JP2014512190A - 核酸の液相抽出方法とその検出方法 - Google Patents
核酸の液相抽出方法とその検出方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2014512190A JP2014512190A JP2014506706A JP2014506706A JP2014512190A JP 2014512190 A JP2014512190 A JP 2014512190A JP 2014506706 A JP2014506706 A JP 2014506706A JP 2014506706 A JP2014506706 A JP 2014506706A JP 2014512190 A JP2014512190 A JP 2014512190A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- sample
- nucleic acid
- biological sample
- kpa
- heating
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
【解決手段】前記核酸検体溶液の抽出方法は、生体サンプルを加熱室に入れるステップ;任意に、前記生体サンプルに溶媒を加えるステップ;前記生体サンプルを高圧加熱に曝すステップ;任意に、前記生体サンプルを遠心分離するステップ;および前記核酸検体を得るステップを含んでなる。
【選択図】図1
Description
従来の化学的方法によれば、細胞または組織は、通常先ず酵素によって消化され、その後有機溶媒で抽出される。単離された核酸は、エタノールまたはイソプロパノールによって沈殿され、捕獲され水中に濃縮される。全工程で2、3日間要する。殊に、パラフィン埋め込み組織には、キシレン中の多数回の脱ろう、高濃度のプロテアーゼ等で長時間消化され、短時間効率のより著しい不利をもたらす。
近年、種々の液相核酸抽出キットが自国または外国において開発されている。それらキットの殆どは、核酸を分離し、ある粒子の表面に核酸を吸着し、そのあとで沈殿または溶出するという溶解細胞原理に基づく。これらの方法は、核酸抽出時間を比較的短縮させるが、低コスト、高効率、単純な目標プロセスには未だ程遠い。
遺伝子検出の増大する重要性と共に、核酸抽出技術は、遺伝子検出の新規方法および技術の緊急性に比べて、同時に進行すべき改革及び躍進を伴なっていない。限定された核酸の入手性は、核酸検出、特にパラフィン埋め込み組織に大いに依存する、特に遺伝子型決定または診断の為の遺伝子検出の成功の鍵となって来た。
本発明の高圧は、圧力釜、オートクレーブなどの当業界において通常用いられる高圧装置によって達成され得る。
1.遠心分離チューブの調製:1.5ml遠心分離チューブのキャップは、アルコールバーナーを用いて加熱された細い針によって細かな穴を開け、高圧下でガスの膨張による栓外れを防ぐ。
2.サンプリング:ヒト結腸癌パラフィン埋め込み組織区分(5〜10μm)を1から2切れ、1.5mlの遠心分離用チューブに入れた。500μlの0.1M苛性ソーダ水溶液(pH11)を加え、サンプルを液に完全に浸漬させた。
3.高圧:高圧加熱は、30〜45分間実施(リレン製電気圧力釜、モデル DYG−5B、操作圧力140−170kPa、圧力限界200kPa)
4.PCR:高圧プロセスが完了した後で、冷却なしで直ちに遠心分離ステップ(13,000rpm,5分間)に付された。1−2μlの上澄み液(または1:10の上澄み液の希釈を1−2μl)が指示書にしたがってPCR分析に用いられた。
5.電気泳動法:PCR製品が電気泳動法によって検出された。もし製品の量が少な過ぎれば、ネステッドPCRで実施できる。
6.PCR品の配列決定結果:図1Aおよび図1B
結果は、高圧加熱法を通してパラフィン埋め込み組織サンプルから得られた核酸サンプルは、PCR品の直接配列決定の要求に適合していることを示した。
ある量のパラフィン区分のレーザー顕微解剖された腫瘍細胞が、実施例1の方法にしたがって加工された(もし細胞の量が少なければ、溶液量を少なくした)。PCRに上澄み液が用いられた。PCR品の配列決定結果が図2に示された。
上述の結果は、本発明の高圧加熱法は、遺伝子型分析や診断に用いられ得る信頼できる量の核酸を得るために少量の細胞に適用し得る。少量の細胞または組織の遺伝子型分析および診断(微細針吸収腫瘍組織の如き)の成功率は増加し、それは治療の薬剤選択をするために外科手術の機会を逸していた癌患者に極めて重要である。
結核菌によって感染の疑いのあるパラフィン埋め込み組織区分、1〜2切れが実施例1と本質的に同じ方法によって加工され、加熱時間は20−30分であった。上澄み液がリアルタイムPCR(蛍光プローブがPCRプレミックス(予備混合物)に添加された)に用いられた。
結果は、許容量のバクテリアDNAが、高圧加熱法によってパラフィン埋め込み組織から得られ、臨床的同定および結核菌の診断を援助することを示した。
カンジダ・アルビカンスの疑いのあるヒト病変部のスワッブ(綿棒に分泌物を付けたもの)を0.1Mの苛性ソーダ水溶液(pH11)200μlで洗浄し、実施例1と本質的に同じ方法で処理し、加熱時間は35−50分であった。上澄み液が蛍光PCR(蛍光プローブがPCRプレミックスに入れられた)に用いられ、結果が図3に示された。
HBV罹患者から採取した血清、5μlを0.1M苛性ソーダ水溶液(pH11)、200μlと混ぜ、本質的に実施例1と同じ方法によって処理し、加熱時間は25−40分であった。上澄み液をPCRに用いた。電気泳動の結果を図4に示した。
前記結果から、高圧加熱法が臨床試験のための血清のトレース量から信頼できる量でヴィールス性核酸を得るのに用い得ることが示された。
1.サンプリング
a.ヒト胃腸基質腫瘍のパラフィン区分(5−10μm)、1−2切れ
b.ヒト結腸癌のパラフィン埋め込み組織(5−10μm)、1−2切れ
c.ヒト甲状腺癌の新鮮な組織(1/2粒子サイズ)、みじん切り
d.培養細胞
サンプルは、1.5ml遠心分離用チューブに入れ、適当量の0.1M苛性ソーダ水溶液(pH11)をサンプルが溶液に完全に漬かるように加えた。得られた溶液は、徹底的に混ぜた。
2.高圧:加熱時間は30−45分間(操作圧力;140−170kPa、圧力上限;200kPa)
3.逆転写:(RNA抽出中に、タイムリーに高圧処理が必要で、逆転写プレミックスが予め作られる。)高圧プロセスが完了したときに、遠心分離用チューブが即時遠心分離のあとで、2−5μlの上澄み液がRNAの急速な崩壊を防ぐように逆転写のために急いで用いられた。
逆転写プレ−ミックス:逆転写緩衝剤、0.2mMのdNTPs、0.2μgのランダムプライマー(または0.2μMの特定のプライマー)、50UM−mLVの逆転写、0.01M DTT、DEPC水を最終容量20μlとなるように加えた。
42℃で60分間、95℃で5分間。
4.PCR:逆転写が完了後(即時遠心分離が実施された)、1−5μlの上澄み液をPCRプレミックスに添加した(1XPCR緩衝液、0.2mM dNTP、0.4−0.5μMの特定のプライマー、水を加えて最終25−50μlとした)。PCR:94℃で1分30秒間(94℃で30秒、55℃で30秒、72℃で20秒、30−35サイクル)72℃で2分間。
5.GAPDH mRNA RT−PCR(電気泳動図−226bp):図5参照
前記結果によれば、高圧加熱法は信頼できる量でDNAおよびRNAを同時に得るために用い得、特定の遺伝子配列フラグメント(DNA)および生体マーカー(mRNA)の検出のために用い得る。
1.実施例1と同じ方法にしたがって遠心分離用チューブが調製された。
2.サンプリング
(1)HBV罹患々者からの血清5μlを0.1M苛性ソーダ水溶液(pH11)100μlに添加混合された。
(2)HSV罹患々者から採取したスワーブを0.1M苛性ソーダ水溶液(pH11)100μlで洗浄
(3)腫瘍患者から採取した7μMのパラフィン埋め込み組織区分を2切れ0.1M苛性ソーダ水溶液(pH11)、500μlに入れた。
3.圧力釜のタイプ
(1)リレンブランドの電気圧力釜、モデルDYG−5B
(2)台湾製CIRRUS CR−3560CG−Mオートクレーブ
4.方法
前記3個の生体サンプルがリレンブランドの電気圧力釜(モデルDYG−5B)および台湾製CIRRUS CR−3560CG−Mオートクレーブをそれぞれ用いて、異なる温度で異なる時間、高圧処理に付された。
5.結果
表1に結果を示した。実験結果から、異なる生体サンプルは、高圧処理の時間および圧力の許容範囲において変化することが分かった。
1.遠心分離チューブの調製:1.5ml遠心分離チューブのキャップは、アルコールバーナーを用いて加熱された細い針によって細かな穴を開け、高圧下でガスの膨張による栓外れを防ぐ。
2.サンプリング:ヒト結腸癌パラフィン埋め込み組織区分(5〜10μm)を1から2切れ、1.5mlの遠心分離用チューブに入れた。500μlの0.1M苛性ソーダ水溶液(pH11)を加え、サンプルを液に完全に浸漬させた。
3.高圧:高圧加熱は、30〜45分間実施(リレン製電気圧力釜、モデル DYG−5B、圧力140−170kPa、圧力限界200kPa)
4.PCR:高圧プロセスが完了した後で、冷却なしで直ちに遠心分離ステップ(13,000rpm,5分間)に付された。1−2μlの上澄み液(または1:10の上澄み液の希釈を1−2μl)が指示書にしたがってPCR分析に用いられた。
5.電気泳動法:PCR製品が電気泳動法によって検出された。もし製品の量が少な過ぎれば、ネステッドPCRで実施できる。
6.PCR品の配列決定結果:図1Aおよび図1B
結果は、高圧加熱法を通してパラフィン埋め込み組織サンプルから得られた核酸サンプルは、PCR品の直接配列決定の要求に適合していることを示した。
1.サンプリング
a.ヒト胃腸基質腫瘍のパラフィン区分(5−10μm)、1−2切れ
b.ヒト結腸癌のパラフィン埋め込み組織(5−10μm)、1−2切れ
c.ヒト甲状腺癌の新鮮な組織(1/2粒子サイズ)、みじん切り
d.培養細胞
サンプルは、1.5ml遠心分離用チューブに入れ、適当量の0.1M苛性ソーダ水溶液(pH11)をサンプルが溶液に完全に漬かるように加えた。得られた溶液は、徹底的に混ぜた。
2.高圧:加熱時間は30−45分間(圧力;140−170kPa、圧力上限;200kPa)
3.逆転写:(RNA抽出中に、タイムリーに高圧処理が必要で、逆転写プレミックスが予め作られる。)高圧プロセスが完了したときに、遠心分離用チューブが即席遠心分離のあとで、2−5μlの上澄み液がRNAの急速な崩壊を防ぐように逆転写のために急いで用いられた。
逆転写プレ−ミックス:逆転写緩衝剤、0.2mMのdNTPs、0.2μgのランダムプライマー(または0.2μMの特定のプライマー)、50UM−mLVの逆転写、0.01M DTT、DEPC水が最終容量20μlとなるように加えた。
42℃で60分間、95℃で5分間。
4.PCR:逆転写が完了後(即席遠心分離が実施された)、1−5μlの上澄み液をPCRプレミックスに添加した(1XPCR緩衝液、0.2mM dNTP、0.4−0.5μMの特定のプライマー、水を加えて最終25−50μlとした)。PCR:94℃で1分30秒間(94℃で30秒、55℃で30秒、72℃で20秒、30−35サイクル)72℃で2分間。
5.GAPDH mRNA RT−PCR(電気泳動図−226bp):図5参照
前記結果によれば、高圧加熱法は信頼できる量でDNAおよびRNAを同時に得るために用い得、特定の遺伝子配列フラグメント(DNA)および生体マーカー(mRNA)の検出のために用い得る。
Claims (12)
- 生体サンプルからの核酸検体溶液の抽出方法で、前記方法は、生体サンプルを加熱室に入れるステップ;任意に、前記生体サンプルに溶媒を加えるステップ;前記生体サンプルを高圧加熱に曝すステップ;任意に、前記生体サンプルを遠心分離するステップ;および前記核酸検体を得るステップを含んでなる。
- 前記高圧が、110〜320kPa、特に115〜250kPa、好ましくは120〜200kPaの如き
105〜350kPaである、請求項1の方法。 - 前記高圧加熱の継続時間が、10〜90分、特に20〜60分の如き5〜210分である、先行する請求項の何れかの方法。
- 前記生体サンプルが、生検サンプル、細胞サンプル、腫瘍サンプル、および生体液からなる群から選ばれる、先行する請求項の何れかの方法。
- 前記生体液サンプルが、血液、血清、組織液、尿、糞、痰、脳脊髄液、唾液、涙、および乳頭吸引液からなる群から選ばれる、先行する請求項の何れかの方法。
- 前記生体サンプルがパラフィン埋め込み組織である、先行する請求項の何れかの方法。
- 前記溶媒が、水、DEPC処理水、生理食塩水、アルカリ溶液、および緩衝液からなる群から選ばれる、先行する請求項の何れかの方法。
- 以下のステップ:
任意に、遠心分離管の栓に穿孔するステップ;
パラフィン埋め込み組織区画を遠心分離管に入れ、サンプルが液体に浸漬するように、純水またはアルカリ溶液を加えるステップ;
前記サンプルを140〜200kPaの圧力下、25〜45分加熱するステップ;および
前記サンプルを遠心分離機に掛けて、上澄み液を得るステップ
を含んでなる、先行する請求項の何れかの方法。 - 生体サンプル中の核酸検体を検出する方法で、以下からなる:
請求項1〜8の何れか1項の方法によって前記核酸検体の溶液を得、および
核酸検体を検出する。 - 前記検出が、ポリメラーゼ連鎖反応によって行なわれる、請求項9の方法。
- 前記核酸がDNAまたはRNAである、請求項9または10の方法。
- 更に前記核酸検体の溶液濃縮することを含む、請求項9〜11の何れか1項の方法。
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
PCT/CN2011/000746 WO2012145861A1 (zh) | 2011-04-27 | 2011-04-27 | 核酸液相提取及检测方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2014512190A true JP2014512190A (ja) | 2014-05-22 |
Family
ID=47071532
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2014506706A Pending JP2014512190A (ja) | 2011-04-27 | 2011-04-27 | 核酸の液相抽出方法とその検出方法 |
Country Status (6)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US9487820B2 (ja) |
JP (1) | JP2014512190A (ja) |
CN (2) | CN110257477A (ja) |
CA (1) | CA2834113C (ja) |
DE (1) | DE112011105191B4 (ja) |
WO (1) | WO2012145861A1 (ja) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2020075696A1 (ja) * | 2018-10-09 | 2020-04-16 | 公益財団法人筑波メディカルセンター | 試料の前処理方法 |
WO2022158402A1 (ja) * | 2021-01-25 | 2022-07-28 | 横河電機株式会社 | 核酸配列計測方法 |
Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH05192147A (ja) * | 1991-11-15 | 1993-08-03 | Kirin Bibaretsuji Kk | Dna塩基配列の特定方法 |
WO2004055170A1 (ja) * | 2002-12-17 | 2004-07-01 | Arkray, Inc. | 微生物または細胞の収集方法およびそれに用いる微生物または細胞の収集用具 |
JP2009125033A (ja) * | 2007-11-27 | 2009-06-11 | Konica Minolta Medical & Graphic Inc | 核酸単離方法、核酸抽出装置、及びそれらを用いた細胞種の同定方法及び遺伝子検出方法 |
JP2009254384A (ja) * | 1997-10-31 | 2009-11-05 | Bbi Bioseq Inc | 圧力強化抽出及び精製方法 |
JP2010158190A (ja) * | 2009-01-07 | 2010-07-22 | Hitachi High-Technologies Corp | 核酸回収方法及び核酸回収装置 |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP5624487B2 (ja) * | 2011-01-31 | 2014-11-12 | 横河電機株式会社 | 核酸抽出方法 |
-
2011
- 2011-04-27 JP JP2014506706A patent/JP2014512190A/ja active Pending
- 2011-04-27 CN CN201910524277.7A patent/CN110257477A/zh active Pending
- 2011-04-27 WO PCT/CN2011/000746 patent/WO2012145861A1/zh active Application Filing
- 2011-04-27 US US14/113,244 patent/US9487820B2/en active Active
- 2011-04-27 CA CA2834113A patent/CA2834113C/en active Active
- 2011-04-27 DE DE112011105191.3T patent/DE112011105191B4/de active Active
- 2011-04-27 CN CN201180049214.2A patent/CN103492567A/zh active Pending
Patent Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH05192147A (ja) * | 1991-11-15 | 1993-08-03 | Kirin Bibaretsuji Kk | Dna塩基配列の特定方法 |
JP2009254384A (ja) * | 1997-10-31 | 2009-11-05 | Bbi Bioseq Inc | 圧力強化抽出及び精製方法 |
WO2004055170A1 (ja) * | 2002-12-17 | 2004-07-01 | Arkray, Inc. | 微生物または細胞の収集方法およびそれに用いる微生物または細胞の収集用具 |
JP2009125033A (ja) * | 2007-11-27 | 2009-06-11 | Konica Minolta Medical & Graphic Inc | 核酸単離方法、核酸抽出装置、及びそれらを用いた細胞種の同定方法及び遺伝子検出方法 |
JP2010158190A (ja) * | 2009-01-07 | 2010-07-22 | Hitachi High-Technologies Corp | 核酸回収方法及び核酸回収装置 |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
JPN6015003016; The Journal of Histochemistry & Cytochemistry Vol.50, No.8, 2002, p.1005-1011 * |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2020075696A1 (ja) * | 2018-10-09 | 2020-04-16 | 公益財団法人筑波メディカルセンター | 試料の前処理方法 |
WO2022158402A1 (ja) * | 2021-01-25 | 2022-07-28 | 横河電機株式会社 | 核酸配列計測方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
DE112011105191T5 (de) | 2014-02-13 |
DE112011105191B4 (de) | 2016-04-07 |
US9487820B2 (en) | 2016-11-08 |
CA2834113A1 (en) | 2012-11-01 |
US20140087388A1 (en) | 2014-03-27 |
CN103492567A (zh) | 2014-01-01 |
CN110257477A (zh) | 2019-09-20 |
WO2012145861A1 (zh) | 2012-11-01 |
CA2834113C (en) | 2017-11-21 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN108841957B (zh) | 由血浆环状rna组成的肝癌诊断标志物及诊断试剂盒 | |
JP2004519234A (ja) | 核mRNAの収集および使用方法 | |
CN106350512A (zh) | 一种真核细胞核酸提取方法 | |
TWI462930B (zh) | 福馬林固定石蠟包埋樣本核酸分離方法 | |
CN104911274B (zh) | 一种单细胞实时荧光定量pcr检测方法及试剂盒 | |
CN105861672A (zh) | 一种人体外周血游离DNA中septin9基因甲基化检测试剂盒及检测方法 | |
CN102807976A (zh) | 一种核酸快速提取试剂盒及其应用 | |
WO2019024341A1 (zh) | 一种体液游离dna的文库构建方法及其应用 | |
CN107653333A (zh) | 一种牛巴贝斯虫巢式pcr特异性引物及检测试剂盒与巢式pcr检测方法 | |
CN109207473B (zh) | 一种宫颈细胞裂解试剂盒及裂解方法 | |
CN101914526A (zh) | 血清或血浆中微小rna的提取方法 | |
EP3105351B1 (en) | Kit and method for detecting bladder cancer | |
JP2014512190A (ja) | 核酸の液相抽出方法とその検出方法 | |
WO2016004548A1 (zh) | 临床微量活检石蜡包埋组织的前处理方法 | |
CN117144052A (zh) | 引物对、红色毛癣菌rpa试纸条试剂盒及检测方法 | |
CN109679945B (zh) | 一种用于提高血浆样本中游离dna提取率的助沉剂 | |
CN106987587A (zh) | 一种用于荧光定量pcr检测的快速提取核酸方法 | |
WO2006064739A1 (ja) | 核酸増幅反応を行うための生物学的試料の処理方法 | |
CN109439655B (zh) | 适用于超微量细胞核酸提取的试剂盒及方法 | |
CN113637668A (zh) | 一种同时提取血浆和血细胞病原菌dna的试剂盒及应用 | |
CN113444776A (zh) | 一种多重取代扩增技术制备重复序列的封闭试剂的方法 | |
CN112063615A (zh) | 一种基因组dna提取液、基因组dna提取方法及其应用 | |
JP6318239B2 (ja) | 真菌核酸の抽出方法 | |
JP2015096061A (ja) | 核酸増幅方法、核酸増幅用の核酸試料の製造方法および核酸解析方法 | |
Wang et al. | Nested PCR-SSCP assay for the detection of p53 mutations in paraffin wax embedded bone tumours: improvement of sensitivity and fidelity |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20140106 |
|
A529 | Written submission of copy of amendment under article 34 pct |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A529 Effective date: 20131028 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20131111 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20150127 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20150423 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20150825 |