CN100489111C - Cmp-n-乙酰神经氨酸的制造方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供可以不使用层析处理，通过简单的操作，容易、且高收率地获得不通过层析处理难以得到的高纯度CMP-N-乙酰神经氨酸(CMP-NeuAc)(HPLC纯度在95%以上)的方法。CMP-N-乙酰神经氨酸的制造方法，它是高纯度CMP-NeuAc的制造方法，其特征在于，将以下的工序1～4适当组合来进行：工序1：在含有CMP-NeuAc的溶液中添加二价阳离子，使共存的磷酸、焦磷酸、核苷酸沉淀的工序；工序2：在含有CMP-NeuAc的溶液中添加磷酸酶，将共存的核苷酸转化为核苷的工序；工序3：添加有机溶剂，使CMP-NeuAc沉淀的工序；工序4：回收沉淀的CMP-NeuAc的工序。

Description

CMP-N-乙酰神经氨酸的制造方法
技术领域
本发明涉及作为糖链合成的重要原料的CMP-N-乙酰神经氨酸(CMP-NeuAc)的制造方法。
背景技术
近年来，随着关于涉及糖链的结构和功能的研究飞速进步，作为具有生理活性的寡糖、糖脂、糖蛋白等医药品或功能性素材的用途开发备受瞩目。其中，已知在末端含有N-乙酰神经氨酸(NeuAc)的含唾液酸的糖链是具有作为细胞粘附或病毒感染时的受体等重要功能的糖链。
含唾液酸的糖链一般通过唾液酸转移酶的催化而合成。唾液酸转移酶是指将胞苷-5′-一磷酸-N-乙酰神经氨酸(CMP-NeuAc)作为糖供体，使唾液酸转移到作为接纳体的糖链的酶。
CMP-NeuAc基本上以胞苷-5′-三磷酸(5′-CTP)和神经氨酸(NeuAc)作为底物，通过CMP-NeuAc合成酶的酶反应来合成。
然而，由于作为糖供体使用的CMP-NeuAc非常不稳定、难以大量制备，所以价格极高，而且在量上只能以试剂水平的较少的量进行供给。此外，供给的制品的纯度也差(以往，不易得到纯度在95％以上的高纯度制品，HPLC鉴定中通常具有90％左右的纯度)，往往不适合作为含唾液酸的糖链等的制造原料。
以往，作为CMP-NeuAc的纯化方法，由于难以将在反应工序中或纯化工序中分解产生、或者在合成反应液中残留的胞苷-5′-一磷酸(5′-CMP)、胞苷-5′-二磷酸(5′-CDP)和5′-CTP与CMP-NeuAc进行分离，因此报道有，作为优选的方法，使用来源于小牛的碱性磷酸酶(CIAP)将共存的5′-CMP、5′-CDP和5′-CTP的磷酸除去而全部形成胞苷后，通过离子交换层析或凝胶过滤层析等各种层析处理分离CMP-NeuAc的方法。(专利文献1～3、非专利文献1)
专利文献1：日本专利特开平5-276973号公报
专利文献2：日本专利特公平5-73391号公报
专利文献3：日本专利特开平8-73480号公报
非专利文献1：J.Am.Chem.Soc.，110，7159-7163(1988)
发明的揭示
发明要解决的课题
然而，上述以往的方法中，需要进行使操作繁复和成本提高的各种层析处理，未必能说是适合于工业水平的大量制造时的纯化方法。此外，磷酸酶处理所使用的来源于小牛的碱性磷酸酶(CIAP)在目前是难以大量制备的酶，也希望使用该酶之外的磷酸酶。
此外，虽然报道了不需要层析处理、使用利用对溶剂溶解度的差别的分级沉淀法(J.Am.Chem.Soc.，110，7159-7163(1988))，但采用分级沉淀法的CMP-NeuAc的回收率和纯度都不及上述层析处理法，无法成为实用的方法。
解决课题的方法
本发明者对不需要层析处理、用于高收率地大量制造高纯度CMP-NeuAc的方法反复进行认真研究后发现，(1)使用CMP-NeuAc合成酶的酶反应结束后，通过添加可迅速与磷酸形成不溶性沉淀的钙、锰等二价阳离子，可以使混杂在反应液中的无机磷酸和焦磷酸形成磷酸盐而沉淀，还可使作为未反应底物的5′-CTP也形成盐而沉淀，(2)即使添加二价阳离子，对磷酸酶反应也没有影响，可以特异性地将5′-CMP、5′-CDP和5′-CTP分解成胞苷，(3)通过添加二价阳离子，CMP-NeuAc对醇等有机溶剂的沉淀性选择性地提高，胞苷与NeuAc的分级沉淀变得非常容易，从而完成了本发明。
因此，本发明如下。
(1)CMP-NeuAc的制造方法，它是高纯度CMP-NeuAc的制造方法，其特征在于，将以下的工序1～4适当组合来进行：
工序1：在含有CMP-NeuAc的溶液中添加二价阳离子，使共存的磷酸、焦磷酸、核苷酸沉淀的工序；
工序2：在含有CMP-NeuAc的溶液中添加磷酸酶，将共存的核苷酸转化为核苷的工序；
工序3：添加有机溶剂，使CMP-NeuAc沉淀的工序；
工序4：回收沉淀的CMP-NeuAc的工序。
(2)如上述(1)所述的方法，以工序1、工序2、工序3、工序4的顺序实施。
(3)如上述(1)所述的方法，以工序2、工序1、工序3、工序4的顺序实施。
(4)如上述(1)所述的方法，同时进行工序1和工序2。
(5)如上述(1)所述的方法，多次实施工序3和工序4。
(6)如上述(1)～(5)中的任一项所述的方法，二价阳离子为钙离子或锰离子。
(7)如上述(1)～(5)中的任一项所述的方法，磷酸酶为大肠杆菌碱性磷酸酶。
(8)如上述(1)～(5)中的任一项所述的方法，有机溶剂为碳原子数在5以下的醇。
(9)上述(1)所述的制造方法，工序4的CMP-NeuAc回收后，再交付离子交换反应，置换CMP-NeuAc的离子。
(10)上述(9)所述的制造方法，所述离子交换反应使用离子交换树脂。
发明的效果
采用本发明，可以不使用层析处理，通过简单的操作，容易、且高收率地获得不通过层析处理难以得到的高纯度CMP-NeuAc(HPLC纯度在95％以上)。
实施发明的最佳方式
如上所述，本发明的CMP-NeuAc制造工序以工序1～工序4为基础。以下，对各工序逐个进行详细说明。
(工序1)
工序1是在含有CMP-NeuAc的溶液中添加二价阳离子，使共存的磷酸、焦磷酸、核苷酸沉淀的工序。
作为供于工序1(或工序2)的含有CMP-NeuAc的溶液，只要是含有CMP-NeuAc的水溶液，没有特别限定，可以例举例如使用了酶的CMP-NeuAc合成的反应混合液，具体可以例举以5′-CTP和NeuAc为底物、通过CMP-NeuAc合成酶的酶反应合成的含有CMP-NeuAc的溶液。
作为添加的二价阳离子，只要是与无机磷酸、焦磷酸、核苷酸形成不溶性沉淀的离子，没有特别限定，可以例举如钙或锰各离子。具体来说，添加钙离子时，可以使用氯化钙、硫酸钙、氢氧化钙、碳酸钙等水溶性钙盐；添加锰离子时，可以使用氯化锰、硫酸锰等水溶性锰盐。添加浓度在0.1～2000mM的范围内适当设定即可。
通过在含有CMP-NeuAc的溶液中添加这样的二价阳离子，在温度为0～60℃的条件下，根据需要将pH调整至6.0～13.0并/或进行搅拌，磷酸钙、磷酸锰等不溶性盐沉淀，所以通过常规的固液分离方法(过滤、离心分离等)去除沉淀物，供于下一工序。
(工序2)
工序2是在含有CMP-NeuAc的溶液中添加磷酸酶，将共存的核苷酸转化为核苷的工序。
作为用于反应的磷酸酶，只要是可以将核苷酸的磷酸残基脱磷酸而转化为核苷、并可以特异性地将5′-CMP、5′-CDP和5′-CTP水解成胞苷的酶，没有特别限定，尤其考虑到反应时CMP-NeuAc的稳定性和酶制备的简便性等，碱性磷酸酶、特别是大肠杆菌碱性磷酸酶是理想的。
磷酸酶反应可以如下进行实施：在70℃以下、较好是20～60℃用0.1～50小时左右，以每1mL 0.01单位以上、较好是0.1～50单位在含有CMP-NeuAc的溶液中添加磷酸酶，根据需要进行搅拌、调整pH，同时使反应进行。
上述工序1和工序2的顺序没有太大关系，可以先进行任一工序，也可以同时进行。例如，在以工序1、工序2的顺序进行实施时，反应后，由于反应液中存在二价离子，在磷酸酶处理中或处理后，磷酸钙、磷酸锰等不溶性盐沉淀，所以通过常规的固液分离方法(过滤、离心分离等)去除沉淀物，供于下一工序。
(工序3)
工序3是添加有机溶剂，使CMP-NeuAc沉淀的工序。
作为添加的有机溶剂，较好是碳原子数为1～5的醇，具体可以使用甲醇、乙醇、异丙醇等。此外，有机溶剂的添加量可以在对应于反应液为0.1～20倍量的范围内适当设定。
通过向经上述工序1或工序2处理后的溶液中添加这样的有机溶剂，在温度为-80～60℃的条件下，根据需要将pH调整至6.0～13.0并/或进行搅拌，沉淀CMP-NeuAc。
(工序4)
工序4是回收沉淀的CMP-NeuAc的工序。
回收可以通过常规的固液分离方法(过滤、离心分离等)来进行，回收后，根据需要进行干燥，制成制品。
此外，通过多次(通常2～5次左右)实施上述工序3和本工序4，可以获得更高纯度的CMP-NeuAc。
(附加工序)
上述工序4结束后，由于CMP-NeuAc形成钙盐、锰盐等盐，因此也可以根据需要转化成例如钠盐等。
盐的交换反应可以如下进行：将回收的沉淀再溶解，使其接触(通过该树脂柱等)例如置换目标盐的离子交换树脂。
这样得到的CMP-NeuAc是HPLC的纯度在95％以上，5′-CMP等杂质极少的高纯度制品。
实施例
以下，例举实施例，对本发明进行具体说明，但本发明当然并不局限于这些实施例。反应液中的CMP-NeuAc的定量通过HPLC法来进行。具体来说，在分离中使用YMC公司制的ODS-HS302柱，洗脱液使用0.1M三乙胺-磷酸(pH6.0)。
实施例1
(1)CMP-NeuAc合成酶的制备
将流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)Rd株的染色体DNA(ATCC51907D)作为模板，按照常规方法合成以下所示的两种引物DNA。使用得到的引物，通过PCR法扩增流感嗜血杆菌的CMP-NeuAc合成酶(neuA)基因。
引物(A)：5′-TGCCATGGTGAAAATAATAATGACAAGAA-3′(序列编号1)
引物(B)：5′-AACTGCAGTGCAGATCAAAAGTGCGGCC-3′(序列编号2)
采用PCR法的neuA基因的扩增如下进行：使用在100μL中含有50mM氯化钾、10mM Tris盐酸(Ph8.3)、1.5mM氯化镁、0.001％明胶、0.1μg模板DNA、各0.2μM引物DNA(A)和(B)以及2.5单位AmpliTaq DNA聚合酶的反应液，用Perkin-Elmer Cetus Instrument公司制的DNA热循环仪(DNA Thermal Cycler)，重复25次热变性(94℃，1分钟)、退火(55℃，1.5分钟)、延伸反应(72℃，3分钟)的步骤。
基因扩增后，将反应液用苯酚/氯仿(1∶1)混合液进行处理，得到水溶性部分。在得到的水溶性部分中添加2倍体积的乙醇，使DNA沉淀。将沉淀回收的DNA按照文献(“Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Second Edition”，Sambrook等编，Cold spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NewYork(1989))的方法通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，纯化相当于720b的DNA片断。将该DNA用限制性酶Nco I和Pst I进行剪切，得到DNA片断。将得到的DNA片断与同样用限制性酶Nco I和Pst I进行消化了的质粒pTrc99A使用T4 DNA连接酶进行连接。使用含有连接了的DNA的反应液对大肠杆菌JM109株进行转化，通过得到的氨苄青霉素抗性的转化体来分离质粒pTrcsiaBNP。PTrcsiaBNP在pTrc99A的trc启动子下游的Nco I-Pst I剪切位点被插入了含有neuA基因的结构基因的DNA片断。
将带有质粒pTrcsiaBNP的大肠杆菌JM109株接种在100mL含有100μg/mL的氨苄青霉素的2×YT培养基中，在37℃下振荡培养。在菌数达到4×108个/mL时，在培养液中添加IPTG，令最终浓度达到0.25mM，再于37℃下继续振荡培养6小时。培养结束后，通过离心分离(9000×g，10分钟)回收菌体，悬浮于5mL缓冲液(100mM Tris盐酸(pH7.8)、10mM MgCl2)中。进行超声波处理将菌体破碎，再通过(20000×g，10分钟)除去菌体残渣。
将这样得到的上清部分作为酶液，对该酶液中的CMP-NeuAc合成酶活性进行测定。其结果与对照菌(带有pTrc99A的大肠杆菌K-12株JM109)一起示于下述表1。本发明中的CMP-NeuAc合成酶的单位(unit)通过以下所示的方法对由5′-CTP和N-乙酰神经氨酸合成CMP-NeuAc的活性进行测定而算出。
(CMP-NeuAc合成酶活性的测定和单位的计算方法)
在50mM Tris盐酸缓冲液(pH8.0)、20mM氯化镁、5mM CTP和10mM N-乙酰神经氨酸的溶液中添加CMP-NeuAc合成酶，在37℃下反应5分钟。此外，使用带有pTrc99A的大肠杆菌JM109株的菌体破碎液代替CMP-NeuAc合成酶进行同样的反应，将其作为对照。
在反应液中加入2倍量的70％乙醇终止反应，将其稀释后，采用HPLC进行分析。在分离中使用YMC公司制的HS-302柱，洗脱液使用50mM醋酸镁水溶液和1mM四丁基铵水溶液的混合液。根据HPLC分析的结果算出反应液中的CMP-NeuAc的量，将37℃下1分钟内合成1μmol的CMP-NeuAc的活性作为1单位(unit)，算出CMP-NeuAc合成酶的活性。
[表1]
 
菌/质粒 CMP-NeuAc合成酶活性(单位/mg蛋白质)    
JM109/pTrc99A <0.01
JM109/pTrcsiaBNP 2.45
(2)大肠杆菌碱性磷酸酶的制备
按照斋藤和三浦的方法(Biochemica et Biophysica Acta.，72，619(1963))制备大肠杆菌JM105株(Takara Bio株式会社)的染色体DNA。将该DNA作为模板，按照常规方法合成以下所示的两种引物DNA。使用得到的引物，通过PCR法扩增大肠杆菌phoA基因(EMBL/GENEBANK/DDBJ DATA BANKS，登录号AE000145.1)。
引物(C)：5′-AAGGATCCAGCTGTCATAAAGTTGTCACGGCC-3′(序列编号3)
引物(D)：5′-TTCTGCAGCCCGTGATCTGCCATTAAGTCTGGTT-3′(序列编号4)
采用PCR法的phoA基因的扩增如下进行：使用在100μL中含有50mM氯化钾、10mM Tris盐酸(Ph8.3)、1.5mM氯化镁、0.001％明胶、0.2mM dATP、0.2mM dGTP、0.2mM dCTP、0.2mM dTTP、0.1μg模板DNA、各0.2μM引物DNA(C)和(D)以及2.5单位AmpliTaq DNA聚合酶的反应液，用Perkin-Elmer Cetus Instrument公司制的DNA热循环仪，重复25次热变性(94℃，1分钟)、退火(55℃，1分钟)、延伸反应(72℃，3分钟)的步骤。
基因扩增后，将反应液用苯酚/氯仿(1:1)混合液进行处理，得到水溶性部分。在得到的水溶性部分中添加2倍体积的乙醇，使DNA沉淀。将沉淀回收的DNA按照文献(Molecular Cloning)的方法通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，纯化相当于1.5kb的DNA片断。将该DNA用限制性酶BamH I和Pst I进行剪切，得到DNA片断。将得到的DNA片断与同样用限制性酶BamH I和Pst I进行消化了的质粒pTrc99A(Pharmacia Biotech.公司)使用T4 DNA连接酶进行连接。使用含有连接了的DNA的反应液对大肠杆菌JM109株(Takara Bio株式会社)进行转化，通过得到的氨苄青霉素抗性的转化体来分离质粒pTrc-phoA。
PTrc-phoA在pTrc99A的trc启动子下游的剪切位点被插入了含有phoA结构基因和核糖体结合位点的BamH I-Pst I DNA片断。
将带有质粒pTrc-phoA的大肠杆菌JM109株接种在500mL含有100μg/mL的氨苄青霉素的2×YT培养基中，在37℃下振荡培养。在菌数达到4×108个/mL时，在培养液中添加IPTG，令最终浓度达到0.2mM，再于37℃下继续振荡培养22小时。培养结束后，通过离心分离(9000×g，10分钟)回收菌体，悬浮于25mL缓冲液(20mM Tris盐酸(pH8.0)、5mM氯化镁)中。进行超声波处理将菌体破碎，再通过(20000×g，10分钟)除去菌体残渣。
接着，在对所得的上清部分进行80℃、15分钟的热处理后，通过离心分离(20000×g，10分钟)除去菌体残渣，对其使用合计为2L的缓冲液(20mM Tris盐酸(pH8.0)、1mM氯化镁)进行4℃、一晚的透析，再通过离心分离(20000×g，10分钟)除去菌体残渣。
将这样得到的上清部分作为酶液，对该酶液中的碱性磷酸酶活性进行测定。其结果与对照菌(带有pTrc99A的大肠杆菌JM109株)一起示于下述表2。本发明中的碱性磷酸酶的单位(unit)通过以下所示的方法测定、算出。
(碱性磷酸酶活性的测定和单位的计算方法)
在含有400mM Tris盐酸缓冲液(pH8.5)和20mM尿苷-5′-一磷酸的溶液中添加酶液，在40℃下反应5～15分钟。此外，使用带有pTrc99A的大肠杆菌JM109株的菌体破碎液代替碱性磷酸酶进行同样的反应，将其作为对照。在反应液中加入等量的0.5M磷酸二氢钾溶液终止反应后，采用HPLC进行分析，对反应液中的尿苷量进行定量。将37℃下1分钟内生成1μmol的尿苷的活性作为1单位(unit)，算出碱性磷酸酶的活性。
[表2]
 
菌/质粒 碱性磷酸酶活性(单位/mg蛋白质)
JM109/pTrc99A <0.5
JM109/pTrc-phoA 14.04
(3)二价离子的添加效果
将5mL 0.2M NeuAc溶液、4mL 0.25M CTP·3Na溶液和1M氯化镁溶液混合后，用2M氢氧化钠溶液将pH调整至10，用蒸馏水定容至50mL。加温至40℃后，添加70单位的CMP-NeuAc合成酶，一边搅拌一边开始反应。反应中，为了将反应液的pH维持在8.5附近，适时滴入1M氢氧化钠溶液。
反应开始1小时后，添加3mL 1M氯化钙溶液，继续添加5单位的大肠杆菌碱性磷酸酶，再在40℃下一边搅拌一边进行反应。反应中，为了将反应液的pH维持在9.0附近，适时滴入1M氢氧化钠溶液。30分钟后，取样一部分通过HPCL分析反应液组成，得到如下述表3所示的结果。
此外，与上述同样地进行1小时CMP-NeuAc合成后，添加3mL 1M氯化锰溶液或3mL蒸馏水，然后同样地进行大肠杆菌碱性磷酸酶反应，将30分钟后取样时的反应液组成也一并记录。
由表3可知，通过添加二价阳离子可以高效地进行大肠杆菌碱性磷酸酶反应，特别是可以有效地除去难以与CMP-NeuAc分离的CMP。
[表3]
 
CMP-NeuAc CTP CMP 胞苷 尿苷
CaCl<sub>2</sub> 14.57mM <0.02mM <0.02mM 1.283mM 0.7932mM
MnCl<sub>2</sub> 11.17mM <0.02mM <0.02mM 0.7051mM 0.5031mM
蒸馏水 16.34mM 0.8625mM 0.8065mM 0.0541mM 0.1127mM
实施例2 对于乙醇沉淀的二价离子的添加效果
将70mg CMP-NeuAc·2Na粉末(Sigma公司制)用蒸馏水溶解，调至500μL(约0.2M溶液)。将其以100μL分取后，分别添加50μL A.1M氯化钙溶液、B.1M氯化锰溶液、C.蒸馏水。接着，分别添加300μL乙醇，在4℃下静置一晚后，进行121000×g、4℃、10分钟的离心分离，测定所得上清在270nm下的吸光度。根据得到的测定值算出作为沉淀部分的回收率后，得到表4所示的结果。
由表4可知，通过添加可与磷酸形成不溶性沉淀的二价阳离子，乙醇沉淀处理中的CMP-NeuAc的回收率大幅提高。
[表4]
 
沉淀回收率(％)
CaCl<sub>2</sub> 89.7
MnCl<sub>2</sub> 55.4
蒸馏水 0.40
实施例3
在100mL 1M氯化镁溶液中添加12.4g NeuAc(Marukin Chuyu公司制)、24.2g5′-CTP·2Na(雅玛山酱油公司制)进行溶解后，用1M氢氧化钠将pH调整至9.5，用蒸馏水定容至2L。加温至40℃后，添加2810单位的CMP-NeuAc合成酶，一边搅拌一边开始反应。反应中，为了将反应液的pH维持在8.5附近，适时滴入1M氢氧化钠溶液。
反应开始1小时后，添加50mL 2.5M氯化钙溶液，继续添加200单位的大肠杆菌碱性磷酸酶，再在40℃下一边搅拌一边进行反应。反应中，为了将反应液的pH维持在9.0附近，适时滴入1M氢氧化钠溶液。
磷酸酶反应1小时后，将反应液冷却至4℃。放置一晚后，通过离心分离(15000×g，15分钟)除去沉淀物。将得到的上清用1M盐酸溶液调整至pH7.0后，添加2g碳粉，在冰浴中搅拌1小时。使用0.45μm过滤器除去碳粉后，将得到的2.03L滤液浓缩至约100mL。
将在浓缩中生成的沉淀使用G3玻璃过滤器除去后，向得到的140mL滤液添加660mL乙醇，在室温下搅拌后，再于4℃下搅拌，放置一晚。
用G3玻璃过滤器回收沉淀后，进行减压干燥，将其用蒸馏水溶解至150mL，添加450mL乙醇，在室温下搅拌后，再于4℃下搅拌，放置一晚。
用G3玻璃过滤器回收沉淀后，进行减压干燥，将其用蒸馏水溶解至250mL，在1000mL用钠离子置换了的PK216(Na)树脂(三菱化学公司制)柱中以400～450mL/h的流速通过。
回收370mL含有CMP-NeuAc的部分，用蒸发器浓缩至50mL左右后，用1M盐酸溶液将pH调整至7.0。
向其添加0.5g碳粉，在水浴中搅拌约1小时后，使用0.45μm过滤器除去碳粉。向得到的70mL滤液添加400mL乙醇，在室温下搅拌后，再于4℃下搅拌一晚。用G3玻璃过滤器回收沉淀，通过将其减压干燥，获得HPLC纯度为98.8％的CMP-NeuAc·2Na粉末(18.4g)。
该CMP-NeuAc的HPLC的分析结果如下。
<分析条件>
柱：ODS-HS302(YMC公司制)
洗脱液：0.1M三乙胺-磷酸(pH6.0)
<分析结果>
CMP-NeuAc   98.8％
5′-CMP     1.2％

Claims (8)

1.CMP-NeuAc的制造方法，它是高纯度CMP-NeuAc的制造方法，其特征在于，以工序(1)、工序(2)、工序(3)、工序(4)的顺序实施或者以工序(2)、工序(1)、工序(3)、工序(4)的顺序实施。
工序(1)：在含有CMP-NeuAc的溶液中添加二价阳离子，使共存的磷酸、焦磷酸、核苷酸沉淀的工序；
工序(2)：在含有CMP-NeuAc的溶液中添加磷酸酶，将共存的核苷酸转化为核苷的工序；
工序(3)：添加有机溶剂，使CMP-NeuAc沉淀的工序；以及
工序(4)：回收沉淀的CMP-NeuAc的工序。
2.如权利要求1所述的方法，其特征还在于，同时进行工序(1)和工序(2)。
3.如权利要求1所述的方法，其特征还在于，多次实施工序(3)和工序(4)。
4.如权利要求1～3中的任一项所述的方法，其特征还在于，二价阳离子为钙离子或锰离子。
5.如权利要求1～3中的任一项所述的方法，其特征还在于，磷酸酶为大肠杆菌碱性磷酸酶。
6.如权利要求1～3中的任一项所述的方法，其特征还在于，有机溶剂为碳原子数在5以下的醇。
7.权利要求1所述的制造方法，其特征还在于，工序(4)的CMP-NeuAc回收后，再交付离子交换反应，置换CMP-NeuAc的离子。
8.权利要求7所述的制造方法，其特征还在于，所述离子交换反应使用离子交换树脂。
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