JPH0873480A - 生物源からヌクレオチド活性糖を単離し、精製する方法 - Google Patents
生物源からヌクレオチド活性糖を単離し、精製する方法Info
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- JPH0873480A JPH0873480A JP7224835A JP22483595A JPH0873480A JP H0873480 A JPH0873480 A JP H0873480A JP 7224835 A JP7224835 A JP 7224835A JP 22483595 A JP22483595 A JP 22483595A JP H0873480 A JPH0873480 A JP H0873480A
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
- C12P19/28—N-glycosides
- C12P19/30—Nucleotides
- C12P19/305—Pyrimidine nucleotides
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 本発明は生物源から糖ヌクレオチド、特にシ
チジンモノホスフェート−活性化Ｎ−アセチルノイラミ
ン酸（ＣＭＰ−Ｎａｎａ）を単離し、精製するための改
善された方法を提供する。 【解決手段】 糖ヌクレオチドはアルコール性沈殿によ
りタンパク質を除去した糖ヌクレオチド含有溶液から、
固定相としてシリカゲルを使用する改善されたカラムク
ロマトグラフィー法を用いて、その後の脱塩工程だけで
それらを単離できるような高純度で得る。
チジンモノホスフェート−活性化Ｎ−アセチルノイラミ
ン酸（ＣＭＰ−Ｎａｎａ）を単離し、精製するための改
善された方法を提供する。 【解決手段】 糖ヌクレオチドはアルコール性沈殿によ
りタンパク質を除去した糖ヌクレオチド含有溶液から、
固定相としてシリカゲルを使用する改善されたカラムク
ロマトグラフィー法を用いて、その後の脱塩工程だけで
それらを単離できるような高純度で得る。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は生物源から糖ヌクレオチ
ド、特にシチジンモノホスフェート−活性化Ｎ−アセチ
ルノイラミン酸（ＣＭＰ−Ｎａｎａ）を単離し、精製す
るための改善された方法に関する。
ド、特にシチジンモノホスフェート−活性化Ｎ−アセチ
ルノイラミン酸（ＣＭＰ−Ｎａｎａ）を単離し、精製す
るための改善された方法に関する。
【０００２】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】糖分
子はすべての細胞に存在し、生活過程において非常に重
要である。栄養作用を果たす他に、それらはまた構造用
支持体（細胞壁）を与えるのに、そして核酸の構成成分
として非常に重要である。糖はモノマー、オリゴマーお
よびポリマーとして天然に存在する。
子はすべての細胞に存在し、生活過程において非常に重
要である。栄養作用を果たす他に、それらはまた構造用
支持体（細胞壁）を与えるのに、そして核酸の構成成分
として非常に重要である。糖はモノマー、オリゴマーお
よびポリマーとして天然に存在する。
【０００３】糖分子はそれらを細胞内で他の分子と化学
結合させる前に、または重合させる前に初めに活性化し
なければならない。この活性化はホスフェートの添加ま
たはヌクレオチドでの誘導化により行われる。これらの
反応は共に特殊な酵素（それぞれ、キナーゼおよびグリ
コシルトランスフェラーゼ）により触媒され、大抵は連
続的に起こる。生物細胞において、個々の糖は通常、活
性化を引き起こす特定のヌクレオシドホスフェートと結
合している。例えばＮ−アセチルノイラミン酸の場合、
これはシチジンであるが、５′−モノホスフェートで、
すなわちシチジンモノホスフェート−Ｎ−アセチルノイ
ラミン酸として存在する。
結合させる前に、または重合させる前に初めに活性化し
なければならない。この活性化はホスフェートの添加ま
たはヌクレオチドでの誘導化により行われる。これらの
反応は共に特殊な酵素（それぞれ、キナーゼおよびグリ
コシルトランスフェラーゼ）により触媒され、大抵は連
続的に起こる。生物細胞において、個々の糖は通常、活
性化を引き起こす特定のヌクレオシドホスフェートと結
合している。例えばＮ−アセチルノイラミン酸の場合、
これはシチジンであるが、５′−モノホスフェートで、
すなわちシチジンモノホスフェート−Ｎ−アセチルノイ
ラミン酸として存在する。
【０００４】Ｎ−アセチルノイラミン酸(Ｎａｎａ)は細
菌（例えばネイセリア(Neisseriae)およびストレプトコ
ックス（Streptococci））の細胞表面上にポリマー成分
（ヘテロポリマー）として他の糖と一緒に存在する。こ
れに関して、Ｎａｎａは様々な結合で存在し、例えば大
腸菌ではＮａｎａは細胞外ホモポリマー、コロミン酸と
して存在する。しかしながら、この場合、それは常に
２.８および２.９結合で存在する（Reglero らの Int.
J. Biochem., 第25巻, No. 11, 第1,517〜1,527頁 (199
3年)）。
菌（例えばネイセリア(Neisseriae)およびストレプトコ
ックス（Streptococci））の細胞表面上にポリマー成分
（ヘテロポリマー）として他の糖と一緒に存在する。こ
れに関して、Ｎａｎａは様々な結合で存在し、例えば大
腸菌ではＮａｎａは細胞外ホモポリマー、コロミン酸と
して存在する。しかしながら、この場合、それは常に
２.８および２.９結合で存在する（Reglero らの Int.
J. Biochem., 第25巻, No. 11, 第1,517〜1,527頁 (199
3年)）。
【０００５】これらの細胞壁構成成分の生合成は細胞内
で起こる。Ｎａｎａは最初にシチジントリホスフェート
（ＣＴＰ）を使用して酵素、ＣＭＰ−Ｎａｎａシンター
ゼ（ＥＣ ２.７.７.４３）により活性化されてＣＭＰ
−Ｎａｎａを与え（Kean の Glycobiol., 第1巻, No.
5, 第441〜447頁 (1991年)）、次にシアリルトランスフ
ェラーゼを用いて結合されてポリマーサブユニットにな
る。これらのポリマーサブユニットは脂質キャリヤーを
使用して細胞から分泌され、そして細胞外で互いに結合
されて１分子の実ポリマーになる(Shockman および Bar
rett の Ann. Rev. Microbiol., 第37巻, 第501〜527頁
(1983年)）。Ｎ−アセチルノイラミン酸はまた、真核
細胞に存在し、そこで細胞壁上に存在するだけでなく、
しばしば糖タンパク質の糖鎖の末端分子としても存在す
る。これらの糖鎖は細胞間識別に使用されるか、または
タンパク質の構造を維持するのに必要である。
で起こる。Ｎａｎａは最初にシチジントリホスフェート
（ＣＴＰ）を使用して酵素、ＣＭＰ−Ｎａｎａシンター
ゼ（ＥＣ ２.７.７.４３）により活性化されてＣＭＰ
−Ｎａｎａを与え（Kean の Glycobiol., 第1巻, No.
5, 第441〜447頁 (1991年)）、次にシアリルトランスフ
ェラーゼを用いて結合されてポリマーサブユニットにな
る。これらのポリマーサブユニットは脂質キャリヤーを
使用して細胞から分泌され、そして細胞外で互いに結合
されて１分子の実ポリマーになる(Shockman および Bar
rett の Ann. Rev. Microbiol., 第37巻, 第501〜527頁
(1983年)）。Ｎ−アセチルノイラミン酸はまた、真核
細胞に存在し、そこで細胞壁上に存在するだけでなく、
しばしば糖タンパク質の糖鎖の末端分子としても存在す
る。これらの糖鎖は細胞間識別に使用されるか、または
タンパク質の構造を維持するのに必要である。
【０００６】生物過程におけるオリゴ糖の重要性は治療
に介在する機会があるものとしてますます評価されてい
る。したがって、オリゴ糖を基剤とする薬剤（例えば抗
炎症活性化合物）を考えることができる（WO 91/19502,
WO 92/22661, WO 92/22565および WO 92/22563、 さら
に欧州特許出願公報0089 938、 0089 939 および 008994
0）。しかしながら、これに関しては特定の様式で互い
に結合される単糖からなるオリゴ糖を十分な量製造する
ことに問題がある。多数の官能基があるため、様々な結
合を有し、そのうちの１つだけが所望の生物活性を示
す、種々の異性形態で存在する所定のオリゴ糖を考える
ことができる。所望の配置のオリゴ糖の化学的手段だけ
による合成は保護基を使用する必要があり、また労力を
要し、コストが高い。別法として、酵素を使用してこれ
らの生物学的に活性なオリゴ糖を製造することが望まし
い。これらの酵素（グリコシルトランスフェラーゼ）は
生物学的物質に遍在し、それからこれらを単離すること
ができる（例えば Beyer らの Adv. Enzymol., 第52巻,
第23〜175頁 (1981年)を参照）。これらは基質および
受容体に関して、その結果として化学結合の性質に関し
て高度の特異性を示し、またこれらのうち幾つかはその
誘導体を使用することができる。
に介在する機会があるものとしてますます評価されてい
る。したがって、オリゴ糖を基剤とする薬剤（例えば抗
炎症活性化合物）を考えることができる（WO 91/19502,
WO 92/22661, WO 92/22565および WO 92/22563、 さら
に欧州特許出願公報0089 938、 0089 939 および 008994
0）。しかしながら、これに関しては特定の様式で互い
に結合される単糖からなるオリゴ糖を十分な量製造する
ことに問題がある。多数の官能基があるため、様々な結
合を有し、そのうちの１つだけが所望の生物活性を示
す、種々の異性形態で存在する所定のオリゴ糖を考える
ことができる。所望の配置のオリゴ糖の化学的手段だけ
による合成は保護基を使用する必要があり、また労力を
要し、コストが高い。別法として、酵素を使用してこれ
らの生物学的に活性なオリゴ糖を製造することが望まし
い。これらの酵素（グリコシルトランスフェラーゼ）は
生物学的物質に遍在し、それからこれらを単離すること
ができる（例えば Beyer らの Adv. Enzymol., 第52巻,
第23〜175頁 (1981年)を参照）。これらは基質および
受容体に関して、その結果として化学結合の性質に関し
て高度の特異性を示し、またこれらのうち幾つかはその
誘導体を使用することができる。
【０００７】これらのグリコシルトランスフェラーゼが
使用される場合、糖ヌクレオチドを供与基質として存在
させる必要がある。これらの糖ヌクレオチドは高価であ
り、化学的に不安定であり、また単離するのが困難であ
る。化学的手段による全合成は酵素を使用して糖ヌクレ
オチドを製造する別法を示すが、それも同様に非常に労
力を要し、費用がかかる。
使用される場合、糖ヌクレオチドを供与基質として存在
させる必要がある。これらの糖ヌクレオチドは高価であ
り、化学的に不安定であり、また単離するのが困難であ
る。化学的手段による全合成は酵素を使用して糖ヌクレ
オチドを製造する別法を示すが、それも同様に非常に労
力を要し、費用がかかる。
【０００８】糖ヌクレオチドを生物学的物質から直接単
離することができる。しかしながら、これらの分子は細
胞内に非常に低い濃度で存在するため、特定の場合だけ
この源からこれらを製造する値打ちがある。これらの分
子は大抵、複合体製造工程に伴って自然に分解し、収量
が減少する。このため、糖ヌクレオチドを合成する酵素
を先に単離することなく、糖ヌクレオチドを生物源から
直接単離するための改良された、時間のかからない方法
が必要とされる。
離することができる。しかしながら、これらの分子は細
胞内に非常に低い濃度で存在するため、特定の場合だけ
この源からこれらを製造する値打ちがある。これらの分
子は大抵、複合体製造工程に伴って自然に分解し、収量
が減少する。このため、糖ヌクレオチドを合成する酵素
を先に単離することなく、糖ヌクレオチドを生物源から
直接単離するための改良された、時間のかからない方法
が必要とされる。
【０００９】早くも１９５９年には、ＣＭＰ−Ｎａｎａ
が大腸菌Ｋ−２３５株（ＡＴＣＣ１３０２７）で検出さ
れ、その菌株の細胞から単離された（Comb らの J. Am.
Chem. Soc., 第81巻, 第5,513〜5,514頁）。これま
で、その細胞は超音波により破壊され、ＣＭＰ−Ｎａｎ
ａはアニオン交換樹脂（Ｄｏｗｅｘ−１，Ｃｌ-；Ｌｉ
Ｃｌで溶離）を使用して精製された。ＣＭＰ−Ｎａｎａ
の単離に関する他の論文(Comb らの J. Biol. Chem.,
第241巻, 第23号, 第5,637〜5,642号 (1966年))は、様
々な方法（超音波，フレンチプレスなど）の１つを使用
して細胞を溶解させたら、ヌクレオチドとタンパク質を
最初にエタノールで沈殿させる必要があることを示唆し
ている。これを行うために、細胞は最初にアセトンの存
在下で乾燥され、次に８０％エタノールで処理され、室
温で１２時間放置され、最後に遠心分離される。抽出物
中のヌクレオチドはイオン交換樹脂（Ｄｏｗｅｘ−１，
ＨＣＯ3 -，２００〜４００メッシュ）に結合され、炭酸
水素トリエチルアンモニウムを使用してpH７.４で溶離
される。細胞の性質に応じて、全量のヌクレオチド中に
おけるＣＭＰ−Ｎａｎａの割合は１〜１０％である。し
かしながら、処理中に問題が生じる。したがって、イオ
ン交換樹脂は８０％エタノール性緩衝液で数時間平衡さ
せる必要があり、またカラム中の緩衝液の流速は溶離の
間減少する（時間ファクター）。
が大腸菌Ｋ−２３５株（ＡＴＣＣ１３０２７）で検出さ
れ、その菌株の細胞から単離された（Comb らの J. Am.
Chem. Soc., 第81巻, 第5,513〜5,514頁）。これま
で、その細胞は超音波により破壊され、ＣＭＰ−Ｎａｎ
ａはアニオン交換樹脂（Ｄｏｗｅｘ−１，Ｃｌ-；Ｌｉ
Ｃｌで溶離）を使用して精製された。ＣＭＰ−Ｎａｎａ
の単離に関する他の論文(Comb らの J. Biol. Chem.,
第241巻, 第23号, 第5,637〜5,642号 (1966年))は、様
々な方法（超音波，フレンチプレスなど）の１つを使用
して細胞を溶解させたら、ヌクレオチドとタンパク質を
最初にエタノールで沈殿させる必要があることを示唆し
ている。これを行うために、細胞は最初にアセトンの存
在下で乾燥され、次に８０％エタノールで処理され、室
温で１２時間放置され、最後に遠心分離される。抽出物
中のヌクレオチドはイオン交換樹脂（Ｄｏｗｅｘ−１，
ＨＣＯ3 -，２００〜４００メッシュ）に結合され、炭酸
水素トリエチルアンモニウムを使用してpH７.４で溶離
される。細胞の性質に応じて、全量のヌクレオチド中に
おけるＣＭＰ−Ｎａｎａの割合は１〜１０％である。し
かしながら、処理中に問題が生じる。したがって、イオ
ン交換樹脂は８０％エタノール性緩衝液で数時間平衡さ
せる必要があり、またカラム中の緩衝液の流速は溶離の
間減少する（時間ファクター）。
【００１０】最後に、ＣＭＰ−Ｎａｎａを含有するフラ
クションは合一され、さらにペーパークロマトグラフィ
ーまたはSephadex（登録商標）Ｇ−２５におけるクロマ
トグラフィーにより精製される。上記の方法に特有の欠
点は、この化合物に潜在的に必要な量と比較して少量の
ＣＭＰ−Ｎａｎａを製造することしかできず、またその
製造は手間がかかり、再生するのが難しく、時間がかか
るということである。理論的に、上記の方法を使用して
他の糖ヌクレオチドをすべて単離することができる。
クションは合一され、さらにペーパークロマトグラフィ
ーまたはSephadex（登録商標）Ｇ−２５におけるクロマ
トグラフィーにより精製される。上記の方法に特有の欠
点は、この化合物に潜在的に必要な量と比較して少量の
ＣＭＰ−Ｎａｎａを製造することしかできず、またその
製造は手間がかかり、再生するのが難しく、時間がかか
るということである。理論的に、上記の方法を使用して
他の糖ヌクレオチドをすべて単離することができる。
【００１１】細胞抽出物から糖ヌクレオチドを単離する
可能性を調査する他に、活性糖を製造するのに必要な酵
素を単離し、これらの酵素を使用して活性糖を合成する
ことにとりかかる研究者もいた。文献にはこれらの製造
法の多くの例が記載されている。ヌクレオチド−活性糖
の例はＵＤＰ−グルコース、ＵＤＰ−ガラクトース、Ｕ
ＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン、ＵＤＰ−Ｎ−アセチ
ルガラクトサミン、ＵＤＰ−グルクロン酸、ＧＤＰ−フ
コース、ＧＤＰ−マンノース、ｄＴＤＰ−グルコース、
ｄＴＤＰ−ガラクトースおよびＣＭＰ−Ｎ−アセチルノ
イラミン酸である。
可能性を調査する他に、活性糖を製造するのに必要な酵
素を単離し、これらの酵素を使用して活性糖を合成する
ことにとりかかる研究者もいた。文献にはこれらの製造
法の多くの例が記載されている。ヌクレオチド−活性糖
の例はＵＤＰ−グルコース、ＵＤＰ−ガラクトース、Ｕ
ＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン、ＵＤＰ−Ｎ−アセチ
ルガラクトサミン、ＵＤＰ−グルクロン酸、ＧＤＰ−フ
コース、ＧＤＰ−マンノース、ｄＴＤＰ−グルコース、
ｄＴＤＰ−ガラクトースおよびＣＭＰ−Ｎ−アセチルノ
イラミン酸である。
【００１２】ＣＭＰ−Ｎａｎａの酵素による製造および
その精製を扱う幾つかの研究を下記に挙げる。例えば、
Shames ら(Glycobiol., 第1巻, 第2号, 第187〜191頁
(1991年)）は大腸菌に過剰発現させたベクターにクロー
ン化されたＣＭＰ−Ｎａｎａシンターゼを使用してＣＭ
Ｐ−Ｎａｎａを合成し、その誘導体のうち幾つかをエタ
ノールで沈殿させ、乾燥することにより単離した。Liu
ら(J. Am. Chem. Soc., 第114巻, 第3,901〜3,910頁 (1
992年)）はヌクレオチドを分離するためにアニオン交換
樹脂（Ｄｏｗｅｘ−１，ギ酸塩形態）におけるクロマト
グラフィー、次に過剰の重炭酸アンモニウムを分離する
ためにカチオン交換樹脂（Ｄｏｗｅｘ５０Ｗ−Ｘ８，Ｈ
+形態）におけるクロマトグラフィーを行って、酵素反
応混合物からのＣＭＰ−Ｎａｎａを精製した。他の研究
者達もまたＣＭＰ−Ｎａｎａを酵素により製造し、その
生成物を分取用ＨＰＬＣ（Gross らの Joint Meeting,B
asel, 第366巻, 第795〜796頁 (1985年)）により；活性
炭に結合させ、次に５０％エタノール中の０.１Ｍ ＮＨ
4Ｃｌで溶離することにより（Shoyab らの J.Neuroche
m., 第11巻, 第639〜646頁 (1964年)）；ワットマン３
ＭＭシートにおけるペーパークロマトグラフィーで精製
することにより（Van den Eijnden および Dijk の Hop
pe-Seyler's Z. Physiol. Chem., 第353巻, 第1,817〜
1,820頁 (1972年))；またはシリカゲルカラムクロマト
グラフィー(Auge および Gautheronの Tetrahedron Let
t., 第29巻, 第7号, 第789〜790頁 (1988年)）により精
製した。これらのおよび他の研究者達はプロパノール：
水（７：３）混合物、またはpH６.５のエタノール：酢
酸アンモニウム（７：３）溶離剤系を使用してＣＭＰ−
Ｎａｎａを精製した（Higa および Paulson の J. Bio
l. Chem., 第260巻, 第8,838〜8,849頁 (1985年)）。
その精製を扱う幾つかの研究を下記に挙げる。例えば、
Shames ら(Glycobiol., 第1巻, 第2号, 第187〜191頁
(1991年)）は大腸菌に過剰発現させたベクターにクロー
ン化されたＣＭＰ−Ｎａｎａシンターゼを使用してＣＭ
Ｐ−Ｎａｎａを合成し、その誘導体のうち幾つかをエタ
ノールで沈殿させ、乾燥することにより単離した。Liu
ら(J. Am. Chem. Soc., 第114巻, 第3,901〜3,910頁 (1
992年)）はヌクレオチドを分離するためにアニオン交換
樹脂（Ｄｏｗｅｘ−１，ギ酸塩形態）におけるクロマト
グラフィー、次に過剰の重炭酸アンモニウムを分離する
ためにカチオン交換樹脂（Ｄｏｗｅｘ５０Ｗ−Ｘ８，Ｈ
+形態）におけるクロマトグラフィーを行って、酵素反
応混合物からのＣＭＰ−Ｎａｎａを精製した。他の研究
者達もまたＣＭＰ−Ｎａｎａを酵素により製造し、その
生成物を分取用ＨＰＬＣ（Gross らの Joint Meeting,B
asel, 第366巻, 第795〜796頁 (1985年)）により；活性
炭に結合させ、次に５０％エタノール中の０.１Ｍ ＮＨ
4Ｃｌで溶離することにより（Shoyab らの J.Neuroche
m., 第11巻, 第639〜646頁 (1964年)）；ワットマン３
ＭＭシートにおけるペーパークロマトグラフィーで精製
することにより（Van den Eijnden および Dijk の Hop
pe-Seyler's Z. Physiol. Chem., 第353巻, 第1,817〜
1,820頁 (1972年))；またはシリカゲルカラムクロマト
グラフィー(Auge および Gautheronの Tetrahedron Let
t., 第29巻, 第7号, 第789〜790頁 (1988年)）により精
製した。これらのおよび他の研究者達はプロパノール：
水（７：３）混合物、またはpH６.５のエタノール：酢
酸アンモニウム（７：３）溶離剤系を使用してＣＭＰ−
Ｎａｎａを精製した（Higa および Paulson の J. Bio
l. Chem., 第260巻, 第8,838〜8,849頁 (1985年)）。
【００１３】すべての他の糖ヌクレオチドを精製するた
めの、同じような方法は知られており、報告されてい
る。当業者に知られているヌクレオチド−活性糖の製造
法の例を下記に示す：Kittelmann らの Annals New Yor
k Acad. Sci., 第672巻, 酵素工学, 第444〜450頁 (199
2年)；Makino らの Tetrahedron Lett., 第34巻, 第2,7
75頁 (1993年)；Martin らの第34巻, 第1,765頁 (1993
年)；欧州特許出願0524143 A1；Ikeda の Carbohydr. R
es., 第242巻, 第123頁 (1992年); Kean の Glycobio
l., 第1巻, 第441頁 (1991年); Ichikawa らの J. Org.
Chem., 第57巻,第2,943頁 (1993年); Adelhorst らの
Carbohydr. Res., 第242巻, 第69頁(1993年); Schmidt
らの Lieb. Ann. Chem., 第121頁 (1991年); Stiller
らの Lieb.Ann. Chem., 第467頁 (1992年); Heidlas ら
の J. Org. Chem., 第57巻, 第146頁 (1992年); Heidla
s の Acc. Chem., Res., 第25巻, 第307頁 (1992年); S
imon らの J. Org. Chem., 第55巻, 第1,834頁 (1990
年); Wong らの J. Org. Chem., 第57巻, 第4,343頁(19
92年); Pallanca らの J. Chem. Soc. Perkin Trans.1,
第3,017頁 (1993年)。
めの、同じような方法は知られており、報告されてい
る。当業者に知られているヌクレオチド−活性糖の製造
法の例を下記に示す：Kittelmann らの Annals New Yor
k Acad. Sci., 第672巻, 酵素工学, 第444〜450頁 (199
2年)；Makino らの Tetrahedron Lett., 第34巻, 第2,7
75頁 (1993年)；Martin らの第34巻, 第1,765頁 (1993
年)；欧州特許出願0524143 A1；Ikeda の Carbohydr. R
es., 第242巻, 第123頁 (1992年); Kean の Glycobio
l., 第1巻, 第441頁 (1991年); Ichikawa らの J. Org.
Chem., 第57巻,第2,943頁 (1993年); Adelhorst らの
Carbohydr. Res., 第242巻, 第69頁(1993年); Schmidt
らの Lieb. Ann. Chem., 第121頁 (1991年); Stiller
らの Lieb.Ann. Chem., 第467頁 (1992年); Heidlas ら
の J. Org. Chem., 第57巻, 第146頁 (1992年); Heidla
s の Acc. Chem., Res., 第25巻, 第307頁 (1992年); S
imon らの J. Org. Chem., 第55巻, 第1,834頁 (1990
年); Wong らの J. Org. Chem., 第57巻, 第4,343頁(19
92年); Pallanca らの J. Chem. Soc. Perkin Trans.1,
第3,017頁 (1993年)。
【００１４】オリゴ糖に基づく薬剤の潜在性および酵素
によるグリコシル化反応を用いてそれらを製造する可能
性を調査するための上記の文献を考慮して、一定の性質
を有する糖ヌクレオチドを所望の量製造するための方法
が必要とされる。本発明の目的は最初に述べた現状の技
術の欠点のない、生物源（抽出物または酵素混合物）か
ら糖ヌクレオチドを単離するための改良法を提供するこ
とである。
によるグリコシル化反応を用いてそれらを製造する可能
性を調査するための上記の文献を考慮して、一定の性質
を有する糖ヌクレオチドを所望の量製造するための方法
が必要とされる。本発明の目的は最初に述べた現状の技
術の欠点のない、生物源（抽出物または酵素混合物）か
ら糖ヌクレオチドを単離するための改良法を提供するこ
とである。
【００１５】本目的は、必要に応じて不溶の細胞構成成
分が除去された、細胞抽出物または酵素反応混合物から
の反応溶液である糖ヌクレオチド含有溶液をアルコール
性タンパク質沈殿により溶解したタンパク質を除去した
後に濃縮乾燥し、得られる糖ヌクレオチド含有残留物を
溶離剤混合物中に取り、シリカゲル上でクロマトグラフ
ィー処理することからなり；糖ヌクレオチド含有残留物
を容量比が１：１〜１：１０の短鎖アルコールおよび
０.５〜１モルアンモニウム塩水溶液の混合物で構成さ
れる溶離剤混合物中に取り、得られる溶液を乾燥シリカ
ゲルと混合し、それをハチミツ様の稠度の粘稠な塊とし
て、任意の粒度の商業的に入手できるシリカゲルを固定
相として含有するクロマトグラフィーカラムに装入し、
そして前記溶離剤混合物を使用して糖ヌクレオチドを減
圧下で溶離することを特徴とする、生物源から糖ヌクレ
オチドを単離し、精製する方法により達成される。
分が除去された、細胞抽出物または酵素反応混合物から
の反応溶液である糖ヌクレオチド含有溶液をアルコール
性タンパク質沈殿により溶解したタンパク質を除去した
後に濃縮乾燥し、得られる糖ヌクレオチド含有残留物を
溶離剤混合物中に取り、シリカゲル上でクロマトグラフ
ィー処理することからなり；糖ヌクレオチド含有残留物
を容量比が１：１〜１：１０の短鎖アルコールおよび
０.５〜１モルアンモニウム塩水溶液の混合物で構成さ
れる溶離剤混合物中に取り、得られる溶液を乾燥シリカ
ゲルと混合し、それをハチミツ様の稠度の粘稠な塊とし
て、任意の粒度の商業的に入手できるシリカゲルを固定
相として含有するクロマトグラフィーカラムに装入し、
そして前記溶離剤混合物を使用して糖ヌクレオチドを減
圧下で溶離することを特徴とする、生物源から糖ヌクレ
オチドを単離し、精製する方法により達成される。
【００１６】溶離剤混合物は好ましくは、容量比が１：
１〜１：２、特に１：１.２５の短鎖アルコールおよび
０.５〜１モルアンモニウム塩水溶液の混合物で構成さ
れる。アンモニウム塩水溶液は好ましくは１モルであ
る。溶離剤混合物において、短鎖アルコールは好ましく
は２−プロパノールであり、そしてアンモニウム塩は好
ましくは炭酸水素トリエチルアンモニウムである。
１〜１：２、特に１：１.２５の短鎖アルコールおよび
０.５〜１モルアンモニウム塩水溶液の混合物で構成さ
れる。アンモニウム塩水溶液は好ましくは１モルであ
る。溶離剤混合物において、短鎖アルコールは好ましく
は２−プロパノールであり、そしてアンモニウム塩は好
ましくは炭酸水素トリエチルアンモニウムである。
【００１７】新規な方法は特に、シチジンモノホスフェ
ート−Ｎ−アセチル−ノイラミン酸（ＣＭＰ−Ｎａｎ
ａ）を単離し、精製するのに良く適している。しかしな
がら、新規な方法はまた、生物源（細胞抽出物および酵
素混合物）からすべての他のヌクレオチド−活性糖およ
びそれらの誘導体を単離し、精製するのに、特に酵素混
合物から得られたＣＭＰ−Ｎａｎａの誘導体を単離し、
精製するのに適している。
ート−Ｎ−アセチル−ノイラミン酸（ＣＭＰ−Ｎａｎ
ａ）を単離し、精製するのに良く適している。しかしな
がら、新規な方法はまた、生物源（細胞抽出物および酵
素混合物）からすべての他のヌクレオチド−活性糖およ
びそれらの誘導体を単離し、精製するのに、特に酵素混
合物から得られたＣＭＰ−Ｎａｎａの誘導体を単離し、
精製するのに適している。
【００１８】Ｎ−アセチルノイラミン酸の誘導体の例と
しては、Ｎ−アセチル−４−Ｏ−アセチルノイラミン酸
（Ｎｅｕ４,５Ａｃ2）、Ｎ−アセチル−９−Ｏ−アセチ
ルノイラミン酸（Ｎｅｕ５,９Ａｃ2）、Ｎ−アセチル−
７,９−ジ−Ｏ−アセチルノイラミン酸（Ｎｅｕ５,７,
９Ａｃ3）、Ｎ−アセチル−９−Ｏ−ラクトイルノイラ
ミン酸（Ｎｅｕ４Ａｃ９Ｌｔ）、Ｎ−アセチル−４−Ｏ
−アセチル−９−Ｏ−ラクトイルノイラミン酸（Ｎｅｕ
４,５Ａｃ2９Ｌｔ）、Ｎ−アセチルノイラミン酸−９−
ホスフェート（Ｎｅｕ５Ａｃ９Ｐ）、Ｎ−グリコリルノ
イラミン酸（Ｎｅｕ５Ｇｃ）、Ｎ−グリコリル−９−Ｏ
−アセチルノイラミン酸（Ｎｅｕ９Ａｃ５Ｇｃ）、Ｎ−
グリコリル−９−Ｏ−ラクトイルノイラミン酸（Ｎｅｕ
５Ｇｃ９Ｌｔ）、Ｎ−グリコリルノイラミン酸−８−ス
ルフェート（Ｎｅｕ５Ｇｃ８Ｓ）が挙げられる。下記の
誘導体もまたこのリストに加えることができる；５−ア
ジドノイラミン酸、Ｎ−アセチル−９−アジド−９−デ
オキシノイラミン酸、Ｎ−アセチル−９−アセトアミド
−９−デオキシノイラミン酸、カルボメトキシ−Ｎ−ア
セチルノイラミン酸およびカルボベンジルオキシ−Ｎ−
アセチルノイラミン酸。
しては、Ｎ−アセチル−４−Ｏ−アセチルノイラミン酸
（Ｎｅｕ４,５Ａｃ2）、Ｎ−アセチル−９−Ｏ−アセチ
ルノイラミン酸（Ｎｅｕ５,９Ａｃ2）、Ｎ−アセチル−
７,９−ジ−Ｏ−アセチルノイラミン酸（Ｎｅｕ５,７,
９Ａｃ3）、Ｎ−アセチル−９−Ｏ−ラクトイルノイラ
ミン酸（Ｎｅｕ４Ａｃ９Ｌｔ）、Ｎ−アセチル−４−Ｏ
−アセチル−９−Ｏ−ラクトイルノイラミン酸（Ｎｅｕ
４,５Ａｃ2９Ｌｔ）、Ｎ−アセチルノイラミン酸−９−
ホスフェート（Ｎｅｕ５Ａｃ９Ｐ）、Ｎ−グリコリルノ
イラミン酸（Ｎｅｕ５Ｇｃ）、Ｎ−グリコリル−９−Ｏ
−アセチルノイラミン酸（Ｎｅｕ９Ａｃ５Ｇｃ）、Ｎ−
グリコリル−９−Ｏ−ラクトイルノイラミン酸（Ｎｅｕ
５Ｇｃ９Ｌｔ）、Ｎ−グリコリルノイラミン酸−８−ス
ルフェート（Ｎｅｕ５Ｇｃ８Ｓ）が挙げられる。下記の
誘導体もまたこのリストに加えることができる；５−ア
ジドノイラミン酸、Ｎ−アセチル−９−アジド−９−デ
オキシノイラミン酸、Ｎ−アセチル−９−アセトアミド
−９−デオキシノイラミン酸、カルボメトキシ−Ｎ−ア
セチルノイラミン酸およびカルボベンジルオキシ−Ｎ−
アセチルノイラミン酸。
【００１９】糖ヌクレオチド含有溶液（細胞抽出物また
は酵素混合物）から始まる、本発明の方法を下記に詳し
く記載する。糖ヌクレオチド含有溶液をアルコール、例
えばエタノールまたはプロパノールと、最終濃度が４０
〜６０％、特に約５０％（容量／容量）となるまで混合
し、そしてこの混合物を４℃で１時間インキュベートす
る。沈殿したタンパク質、不溶の細胞構成成分、また使
用した場合はガラスビーズを適当な方法で分離し、そし
て残留する上澄み液を真空下で濃縮する（回転蒸発また
は凍結乾燥する）。
は酵素混合物）から始まる、本発明の方法を下記に詳し
く記載する。糖ヌクレオチド含有溶液をアルコール、例
えばエタノールまたはプロパノールと、最終濃度が４０
〜６０％、特に約５０％（容量／容量）となるまで混合
し、そしてこの混合物を４℃で１時間インキュベートす
る。沈殿したタンパク質、不溶の細胞構成成分、また使
用した場合はガラスビーズを適当な方法で分離し、そし
て残留する上澄み液を真空下で濃縮する（回転蒸発また
は凍結乾燥する）。
【００２０】濃縮乾燥した上澄み液を次のシリカゲルカ
ラムクロマトグラフィー用の溶離剤に溶解し、この溶液
を乾燥シリカゲルと混合してハチミツ様の稠度の粘稠な
塊を生成する。容量比が１：１〜１：１０、好ましくは
１：１〜１：２の短鎖アルコールおよび０.５〜１モル
アンモニウム塩水溶液の混合物は溶離剤として使用する
のに適している。容量比が１：１.２５の２−プロパノ
ールおよび１Ｍ炭酸水素トリエチルアンモニウム水溶液
の混合物は特に溶離剤として使用するのに適している。
分離のために、任意の粒度の商業的に入手できるシリカ
ゲルを使用することができる。装入した混合物を圧力下
に溶離する。
ラムクロマトグラフィー用の溶離剤に溶解し、この溶液
を乾燥シリカゲルと混合してハチミツ様の稠度の粘稠な
塊を生成する。容量比が１：１〜１：１０、好ましくは
１：１〜１：２の短鎖アルコールおよび０.５〜１モル
アンモニウム塩水溶液の混合物は溶離剤として使用する
のに適している。容量比が１：１.２５の２−プロパノ
ールおよび１Ｍ炭酸水素トリエチルアンモニウム水溶液
の混合物は特に溶離剤として使用するのに適している。
分離のために、任意の粒度の商業的に入手できるシリカ
ゲルを使用することができる。装入した混合物を圧力下
に溶離する。
【００２１】集めたフラクションを適当な検出法、好ま
しくは薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）またはＨＰＬ
Ｃにより検査する。ＴＬＣは適当な支持体（例えばシリ
カゲル６０ＨＰＴＬＣプレートなど）上で行うことがで
きる。上記の溶離剤はこの目的に適した溶離剤である。
文献に通常記載されている検出法はＨＰＬＣ分析におい
て好適に使用されうる(例えばPetrie III および Koryt
nyk の Anal. Biochem., 第131巻, 第153〜159頁 (1983
年)）。
しくは薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）またはＨＰＬ
Ｃにより検査する。ＴＬＣは適当な支持体（例えばシリ
カゲル６０ＨＰＴＬＣプレートなど）上で行うことがで
きる。上記の溶離剤はこの目的に適した溶離剤である。
文献に通常記載されている検出法はＨＰＬＣ分析におい
て好適に使用されうる(例えばPetrie III および Koryt
nyk の Anal. Biochem., 第131巻, 第153〜159頁 (1983
年)）。
【００２２】一般に、シリカゲルカラムクロマトグラフ
ィーはそれぞれ純度の異なる糖ヌクレオチド含有フラク
ションをもたらし、その汚染の程度に応じて、さらにア
ニオン交換クロマトグラフィーにより精製したり、また
は簡単にゲル濾過により脱塩したりする必要がある。所
望の生成物を含有するすべての（陽性の）フラクション
をそれらの汚染の程度に従って合一し、真空下で濃縮す
る。
ィーはそれぞれ純度の異なる糖ヌクレオチド含有フラク
ションをもたらし、その汚染の程度に応じて、さらにア
ニオン交換クロマトグラフィーにより精製したり、また
は簡単にゲル濾過により脱塩したりする必要がある。所
望の生成物を含有するすべての（陽性の）フラクション
をそれらの汚染の程度に従って合一し、真空下で濃縮す
る。
【００２３】さらにアニオン交換クロマトグラフィーに
より精製する必要のあるフラクションを適当な溶離剤、
特にカラムの移動緩衝液に溶解する。次に、それぞれ使
用するアニオン交換物質の性質に応じて供給者により指
定された溶離緩衝液を使用してクロマトグラフィーを行
う。陽性のフラクションを上記の検出法により検出し、
真空下で濃縮し、次にゲル濾過により脱塩し、精製す
る。
より精製する必要のあるフラクションを適当な溶離剤、
特にカラムの移動緩衝液に溶解する。次に、それぞれ使
用するアニオン交換物質の性質に応じて供給者により指
定された溶離緩衝液を使用してクロマトグラフィーを行
う。陽性のフラクションを上記の検出法により検出し、
真空下で濃縮し、次にゲル濾過により脱塩し、精製す
る。
【００２４】アニオン交換クロマトグラフィーにより精
製する必要のないフラクションはさらにゲル濾過（例え
ばバイオゲルＰ２またはSephadex G10〜G200）により直
接、精製および／または脱塩することができる。これら
の条件下で、生成物は炭酸水素トリエチルアンモニウム
塩として溶離する。陽性のフラクションを特定の検出法
により同定し、真空下で濃縮し、−２０℃で保存する。
製する必要のないフラクションはさらにゲル濾過（例え
ばバイオゲルＰ２またはSephadex G10〜G200）により直
接、精製および／または脱塩することができる。これら
の条件下で、生成物は炭酸水素トリエチルアンモニウム
塩として溶離する。陽性のフラクションを特定の検出法
により同定し、真空下で濃縮し、−２０℃で保存する。
【００２５】このようにして精製した糖ヌクレオチドは
ＮＭＲ分光分析において文献記載のスペクトルと同じシ
グナルを示す。生成物は生物学的試験で、すなわち糖が
適当なグリコシルトランスフェラーゼにより転移される
場合に活性であることがわかる。以下の実施例により本
発明を詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されな
い。
ＮＭＲ分光分析において文献記載のスペクトルと同じシ
グナルを示す。生成物は生物学的試験で、すなわち糖が
適当なグリコシルトランスフェラーゼにより転移される
場合に活性であることがわかる。以下の実施例により本
発明を詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されな
い。
【００２６】
〔実施例１〕ヌクレオチド−活性糖を単離および精製す
るための新規な方法は、例として大腸菌Ｚ３６２６から
のシチジンモノホスフェート−Ｎ−アセチルノイラミン
酸（ＣＭＰ−Ｎａｎａ）の単離を利用してより詳細に説
明される。この菌株は文献から知られている（Steenber
gen らの J. Bacteriol., 第174巻, 第1,099頁）。それ
はシアリルトランスフェラーゼに突然変異を有し、細胞
内で生成するＣＭＰ−Ｎａｎａを重合させる。この欠点
があるため、ＣＭＰ−Ｎａｎａは細胞内に蓄積する。
るための新規な方法は、例として大腸菌Ｚ３６２６から
のシチジンモノホスフェート−Ｎ−アセチルノイラミン
酸（ＣＭＰ−Ｎａｎａ）の単離を利用してより詳細に説
明される。この菌株は文献から知られている（Steenber
gen らの J. Bacteriol., 第174巻, 第1,099頁）。それ
はシアリルトランスフェラーゼに突然変異を有し、細胞
内で生成するＣＭＰ−Ｎａｎａを重合させる。この欠点
があるため、ＣＭＰ−Ｎａｎａは細胞内に蓄積する。
【００２７】ａ） 大腸菌Ｚ３６２６株の培養および醗
酵 この菌株は文献記載の培地で増殖する（Vchida らの Ag
r. Biol. Chem., 第37巻, 第9号, 第2,105〜2,110頁, 1
973年）。高い細胞内濃度のＣＭＰ−Ｎａｎａを得るよ
うに、この培地の組成をさらに最適化した。 炭素源の最適化：種々の炭素源（ラクトース，サッカロ
ース，マルトース，グルコース，ガラクトース，ソルビ
トール，マンノースおよびグリセロール）を使用した。
その結果、グルコースが最も適当な基体であった。 グルコース濃度の最適化：ＣＭＰ−Ｎａｎａを生成する
のに最適なグルコース濃度は３０ｇ／リットルであっ
た。
酵 この菌株は文献記載の培地で増殖する（Vchida らの Ag
r. Biol. Chem., 第37巻, 第9号, 第2,105〜2,110頁, 1
973年）。高い細胞内濃度のＣＭＰ−Ｎａｎａを得るよ
うに、この培地の組成をさらに最適化した。 炭素源の最適化：種々の炭素源（ラクトース，サッカロ
ース，マルトース，グルコース，ガラクトース，ソルビ
トール，マンノースおよびグリセロール）を使用した。
その結果、グルコースが最も適当な基体であった。 グルコース濃度の最適化：ＣＭＰ−Ｎａｎａを生成する
のに最適なグルコース濃度は３０ｇ／リットルであっ
た。
【００２８】窒素源の最適化：これらの最適化実験のた
めに、複合のおよび所定の窒素源を使用した。酵母抽出
物が最良の収量をもたらした。 酵母抽出物濃度の最適化：ＣＭＰ−Ｎａｎａを生成する
のに最適な濃度は２ｇ／リットルであった。 培養の最適化：菌株を良く通風しながら６〜８のpH、３
０〜４０℃の温度で１６〜２４時間培養した場合に、Ｃ
ＭＰ−Ｎａｎａの細胞内濃度が最高になる。 最適化条件下のＣＭＰ−Ｎａｎａの細胞内濃度：菌株は
１０リットルの培養物あたり約１５０mgのＣＭＰ−Ｎａ
ｎａを生成する。
めに、複合のおよび所定の窒素源を使用した。酵母抽出
物が最良の収量をもたらした。 酵母抽出物濃度の最適化：ＣＭＰ−Ｎａｎａを生成する
のに最適な濃度は２ｇ／リットルであった。 培養の最適化：菌株を良く通風しながら６〜８のpH、３
０〜４０℃の温度で１６〜２４時間培養した場合に、Ｃ
ＭＰ−Ｎａｎａの細胞内濃度が最高になる。 最適化条件下のＣＭＰ−Ｎａｎａの細胞内濃度：菌株は
１０リットルの培養物あたり約１５０mgのＣＭＰ−Ｎａ
ｎａを生成する。
【００２９】〔実施例２〕 細胞の単離および破壊 細胞密度が十分な値に達した時、すなわち約１６〜３０
時間後、培養を終了させる。細胞を遠心分離により採取
し、そして例えば１０〜１００ミリＭ トリス／ＨＣｌ
（pH６〜８）のような緩衝液で洗浄する。沈降した細胞
を適当な緩衝液（上記参照。さらに１〜１０ミリＭ Ｅ
ＤＴＡおよび０.１〜１ミリＭ ＮａＦの存在下）中で再
懸濁し、そして慣用の方法、例えば微細なガラスビーズ
と一緒に振とうすることにより、超音波により、または
フレンチプレスを使用することにより、冷却下で破壊す
る。破壊を容易にするため、リゾチーム(１〜１０mg／m
l)もまた使用することができる。この混合物はＣＭＰ−
Ｎａｎａ源（粗製抽出物）として使用される。次に、最
終濃度が５０％となるまてエタノールを加えることによ
りタンパク質を沈殿させる。混合物を４℃で１時間イン
キュベートした後、それを遠心分離し、その上澄み液を
真空下で濃縮する（回転蒸発または凍結乾燥する）。
時間後、培養を終了させる。細胞を遠心分離により採取
し、そして例えば１０〜１００ミリＭ トリス／ＨＣｌ
（pH６〜８）のような緩衝液で洗浄する。沈降した細胞
を適当な緩衝液（上記参照。さらに１〜１０ミリＭ Ｅ
ＤＴＡおよび０.１〜１ミリＭ ＮａＦの存在下）中で再
懸濁し、そして慣用の方法、例えば微細なガラスビーズ
と一緒に振とうすることにより、超音波により、または
フレンチプレスを使用することにより、冷却下で破壊す
る。破壊を容易にするため、リゾチーム(１〜１０mg／m
l)もまた使用することができる。この混合物はＣＭＰ−
Ｎａｎａ源（粗製抽出物）として使用される。次に、最
終濃度が５０％となるまてエタノールを加えることによ
りタンパク質を沈殿させる。混合物を４℃で１時間イン
キュベートした後、それを遠心分離し、その上澄み液を
真空下で濃縮する（回転蒸発または凍結乾燥する）。
【００３０】〔実施例３〕 シリカゲルカラムクロマトグラフィーによるＣＭＰ−Ｎ
ａｎａの精製 このようにして濃縮乾燥した上澄み液を少量の、容量比
が１：１.２５のイソプロパノール：１Ｍ炭酸水素トリ
エチルアンモニウム（シリカゲルカラム用溶離剤）に溶
解し、この溶液を乾燥シリカゲルと混合してハチミツ様
の稠度の塊を生成する。この混合物をシリカゲルカラム
に装入し、溶離剤を使用して圧力下に溶離し、そしてフ
ラクションを集める。炭酸水素トリエチルアンモニウム
の使用は、これにより確実に生成物を最も安定な塩形態
で単離できるため重要である。
ａｎａの精製 このようにして濃縮乾燥した上澄み液を少量の、容量比
が１：１.２５のイソプロパノール：１Ｍ炭酸水素トリ
エチルアンモニウム（シリカゲルカラム用溶離剤）に溶
解し、この溶液を乾燥シリカゲルと混合してハチミツ様
の稠度の塊を生成する。この混合物をシリカゲルカラム
に装入し、溶離剤を使用して圧力下に溶離し、そしてフ
ラクションを集める。炭酸水素トリエチルアンモニウム
の使用は、これにより確実に生成物を最も安定な塩形態
で単離できるため重要である。
【００３１】適当な検出法、好ましくは薄層クロマトグ
ラフィー（ＴＬＣ）またはＨＰＬＣを使用してフラクシ
ョンを検査する。ＴＬＣは適当な支持体（例えばシリカ
ゲル６０ＨＰＴＬＣプレート（Merck社製）など）上で
行うことができる。このための適当な溶離剤は組成がイ
ソプロパノール：１Ｍ酢酸アンモニウム（２.４：２）
である。文献に通常記載されている測定法は、ＨＰＬＣ
による分析を行う場合に使用するのに適している（例え
ばPetrie III および Korytnyk の Anal. Biochem., 第
131巻, 第153〜159頁 (1983年)）。
ラフィー（ＴＬＣ）またはＨＰＬＣを使用してフラクシ
ョンを検査する。ＴＬＣは適当な支持体（例えばシリカ
ゲル６０ＨＰＴＬＣプレート（Merck社製）など）上で
行うことができる。このための適当な溶離剤は組成がイ
ソプロパノール：１Ｍ酢酸アンモニウム（２.４：２）
である。文献に通常記載されている測定法は、ＨＰＬＣ
による分析を行う場合に使用するのに適している（例え
ばPetrie III および Korytnyk の Anal. Biochem., 第
131巻, 第153〜159頁 (1983年)）。
【００３２】一般に、シリカゲルカラムクロマトグラフ
ィーはそれぞれ純度の異なるフラクションの生成をもた
らし、それらの汚染の程度に応じて、さらにアニオン交
換クロマトグラフィーにより精製したり、または簡単に
ゲル濾過（例えばバイオゲルＰ２（２００〜４００メッ
シュ，Biorad社製）またはShphadex G-10（Pharmacia社
製)）により脱塩したりする必要がある。すべての陽性
のフラクションをそれらの汚染の程度に従って合一し、
真空下で濃縮する。
ィーはそれぞれ純度の異なるフラクションの生成をもた
らし、それらの汚染の程度に応じて、さらにアニオン交
換クロマトグラフィーにより精製したり、または簡単に
ゲル濾過（例えばバイオゲルＰ２（２００〜４００メッ
シュ，Biorad社製）またはShphadex G-10（Pharmacia社
製)）により脱塩したりする必要がある。すべての陽性
のフラクションをそれらの汚染の程度に従って合一し、
真空下で濃縮する。
【００３３】さらにアニオン交換クロマトグラフィーに
より精製する必要のあるフラクションをアニオン交換ク
ロマトグラフィー用溶離剤に溶解し、カラムに装入す
る。このためには、Dowex樹脂を使用するアニオン交換
クロマトグラフィーが好ましく行われる。アニオン交換
クロマトグラフィーにより精製する必要のないフラクシ
ョンはさらにゲル濾過（好ましくはバイオゲルＰ２を使
用する）により精製および／または脱塩することができ
る。生成物は炭酸水素トリエチルアンモニウム塩として
溶離する。
より精製する必要のあるフラクションをアニオン交換ク
ロマトグラフィー用溶離剤に溶解し、カラムに装入す
る。このためには、Dowex樹脂を使用するアニオン交換
クロマトグラフィーが好ましく行われる。アニオン交換
クロマトグラフィーにより精製する必要のないフラクシ
ョンはさらにゲル濾過（好ましくはバイオゲルＰ２を使
用する）により精製および／または脱塩することができ
る。生成物は炭酸水素トリエチルアンモニウム塩として
溶離する。
【００３４】陽性のフラクションを上記の検出法により
同定し、凍結乾燥し、そして−２０℃で冷凍する。この
ようにして精製した試料を1Ｈ−ＮＭＲ分光分析によ
り、それらが正しい構造であるかどうか、また上記の測
定法で検出されない不純物が存在しているかどうかを検
査し、そして得られたスペクトルを文献に記載のものと
比較した。
同定し、凍結乾燥し、そして−２０℃で冷凍する。この
ようにして精製した試料を1Ｈ−ＮＭＲ分光分析によ
り、それらが正しい構造であるかどうか、また上記の測
定法で検出されない不純物が存在しているかどうかを検
査し、そして得られたスペクトルを文献に記載のものと
比較した。
【００３５】〔実施例４〕1 Ｈ−ＮＭＲ分光分析による生成物の検査（Liu らの J.
Am. Chem. Soc., 第114巻, 第3,901頁 (1992年)）1 H-NMR (300MHz, D2O): δ 1.66(1H, ddd, J=13, 12Hz,
H-3ax), 2.05(3H, s,NAc), 2.5(1H, dd, J=13, 4.8Hz,
H-3eq), 3.46(1H, d, J=9.6Hz, H-7), 3.63(1H, dd, J
=6.6, 12Hz, H-9a), 3.9(1H, dd, J=12, 2.4Hz, H-9b),
3.94-4.0(2H,m, H-8, H-5), 4.06(1H, ddd, J=10, 5,
12Hz, H-5), 4.15(1H, dd, J=10, 1.5Hz, H-6), 4.22-
4.28(3H, m, H-4′, H-5′), 4.29-4.38(2H, m, H-3′,
H-2′), 6.00(1H, d, J=5Hz, H-1′), 6.13(1H, d, J=
7.8Hz, H-5″), 7.98(1H, d, J=7.6Hz, H-6″)
Am. Chem. Soc., 第114巻, 第3,901頁 (1992年)）1 H-NMR (300MHz, D2O): δ 1.66(1H, ddd, J=13, 12Hz,
H-3ax), 2.05(3H, s,NAc), 2.5(1H, dd, J=13, 4.8Hz,
H-3eq), 3.46(1H, d, J=9.6Hz, H-7), 3.63(1H, dd, J
=6.6, 12Hz, H-9a), 3.9(1H, dd, J=12, 2.4Hz, H-9b),
3.94-4.0(2H,m, H-8, H-5), 4.06(1H, ddd, J=10, 5,
12Hz, H-5), 4.15(1H, dd, J=10, 1.5Hz, H-6), 4.22-
4.28(3H, m, H-4′, H-5′), 4.29-4.38(2H, m, H-3′,
H-2′), 6.00(1H, d, J=5Hz, H-1′), 6.13(1H, d, J=
7.8Hz, H-5″), 7.98(1H, d, J=7.6Hz, H-6″)
【００３６】〔実施例５〕 α-D-Neu5Ac-(2,6)-β-D-Gal-(1,4)-β-D-GlcNAc-O(C
H2)6NH2の酵素による合成 得られる生成物は酵素反応（シアリルトランスフェラー
ゼ反応）に使用でき、その反応において活性であるよう
な純度である。１２mg（２５μモル）のβ-D-Gal-(1,4)
-β-D-GlcNAc-O(CH2)6NH2を２mlの０.０５Ｍカコジル酸
塩緩衝液および実施例２に従って製造した１５.４mg
（２５μモル）のＣＭＰ−ノイラミン酸に溶解し、この
溶液に１.５mgのウシ血清アルブミンおよび２mgのＭｎ
Ｃｌ2を加えた。混合物のpHを７.４に調整した後、４０
mUのα−２,６−シアリルトランスフェラーゼ（ラット
の肝臓から，Boehringer Mannheim）および２０Ｕのア
ルカリ性ホスファターゼ（仔ウシの腸から、Boehringer
Mannheim）を加え、その混合物を室温で１０日間イン
キュベートした。後処理するために、溶離剤として水を
使用してクロマトグラフィーをバイオゲルＰ２（Biorad
社製）上で行った。凍結乾燥後、三糖が得られた。収
量：１１mgのα-D-Neu5Ac-(2,6)-β-D-Gal-(1,4)-β-D-
GlcNAc-O(CH2)6NH2。
H2)6NH2の酵素による合成 得られる生成物は酵素反応（シアリルトランスフェラー
ゼ反応）に使用でき、その反応において活性であるよう
な純度である。１２mg（２５μモル）のβ-D-Gal-(1,4)
-β-D-GlcNAc-O(CH2)6NH2を２mlの０.０５Ｍカコジル酸
塩緩衝液および実施例２に従って製造した１５.４mg
（２５μモル）のＣＭＰ−ノイラミン酸に溶解し、この
溶液に１.５mgのウシ血清アルブミンおよび２mgのＭｎ
Ｃｌ2を加えた。混合物のpHを７.４に調整した後、４０
mUのα−２,６−シアリルトランスフェラーゼ（ラット
の肝臓から，Boehringer Mannheim）および２０Ｕのア
ルカリ性ホスファターゼ（仔ウシの腸から、Boehringer
Mannheim）を加え、その混合物を室温で１０日間イン
キュベートした。後処理するために、溶離剤として水を
使用してクロマトグラフィーをバイオゲルＰ２（Biorad
社製）上で行った。凍結乾燥後、三糖が得られた。収
量：１１mgのα-D-Neu5Ac-(2,6)-β-D-Gal-(1,4)-β-D-
GlcNAc-O(CH2)6NH2。
【００３７】1H-NMR (300MHz, D2O): δ 1.35-1.42(4H,
m, CH2-スペーサー), 1.54-1.7(4H, m, CH2-スペーサ
ー); 1.72(1H, dd, H-3ax), 2.04(3H, s, NACNeu5Ac),
2.06(3H, s, NACGlcNAc), 2.68(1H, dd, H-3eq), 3.0(2
H, t, CH2-スペーサー), 3.5-4.0(21H, m), 4.46(1H,
d, H-1-Gal), 4.56(1H, d, H-1-GlcNAc)13 C-NMR (300MHz, D2O)): δ 22.35(CH3-Neu5Ac), 22.6
3(CH3-GlcNAc), 24.93, 25.54, 26.97, 28.65(スペーサ
ー-CH2), 39.72(CH2-NH2), 40.40(C3″), 52.18(C5″),
55.20(C2), 60.71(C6), 62.97(C9″), 63.67(C6′), 6
8.53(C7″), 68.72(C4′, C4″), 70.64(CH2-O), 71.03
(C2′), 72.0(C8″), 72.77(C3, C3′),72.85(C6″), 7
4.0(C5′), 74.78(C5), 81.1(C4), 100.8(C2″), 101(C
1), 104(C1′), 173.5(C1″), 174.5(Ac-GlcNAc), 175
(Ac-Neu5Ac)
m, CH2-スペーサー), 1.54-1.7(4H, m, CH2-スペーサ
ー); 1.72(1H, dd, H-3ax), 2.04(3H, s, NACNeu5Ac),
2.06(3H, s, NACGlcNAc), 2.68(1H, dd, H-3eq), 3.0(2
H, t, CH2-スペーサー), 3.5-4.0(21H, m), 4.46(1H,
d, H-1-Gal), 4.56(1H, d, H-1-GlcNAc)13 C-NMR (300MHz, D2O)): δ 22.35(CH3-Neu5Ac), 22.6
3(CH3-GlcNAc), 24.93, 25.54, 26.97, 28.65(スペーサ
ー-CH2), 39.72(CH2-NH2), 40.40(C3″), 52.18(C5″),
55.20(C2), 60.71(C6), 62.97(C9″), 63.67(C6′), 6
8.53(C7″), 68.72(C4′, C4″), 70.64(CH2-O), 71.03
(C2′), 72.0(C8″), 72.77(C3, C3′),72.85(C6″), 7
4.0(C5′), 74.78(C5), 81.1(C4), 100.8(C2″), 101(C
1), 104(C1′), 173.5(C1″), 174.5(Ac-GlcNAc), 175
(Ac-Neu5Ac)
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 リユーデイガー・マルクヴアルト ドイツ連邦共和国デー−60389フランクフ ルト．ギユンタースブルクアレー69 (72)発明者 ゲールハルト・クレツチユマル ドイツ連邦共和国デー−65760エシユボル ン．ウルメンヴエーク10 (72)発明者 ヨハネス・マイヴエス ドイツ連邦共和国デー−65510イートシユ タイン．テーオドーア−フリートナー−シ ユトラーセ39
Claims (7)
- 【請求項１】 必要に応じて不溶の細胞構成成分が除去
された、細胞抽出物または酵素反応混合物からの反応溶
液である糖ヌクレオチド含有溶液をアルコール性タンパ
ク質沈殿により溶解したタンパク質を除去した後に濃縮
乾燥し、得られる糖ヌクレオチド含有残留物を溶離剤混
合物中に取り、シリカゲル上でクロマトグラフィー処理
することからなり；糖ヌクレオチド含有残留物を容量比
が１：１〜１：１０の短鎖アルコールおよび０.５〜１
モルアンモニウム塩水溶液の混合物で構成される溶離剤
混合物中に取り、得られる溶液を乾燥シリカゲルと混合
し、それをハチミツ様の稠度の粘稠塊として、任意の粒
度の市販のシリカゲルを固定相として含有するクロマト
グラフィーカラムに装入し、そして前記溶離剤混合物を
使用して糖ヌクレオチドを圧力下に溶離することを特徴
とする、生物源から糖ヌクレオチドを単離し、精製する
方法。 - 【請求項２】 溶離剤混合物は容量比が１：１〜１：２
の短鎖アルコールおよび０.５〜１モルアンモニウム塩
水溶液の混合物で構成される請求項１記載の方法。 - 【請求項３】 容量比が１：１.２５である請求項１ま
たは２記載の方法。 - 【請求項４】 アンモニウム塩水溶液が１モルである請
求項１〜３の何れかの項記載の方法。 - 【請求項５】 短鎖アルコールが２−プロパノールであ
る請求項１〜４の何れかの項記載の方法。 - 【請求項６】 アンモニウム塩が炭酸水素トリエチルア
ンモニウムである請求項１〜５の何れかの項記載の方
法。 - 【請求項７】 糖ヌクレオチドがシチジンモノホスフェ
ート−Ｎ−アセチルノイラミン酸である請求項１〜６の
何れかの項記載の方法。
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|---|---|---|---|
| DE4431280:6 | 1994-09-02 | ||
| DE4431280A DE4431280A1 (de) | 1994-09-02 | 1994-09-02 | Verfahren zur Isolierung und Reinigung von nukleotidaktivierten Zuckern aus biologischen Quellen |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0873480A true JPH0873480A (ja) | 1996-03-19 |
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|---|---|---|---|
| JP7224835A Pending JPH0873480A (ja) | 1994-09-02 | 1995-09-01 | 生物源からヌクレオチド活性糖を単離し、精製する方法 |
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|---|---|
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| EP (1) | EP0704536B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0873480A (ja) |
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| CA (1) | CA2157457A1 (ja) |
| DE (2) | DE4431280A1 (ja) |
| DK (1) | DK0704536T3 (ja) |
| ES (1) | ES2126822T3 (ja) |
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2009130923A1 (ja) * | 2008-04-25 | 2009-10-29 | 独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構 | 植物からのシアル酸含有化合物の抽出方法 |
| JP2009254384A (ja) * | 1997-10-31 | 2009-11-05 | Bbi Bioseq Inc | 圧力強化抽出及び精製方法 |
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|---|---|---|---|---|
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| CN100413974C (zh) * | 2002-07-18 | 2008-08-27 | 雅玛山酱油株式会社 | Cmp-n-乙酰神经氨酸的制造方法 |
| CN100489111C (zh) * | 2003-09-26 | 2009-05-20 | 雅玛山酱油株式会社 | Cmp-n-乙酰神经氨酸的制造方法 |
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| EP0089940A1 (en) | 1982-03-23 | 1983-09-28 | BioCarp AB | Compositions for therapeutic or diagnostic use containing oligosaccharides |
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| US5352670A (en) | 1991-06-10 | 1994-10-04 | Alberta Research Council | Methods for the enzymatic synthesis of alpha-sialylated oligosaccharide glycosides |
| WO1992022563A1 (en) | 1991-06-10 | 1992-12-23 | Alberta Research Council | Modified sialyl lewisa compounds |
| DE59209053D1 (de) | 1991-07-17 | 1998-01-22 | Forschungszentrum Juelich Gmbh | Verfahren zur Herstellung aktivierter Sialinsäuren |
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- 1994-09-02 DE DE4431280A patent/DE4431280A1/de not_active Withdrawn
-
1995
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- 1995-08-28 AT AT95113496T patent/ATE173507T1/de not_active IP Right Cessation
- 1995-08-28 DE DE59504253T patent/DE59504253D1/de not_active Expired - Fee Related
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-
1999
- 1999-02-12 GR GR990400468T patent/GR3029384T3/el unknown
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|---|---|---|---|---|
| JP2009254384A (ja) * | 1997-10-31 | 2009-11-05 | Bbi Bioseq Inc | 圧力強化抽出及び精製方法 |
| WO2009130923A1 (ja) * | 2008-04-25 | 2009-10-29 | 独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構 | 植物からのシアル酸含有化合物の抽出方法 |
| JPWO2009130923A1 (ja) * | 2008-04-25 | 2011-08-11 | 独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構 | 植物からのシアル酸含有化合物の抽出方法 |
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| DE4431280A1 (de) | 1996-03-07 |
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