JP2009254384A - 圧力強化抽出及び精製方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】生物学的物質の細胞溶解および生成の方法であって、サンプルを高圧にすることを含む。さらに、この方法を実施する装置に特徴がある。少なくとも2つの電極20,30,70,80を含み、圧力チャンバ内に位置する相と接触する導電性の流体を収容し、前記電極を接続する導管40,60,75,90を含む。
【選択図】図2
Description
本出願は、1998年1月30日に出願された米国特許出願第09/016,062号の一部継続出願であり、この米国特許出願第09/016,062号は、1997年10月31日に出願された米国特許出願第08/962,280号の一部継続出願である。これらの両方の出願の全体を、ここに参照のために編入する。
通常は、精製すべき生体分子を含む溶液を、低圧(たとえば雰囲気圧)にて固相へ導入する。溶液中に存在する生体分子が固相に結合した状態でその固相を、緩衝剤で処理済みの第二の溶液で洗浄する。高圧下での洗浄の間、所望の生体分子は固相に結合したままであり、望ましくない混入物(たとえば蛋白および脂質)は固相から除去される。洗浄が完了した時点で、所望の生体分子が固相から解放されるよう十分に、圧力をさらに上昇させる。この上昇した圧力が維持されている間に、新たな低塩緩衝剤を用いて、解放された生体分子を固相から洗い出して収集容器内へ流し入れる。これらの手順は、完全に自動化できる。回収した生体分子は、高塩濃度に影響されていないため、下流にて酵素反応に使用できる。
本方法の適用例としては、臨床または研究目的での血液、細胞培養(ゲノムまたは感染症)、または組織(たとえば腫瘍生検)からの核酸の精製、遺伝子またはバイオテクノロジー研究のための微生物DNAの精製、DNAの脱塩化、法医学的分析(たとえば犯行現場で発見された毛髪、血液、精液、または組織からのDNAの精製)、およびPCR製品の精製が含まれる。本発明の単離および精製手法は、天然核酸および人工核酸の両方に適用できる。人工核酸は通常、リボースまたはデオキシリボース、あるいはそれらの幾何学的アナログに基づく。人工核酸には、チオリン酸結合およびアミド結合を含む、天然のホスホジエステル結合以外の結合を使用できる。
圧力によって誘導される蛋白質の構造変化は、蛋白質や酵素の活性を保持したまま、埋没したアミノ酸(蛋白質や酵素の内部あるいは活性部位のアミノ酸)を標識する際に有用な手法となりうる。蛋白質と化学修飾剤との反応液に高圧力をかけて(それ自体または低温度、高温度、界面活性剤、他の変性剤との組み合わせで)、蛋白質の構造を混乱させることができることが知られている。化学修飾剤の例としては以下のものを挙げることができる。イソチオシアネート、1,2-または1,3-ジカルボニル化合物、マレイミド、スクシイミド、塩化スルホニル、アルデヒド、ニンヒドリン、オルトフタルアルデヒド、インドアセトアミド、β−メルカプトエタノール、グルタルアルデヒドのような架橋剤、アミン、チオール酸、カルボキシル酸、イミダゾール、あるいは蛋白質に特徴的な他の機能基と反応することがわかっている他の化合物。高圧力によって新しく露出した蛋白質残基と化学修飾剤が反応して、蛋白質を不活化する。
細胞培養液や組織などの細胞から、生体分子を精製する際には、それが非分泌型である場合、サンプルを固相上にのせる前に、細胞を溶かすか、少なくとも浸透性にしなければならない。細胞を溶かす方法には多くのものが知られており、核酸の単離に関しては上述の通りである。その方法には、化学的な方法(フェノール/クロロホルム抽出、グアニジン塩、カオトロピック塩、ドデシル硫酸ナトリウムのような界面活性剤、Proteinase Kのような酵素)と、物理的な方法(煮沸、フレンチプレス、ダウンシング、グラスビーズ存在下でのボルテックス、ソニケーション--Bollag et al., "Protein Method", 2nd Ed., 1996, pp. 27-56など参照)が含まれる。このような方法では、時間と温度によって結果が大きく左右されることが多い。
細胞溶解は、「凍結高圧」工程によっても可能である。この工程は細胞サンプルを高圧力と0℃以下に、順番にまたは同時に曝すことからなる。圧力は最低約1,000psi、あるいは5,000、20,000psiでよい。処理される細胞サンプルは低温と高圧に耐えうるチャンバに置かれなければならない。以後、便宜的にこのようなチャンバのことを「凍結高圧室」と呼ぶことにする。
不安定な生体物質を精製する際に常に問題となるのは、出発材料に酵素や酸素のような、分解を促す物質が含まれていることである。多くの場合、精製のために粗出発材料を壊す際に、このような物質が遊離する。高圧力と低温度はともに、分解活性を阻害することができるので、不安定な生体物質を単離する際には、凍結高圧状態でおこなうほうが有利である。凍結高圧精製は、すでに述べた凍結高圧装置に分離手段を付加することで行うことができる。
上述のように、細胞溶解と組織破壊は、圧力を大きく変化させることで促進される。圧力を変化させると、固体から液体への相転移が低温で起きる。他の高圧溶解法あるいは、高圧破壊法は、サンプルを固相のままで圧力を変化させるものである。後者の技術の形態の特徴は、低温小さな圧力変化をかける点にある(常圧から2,000、10,000あるいは20,000psiまで、約−20℃から0℃で、好ましくは約−8℃で)。他の形態では、より大きな圧力変化をすばやいサイクルで行うために物質の大部分で固体から液体への相転移が起きない。第三の形態では、高圧氷を形成させ、ある高圧力からさらに別の高圧力へ変化させる。
単離装置の設計図の一つを図1に示した。この装置はカートリッジ10で、金属(チタン、ステンレス綱、アルミニウムなど)、プラスチック(ポリプロピレンやポリテトラフルオロエチレンのような耐熱プラスチックなど)、ガラス、石英、石材(サファイアなど)、あるいはセラミックから製造され、米国特許出願第96/03232号に記載されているような圧力調節装置に取り付けられるように加工してある。
他の単離装置の設計図を図2及び3に示す。この装置は、電極アレイを少なくとも2軸に沿って配置したチップの形態をとる。各電極は固相化剤でコートされている。場合によっては、すべての電極を同一材でコートしたり、各電極ごとにコーティングを変えたり、2つ以上の電極に連結したキャピラリーに沿ってコーティングの勾配をつけたりする。チップは質量分析計やキャピラリー電気泳動装置といった分析装置に接続してもよい。
本発明のさらに他の形態の一例として、サンプルを第一の(ローディング)シリンジに注入する。シリンジは狭い出口を付したDEAE樹脂カートリッジを持つ。このシステムでは、高圧を生むために非常に小さい樹脂チャンバを持たなければならず、その材料は高圧に耐えなければならない。プランジャをゆっくりと押し下げ、大きな圧力勾配ができないようにする。サンプルが樹脂上にロードされたら、廃液を捨てる。10〜300mMなどの低塩濃度の緩衝液をシリンジ内に入れる。
図9は圧力調節装置内の加圧のための筒状チャンバを示している。チャンバ300は、固定した閉鎖310、サンプルセル320、ピストン330からなる。ピストンはチャンバ300の外からサンプルセル320まで圧力を伝える。サンプルセル320は、固定端キャップ340、柔軟壁350、サンプル区画360からなる。固定端キャップ340は、柔軟壁350がピストン330と筒壁380との間の隙間370へ押し出されるのを防止する。柔軟壁350によりサンプルセル320が変形し、それによりサンプル区画360内のサンプルが圧縮される。
陰イオン交換カートリッジ内でのDNAの単離と精製
DNAサンプルをQiagen DEAE陰イオン交換樹脂(Qiagen Inc., Santa Clarita, CA)を用いて、常圧下および高圧下で分離した。DEAE樹脂を9mm×内径4mm(外径5mm)のステンレス鋼の「半分に区切られたカラム」に充填した。カラムを2μmのポアサイズを持つチタン製フリット(Valco Instrument Company, Inc., Houston, TX)でキャップした。2つの、半分に区切られたカラムはそれぞれ、一方は樹脂を含み、もう一方は樹脂を含まずスペーサーとして働く。これらを、カラムホルダーに装着した。カラムホルダーは内径5mmの金属筒で、シリンジフィッティングが端に付いているので、液体はカラムを通過することができる。
脱塩なしでの溶出物の制限酵素消化
pCMV-SV40Tプラスミドを、JM109株の1.5ml一晩培養液からアルカリ溶解にて単離した(Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press: Plainview, NY, 1989, pp. 1.25-1.26)。1.5ml一晩培養液をマイクロ遠心管に入れ、12,000gで30秒遠心した。培地を除き、細胞を100μlの溶液1に激しくボルテックスして懸濁した。溶液1は50mMグルコース、25mM Tris-HCl(pH8.0)、10mM EDTA(pH8.0)からなる。新しく作った0.2M NaOH(1%ドデシル硫酸ナトリウム、SDSを含む)を200μl加え、チューブを5回ひっくり返した。氷冷した溶液3(5M酢酸カリウム60ml、氷酢酸11.5ml、水28.5mlを混合して作製する)を150μl加え、サンプルを穏やかにボルテックスし、氷中に4分おいた。サンプルを12,000gで5分間遠心した。中和された清澄な上清を新しいチューブに移し、最終的に700μlになるように水を加えた。300μlのサンプルをQiagen #12129プラスミドキット(Santa Clarita, CA)を用いて精製した。最後のイソプロパノール沈殿は行わなかった。
高圧により単離精製したプラスミドDNAを用いた、動物細胞での蛋白質発現
pCMV-SV40TAgベクターはSV40のラージT抗原(TAg)をコードしている。このベクターを細菌株JM109に形質転換し、基本的には実施例2に述べたような通常のアルカリ溶解法にて単離した。(Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press: Plainview, NY, 1989)。サンプル1.0mlをQiagen #12129プラスミドキット(Santa Clarita, CA)を用いて精製した。サンプル1.0mlを3等分し、実施例1で述べたようにバッチで精製した。プラスミドは29,000psi、500mM NaClにて溶出した。精製されたpCMV-SV40TAgプラスミドをエタノール沈殿し滅菌水に溶解した。
DEAE陰イオン交換カートリッジによる全RNAの単離
TAgを安定に発現するBSC40細胞をChomczynskiらの方法(Anal. Biochem., 162:156-159, 1987)で溶解した。1mlのRNA STAT-60TM(Tel-test, Inc., Friendswood, TX)を細胞に直接加えた。5分間室温に置いた後、細胞をプレートから剥がし、ピペッティングにより均質化し、滅菌したマイクロ遠心チューブに移した。クロロホルムを0.2ml加え、15秒間激しく混合し、遠心により上層の水相を分離した。イソプロパノール沈殿によって得られたマイクロ遠心チューブ中のRNAのペレットを、50μlのRNase不含滅菌水に溶解した。RNAサンプル10μlを平衡化緩衝液500μl(750mM塩化ナトリウム、50mM MOPS, pH7.0、15%エタノール、0.15%Triton X-100)と混ぜた。
真核細胞サンプルからのメッセンジャーRNA(mRNA)の精製
固相を含む2つのカートリッジを順番に接続して、第一のカートリッジからの溶出物が第二のカートリッジに注入されるようにする。第一のカートリッジには活性化済DEAE陰イオン交換樹脂を充填し、第二のカラムにはポリチミジン(poly-dT)を共有結合させた樹脂を充填する。
高圧で精製されたRNAを用いた、ヒト悪性腫瘍におけるp53変異の検出
実施例4で述べたようにChomczynskiらの方法(前出)と高圧DEAEカラム精製とを組み合わせて、腫瘍サンプルから全RNAを調製する。均質化したヒトサンプルを8M尿素、50mM Tris-Cl緩衝液(pH8.0)で溶解する。500μlの尿素溶液を、常圧下でカートリッジに充填した活性化済DEAE樹脂にロードする。全RNAは29,000psiで溶出される。p53のmRNAを、p53に特異的なプライマーを用いて、逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)にて増幅する(Promega, Madison, WI)。得られたDNA産物の塩基配列をSequenase 2.0キット(United States Biochemicals)を用いたジデオキシ連鎖終結法にて決定し、p53の共通配列と比較することで変異分析を行う。このように、細胞からRNA分子を得る方法として、高圧RNA単離が効果的で単純な方法であるといえる。
ヒト全血からのRNA単離
ヘパリンなどの抗凝血剤を加えた全血300mlを、実施例1で述べたように、DEAE陰イオン交換カートリッジに3分以上かけてロードする。次にカラムを60,000psiに加圧して細胞を溶解し、核酸分子をDEAE樹脂に結合させる。続いて、実施例4で述べたようにRNAを29,000psiで溶出し、連続したフラクションを集め、イソプロパノールで沈殿させ、30mlのRNase不含水に溶解する。
イオン交換電気泳動における圧力の効果
384μMのローダミン標識デオキシオリゴヌクレオチド21量体5μlと、Qiagenシリカイオン交換樹脂100μlを、25mM TBE緩衝液中で混合した。樹脂や液体を扱うためのリザーバが4つ付いたアクリル製カートリッジに樹脂を入れた。各リザーバの底に電極をつけ、カートリッジの外につけたワイヤによってカートリッジのキャップに接続した。カートリッジをホウ酸緩衝液で満たす。Oリング付きのキャップは、カラム先端を密閉し、ピストンとして働く。カートリッジは加圧装置のキャップ内の4本の電線へと接続されるように設計された。シリコンオイルを加圧剤として用いる。
高圧力による浸透化と電気泳動による細胞やウイルスからの核酸の精製
pACYCプラスミドをもつ大腸菌を5ml培養液にて、100μg/mlのアンピシリンを加えたLuria液体培地(LB/amp)中で600nmにおける光学密度が0.6になるまで培養した。培養液1mlを10,000gで10分間遠心して細胞をペレットにした。上清を捨てて細胞を1mlの蒸留水に懸濁した。実施例8で述べたように、細胞懸濁液90μlと384μMのローダミン標識オリゴヌクレオチド21量体2μlとを高圧電気泳動カートリッジにアプライした。1%アガロースゲルをカートリッジ内の別の区画に作った。カートリッジを30,000psiまで加圧し、35Vで15分間電場をかけた。標識オリゴヌクレオチドがゲル中に移動するのが観察されたことから、DNAが移動するのに適切な電気的処理がなされたことがわかる。アガロース片を針で取り除き、平板アガロースゲルのウェル中に入れた。平板ゲルを、4つの対照とともに泳動する。1)純粋なプラスミド、2)未処理の細胞、3)常圧下のカートリッジ中で電気泳動した細胞、4)電気泳動しないで15分間30,000psiで加圧した細胞。その結果、高圧力による細胞壁と細胞膜の浸透化によってプラスミドDNAを遊離させることができることがわかった。この結果は、プラスミドDNAを一工程で精製できる可能性を示している。溶解、中和、精製といった別々の工程が必要ない。
変化圧力と一定圧力のどちらかまたは両方による、細胞溶解とRNA精製
マウスNIH3T3細胞を組織培養皿で常法に従って培養した。組織培養皿中の細胞を8mlのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で洗浄し、剥がしてから500mlのPBSに懸濁した。細胞懸濁液50μlをカプセル内に入れ、シリカ融点オイル(Sigma Chemicals, St. Louis, MO)で満たした圧力室内に挿入した。細胞液をいれたカプセルへの加圧と減圧を60回繰り返した。各サイクルにおいて、カプセルを30,000psiで1.25秒間加圧し、1.25秒間常圧に戻した。別の実験では、カプセルを10分間、60,000psiで一定に保った。
変化圧力と一定圧力のどちらかまたは両方による、細胞溶解と染色体DNA精製
実施例10で述べたような、高圧の変化と一定圧力の与圧のどちらかまたは両方をかけることによる細胞の破壊に加えて、Proteinase Kや界面活性剤といった試薬を加えてもよく、そうすることで核内のDNA/蛋白質複合体から染色体DNAを遊離させることができる。中性あるいは正に荷電した界面活性剤をテストしたが、このような化合物は後に行う高圧精製との同時使用が可能である。そのような界面活性剤としては、NP-40や塩化セチルトリメチルアンモニウム(CTMA)が挙げられる。まず、DEAE樹脂を2%NP-40、100mM酢酸ナトリウム緩衝液pH4.5で活性化し、50mM Tris-Cl、400mM NaCl、2%NP-40、pH8.5からなる緩衝液で平衡化する。次に、実施例1で述べたように、マウスNIH3T3細胞を8mlのPBSで2回洗浄し、剥がして1mlのPBSに懸濁し、DEAEカラム上にアプライする。実施例10で述べたように、高圧の変化と一定の与圧のどちらかまたは両方をカートリッジにかける。染色体DNAの溶出は、35,000psiで電気溶出することで行われる。量と品質の対照として、200μlのNIH3T3細胞液と200μlのスクロース緩衝液(1.28Mスクロース、40mM Trsi-Cl、20mM MgCl2、4% Triton X-100、pH7.4)とを混合する。混合物を2,000rpmで15分間遠心し、上清を捨て、400μlの一般的な溶解緩衝液(0.8Mグアニジン塩酸、30mM Tris-HCl、30mM EDTA、5% Tween-20、0.5% Triton X-100、pH8.0)を加え、穏やかにボルテックスし、Proteinase K消化反応を55℃で1時間行う。消化後、溶解液を14,000rpmで10分間遠心する。200μlの上清を取ってQIAamp Tissue Kit #29304のプロトコルに従って核酸を精製する。精製された核酸を最終的に100μlの蒸留水で溶出する。この溶出液に含まれる核酸の内容を、OliGreenにて常法通り分析した。もし対照の蛍光強度が、加圧した細胞と同じくらいであれば、2つの加圧処理は常法と同じくらい効果的であるといえる。
植物RNAの分析のためのサンプルからRNaseを不活化する
0.1gのトウモロコシ葉片を、ホルムアルデヒドとCHES緩衝液(pH9)を含む適切な緩衝液中に置く。サンプルを柔軟な密閉チューブに入れ、−10℃に冷却する。温度が平衡に達したら、サンプルを70,000psiで5分間加圧する。サンプルを処理してRNAを回収する。RNAはブロッティングやRT-PCRで検出できる。
陰イオン交換カートリッジ中での精製
ランダムに切断された様々な長さのDNA断片を(染色体DNAなどから)得るために、陰イオン交換クロマトグラフィーを基盤にした方法を行うことができる。迅速なDNA断片化は、精製された生物学的なサンプルから出発して、高圧陰イオン交換の繰り返しとDNase I消化との組み合わせにより行われる。ヒト血液を溶解し、実施例7で述べたように、陰イオン交換カートリッジ中で精製する。染色体DNAは、100mM NaCl、50mM Trs-Cl、pH7.4からなる緩衝液中、45,000psiでカラムから溶出される。次にこの溶出液とDNase I(Pharmacia, Piscataway, NJ)とを混合し、37℃で様々な時間で保温する。DNase Iを不活化するために、反応液を90℃に3分間おくか、EDTAを最終濃度25mMになるように加える。あるいは、DNase Iを不活化しないままのDNA反応液を、新しいDEAEカートリッジにかけて次の精製段階に進んでもよい。熱処理あるいはEDTA処理した溶液を、新しいDEAEカラムにかける(染色体DNAの精製に用いるものと同じものでよい)。消化されたDNA断片を、100mM NaCl、50mM Tris-Cl、pH7.0からなる緩衝液100μlで、40,000psiにて溶出する。得られたDNAのサイズの分布を、アガロースゲル電気泳動で調べる。このようなサンプル調整法は、DNAハイブリダイゼーションチップに組み込まれていてもよいので、サンプル調製とそれに続くハイブリダイゼーション分析を単一の工程で行うことが可能となる。1%アガロースゲル電気泳動がDNA断片のサイズ分布を確かめるのに使用される。
圧力による細胞溶解と核酸の精製を統合するためのカートリッジ
設計されたカートリッジは、図10Aおよび10Bに示したように、必須な区画を望み通りに作製することができる。出発材料(細胞液や細胞溶解液など)を区画390にロードする。区画395は(460と470とに二分されている)、固形支持体上のDEAEのようなイオン交換樹脂で満たされ、核酸精製に使用される。この区画には4つの電極410、420、430、440、を取り付けることができる。電極はポリアクリルアミドゲルで保護されている。電極410と420は溶出前の精製に使用され、比較的低い圧力で夾雑物が除かれる(蛋白質、ポリサッカライド、脂質など)。電極430と440は核酸産物を高圧で精製する際に使用される。すべての電極は、実施例10及び11で述べたように、溶解工程において使用される。区画395はプラスチック壁450で隔てられており、核酸分子が460から470まで移動できるようになっていて、クロマトグラフィーの効果で解像度が改善するようになっている。高解像度を得るためには、核酸の荷電と大きさの両方を考慮しなければならない。大きいDNAは樹脂から解離するのにより高い圧力を必要とするので、適切な圧力下では、相対的に小さなDNA分子が最初に溶出される。クロマトグラフィーによる効果により、DNAの大きさの分離度が増す。区画400は吸着物質の層からなる(セルロースベースのフィルターメンブレン、シリカゲル、CaO、綿など)。吸着物質の層は多くの液体を吸着するので、比較的大量の溶液をカートリッジにかけることができ、産物の収量が改善する。区画405と、区画395および400とは核酸浸透膜480によって仕切られており、低塩緩衝液を含む(50mM NaCl、50mM Tris-HCl、pH8.5など)。区画405は物理的に区画390と仕切られているが、その間の障壁490は針を使って穴をあけることができるので、その穴から区画405にある核酸産物をシリンジで集めることができる。
高圧空気の出し入れを利用した細胞溶解
酵母細胞の一晩培養液50μlを500mlカラムにロードした。ピストンをカラム内に挿入し、外部からの圧力がカラム内に伝わるようにした。カラムを圧力調節装置へ移し、60,000psiで5分間加圧した。減圧し、常圧下で1分間おいてから、再度加圧した。さらに2回減圧と加圧を繰り返し、常圧下で細胞液をカラムより回収した。顕微鏡下での判定を行い、さらに核酸含有量を蛍光色素結合分析で決定した。その結果、高圧空気の出し入れにより、高圧パルスによるものと同等の細胞溶解を起こすことができることがわかった。
RNA/DNA混合物からRNAの分離
Torula酵母(IV型)の全RNAをSigma(St. Louis, MO)より購入した。pKK223-3(Pharmacia, Piscataway, NJ)をDNA対照として用いた。RNAとDNAをNTM緩衝液(pH7.0)中で混合した(NTM:175mM NaCl、35mM Tris、0.5mM MgCl2)。混合物をまず、ステンレス綱カートリッジ内のQiagen DEAE樹脂に結合させた。0.4mlのRNA/DNA液を、活性化済DEAE樹脂をを含むカートリッジに注入したあと、200μlのNTM緩衝液(pH8.5)で洗浄した。23,600psi、NTM緩衝液(pH8.5)での1200μlの溶出フラクションを集めた。カートリッジを1mlの高塩緩衝液(1.25M NaCl、50mM Tris-HCl, pH8.5、15%エタノール)で洗浄した。溶出物をOriGreen蛍光アッセイで分析した。残りの溶出フラクションと高塩緩衝液での洗浄液をエタノール沈殿し、20μlの再蒸留水に溶解した。これらをアガロースゲル電気泳動で確認した。その結果、RNAが完全にDNAから分離されており、RNAが精製されたことがわかった。DNAは高塩洗浄工程で回収されるが、その際わずかにRNAが混入した。このように、高圧力を利用した精製により、RNA/DNA混合物からRNAを分離することができる。
高温高圧下での酵母細胞の溶解
酵母細胞を高温と高圧のどちらかまたは両方に曝すことで、細胞が溶解するか否かを調べるために、Sigma(St Louis,MO)より取得したパン酵母細胞を12.5mlのYPD液体培地にて30℃で一晩培養した。1.5ml中の1.5×108細胞を10,000rpm、1分間の遠心でペレットにした。細胞を1mlのPBS(pH6)に懸濁し、再度ペレットにした。細胞ペレットは使用するまで氷中に保存した。使用前に細胞を0.5mlのPBS由来の溶解液に懸濁した(77mM NaCl、1.5mM KCl、2.4mM Na2HPO4、0.8mM KH2PO4、10%ベントナイト(10mM NaOAc(pH6.0)に溶解)、1% SDS、10mM DTT)。
酵母細胞の凍結加圧溶解(1)
1.5×108のパン酵母細胞を洗浄し、前の実施例で述べた、ベントナイトを含むPBS由来の溶解緩衝液に懸濁した。細胞懸濁液のうちの200μlを、10分間の加圧処理にかけた。この加圧処理は−18℃で行われ、常圧と、20,000psi、35,000psi、50,000psi、65,000psiそれぞれとの間の5回サイクルからなる。各サイクルの最終圧力で1分間保たれる。例えば、常圧から50,000psiまで圧力を変化させるサイクルでは、常圧で1分間保ち、50,000psiでさらに1分間保った。80,000psiの圧力まで上昇させ、維持する処理も加えられた。
酵母細胞の凍結加圧溶解(2)
パン酵母を12.5mlのYPD培地にて、30℃で一晩培養した。およそ109の細胞を10,000rpmで10分間遠心した。ペレットを1%SDS、10mM DTTを含むPBS由来の溶解液(pH6.0)に懸濁した。次に細胞を5分間の加圧処理にかけた。この処理は、−15℃にて、常圧と37,000psiのサイクルを5回繰り返すものである。
凍結サンプルの圧力変化
Saccharomyces cerevisiae(パン酵母)をYPD培地にて30℃で一晩培養し、細胞密度を光学顕微鏡にて測定した。10,000gで1分間遠心して酵母を沈殿させ、PBSにて洗浄した。上清を捨て、ペレットを270μlの溶解緩衝液(2%Triton X100、1% SDS、100mM Tris-HCl(pH8)、1mM EDTA)に懸濁した。酵母サンプルは使用するまで−20℃で保存した。酵母サンプルを、加圧装置にかけた。加圧装置はエチレングリコールで満たし、−5℃に制御した。2000psiで5分間、常圧で5分間、圧力を上下させた。サンプルを穏やかにボルテックスし、10,000gで1分間遠心して細胞片を除去した。上清を集め、フェノール:クロロホルム:イソアミルアルコール抽出にて精製して、DNAをPicoGreen蛍光色素(Molecular Probes, WA)にて定量した。収量を対照サンプルと比較した。対照サンプルは、溶解緩衝液中でグラスビーズとともにボルテックスして壊した(Rose, Winston and Hieter, "Methods in Yeast Genetics")。2000psiに加圧したサンプルの収量は、陽性対照のDNA量の50%であった。一方、15,000psiに加圧したサンプルの収量は、対照の10%にすぎなかった。
上の記述から、当業者は本発明の本質的な特徴を確かめることが可能である。また、本発明の意図および範囲から逸脱しない限りにおいて、種々の使用法および条件に適合するように、種々の変更及び変形を本発明に加えることも可能である。
Claims (102)
- 圧力調整装置であって、
少なくとも2つの電極を含む電極アレイシステムと、
圧力チャンバ内に位置する相と接触する導電性の流体を収容し、前記電極を接続する導管と、
を含む圧力調整装置。 - 請求項1に記載の装置において、
前記導管と接続され導管によって移送される物質を収容する少なくとも1つのリザーバをさらに含む装置。 - 請求項2に記載の装置において、
前記リザーバは、前記圧力チャンバ内に位置する装置。 - 請求項1に記載の装置において、
前記導管は、非導電体のチューブを含む圧力調整装置。 - 請求項1に記載の装置において、
前記圧力チャンバからまたは圧力チャンバへ圧力を伝達する圧力伝達装置をさらに有する装置。 - 請求項1に記載の装置において、
少なくとも3つの電極を含む装置。 - 請求項6に記載の装置において、
前記電極は、少なくとも2つの軸を規定する装置。 - サンプルから核酸を精製する方法であって、
サンプルと、前記請求項1の装置の相であって核酸をサンプルの非核酸物質を結合させるより大きな親和力で核酸を非特異的に結合させる相と、を初期圧力において接触させ、 少なくともいくつかの非核酸物質を前記電極の1つに向けて移送し、
核酸の相との結合を破壊するのに十分なレベルに圧力を調整し、
核酸を第2の前記電極に向けて移送する方法。 - 請求項1に記載の装置において、
前記導管は、電気泳動性の毛管を含む装置。 - サンプルから核酸を精製する方法であって、
サンプルと、前記請求項9の装置の相であって核酸をサンプルの非核酸物質を結合させるより大きな親和力で核酸を非特異的に結合させる相と、を初期圧力において接触させ、 少なくともいくつかの非核酸物質を核酸から電気泳動的に分離し、
核酸の相との結合を破壊するのに十分なレベルに圧力を調整し、
調整された圧力で、核酸を相から電気泳動的に分離する方法。 - 請求項1に記載の装置において、
前記導管は、電気浸透性の毛管を含む圧力調整装置。 - サンプルから核酸を精製する方法であって、
サンプルと、前記請求項11の装置の相であって核酸をサンプルの非核酸物質を結合させるより大きな親和力で核酸を非特異的に結合させる相と、を初期圧力において接触させ、
少なくともいくつかの非核酸物質を核酸から電気浸透的に分離し、
核酸の相との結合を破壊するのに十分なレベルに圧力を調整し、
調整された圧力で、核酸を相から電気浸透的に分離する方法。 - 請求項1に記載の装置において、
前記電極アレイシステムは、マイクロチップ上に構成されている装置。 - 請求項1に記載の装置において、
前記相は、ヒドロキシアパタイトを含む装置。 - 請求項1に記載の装置において、
前記相は、固定化された核酸分子を含む装置。 - 請求項1に記載の装置において、
前記相はシリカを含む装置。 - 請求項1に記載の装置において、
前記相はアニオン交換樹脂を含む装置。 - サンプルから核酸を精製する方法であって、
サンプルを、サンプルの非核酸物質を結合させるより大きな親和力で核酸を非特異的に結合させる相に対し、初期圧力において加え、
少なくともいくつかの非核酸物質を相および核酸から空間的に分離し、
核酸の相との結合を破壊するのに十分なレベルに圧力を調整し、
調整された圧力で、核酸を相から空間的に分離し、
前記サンプルを加えるステップおよび第1の空間的な分離ステップは、単一の反応槽内で行われる方法。 - 請求項18に記載の方法において、
前記第1の空間的分離ステップは、非核酸物質をリザーバへ移送することを含む方法。 - 請求項19に記載の方法において、
前記リザーバは結合物質を含む方法。 - 請求項18に記載の方法において、
前記第1の空間的な分離ステップは、電気的泳動を含む方法。 - 請求項18に記載の方法において、
前記第1の空間的な分離ステップは、電気的浸透を含む方法。 - 請求項18に記載の方法において、
前記初期圧力は、大気圧であり、前記調整された圧力は、上昇された圧力である方法。 - 請求項23に記載の方法において、
前記上昇された圧力は500〜100,000psiである方法。 - 請求項18に記載の方法において、
前記サンプルは、細胞を含み、
サンプルを細胞が溶解するに十分な高圧とすることをさらに含む方法。 - 請求項25に記載の方法において、
前記細胞は、外側膜および核膜を含み、
前記高圧は、外側膜を溶解させるのに十分であるが、核膜を溶解させるには不十分である方法。 - 請求項18に記載の方法において、
前記サンプルは、核酸結合蛋白を含み、
サンプルを核酸結合蛋白を不活性化するのに十分な高圧とすることをさらに含む方法。 - 請求項27に記載の方法において、
核酸結合蛋白はヌクレアーゼ酵素を含む方法。 - 請求項18に記載の方法において、
前記サンプルは、
種々のサイズの核酸を含み、
前記調整された圧力レベルは、比較的少量の核酸を相との結合を破壊し、
さらに、
調整された圧力を比較的多くの核酸と相との結合を破壊するのに十分なレベルのさらに調整された圧力とし、
このさらに調整された圧力において、核酸を相から空間的に分離する方法。 - 請求項25に記載の方法において、
前記サンプルは、生物学的流体を含む方法。 - 請求項25に記載の方法において、
前記サンプルは、全血を含む方法。 - 請求項25に記載の方法において、
前記サンプルは、血清および血漿を含む方法。 - 請求項25に記載の方法において、
前記サンプルは、培養された細胞を含む方法。 - 請求項25に記載の方法において、
前記サンプルは腫瘍生検組織を含む方法。 - 請求項25に記載の方法において、
前記サンプルは植物組織を含む方法。 - 請求項25に記載の方法において、
前記サンプルは生きている組織を含む方法。 - 請求項18に記載の方法において、
前記核酸は、DNAを含む方法。 - 請求項18に記載の方法において、
前記核酸は、RNAを含む方法。 - 請求項18に記載の方法において、
前記核酸は、メッセンジャーRNAを含む方法。 - 請求項18に記載の方法において、
前記核酸は、ウィルス性のRNAを含む方法。 - 請求項37に記載の方法において、
前記DNAは、染色体DNAを含む方法。 - 請求項37に記載の方法において、
前記DNAは、ベクタを含む方法。 - 請求項37に記載の方法において、
前記DNAは、ウィルス性DNAを含む方法。 - 請求項18に記載の方法において、
前記調整された圧力はベクタDNAを溶離するのに十分であるが、染色体DNAを溶離するの十分なほど高くない方法。 - 請求項18に記載の方法において、
前記調整された圧力はベクタRNAを溶離するのに十分であるが、染色体DNAを溶離するの十分なほど高くない方法。 - 請求項18に記載の方法において、
ジカルボニル物質をサンプルに添加し核酸結合蛋白を不活性化する方法。 - 請求項18に記載の方法において、
前記相は、ヒドロキシアパタイトを含む方法。 - 請求項18に記載の方法において、
前記相は、固定化された核酸分子を含む方法。 - 請求項18に記載の方法において、
前記相は、シリカを含む方法。 - 請求項18に記載の方法において、
前記相は、アニオン交換樹脂を含む方法。 - 請求項18に記載の方法において、
前記相は、圧力感応ゲルを含む方法。 - 請求項18に記載の方法において、
前記相は、圧力安定媒体を含む方法。 - 請求項52に記載の方法において、
前記圧力安定媒体は、正に帯電した表面を有する1〜50μmのビーズを含む多孔でない樹脂である方法。 - 請求項18に記載の方法において、
前記膜の1つは、実質的に核酸が非透過であり、第2の膜は電気的ポテンシャルに印加において増加された透過性を有し、
前記核酸を2つの膜の間に電気泳動で濃縮することを含む方法。 - 請求項54に記載の方法において、
前記濃縮は、前記調整された圧力において、行われる方法。 - 請求項18に記載の方法において、
電気泳動によってフィルタ中に空間的に分離された核酸をトラップすることをさらに含む方法。 - 請求項18に記載の方法において、
空間的に分離された核酸を分析機器に移送することをさらに含む方法。 - 請求項57に記載の方法において、
前記分析機器は、マトリックス・アシステッド・レーザ・デソープションおよびイオナイザーション(Matrix-assisted Laser Desorption and Ionization(MALDI)質量分析計である方法。 - 請求項18に記載の方法を実行する装置であって、
圧力調整装置と、
前記細胞は前記装置内に適用されるセルであって、前記相を含む加圧可能セルと、
を含む装置。 - サンプルを加圧する装置であって、
サンプル室と、
流体を媒体およびサンプル室の間に流し、外部の加圧媒体からサンプル室に圧力を伝達する圧力伝達装置と、
を含む装置。 - 請求項60に記載の装置において、
前記サンプル室および圧力伝達装置が内部に形成されたオリフィスを有するチャンバをさらに有する装置。 - 請求項60に記載の装置において、
前記圧力伝達装置は、形状記憶合金装置を含む装置。 - 請求項60に記載の装置において、
前記圧力伝達装置は、磁歪装置を含む装置。 - 請求項61に記載の装置において、
前記チャンバは、シリンダーを含み、前記圧力伝達装置はピストンを含む装置。 - 請求項64に記載の装置において、
前記シリンダーは、シールされた端部および開放された端部を有するプラスチックチューブを含み、前記ピストンはゴムのピストンを含む装置。 - 請求項60に記載の装置において、
前記チャンバは、微量滴定(マイクロティター)プレートのウェルを含む装置。 - 細胞を透過化(permeabilizing)させる方法であって、
請求項60の装置のサンプル室に初期圧力で細胞を充填し、
少なくとも10,000psiに圧力を瞬間的に上昇し、細胞を透過化させる方法。 - 請求項67に記載の方法において、
前記サンプル室は、ガスも充填される方法。 - 請求項67に記載の方法において、
電圧をサンプル室に印加し、透過化された細胞の少なくともいくつかの物質を細胞の物質から空間的に分離する方法。 - 請求項67に記載の方法において、
細胞を凍結することをさらに含む方法。 - 改良されたイオン交換クロマトグラフィー方法であって、
高圧を利用してイオン交換物質との結合親和力を調整することを含む方法。 - 細胞から分子を分離する方法であって、
細胞を圧力チャンバ内で、少なくとも500psiの上昇された圧力にさらし、細胞を溶解させ、
前記圧力チャンバ内で、分子を細胞から分離する方法。 - 請求項72に記載の方法において、
上昇された圧力と大気圧と間の圧力のサイクルを少なくとも2回行う方法。 - 請求項72に記載の方法において、
前記分子は、流れている溶媒への溶離、電気泳動、電気浸透、吸着媒体への選択的吸着、ろ過、差動沈殿(differential sedimentation)、蒸発、蒸留、ガスクロマトグラフィーまたは沈殿(precipitation)によって、抽出される方法。 - 請求項72に記載の方法において、
前記圧力は、1秒以内に最終的な値に上昇される方法。 - 請求項72に記載の方法において、
前記圧力は、0.1秒以内に最終的な値に上昇される方法。 - 請求項72に記載の方法において、
前記分子は、細胞が前記上昇された圧力にある時に抽出される方法。 - 請求項72に記載の方法において、
セルを大気圧に戻すことをさらに含む方法。 - 請求項72に記載の方法において、
少なくともに部分的に分子を前記圧力チャンバ内で精製する方法。 - 請求項79に記載の方法において、
前記分子は、流れている溶媒への溶離、電気泳動、電気浸透、吸着媒体への選択的吸着、ろ過、差動沈殿(differential sedimentation)、蒸発、蒸留、ガスクロマトグラフィーまたは沈殿(precipitation)によって、抽出される方法。 - 請求項79に記載の方法において、
前記精製ステップは、少なくとも500psiの圧力における変化を必要とする方法。 - 請求項72に記載の方法において、
前記セルは、酵母、細菌、真菌(ファンジャイ:fungi)、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞および原生動物細胞の群から選ばれたものである方法。 - 請求項78に記載の方法において、
前記細胞は、1秒またはそれ以下で、大気圧に戻される方法。 - 請求項78に記載の方法において、
前記細胞は、0.1秒またはそれ以下で、大気圧に戻される方法。 - 細胞を溶解させる方法であって、
凍結された細胞を大気圧下で提供し、
細胞を零下の温度に維持しながら、圧力チャンバ内において零下の温度で凍結された細胞が溶けるのに十分な上昇された圧力下にさらし、
圧力チャンバの圧力を減少させて零下の温度で細胞を凍結し、
前記さらす工程と、圧力を減少させる工程を細胞が溶解するまで繰り返す方法。 - 請求項85に記載の方法において、
前記零下の温度は、ほぼ−20℃またはそれ以上であり、前記上昇された圧力は、ほぼ28psiと75,000psiの間である方法。 - 請求項85に記載の方法において、
前記上昇された圧力は、最終的な値まで、10秒以内に上昇される方法。 - 請求項85に記載の方法において、
前記上昇された圧力は、最終的な値まで、1秒以内に上昇される方法。 - 請求項85に記載の方法において、
前記細胞は、細菌、真菌細胞、植物細胞、動物細胞、昆虫細胞または原生動物細胞である方法。 - 請求項85に記載の方法において、
前記細胞は、酵母細胞である方法。 - 生物学的成分を液体サンプルから分離する方法であって、
圧力チャンバ内において、サンプルを零下の温度において液体状態に維持するのに十分な上昇された圧力にさらし、
上昇された圧力を維持する一方、サンプルの温度を零下に下降させ、
上昇された圧力および零下の温度を維持している間にサンプルから生物学的成分を分離する方法。 - 請求項91に記載の方法において、
前記零下の温度は、ほぼ−20℃またはそれ以上であり、前記上昇された圧力は、ほぼ28psiと75,000psiの間である方法。 - 圧力調整装置であって、
少なくとも2つの電極を含む電極アレイシステムと、
圧力チャンバ内に位置する相と接触する導電性の流体を収容し、前記電極を接続する導管と、
前記圧力チャンバ内の温度を制御する手段と、
を含む圧力調整装置。 - 請求項93に記載の圧力調整装置であって、
前記導管と接続され導管によって移送される物質を収容する少なくとも1つのリザーバをさらに含む装置。 - 液体サンプルから核酸を精製する方法であって、
サンプルと、前記請求項93の装置の相であって核酸をサンプルの非核酸物質を結合させるより大きな親和力で核酸を非特異的に結合させる相と、を初期圧力において接触させ、
少なくともいくつかの非核酸物質を前記電極の1つに向けて移送し、
核酸の相との結合を破壊するのに十分なレベルに圧力を調整し、
核酸を第2の前記電極に向けて移送し、
かつ、前記初期圧力または調整された圧力または両方は、サンプルを零下の温度で液体状態に維持するのに十分な圧力である方法。 - 請求項95に記載の方法において、
前記核酸は、RNAである方法。 - 請求項96に記載の方法において、
前記調整された圧力はRNAを溶離するのに十分であるが、染色体DNAを溶離するの十分なほど高くない方法。 - 細胞から分子を分離する方法であって、
圧力チャンバ内において、細胞を少なくとも45℃の温度、少なくとも500psiの圧力にさらし、溶解された細胞を形成し、
圧力チャンバ内で、溶解された細胞から分子を分離する方法。 - 請求項98において、
前記温度は、ほぼ50℃からほぼ90℃の範囲にある方法。 - 細胞または組織を破壊、または微生物を不活性化する方法であって、
サンプルを凍結し、
サンプルを凍結状態に維持しつつ圧力を脈動させ、細胞、組織、または微生物を破壊する方法。 - サンプル中の蛋白を不活性化する方法であって、
サンプルに、イソチオシアン酸塩(isothiocyanates)、1,2−および1,3−ジカルボニル化合物(dicarbonyl compounds)、マレイミド(maleimides)、スクシンイミド(succinimides)、スルフォニルクロライド(sulfonyl chlorides)、アルデヒド(aldehydes)、ニンヒドリン(ninhydrin)、オルトフタルアルデヒド(ortho- phthalaldehyde)、ヨードアセタミド(iodoacetamide)、β−メルカプトエタノール(β−mercaptoethanol)、
および架橋物質の群から選択された1以上の試薬を添加し、反応混合物を形成し、
反応混合物を加圧し、蛋白を不活性化する方法。 - 請求項101に記載の方法において、
前記蛋白は、リボヌクレアーゼ酵素である方法。
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