KR20060109437A - Ｃｍｐ-ｎ-아세틸뉴라민산의 제조법 - Google Patents

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Abstract

크로마토그래피 처리 이외에서는 곤란했던 고순도의 CMP-N-아세틸뉴라민산(HPLC 순도 95% 이상) 을, 크로마토그래피 처리를 사용하지 않고, 단순한 조작으로 용이하게 또한 양호한 수율로 취득할 수 있는 방법을 제공한다. 고순도의 CMP-N-아세틸뉴라민산(CMP-NeuAc) 의 제조법으로서, 이하의 공정 1∼4 의 각 공정을 적절히 조합하여 실시하는 것을 특징으로 하는 CMP-NeuAc 의 제조법.
공정 1 : CMP-NeuAc 함유액에 2 가 양이온을 첨가하여, 공존하는 인산, 피로인산, 뉴클레오티드를 침전시키는 공정, 공정 2 : CMP-NeuAc 함유액에 포스파타아제를 첨가하여, 공존하는 뉴클레오티드를 뉴클레오시드로 변환하는 공정, 공정 3 : 유기 용매를 첨가하여 CMP-NeuAc 를 침전시키는 공정, 공정 4 : 침전된 CMP-NeuAc 를 회수하는 공정

Description

ＣＭＰ-Ｎ-아세틸뉴라민산의 제조법{PROCESS FOR PRODUCING CMP-N-ACETYLNEURAMINIC ACID}
본 발명은, 당(糖)사슬 합성의 중요한 원료인 CMP-N-아세틸뉴라민산 (CMP-NeuAc)의 제조법에 관한 것이다.
최근, 당사슬에 관한 구조 및 기능에 관한 연구가 급속히 진행되고, 생리 활성을 갖는 올리고당, 당지질, 당단백질 등의 의약품 또는 기능성 소재로서의 용도 개발이 주목 받고 있다. 그 중에서도, 말단에 N-아세틸뉴라민산 (NeuAc) 을 함유하는 시알산 함유 당사슬은, 세포 접착이나 바이러스 감염시의 수용체가 되는 등 중요한 기능을 갖는 당사슬로서 알려져 있다.
시알산 함유 당사슬은, 일반적으로 시알산 전이 효소의 촉매에 의해 합성된다. 또한, 시알산 전이 효소란, 시티딘5'-모노인산-N-아세틸뉴라민산 (CMP-NeuAc) 을 당 공급체로 하여, 수용체가 되는 당사슬에 시알산을 전이시키는 효소이다.
CMP-NeuAc 는, 기본적으로는 시티딘5'-트리인산(5'-CTP) 과 뉴라민산(NeuAc) 을 기질로 하고, CMP-NeuAc 신세타아제의 촉매 반응에 의해 합성되어 있다.
그러나, 당 공급체로서 사용하는 CMP-NeuAc 는 매우 불안정하여 대량 조제가 곤란하기 때문에 매우 고가이며, 또한 양적으로도 시약 레벨에서의 미소한 양으로밖에 공급되고 있지 않다. 또 공급되고 있는 제품의 순도도 나빠 (종래, 순도 95% 이상의 고순도품을 취득하는 것이 용이하지 않고, HPLC 검정 상, 통상 90% 전후의 순도를 갖고 있다), 시알산 함유 당사슬 등의 제조 원료로서는 부적절한 것이다.
종래, CMP-NeuAc 의 정제법으로는, 반응 공정 중 또는 정제 공정 중에 분해되어 생성하거나, 또는 합성 반응액 중에 잔존하는 시티딘5'-모노인산(5'-CMP), 시티딘5-디인산(5'-CDP) 및 5'-CTP 와 CMP-NeuAc 를 분리하는 것이 매우 어렵기 때문에, 송아지 유래의 알칼리 포스파타아제(CIAP) 를 사용하여 공존하는 5'-CMP, 5'-CDP 및 5'-CTP 의 인산을 제거하여 모두 시티딘으로 한 후, 이온 교환 크로마토그래피나 겔 여과 크로마토그래피 등의 각종 크로마토그래피 처리에 의해 CMP-NeuAc 를 분리하는 방법이 바람직한 방법으로 보고되어 있다. (특허문헌 1∼3, 비특허문헌 1 )
[특허문헌 1] 일본 공개특허공보 평5-276973호
[특허문헌 2] 일본 특허공보 평5-73391호
[특허문헌 3] 일본 공개특허공보 평8-73480호
[비특허문헌 1] J. Am. Chem. Soc., 110, 7159-7163(1988)
발명의 개시
발명이 해결하고자 하는 과제
그러나, 상기 종래법에서는, 번거롭고 고비용으로 이어지는 각종 크로마토그래피 처리를 필수로 하고 있어, 반드시 공업적 레벨의 대량 제조시의 정제법으로 바람직한 것이라고는 말할 수 없었다. 또 포스파타아제 처리에 사용하는 송아지 유래의 알칼리 포스파타아제 (CIAP) 는 현재 시점에서 대량 조제가 곤란한 효소여서, 본 효소 이외의 포스파타아제를 사용하는 것도 요망되고 있었다.
또 크로마토그래피 처리를 필수로 하지 않은, 용매에 대한 용해도의 차를 이용한 분별 침전법도 보고되어 있지만 (J. Am. Chem. Soc., 110, 7159-7163 (1988)), 분별 침전법에서의 CMP-NeuAc 의 회수율 및 순도 모두 상기 크로마토그래피 처리법에는 도저히 미치지 못하여, 실용적인 방법으로는 되어 있지 않다.
과제를 해결하기 위한 수단
본 발명자는, 크로마토그래피 처리를 필요로 하지 않고, 고순도의 CMP-NeuAc를 양호한 수율로 대량으로 제조하기 위한 방법에 관하여 예의 검토를 거듭한 결과, (1) CMP-NeuAc 합성 효소에 의한 촉매 반응 종료 후, 신속하게 인산과 불용성 침전을 형성할 수 있는 칼슘, 망간 등의 2 가 양이온을 첨가함으로써, 반응액 중에 혼재하는 무기 인산 및 피로인산을 인산염으로 침전시키고, 또 미반응 기질인 5'-CTP 도 염으로 침전시킬 수 있는 것, (2) 2 가 양이온을 첨가해도 포스파타아제 반응은 아무런 영향을 받지 않고, 5'-CMP, 5'-CDP, 5'-CTP 를 특이적으로 시티딘으로 분해할 수 있는 것, (3) 2 가 양이온을 첨가함으로써, CMP-NeuAc 의 알코올 등의 유기 용매에 대한 침강성이 선택적으로 높아지고, 시티딘 및 NeuAc 의 분별 침전이 매우 용이해지는 것 등을 확인하여 본 발명을 완성시켰다.
따라서, 본 발명은 이하와 같다.
(1) 고순도의 CMP-NeuAc 의 제조법으로서, 이하의 공정 1∼4 의 각 공정을 적절히 조합하여 실시하는 것을 특징으로 하는 CMP-NeuAc 의 제조법.
공정 1 : CMP-NeuAc 함유액에 2 가 양이온을 첨가하여, 공존하는 인산, 피로인산, 뉴클레오티드를 침전시키는 공정,
공정 2 : CMP-NeuAc 함유액에 포스파타아제를 첨가하여, 공존하는 뉴클레오티드를 뉴클레오시드로 변환하는 공정,
공정 3 : 유기 용매를 첨가하여, CMP-NeuAc 를 침전시키는 공정
공정 4 : 침전된 CMP-NeuAc 를 회수하는 공정
(2) 공정 1, 공정 2, 공정 3, 공정 4 의 순서로 실시하는 상기 (1) 기재의 방법.
(3) 공정 2, 공정 1, 공정 3, 공정 4 의 순서로 실시하는 상기 (1) 기재의 방법.
(4) 공정 1 과 공정 2 를 동시에 실시하는 상기 (1) 기재의 방법.
(5) 공정 3 과 공정 4 를 복수회 실시하는 상기 (1) 기재의 방법.
(6) 2 가 양이온이 칼슘 이온 또는 망간 이온인 상기 (1)∼(5) 중 어느 하나에 기재된 방법.
(7) 포스파타아제가 대장균 알칼리 포스파타아제인 상기 (1)∼(5) 중 어느 하나에 기재된 방법.
(8) 유기 용매가 탄소수 5 이하의 알코올인 상기 (1)∼(5) 중 어느 하나에 기재된 방법.
(9) 공정 4 의 CMP-NeuAc 의 회수 후, 추가로 염 교환 반응 처리하여, CMP-NeuAc 의 염을 치환하는 상기 (1) 기재의 제조법.
(10) 이온 교환 수지를 사용하는 염 교환 반응인 상기 (9) 기재의 제조법. 발명의 효과
본 발명에 의해, 크로마토그래피 처리 이외에는 곤란했던 고순도의 CMP-NeuAc (HPLC 순도 95% 이상) 를, 크로마토그래피 처리를 사용하지 않고, 단순한 조작으로 용이하게, 또한 양호한 수율로 취득할 수 있게 되었다.
발명을 실시하기 위한 최선의 형태
본 발명의 CMP-NeuAc 제조 공정은, 상기 기술한 바와 같이, 공정 1∼공정 4 를 기본으로 하고 있다. 이하, 각 공정마다 상세히 기술한다.
(공정 1)
공정 1 은, CMP-NeuAc 함유액에 2 가 양이온을 첨가하여, 공존하는 인산, 피로인산, 뉴클레오티드를 침전시키는 공정이다.
공정 1 (또는 공정 2) 에 사용되는 CMP-NeuAc 함유액으로는, CMP-NeuAc 를 함유하는 수용액이면 특별히 한정되지 않고, 예를 들어 효소를 사용한 CMP-NeuAc 합성의 반응 혼합액을 들 수 있고, 구체적으로는, 5'-CTP 와 NeuAc 를 기질로 하여 CMP-NeuAc 신세타아제의 촉매 반응에 의해 합성된 CMP-NeuAc 함유액을 예시할 수 있다.
첨가하는 2 가 양이온으로는, 무기인산, 피로인산 또는 뉴클레오티드와 불용성의 침전을 형성하는 것이면 특별히 한정되지 않고, 예를 들어 칼슘 또는 망간의 각 이온을 들 수 있다. 구체적으로는, 칼슘 이온을 첨가하는 경우에는, 염화 칼슘, 황산 칼슘, 수산화 칼슘, 탄산 칼슘 등의 수용성 칼슘염을 사용할 수 있고, 망간 이온을 첨가하는 경우에는 염화 망간, 황산 망간 등의 수용성 망간염을 사용할 수 있다. 첨가 농도로는, 0.1∼2000mM 의 범위에서 적절히 설정하면 된다.
이러한 2 가 양이온을 CMP-NeuAc 함유액에 첨가하고, 온도 0∼60℃ 의 조건 하, 필요에 따라 pH 를 6.0∼13.0 으로 조정하여, 및/또는 교반함으로써, 인산 칼슘, 인산 망간 등의 불용염이 침강되기 때문에, 침전물을 통상의 고액 분리 수단 (여과, 원심 분리 등) 에 의해 제거하여, 다음 공정에 사용한다.
(공정 2)
공정 2 는, CMP-NeuAc 함유액에 포스파타아제를 첨가하여, 공존하는 뉴클레오티드를 뉴클레오시드로 변환하는 공정이다.
반응에 사용하는 포스파타아제로는 뉴클레오티드의 인산 잔기를 탈인산하여 뉴클레오시드로 변환할 수 있는 효소로, 5'-CMP, 5'-CDP, 5'-CTP 를 특이적으로 시티딘까지 가수 분해할 수 있는 효소이면 특별히 한정되지 않고, 특히, 반응시에 있어서의 CMP-NeuAc 의 안정성이나 효소 조제의 용이성 등을 고려하면 알칼리 포스파타아제, 특히 대장균 알칼리 포스파타아제가 바람직하다.
포스파타아제 반응은, CMP-NeuAc 함유액 1㎖ 당 0.01 유닛 이상, 바람직하게는 0.1∼50 유닛 첨가하고, 70℃ 이하, 바람직하게는 20∼60℃ 에서 0.1∼50 시간 정도, 필요에 따라 교반하여, pH 를 조정하면서 반응시킴으로써 실시할 수 있다.
또한, 상기 공정 1 과 공정 2 는 순서는 특별히 관계없이 어느 쪽을 먼저 실시해도 상관없으며, 동시에 실시해도 된다. 예를 들어, 공정 1, 공정 2 의 순서로 실시한 경우, 반응 후, 반응액 중에 2 가 이온이 존재하기 때문에, 포스파타아제 처리 중 또는 처리 후, 인산 칼슘, 인산 망간 등의 불용염이 침강되므로, 침전물을 통상의 고액 분리 수단 (여과, 원심 분리 등) 에 의해 제거하여, 다음 공정에 사용한다.
(공정 3)
공정 3 은, 유기 용매를 첨가하여 CMP-NeuAc 를 침전시키는 공정이다.
첨가하는 유기 용매로는, 탄소수 1∼5 의 알코올이 바람직하고, 구체적으로는 메탄올, 에탄올, 이소프로판올 등을 사용할 수 있다. 또 유기 용매의 첨가량으로는, 반응액당 0.1∼20 배량의 범위에서 적절히 설정할 수 있다.
이러한 유기 용매를 상기 공정 1 또는 공정 2 의 처리 후의 액에 첨가하고, 온도 -80∼60℃ 의 조건 하, 필요에 따라 pH 를 6.0∼13.0 으로 조정하여, 및/또는 교반함으로써, CMP-NeuAc 가 침강된다.
(공정 4)
공정 4 는, 침전된 CMP-NeuAc 를 회수하는 공정이다.
회수 방법은, 통상의 고액 분리 수단 (여과, 원심 분리 등) 에 의해서 실시할 수 있고, 회수 후, 필요에 따라 건조시켜 제품으로 한다.
또 상기 공정 3 과 본 공정 4 를 복수회 (통상 2∼5 회 정도) 실시함으로써, 보다 고순도의 CMP-NeuAc 를 취득할 수 있다.
(부가 공정)
상기 공정 4 종료 후, CMP-NeuAc 는 칼슘염, 망간염 등의 염으로 되어 있기 때문에, 필요에 따라 예를 들어 나트륨염 등으로 변환할 수 있다.
염의 교환 반응은 회수한 침전을 재용해하고, 예를 들어, 목적으로 하는 염으로 치환한 양이온 교환 수지에 접촉 (당해 수지 칼럼으로 통과 등) 시킴으로써 실시할 수 있다.
이렇게 하여 얻어진 CMP-NeuAc 는 HPLC 에 의한 순도가 95% 이상이고, 5'-CMP 등의 협잡물이 매우 적은 고순도의 제품이다.
이하, 실시예를 나타내어 본 발명을 구체적으로 설명하지만, 본 발명이 이것에 한정되지 않는 것은 분명하다. 또한, 반응액 중의 CMP-NeuAc 의 정량은 HPLC 법을 사용하여 실시하였다. 구체적으로는, 분리에는 YMC 사 제조의 ODS-HS302 칼럼을 사용하고, 용리액으로서 0.1M 트리에틸아민-인산 (pH6.0) 을 사용하였다.
실시예 1
(1) CMP-NeuAc 신세타아제의 조제
Haemophilus . influenzae Rd 주의 염색체 DNA (ATCC51907D) 를 템플레이트로 하여, 이하에 나타내는 2 종류의 프라이머 DNA 를 통상적인 방법에 따라서 합성하였다. 얻어진 프라이머를 사용하여, PCR 법에 의해 H. influenzae 의 CMP-NeuAc 신세타아제 (neuA) 유전자를 증폭시켰다.
프라이머 (A) : 5'-TGCCATGGTGAAAATAATAATGACAAGAA-3'(서열 번호 1)
프라이머 (B) : 5'-AACTGCAGTGCAGATCAAAAGTGCGGCC-3' (서열 번호 2)
PCR 법에 의한 neuA 유전자의 증폭은, 100㎕ 중에, 50mM 염화 칼륨, 10mM 트리스 염산 (pH8.3), 1.5mM 염화 마그네슘, 0.001% 젤라틴, 템플레이트 DNA 0.1㎍, 프라이머 DNA (A) 및 (B) 각각 0.2㎛, 및 AmpliTaq DNA 폴리머라아제 2.5 유닛을 함유하는 반응액을 사용하고, Perkin-Elmer Cetus Instrument 사 제조 DNA Thermal Cycler 로, 열변성 (94℃, 1 분), 어닐링 (55℃, 1.5 분), 신장 반응 (72℃, 3 분) 의 단계를 25 회 반복함으로써 실시하였다.
유전자 증폭 후, 반응액을 페놀/클로로포름 (1:1) 혼합액으로 처리하여, 수용성 획분을 얻었다. 얻어진 수용성 획분에 2 배용적의 에탄올을 첨가하여 DNA 를 침전시켰다. 침전 회수한 DNA 를 문헌 (「Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition」(Sambrook 외 편저, Cold spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1989)) 방법에 따라서 아가로스 겔 전기 영동에 의해 분리하여, 720b 상당의 DNA 단편을 정제하였다. 그 DNA 를 제한 효소 NcoI 및 PstI 로 절단하여 DNA 단편을 얻었다. 얻어진 DNA 단편과, 동일하게 제한 효소 NcoI 및 PstI 로 소화한 플라스미드 pTrc99A 를 T4DNA 리가아제를 사용하여 연결했다. 연결한 DNA 를 함유하는 반응액을 사용하여 대장균 JM109 주를 형질 전환하여 얻어진 암피실린 내성 형질 전환체로부터 플라스미드 pTrcsiaBNP 를 단리시켰다. pTrcsiaBNP 는, pTrc99A 의 trc 프로모터 하류의 NcoI-PstI 절단 부위에 neuA 유전자의 구조 유전자를 함유하는 DNA 단편이 삽입된 것이다.
플라스미드 pTrcsiaBNP 를 유지하는 대장균 JM109 균을, 100㎍/㎖ 의 암피실린을 함유하는 2×YT 배지 100mL 에 식균(植菌)하여, 37℃ 에서 진탕 배양하였다. 균수가 4×108 개/mL 에 도달한 시점에서, 배양액에 최종 농도 0.25mM 가 되도록 IPTG 를 첨가하고, 추가로 37℃ 에서 6 시간 진탕 배양을 계속하였다. 배양 종료 후, 원심 분리 (9,000×g, 10 분) 에 의해 균체를 회수하고, 5mL 의 완충액 (100mM 트리스 염산 (pH7.8), 10mM MgCl2) 에 현탁시켰다. 초음파 처리를 실시하여 균체를 파쇄하고, 추가로 원심 분리 (20,000×g, 10 분) 에 의해 균체 잔사를 제거하였다.
이와 같이 얻어진 상청 획분을 효소액으로 하여, 이 효소액에서의 CMP-NeuAc 신세타아제 활성을 측정하였다. 그 결과를 대조균 (pTrc99A 를 유지하는 대장균 K-12 주 JM109) 과 같이 하기 표 1 에 나타낸다. 또한, 본 발명에서의 CMP-NeuAc 신세타아제 활성의 단위 (유닛) 는, 이하에 나타내는 방법으로 5'-CTP 와 N-아세틸뉴라민산으로부터의 CMP-NeuAc 의 합성 활성을 측정, 산출한 것이다.
(CMP-NeuAc 신세타아제 활성의 측정과 단위의 산출법)
50mM 트리스 염산 완충액 (pH8.0), 20mM 염화 마그네슘, 5mM CTP 및 10mM N-아세틸뉴라민산에, CMP-NeuAc 신세타아제를 첨가하여 37℃ 에서 5 분간 반응시킨다. 또 CMP-NeuAc 신세타아제의 대신에 pTrc99A 를 유지하는 대장균 JM109 주의 균체 파쇄액을 사용하여 동일한 반응을 실시하고, 이것을 컨트롤로 하였다.
반응액에 2 배량의 70% 에탄올을 첨가하여 반응을 정지하고, 이것을 희석시 킨 후, HPLC 에 의한 분석을 실시하였다. 분리에는 YMC 사 제조 HS-302 칼럼을 사용하고, 용출액으로서 50mM 아세트산 마그네슘 수용액과 1mM 테트라부틸 암모늄 수용액의 혼합액을 사용하였다. HPLC 분석 결과로부터 반응액 중의 CMP-NeuAc 의 양을 산출하고, 37℃ 에서 1 분동안 1μmole 의 CMP-NeuAc 를 합성하는 활성을 1 단위 (유닛) 로 하여 CMP-NeuAc 신세타아제 활성을 산출하였다.
[표 1]
균/플라스미드 CMP-NeuAc 신세타아제 활성(units/mg protein)
JM109/pTrc99A <0.01
JM109/pTrcsiaBNP 2.45
(2) 대장균 알칼리 포스파타아제의 조제
대장균 JM105 주 (다카라바이오(주)) 의 염색체 DNA 를 사이토와 미우라(Saito and Miura) 방법 (Biochemica et Biophysica Acta., 72,619(1963)) 에 따라서 조제하였다. 이 DNA 를 주형으로 하여, 이하에 나타내는 2 종류의 프라이머 DNA 를 통상적인 방법에 따라서 합성하였다. 얻어진 프라이머를 사용하고, PCR 법에 의해 대장균 phoA 유전자 (EMBL/GENEBANK/DDBJ DATA BANKS, Accession No. AE000145.1) 를 증폭시켰다.
프라이머 (C): 5'-AAGGATCCAGCTGTCATAAAGTTGTCACGGCC-3' (서열 번호 3)
프라이머 (D): 5'-TTCTGCAGCCCGTGATCTGCCATTAAGTCTGGTT-3' (서열 번호 4)
PCR 법에 의한 phoA 유전자의 증폭은, 100㎕ 중에, 50mM 염화 칼륨, 10mM 트리스 염산 (pH8.3), 1.5mM 염화 마그네슘, 0.001% 젤라틴, 0.2mM dATP, 0.2mM dGTP, 0.2mM dCTP, 0.2mM dTTP, 주형 DNA 0.1㎍, 프라이머 DNA (C) 및 (D) 각각 0.2mM 및 AmpliTaq DNA 폴리머라아제 2.5 유닛를 함유하는 반응액을 사용하여 Perkin-Elmer Cetus Instrument 사 제조 DNA Thermal Cycler 로, 열변성 (94℃, 1분), 어닐링 (55℃, 1 분), 신장 반응 (72℃, 3 분) 의 단계를 25 회 반복함으로써 실시하였다.
유전자 증폭 후, 반응액을 페놀/클로로포름 (1:1) 혼합액으로 처리하여 수용성 획분을 얻었다. 얻어진 수용성 획분에 2 배용적의 에탄올을 첨가하여 DNA 를 침전시켰다. 침전 회수한 DNA 를 문헌 (Molecular cloning) 방법에 따라서 아가로스 겔 전기 영동에 의해 분리하고, 1.5kb 상당의 DNA 단편을 정제하였다. 해당 DNA 를 제한 효소 BamHI 및 PstI 로 절단하여 DNA 단편을 얻었다. 얻어진 DNA 단편과, 동일하게 제한 효소 BamHI 및 PstI 로 소화한 플라스미드 pTrc99A (Pharmacia Biotech.사) 를 T4 DNA 리가아제를 사용하여 연결하였다. 연결한 DNA 를 함유하는 반응액을 사용하여 대장균 JM109 주 (다카라바이오(주)) 를 형질 전환하여, 얻어진 암피실린 내성 형질 전환체로부터 플라스미드 pTrc-phoA 를 단리시켰다.
pTrc-phoA 는, pTrc99A 의 trc 프로모터 하류의 절단 부위에 대장균 phoA 구조 유전자 및 리보솜 결합 부위를 함유하는 BamHI-PstIDNA 단편이 삽입된 것이다.
플라스미드 pTrc-phoA 를 유지하는 대장균 JM109 주를, 100㎍/mL 의 암피실린을 함유하는 2xYT 배지 500mL 에 식균하고, 37℃ 에서 진탕 배양하였다. 균수가 4×108 개/mL 에 도달한 시점에서, 배양액에 최종 농도 0.2mM 가 되도록 IPTG 를 첨가하고, 추가로 37℃ 에서 22 시간 진탕 배양을 계속하였다. 배양 종료 후, 원심 분리 (9,000×g, 10 분) 에 의해 균체를 회수하고, 25mL 의 완충액 (20mM 트리스 염산 (pH8.0), 5mM 염화마그네슘) 에 현탁시켰다. 초음파 처리를 실시하여 균체를 파쇄시키고, 추가로 원심 분리 (20,000×g, 10 분) 에 의해 균체 잔사를 제거하였다.
이어서 얻어진 상청 획분을 80℃, 15 분간의 열처리를 실시한 후에 원심 분리 (20,000×g, 10 분) 에 의해 균체 잔사를 제거하고, 이것을 합계 2L 의 완충액 (20mM 트리스 염산염 (pH8.0), 1mM 염화 마그네슘) 을 사용하여 4℃, 하룻밤 투석을 실시하고, 추가로 원심 분리 (20,000×g, 10 분) 에 의해 균체 잔사를 제거하였다.
이렇게 하여 얻어진 상청 획분을 효소액으로 하여, 효소액에서의 알칼리 포스파타아제 활성을 측정하였다. 그 결과를 대조균 (pTrc99A 를 유지하는 대장균 JMl09 주) 과 같이 하기 표 2 에 나타낸다. 또한, 본 발명에서의 알칼리 포스파타아제 활성 단위 (유닛) 는, 이하에 나타내는 방법에서 측정, 산출한 것이다.
(알칼리 포스파타아제 활성의 측정과 단위의 산출법)
400mM 트리스-염산 완충액 (pH8.5) 및 20mM 우리딘5'-모노인산을 함유하는 용액에 효소액을 첨가하여, 40℃ 에서 5∼15 분 반응시킨다. 또 알칼리 포스파타아제의 대신에 pTrc99A 를 유지하는 대장균 JM109 주의 균체 파쇄액을 사용하여 동일한 반응을 실시하고, 이것을 컨트롤로 하였다. 반응액에 등량의 0.5M 인산 2 수소 칼륨 용액을 첨가함으로써 반응을 정지시킨 후, HPLC 에 의한 분석을 실시 하여, 반응액 중의 우리딘 양을 정량하였다. 37℃ 에서 1 분동안에 1μmole 의 우리딘을 생성하는 활성을 1 단위 (유닛) 로 하여 알칼리 포스파타아제 활성을 산출하였다.
[표 2]
균/플라스미드 알칼리 포스파타아제 활성(units/mg protein)
JM109/pTrc99A <0.5
JM109/pTrc-phoA 14.04
(3) 2 가 이온의 첨가 효과
0.2M NeuAc 용액을 5mL, 0.25M CTP·3Na 용액을 4mL 및 1M 염화 마그네슘 용액을 혼합 후, 2M 수산화나트륨 용액으로 pH 를 10 으로 조정하고, 증류수로 50mL 로 채웠다. 40℃ 로 가온한 후, 70 유닛의 CMP-NeuAc 신세타아제를 첨가하여, 교반하면서 반응을 개시하였다. 반응 중, 반응액의 pH 를 8.5 부근을 유지하기 위해서 1M 수산화나트륨 용액을 적시 적하하였다. ·
반응 개시 1 시간 후, 1M 염화 칼슘 용액 3mL 를 첨가 후, 계속해서 5 유닛의 대장균 알칼리 포스파타아제를 첨가하고, 추가로 40℃ 에서 교반하면서 반응을 실시하였다. 반응 중, 반응액의 pH 를 9.0 부근으로 유지하기 위해서 1M 수산화나트륨 용액을 적시 적하하였다. 30 분 후, 일부를 샘플링하여 HPLC 에 의해 반응액 조성을 분석한 결과, 하기 표 3 에 나타내는 바와 같은 결과가 얻어졌다.
또 상기와 동일하게 CMP-NeuAc 합성을 1 시간 실시한 후, 1M 염화 망간 용액 3 mL 또는 증류수 3mL 첨가 후, 동일하게 대장균 알칼리 포스파타아제 반응을 실시하고, 30분 후에 샘플링했을 때의 반응액 조성도 병기하였다.
표 3 에서, 2 가 양이온을 첨가함으로써 대장균 알칼리 포스파타아제 반응을 효율적으로 실시할 수 있고, 특히 CMP-NeuAc 와의 분리가 곤란한 CMP 를 효율적으로 제거할 수 있음이 분명해졌다.
[표 3]
CMP-NeuAc CTP CMP 시티딘 우리딘
CaCl2 14.57mM <0.02mM <0.02mM 1.283mM 0.7932mM
MnCl2 11.17mM <0.02mM <0.02mM 0.7051mM 0.5031mM
증류수 16.34mM 0.8625mM 0.8065mM 0.0541mM 0.1127mM
실시예 2
에탄올 침전에서의 2 가 이온 첨가 효과
CMP-NeuAc·2 나트륨염 분말 70mg (시그마사 제조) 을 증류수로 용해하여, 500㎕ 로 조제했다 (약 0.2M 용액). 이것을 100㎕ 씩 분취한 후, 각각 A. 1M 염화 칼슘 용액, B. 1M 염화 망간 용액, C. 증류수를 50㎕ 첨가하였다. 계속해서 각각 300㎕ 의 에탄올을 첨가하고, 4℃ 에서 하룻밤 정치한 후, 121,000×g, 4℃, 10 분간의 원심 분리를 실시하여, 얻어진 상청의 270nm 에서의 흡광도를 측정하였다. 얻어진 측정치로부터 침전 획분으로서의 회수율을 산출한 결과, 표 4 에 나타내는 결과가 얻어졌다.
표 4 로부터 알 수 있듯이, 인산과 불용성의 침전을 형성할 수 있는 2 가 양이온을 첨가함으로써 에탄올 침전 처리에서의 CMP-NeuAc 의 회수율이 비약적으로 향상되는 것이 분명해졌다.
[표 4]
침전회수율(%)
CaCl2 89.7
MnCl2 55.4
증류수 0.40
실시예 3
NeuAc 를 12.4g (마루킨 츄유사 제조), 5'-CTP·2Na 염을 24.2g (야마사 쇼유사 제조), 1M 염화 마그네슘 용액을 100mL 첨가, 용해시킨 후, 1M 수산화나트륨으로 pH 를 9.5 로 조정하고, 증류수로 2L 로 채웠다. 40℃ 로 가온한 후, 2,810 유닛의 CMP-NeuAc 신세타아제를 첨가하여, 교반하면서 반응을 개시하였다. 반응 중에 pH 를 8.5 부근으로 유지하기 위해서 1M 수산화나트륨 용액을 적시 적하하였다.
반응 개시 1 시간 후, 2.5M 염화 칼슘 50mL 을 첨가 후, 계속해서 200 유닛의 대장균 알칼리 포스파타아제를 첨가하여, 추가로 40℃ 에서 교반하면서 반응을 실시하였다. 반응 중에 pH 를 9.0 부근으로 유지하기 위해서 1M 수산화나트륨 용액을 적시 적하하였다.
포스파타아제 반응 1 시간 후, 반응액을 4℃ 까지 냉각시켰다. 하룻밤 방치 후, 원심 분리 (15,000×g, 15 분) 에 의해 침전물을 제거하였다. 얻어진 상청을 1M 염화 수소 용액으로 pH7.0 으로 조정 후, 카본 분말 2g 첨가하고, 빙중에서 1 시간 교반하였다. 0.45㎛ 필터를 사용하여 카본 분말을 제거한 후, 얻어진 여과액 2.03L 을 증발기로 약 100mL 까지 농축시켰다.
농축 중에 생성된 침전을 G3 유리 필터를 사용하여 제거한 후, 얻어진 여과액 140mL 에 대하여 에탄올을 660mL 첨가하고, 실온에서 교반한 후, 추가로 4℃ 에 서 교반, 하룻밤 방치하였다.
G3 유리 필터로 침전을 회수한 후, 감압 건조를 실시하고, 이것을 증류수로 150mL 에 용해하여, 에탄올을 450mL 첨가, 실온에서 교반 후, 추가로 4℃ 에서 교반, 하룻밤 방치하였다.
G3 유리 필터로 침전을 회수 후, 감압 건조를 실시하고, 이것을 증류수로 250mL 에 용해하여, 나트륨 이온으로 치환시킨 PK216(Na) 수지 (미쓰비시 화학사 제조) 칼럼 100mL 에 400∼450mL/h 의 유속으로 통과시켰다.
CMP-NeuAc 를 함유하는 획분 370mL 을 회수하여, 증발기로 50mL 정도까지 농축시킨 후, 1M 염화수소 용액으로 pH 를 7.0 으로 조정하였다.
여기에 카본 분말 0.5g 첨가, 수중에서 약 1 시간 교반한 후, 0.45㎛ 필터를 사용하여 카본 분말을 제거하였다. 얻어진 여과액 70mL 에 대하여 에탄올을 400mL 첨가하고, 실온에서 교반한 후, 추가로 4℃ 에서 하룻밤 교반하였다. 침전을 G3 유리 필터를 사용하여 회수하고, 이것을 감압 건조시킴으로써 HPLC 순도 98.8% 의 CMP-NeuAc·2 나트륨염 분말 (18.4g) 을 취득하였다.
이 CMP-NeuAc 의 HPLC 의 분석 결과는 이하와 같다.
<분석 조건>
칼럼: ODS-HS302 (YMC 사 제조)
용리액: 0.1M 트리에틸아민-인산(pH6.0)
<분석 결과>
CMP-NeuAc 98.8%
5'-CMP 1.2%
<110> YAMASA CORPORATION <120> Process for producing CMP-N-acetylneuraminic acid <130> YS0008 <150> JP2003-334484 <151> 2003-09-26 <160> 4 <170> PatentIn Ver. 3.1 <210> 1 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence for amplification of neuA gene <400> 1 tgccatggtg aaaataataa tgacaagaa 29 <210> 2 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence for amplification of neuA gene <400> 2 aactgcagtg cagatcaaaa gtgcggcc 28 <210> 3 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence for amplification of phoA gene <400> 3 aaggatccag ctgtcataaa gttgtcacgg cc 32 <210> 4 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence for amplification of phoA gene <400> 4 ttctgcagcc cgtgatctgc cattaagtct ggtt 34

Claims (10)

  1. 고순도의 CMP-N-아세틸뉴라민산(CMP-NeuAc) 의 제조법으로서, 이하의 공정(1)∼(4) 의 각 공정을 적절히 조합하여 실시하는 것을 특징으로 하는, CMP-NeuAc 의 제조법.
    공정 (1) : CMP-NeuAc 함유액에 2 가 양이온을 첨가하여, 공존하는 인산, 피로인산, 뉴클레오티드를 침전시키는 공정,
    공정 (2) : CMP-NeuAc 함유액에 포스파타아제를 첨가하여, 공존하는 뉴클레오티드를 뉴클레오시드로 변환하는 공정,
    공정 (3) : 유기 용매를 첨가하여 CMP-NeuAc 를 침전시키는 공정 및
    공정 (4) : 침전된 CMP-NeuAc 를 회수하는 공정
  2. 제 1 항에 있어서,
    공정 (1), 공정 (2), 공정 (3), 공정 (4) 의 순서로 실시하는 방법.
  3. 제 1 항에 있어서,
    공정 (2), 공정 (1), 공정 (3), 공정 (4) 의 순서로 실시하는 방법.
  4. 제 1 항에 있어서,
    공정 (1) 과 공정 (2) 을 동시에 실시하는 방법.
  5. 제 1 항에 있어서,
    공정 (3) 과 공정 (4) 을 복수회 실시하는 방법.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
    2 가 양이온이 칼슘 이온 또는 망간 이온인 방법.
  7. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
    포스파타아제가 대장균 알칼리 포스파타아제인 방법.
  8. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
    유기 용매가 탄소수 5 이하의 알코올인 방법.
  9. 제 1 항에 있어서,
    공정 (4) 의 CMP-NeuAc 의 회수 후, 추가로 염 교환 반응 처리하여, CMP -NeuAc 의 염을 치환하는 제조법.
  10. 제 9 항에 있어서,
    이온 교환 수지를 사용하는 염 교환 반응인 제조법.
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