innerhalb des Trägers, Reservoirs, Ventile, Pumpen, Thermoelemente, Reaktionsbereiche mit dort immobilisierten anderen biologisch-funktionalen Molekülen etc. Besonders bevorzugt sind Einrichtungen zur Temperierung des Trägers vorhanden, z. B. zum Einstellen einer bestimmten Temperatur oder eines bestimmten Temperaturprofils während des Extraktionsprozesses. Besonders bevorzugt enthält der Träger Thermoelemente, z. B. Peltier- Elemente, die eine orts- oder/und zeitspezifische Einstellung der Temperatur auf dem Träger oder einzelnen Bereichen des Trägers ermöglichen, für Hybridisierungen und nachfolgendes Aufschmelzen von Nukleinsäure- Doppelsträngen und für andere temperaturabhängige oder temperaturgesteuerte biochemische Reaktionen. Es können darüber hinaus auch Einrichtungen zur modulierten Zugabe von Puffern, z. B. aus unterschiedlichen Reservoirs, vorhanden sein, um Reaktionsbedingungen, z. B. Hybridisierungsbedingungen hinsichtlich der Stringenz, Zeit- oder/und ortsspezifisch auf dem Träger oder Bereichen des Trägers zu modulieren.
  • Weiterhin kann der Träger zusätzliche funktionale biologische Moleküle in immobilisierter Form enthalten, beispielsweise Polymersonden, die zur Analyse der isolierten Zielmoleküle, z. B. zur Qualitätskontrolle, dienen. Weiterhin können funktionale biologische Moleküle in immobilisierter Form für enzymatische Reaktionen, z. B. Enzyme, PCR-Primer, Ribozyme etc., Modifikationen oder Derivatisierungen der Zielmoleküle vorliegen.
  • In einer weiteren Ausführungsform ist der Träger in einer Vorrichtung integriert, umfassend eine programmierbare Lichtquellenmatrix, eine Detektormatrix, einen vorzugsweise zwischen Lichtquellen- und Detektormatrix angeordneten Träger sowie Mittel zur Zufuhr von Fluids in den Träger und zur Ableitung von Fluids aus dem Träger. Die programmierbare Lichtquellen- bzw. Belichtungsmatrix kann eine Reflexionsmatrix, eine Lichtventilmatrix, z. B. eine LCD-Matrix oder eine selbstemittierende Belichtungsmatrix, sein. Derartige Lichtmatrices sind in WO 00/13017 und WO 00/13018 offenbart. Die Detektormatrix kann gegebenenfalls im Trägerkörper integriert sein.
  • Der in situ Aufbau von Rezeptoren auf dem Träger kann fluidchemische Schritte, photochemische Schritte, elektrochemische Schritte oder Kombinationen von zwei oder mehreren dieser Schritte umfassen. Ein Beispiel für eine elektrochemische Synthese von Rezeptoren auf einem Träger ist in DE 101 20 633.1 beschrieben. Ein Beispiel für ein Hybridverfahren, umfassend die Kombination von fluidchemischen Schritten und photochemischen Schritten, ist in DE 101 22 357.9 beschrieben.
  • Die Verwendung eines Trägers, umfassend einen Array mit einer Vielzahl verschiedener Rezeptoren, ermöglicht die Immobilisierung von mehreren unterschiedlichen Zielmolekülen aus einer komplexen Probe in einem einzigen Schritt. Die Elution der auf dem Träger immobilisierten Zielmoleküle kann ebenfalls in einem einzigen Schritt erfolgen. Bevorzugt ist jedoch eine Orts- oder/und zeitspezifische Elution, wobei einzelne Zielmoleküle oder einzelne Gruppen von Zielmolekülen zunächst in einem ersten Schritt von Träger eluiert werden und die Elution weiterer Zielmoleküle oder Gruppen von Zielmolekülen in einem oder mehreren nachfolgenden Schritten erfolgt. Diese orts- oder/und zeitspezifische Elution umfasst vorzugsweise fluidchemische, photochemische oder elektrochemische Schritte oder Kombinationen davon. Ebenfalls bevorzugt ist die Verwendung von lokalen Temperaturänderungen auf dem Träger.
  • In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung erfolgt die Elution mittels einer ortsspezifischen Temperaturänderung, z. B. einer Temperaturerhöhung, die zu einer Denaturierung von Nukleinsäure- Doppelsträngen führt. Eine derartige ortsspezifische Temperaturänderung kann durch ortsspezifische Thermoelemente oder/und ortsaufgelöste Einwirkung von Strahlung, z. B. UV/VIS- und insbesondere IR-Strahlung, erfolgen, die ortsaufgelöst zu einer Wärmeentwicklung führt.
  • Eine separate orts- oder/und zeitspezifische Elution unterschiedlicher Zielmoleküle kann gegebenenfalls auch durch Abtrennung einzelner Reaktionsräume mittels hydrophober Barrieren entlang von Kanälen erreicht werden, um die diffusionsbedingten Vermischungen von eluierten Zielmolekülen, z. B. Nukleinsäuren, zu vermeiden.
  • Durch orts- oder/und zeitspezifische Elution können auch gezielt Gemische von ausgewählten Zielmolekülen erzeugt werden, wobei z. B. mehrere Fraktionen von Zielmolekülgemischen erhalten werden. Desweiteren können Zielmolekül-Gradienten bzw. Gradientenmischungen durch unterschiedliche Elutionseinwirkung an verschiedenen Stellplätzen, z. B. durch unterschiedlich lange Temperatureinwirkungen, hergestellt werden.
  • Das erfindungsgemäße Verfahren kann auch für die Isolierung von Proteinen und anderen Molekülen, insbesondere DNA-bindenden Molekülen, eingesetzt werden, wenn als Rezeptoren geeignete Fängersonden ausgewählt werden. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform können daher DNA-bindende Proteine mit Hilfe von DNA-Fängersonden, die als Doppel- oder Einzelstrang vorliegen können, extrahiert werden. In noch einer weiteren bevorzugten Ausführungsform können auch Peptidfängersonden für die Isolierung von Proteinen oder DNA-Molekülen verwendet werden. In noch einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden als Fängersonden Nukleinsäuren mit speziellen Bindungseigenschaften verwendet, z. B. Aptamere oder Ribozyme.
  • Das erfindungsgemäße Verfahren hat gegenüber dem Stand der Technik den Vorteil, dass es eine selektive Isolation von mehreren Zielmolekülen durch einen einzigen Arbeitsvorgang erlaubt. Die Verwendung mikrofluidischer Träger bewirkt, dass hierzu mit geringen Probenvolumina von z. B. 0,1 µl bis 100 µl gearbeitet werden kann. Trotz dieser geringen Probenvolumina werden im Träger hohe lokale Konzentrationen der Zielmoleküle erreicht, so dass sehr spezifisch und umfassend extrahiert werden kann.
  • Durch das mikrofluidische Format wird bei der Extraktion keine Aerosolbildung und dadurch Querkontamination hervorgerufen, wie es z. B. bei säulengestützten Verfahren mit Zentrifugationsschritt oder Vakuumabsaugung der Fall ist. Außerdem findet keine Kompetition von unterschiedlich häufigen oder/und in einer Tertiärstruktur vorliegenden Nukleinsäuren um einheitliche Bindungsstellen statt, welches ansonsten zum Vorteil der häufigeren bzw. weniger gefalteten Moleküle verlaufen kann, wie dies bei poly-A Säulen der Fall ist. Die durch das erfindungsgemäße Verfahren selektiv extrahierten Nukleinsäuren sind daher in anschließenden Schritten, wie z. B. PCR, leichter zu handhaben als ein Gemisch, wodurch weniger Probleme, z. B. falsche Bindung von Primern etc., hervorgerufen werden. Schließlich kann das erfindungsgemäße Verfahren auch leicht automatisiert werden. Insbesondere können vorher oder nachher stattfindende Prozesse automatisch angekoppelt werden, z. B. eine enzymatische Reaktion oder eine Ablage der isolierten Moleküle in geeigneten Behältern.
  • Ein zusätzlicher Vorteil der Verwendung mikrofluidischer Träger als Isolationsmatrix besteht darin, dass ein oder mehrere Zyklen der Bindung und anschließenden Elution von Zielmolekülen nach dem Durchflussprinzip durchgeführt werden können, wobei ein derartiger Zyklus die Schritte: Binden, Waschen unerwünschter Moleküle, Eluieren der gewünschten Moleküle und Rekonstituieren des Trägers umfasst. Die Isolation kann auch unter Zirkulation des Zielmolekülgemisches zur Verbesserung von aktiven Wechselwirkungen zwischen Rezeptor und Analyt bzw. Verbesserung des Waschvorgangs und der Rekonstitution erfolgen.
  • Die extrahierten Zielmoleküle können direkt oder indirekt für diagnostische oder therapeutische Zwecke eingesetzt werden. Weiterhin kann das extrahierte Material in Nachfolgereaktionen eingesetzt werden. So können aus extrahierten Nukleinsäuren Proteine oder Peptide, z. B. durch Transfer in geeignete Vektoren (Klonierung), oder in geeignete Zielzellen (Transformation bzw. Transfektion) oder durch in vitro Translation, insbesondere Isolierung von mRNA-Zielmolekülen, erzeugt werden.
  • Im Folgenden ist der schematische Ablauf des Verfahrens am Beispiel von Nukleinsäuren als Zielmolekülen erläutert:
    • 1. Ermittlung von Daten zu den Sequenzen der Zielmoleküle, die aus einer Probe extrahiert werden sollen, z. B. 20 Gene aus einem Modellorganismus, der gerade untersucht wird; mit zumindest teilweise bekannten Sequenzen der 20 Gene;
    • 2. Ermittlung von geeigneten Fängersonden, die komplementär zu singulären Bereichen in den ausgewählten Genen sind, bevorzugt mit Hilfe eines Computer-Algorithmus;
    • 3. Vorbereitung der Probe durch Isolation von Gesamt-RNA aus Zellen des Modellorganismus;
    • 4. Bereitstellen eines Geräts zur in situ Synthese von entsprechenden Fängersonden in oder auf einem mikrofluidischen Reaktionsträger;
    • 5. Einspeisen der ermittelten Fängersonden-Sequenz in eine Synthese- Steuerungseinheit, die mit dem mikrofluidischen Träger integriert sein kann;
    • 6. Synthetisieren der ausgewählten Fängersonden-Sequenz in oder auf dem mikrofluidischen Reaktionsträger;
    • 7. Zugeben der Probe, so dass die Probe in die Kanäle des Reaktionsträgers gespült wird;
    • 8. Equilibrieren der Bedingungen auf dem Träger, so dass eine Bindung zwischen Zielmolekülen und Fängersonden (Hybridisierung) bei geeigneten Pufferbedingungen und geeigneter Temperatur erfolgen kann;
    • 9. Spülen der Kanäle, um ungebundenes Material zu entfernen;
    • 10. Wechseln des Puffers (Stringenz) und eventuell der Temperatur, um die spezifischen Hybride zwischen Zielmolekülen und Fängersonden zu zerstören;
    • 11. Gezieltes Ausspülen und Auffangen der abgelösten Zielmoleküle;
    • 12. Weitere Verwendung der selektiv extrahierten Nukleinsäuren, z. B. in PCR und Klonierung, um dann nach Expression die Wirkung der Genprodukte zu studieren.
  • Das oben beschriebene Prinzip kann auch in abgewandelter Form zur selektiven Entfernung von bestimmten Komponenten (vorzugsweise mehr als eine Spezies) aus einer ein Zielmolekül oder ein Zielmolekül-Gemisch enthaltenden Probe verwendet werden. Störende Komponenten können entfernt werden, z. B. repetitive Elemente oder Telomersequenzen bei Analyse von Genfragmenten; Herausfiltern von bestimmten Genen (z. B. Housekeeping Genes) bei Transkriptionsanalysen; Protein- oder Proteinklassen, die die Proteomanalyse von (seltenen) Proteinen stören. So können bekannte Komponenten abgefangen und nur noch erwünschte, z. B. bekannte oder unbekannte, Zielmoleküle eluiert werden. Das führt zu einer Aufkonzentration erwünschter Nukleinsäuren oder Proteine oder anderer erwünschter Biomoleküle.
  • Der Ablauf des Verfahrens bei einer derartigen Ausführungsform ist wie folgt:
    • 1. Ermittlung von Daten zu den Sequenzen störender Komponenten;
    • 2. Ermittlung geeigneter Fängersonden für störende Komponenten;
    • 3. 3.-7. wie oben;
    • 4. Equilibrieren bei Bedingungen, bei denen störende Komponenten binden;
    • 5. Gezieltes Ausspülen und Auffangen der gewünschten Moleküle (störende Elemente verbleiben auf dem Träger).
  • Durch diese Vorgehensweise werden störende Komponenten abgereichert, so dass nachfolgende Analyse der gewünschten Moleküle mit höherer Präzision durchgeführt werden können. Weiterhin wird eine Aufkonzentrierung der gewünschten Zielmoleküle der zu untersuchenden Probe erreicht und störende Moleküle, z. B. mehrere Spezies parallel, können gezielt aus dem Molekülgemisch entfernt werden.
  • Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur Isolierung von Zielmolekülen aus einer Probe, umfassend die Schritte
    • 1. Bereitstellen eines mikrofluidischen Trägers mit einem Array von mehreren unterschiedlichen Rezeptoren, die auf jeweils unterschiedlichen Positionen auf dem oder im Träger immobilisiert sind,
    • 2. Leiten einer Probe, die zu isolierende Zielmoleküle enthält, durch den mikrofluidischen Träger, unter Bedingungen, bei denen störende Moleküle spezifisch an die auf dem Träger immobilisierten Rezeptoren binden können, und
    • 3. Eluieren der nichtgebundenen Zielmoleküle vom Träger.
  • Die Verfahrensführung bei dieser Ausführungsform erfolgt entsprechend den Erläuterungen für die erste Ausführungsform, mit der Maßgabe, dass die in der Probe vorhandenen Zielmoleküle nicht oder in geringerem Umfang als die störenden Komponenten an die Rezeptoren auf dem Träger binden.
  • Die vorliegende Erfindung umfasst schließlich auch eine Ausführungsform betreffend ein Verfahren zur Isolierung von Zielmolekülen aus einer Probe, wobei mindestens ein Verfahrenszyklus, bei dem die Zielmoleküle an die Rezeptoren binden und mindestens einen Verfahrenszyklus, bei dem die Zielmoleküle nicht oder nur gering an die Rezeptoren binden, kombiniert werden. Vorzugsweise wird zunächst ein Verfahrenszyklus durchgeführt, bei dem die Zielmoleküle nicht oder nur gering binden, an den sich ein Verfahrenszyklus anschließt, bei dem die Zielmoleküle binden und dann ort- oder/und zeitspezifisch vom Träger eluiert werden.
  • Weiterhin soll die Erfindung durch die folgenden Abbildungen näher erläutert werden.
  • Abb. 1 zeigt ein Beispiel für einen geeigneten mikrofluidischen Reaktionsträger mit insgesamt 4 separaten Kanälen.
  • Abb. 2 zeigt die spezifische Hybridisierung von Nukleinsäure- Zielmolekülen an einem mikrofluidischen Reaktionsträger und deren quantitative Extrahierbarkeit. In Abb. 2A ist die Hybridisierung eines Zielmoleküls an vorbestimmten Positionen auf einem mikrofluidischen Reaktionsträger erkennbar. Abb. 2B zeigt den Träger nach Extraktion. Es ist zu erkennen, dass eine quantitative Elution des Zielmoleküls erfolgt ist.

Claims (26)

1. Verfahren zur Isolierung von Zielmolekülen aus einer Probe, umfassend die Schritte:
a) Bereitstellen eines mikrofluidischen Trägers mit einem Array von mehreren verschiedenen Rezeptoren, die auf jeweils unterschiedlichen Positionen auf dem oder im Träger immobilisiert sind,
b) Leiten einer Probe, die zu isolierende Zielmoleküle enthält, durch den mikrofluidischen Träger, unter Bedingungen, bei denen Zielmoleküle spezifisch an die auf dem Träger immobilisierten Rezeptoren binden können,
c) Entfernen von nichtgebundenem Material aus der Probe vom Träger und
d) Eluieren der an den Träger gebundenen Zielmoleküle.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Zielmoleküle ausgewählt werden aus Nukleinsäuren, Polypeptiden, Peptiden und Sacchariden.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Zielmoleküle aus Nukleinsäuren, insbesondere DNA- oder/und RNA-Molekülen ausgewählt werden.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass als Rezeptoren Hybridisierungssonden verwendet werden.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass man als Hybridisierungssonden Nukleinsäuren oder Nukleinsäureanaloga verwendet.
6. Verfahren nach Anspruch 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Hybridisierungssonden eine Länge entsprechend 10-100 Nukleotiden aufweisen.
7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Probe biologischen oder/und synthetischen Ursprungs verwendet.
8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Probe verwendet, die einem oder mehreren Vorbehandlungsschritten unterzogen worden ist.
9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass man einen Träger mit geschlossenen Kanälen verwendet.
10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass der Träger Mikrokanäle mit einem Durchmesser von 10-1000 µm aufweist.
11. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Array auf dem Träger mindestens 10, vorzugsweise mindestens 20 Positionen mit verschiedenen Rezeptoren enthält.
12. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Rezeptoren an den einzelnen Positionen Einzelsequenzen oder/und Sequenzgemische enthalten.
13. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Rezeptoren des Arrays in situ schrittweise durch orts- oder/und zeitspezifisches Immobilisieren von Rezeptorbausteinen an den jeweils vorbestimmten Positionen auf dem oder im Träger aufgebaut werden.
14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass man den Träger für einen oder mehrere integrierte Synthese- Analyse-Zyklen einsetzt.
15. Verfahren nach Anspruch 13 oder 14, dadurch gekennzeichnet, dass man den Träger zusammen mit einer programmierbaren Lichtquellenmatrix und einer Detektionsmatrix verwendet.
16. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die an den Träger gebundenen Zielmoleküle orts- oder und zeitspezifisch eluiert werden.
17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass die orts- oder/und zeitspezifische Elution fluidchemische, photochemische oder elektrochemische Schritte oder Kombinationen davon umfasst.
18. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass man einen Träger mit lichtempfindlichen Rezeptoren verwendet.
19. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass die orts- oder/und zeitspezifische Elution eine orts- oder/und zeitspezifische Temperaturänderung auf dem Träger umfasst.
20. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass man einen Träger mit integrierten Thermoelementen verwendet. .
21. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass man die extrahierten Zielmoleküle einer Nachfolgereaktion unterzieht.
22. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass man die extrahierten Zielmoleküle direkt oder indirekt für diagnostische oder therapeutische Zwecke einsetzt.
23. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass ein Träger verwendet wird, der zusätzliche funktionale biologische Moleküle in immobilisierter Form enthält.
24. Verfahren nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, dass die zusätzlichen funktionalen biologischen Moleküle Polymersonden sind und der Analyse der isolierten Zielmoleküle dienen.
25. Verfahren zur Isolierung von Zielmolekülen aus einer Probe, umfassend die Schritte:
a) Bereitstellen eines mikrofluidischen Trägers mit einem Array von mehreren verschiedenen Rezeptoren, die auf jeweils unterschiedlichen Positionen auf dem oder im Träger immobilisiert sind,
b) Leiten einer Probe, die zu isolierende Zielmoleküle enthält, durch den mikrofluidischen Träger, unter Bedingungen, bei denen störende Komponenten aus einer Probe spezifisch an die auf dem Träger immobilisierten Rezeptoren binden können, und
c) Eluieren der nichtgebundenen Zielmoleküle vom Träger.
26. Verfahren zur Isolierung von Zielmolekülen aus einer Probe, umfassend mindestens einen Verfahrenszyklus nach Anspruch 1 und mindestens einen Verfahrenszyklus nach Anspruch 25.
DE10149947A 2001-10-10 2001-10-10 Mikrofluidisches Extraktionsverfahren Withdrawn DE10149947A1 (de)

Priority Applications (10)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE10149947A DE10149947A1 (de) 2001-10-10 2001-10-10 Mikrofluidisches Extraktionsverfahren
AT09002448T ATE545019T1 (de) 2001-10-10 2002-10-10 Mikrofluidisches extraktionsverfahren
US10/492,014 US7320862B2 (en) 2001-10-10 2002-10-10 Microfluidic extraction method
DE50213370T DE50213370D1 (de) 2001-10-10 2002-10-10 Mikrofluidisches extraktionsverfahren
AU2002349344A AU2002349344A1 (en) 2001-10-10 2002-10-10 Microfluidic extraction method
EP02781236A EP1436609B1 (de) 2001-10-10 2002-10-10 Mikrofluidisches extraktionsverfahren
AT02781236T ATE426158T1 (de) 2001-10-10 2002-10-10 Mikrofluidisches extraktionsverfahren
EP09002448A EP2065702B1 (de) 2001-10-10 2002-10-10 Mikrofluidisches Extraktionsverfahren
PCT/EP2002/011383 WO2003031965A2 (de) 2001-10-10 2002-10-10 Mikrofluidisches extraktionsverfahren
US11/946,666 US7901886B2 (en) 2001-10-10 2007-11-28 Microfluidic extraction method

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE10149947A DE10149947A1 (de) 2001-10-10 2001-10-10 Mikrofluidisches Extraktionsverfahren

Publications (1)

Publication Number Publication Date
DE10149947A1 true DE10149947A1 (de) 2003-04-17

Family

ID=7702023

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE10149947A Withdrawn DE10149947A1 (de) 2001-10-10 2001-10-10 Mikrofluidisches Extraktionsverfahren
DE50213370T Expired - Lifetime DE50213370D1 (de) 2001-10-10 2002-10-10 Mikrofluidisches extraktionsverfahren

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE50213370T Expired - Lifetime DE50213370D1 (de) 2001-10-10 2002-10-10 Mikrofluidisches extraktionsverfahren

Country Status (6)

Country Link
US (2) US7320862B2 (de)
EP (2) EP2065702B1 (de)
AT (2) ATE545019T1 (de)
AU (1) AU2002349344A1 (de)
DE (2) DE10149947A1 (de)
WO (1) WO2003031965A2 (de)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE102008061774A1 (de) 2008-12-11 2010-06-17 Febit Holding Gmbh Indexierung von Nukleinsäure-Populationen
DE102008061772A1 (de) 2008-12-11 2010-06-17 Febit Holding Gmbh Verfahren zur Untersuchung von Nukleinsäure-Populationen

Families Citing this family (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE10149947A1 (de) * 2001-10-10 2003-04-17 Febit Ferrarius Biotech Gmbh Mikrofluidisches Extraktionsverfahren
US7300755B1 (en) * 2003-05-12 2007-11-27 Fred Hutchinson Cancer Research Center Methods for haplotyping genomic DNA
US7410763B2 (en) * 2005-09-01 2008-08-12 Intel Corporation Multiplex data collection and analysis in bioanalyte detection
WO2008115185A2 (en) * 2006-04-24 2008-09-25 Nimblegen Systems, Inc. Use of microarrays for genomic representation selection
US20080194414A1 (en) * 2006-04-24 2008-08-14 Albert Thomas J Enrichment and sequence analysis of genomic regions
US8383338B2 (en) 2006-04-24 2013-02-26 Roche Nimblegen, Inc. Methods and systems for uniform enrichment of genomic regions
EP2076609A1 (de) 2006-10-10 2009-07-08 Illumina Inc. Zusammensetzungen und verfahren zur repräsentativen auswahl von nukleinsäuren aus komplexen gemischen mittels hybridisierung
US8188255B2 (en) * 2006-10-20 2012-05-29 Exiqon A/S Human microRNAs associated with cancer
US8080372B2 (en) * 2007-04-11 2011-12-20 Canon Kabushiki Kaisha Method for detecting nucleic acid in sample, method for designing probes, system for designing probes therefor
EP2053132A1 (de) 2007-10-23 2009-04-29 Roche Diagnostics GmbH Anreicherung und Sequenzanalyse von Genombereichen
DE102007056398A1 (de) 2007-11-23 2009-05-28 Febit Holding Gmbh Flexibles Extraktionsverfahren für die Herstellung sequenzspezifischer Molekülbibliotheken
JP5795255B2 (ja) 2008-07-18 2015-10-14 キヤノン ユー.エス. ライフ サイエンシズ, インコーポレイテッドCanon U.S. Life Sciences, Inc. 微小流体dna試料調製のための方法およびシステム
US8304185B2 (en) 2009-07-17 2012-11-06 Canon U.S. Life Sciences, Inc. Methods and systems for DNA isolation on a microfluidic device
US20100076185A1 (en) * 2008-09-22 2010-03-25 Nils Adey Selective Processing of Biological Material on a Microarray Substrate
US20100331204A1 (en) * 2009-02-13 2010-12-30 Jeff Jeddeloh Methods and systems for enrichment of target genomic sequences
GB2489686B (en) * 2011-04-01 2018-06-27 Agilent Technologies Inc Fluidic chip with laminated reinforcing layer for pressure reinforcement
US20170357622A1 (en) 2016-06-12 2017-12-14 Apple Inc. Arrangement of documents in a document feed
CN109374159B (zh) * 2018-09-28 2020-09-08 深圳大学 一种多壁碳纳米管压阻传感器及其制备方法

Family Cites Families (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6169169B1 (en) * 1994-05-19 2001-01-02 Dako A/S PNA probes for detection of Neisseria gonorrhoeae and Chlamydia trachomatis
US6013440A (en) 1996-03-11 2000-01-11 Affymetrix, Inc. Nucleic acid affinity columns
WO1997048818A1 (en) * 1996-06-17 1997-12-24 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Thermocycling apparatus and method
US5804384A (en) 1996-12-06 1998-09-08 Vysis, Inc. Devices and methods for detecting multiple analytes in samples
US6391622B1 (en) * 1997-04-04 2002-05-21 Caliper Technologies Corp. Closed-loop biochemical analyzers
WO1998059076A1 (en) * 1997-06-25 1998-12-30 Promega Corporation Method of isolating rna
US6093370A (en) * 1998-06-11 2000-07-25 Hitachi, Ltd. Polynucleotide separation method and apparatus therefor
US6306643B1 (en) * 1998-08-24 2001-10-23 Affymetrix, Inc. Methods of using an array of pooled probes in genetic analysis
JP2002525587A (ja) 1998-08-28 2002-08-13 フェビット フェラリウス バイオテクノロジー ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング 試料中の分析物を測定するための方法および装置
DE50013228D1 (de) * 1999-02-19 2006-09-07 Febit Biotech Gmbh Verfahren zur herstellung von polymeren
US6953686B1 (en) * 1999-05-28 2005-10-11 Cambrex Bio Science Baltimore, Inc. Methods of DNA purification and purified DNA
DE19957319A1 (de) * 1999-11-29 2001-05-31 Febit Ferrarius Biotech Gmbh Dynamische Bestimmung von Analyten
AU2001245650A1 (en) * 2000-03-10 2001-09-24 Ana-Gen Technologies, Inc. Mutation detection using denaturing gradients
CA2314398A1 (en) * 2000-08-10 2002-02-10 Edward Shipwash Microarrays and microsystems for amino acid analysis and protein sequencing
WO2002052045A1 (en) * 2000-12-26 2002-07-04 Aviva Biosciences Active and biocompatible platforms prepared by polymerization of surface coating films
DE10119468A1 (de) * 2001-04-12 2002-10-24 Epigenomics Ag Mikroarray-Verfahren zur Anreicherung von DNA-Fragmenten aus komplexen Mischungen
DE10122357A1 (de) 2001-05-09 2002-11-14 Febit Ferrarius Biotech Gmbh Hybridverfahren zur Herstellung von Trägern für die Analytbestimmung
DE10149947A1 (de) * 2001-10-10 2003-04-17 Febit Ferrarius Biotech Gmbh Mikrofluidisches Extraktionsverfahren

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE102008061774A1 (de) 2008-12-11 2010-06-17 Febit Holding Gmbh Indexierung von Nukleinsäure-Populationen
DE102008061772A1 (de) 2008-12-11 2010-06-17 Febit Holding Gmbh Verfahren zur Untersuchung von Nukleinsäure-Populationen

Also Published As

Publication number Publication date
DE50213370D1 (de) 2009-04-30
EP1436609B1 (de) 2009-03-18
US7320862B2 (en) 2008-01-22
AU2002349344A1 (en) 2003-04-22
EP2065702B1 (de) 2012-02-08
EP1436609A2 (de) 2004-07-14
ATE545019T1 (de) 2012-02-15
EP2065702A1 (de) 2009-06-03
US20080146791A1 (en) 2008-06-19
WO2003031965A2 (de) 2003-04-17
US20050040043A1 (en) 2005-02-24
WO2003031965A3 (de) 2003-12-31
US7901886B2 (en) 2011-03-08
ATE426158T1 (de) 2009-04-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP1436609B1 (de) Mikrofluidisches extraktionsverfahren
EP1153127B1 (de) Verfahren zur herstellung von polymeren
DE60010058T2 (de) Biochemische reinigungsgeräte mit immobilisierten fangsonden und ihre anwendungen
EP1685261B1 (de) Hochparalleler dna-synthesizer auf matrizenbasis
DE102006039479A1 (de) Programmierbare Oligonukleotidsynthese
EP1747065A1 (de) Funktionalisierter poröser träger für mikroarrays
EP1075546A1 (de) Verfahren und vorrichtung zur isolierung von nukleinsäuren
EP2022559A2 (de) Nukleinsäurenbibliothek oder protein- oder peptibibliothek
WO2001046686A9 (de) Chromatographiematerial und verfahren unter verwendung desselben
WO2009065620A2 (de) Flexibles extraktionsverfahren für die herstellung sequenzspezifischer molekülbibliotheken
EP1234056B1 (de) Dynamische bestimmung von analyten durch arrays auf inneren oberflächen
DE19957116A1 (de) Verfahren zur Herstellung synthetischer Nukleinsäuredoppelstränge
WO2001040510A2 (de) Dynamische sequenzierung durch hybridisierung
DE10033091A1 (de) Polymer-Chip
DE10152925A1 (de) Asymmetrische Sonden
DE10335107A1 (de) Verfahren zur Bereitstellung eines Reaktionsgemisches für eine nachfolgende Mikroarrayanalyse

Legal Events

Date Code Title Description
8141 Disposal/no request for examination
8127 New person/name/address of the applicant

Owner name: FEBIT HOLDING GMBH, 69120 HEIDELBERG, DE