JP2003507071A - デオキシリボヌクレオシドの酵素的合成 - Google Patents

デオキシリボヌクレオシドの酵素的合成

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、デオキシリボヌクレオシドのin vitro酵素的合成法およびこの方法に好適な酵素に関する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本発明は、デオキシリボヌクレオシドのin vitro酵素的合成を行う方法および
この方法に好適な酵素に関する。
【０００２】 天然のデオキシリボヌクレオシド(デオキシアデノシンdA、デオキシグアノシ
ンdG、デオキシシチジンdCおよびチミジンdT)は、DNAの構成要素である。核酸塩
基と糖との間のN-グリコシド結合には、ピリミジンのN1もしくはプリン環のN9お
よびデオキシリボースのC1が含まれる。
【化１】
【０００３】 生細胞において、4種のデオキシリボヌクレオシド(dN)は、ヌクレオチド代謝
の「サルベージ経路」から生じる。一群の酵素がデオキシリボヌクレオシドの細
胞内異化に関与している。デオキシリボアルドラーゼ(EC 4.1.2.4)およびデオキ
シリボムターゼ(EC 2.7.5.1)のほかに、このグループにはまた、チミジンホスホ
リラーゼ(EC 2.4.2.4)およびプリンヌクレオシドホスホリラーゼ(EC 2.4.2.1)が
含まれる。これらの4種の酵素は、デオキシリボヌクレオシドを増殖培地に添加
することによって誘導される。これらの酵素をコードする遺伝子は細菌染色体上
で互いに近接して存在することが明らかにされている(Hammer-JespersonおよびM
unch-Peterson, Eur.J.Biochem.17 (1970), 397およびそこで引用されている文
献)。大腸菌では、上記の遺伝子は、異常で複雑な調節パターンを呈するdeoオペ
ロンに位置する(Valentin-Hansen et al., EMBO J.1 (1982), 317)。
【０００４】 デオキシヌクレオシド合成のためにdeoオペロンの酵素を使用することについ
ては、C.F.Barbas III (Overproduction and Utilization of Enzymes in Synth
etic Organic Chemistry, 博士論文 (1989), Texas A&M University)により報告
された。彼は、デオキシヌクレオシド合成のためにホスホペントムターゼおよび
チミジンホスホリラーゼを適用した。デオキシリボース5-リン酸を化学合成によ
り調製したので(Barbas III et al., J.Am.Chem.Soc. 11 2 (1990), 2013-2014)
、この化合物は出発物質として高価で大規模合成に適さないものになっている。
彼はまた、デオキシリボアルドラーゼを組換え酵素として利用できるようにし、
合成への適用可能性を調べた。しかし、彼およびC.-H.Wong(Microbial Aldolase
s in Carbohydrate Synthesis: ACS Symp.Ser.No.466: Enzymes in Carbohydrat
e Synthesis, Eds. M.D.Bednarski, E.S.Simon (1991), 23-27)はともに、3種の
酵素をすべて利用する一体型ワンポット合成を行うことはできなかった。回避し
えないいくつかの欠点が存在するように思われる。これらの欠点としては、不十
分な化学平衡、デオキシリボース1-リン酸のような中間体の不安定性、ならびに
、反応に関与する化合物の酵素に対する不活性化作用および阻害作用が挙げられ
る。
【０００５】 有利な平衡の証拠がS.Royら(JACS 108 (1986), 1675-78)によって与えられて
いる。アルドラーゼ反応の場合、平衡は所望の生成物側(デオキシリボース5-リ
ン酸)に傾き、ホスホペントムターゼの場合、不適切な側(同様にデオキシリボー
ス5-リン酸)に傾き、そしてプリンヌクレオシドホスホリラーゼの場合、所望の
合成生成物側に傾く。同著者らは、合理的な収率を得るために3種の酵素反応を
組み合わせることを提案している。こうした提案に反して、彼らは重水素化され
たデオキシグアノシンおよびチミジンを2ステップの手順で調製した。すなわち
、第1のステップでデオキシリボース5-リン酸を、第2のステップでデオキシリボ
ヌクレオシドを調製した。第2のステップの単離収率は、デオキシグアノシンお
よびチミジンの場合、それぞれ11%および5%であった。こうした低い収率はまた
、アラビノースをベースとしたヌクレオシドの調製においても得られている(Bar
bas III (1990), 前掲)。これらの低い収率から示唆されるように、deoオペロン
の酵素を、デオキシリボヌクレオシドを分解させる生物学的機能とは逆方向に機
能させなければならない合成ルートで使用することには大きな欠点がある。
【０００６】 したがって、デオキシリボヌクレオシドの酵素的in vitro合成を行うための経
済性のある商業的方法は、現時点ではなんら存在しない。これまでのところ、商
業目的で、デオキシヌクレオシドはサカナ精液からDNAの酵素的開裂により生成
されている。しかしながら、この方法は、特に、十分な量および品質で出発物質
を得ることが困難であるという点で、いくつかの欠点を抱えている。
【０００７】 したがって、本発明の目的は、従来の欠点を少なくとも部分的に排除して信頼
しがたい天然の原料になんら依存することなくデオキシリボヌクレオシドの効率
的かつ経済的な合成を可能にする方法を提供することであった。
【０００８】 驚くべきことに、従来の酵素的合成ルートの欠点を回避することができるとと
もに、出発物質の量を基準にして例えば少なくとも80%の高収率でデオキシリボ
ヌクレオシドを取得することができることを見いだした。
【０００９】 第1の態様において、本発明は、デオキシリボヌクレオシドのin vitro酵素的
合成を行う方法であって、デオキシリボヌクレオシドと無機リン酸が生成するよ
うにデオキシリボース1-リン酸(dR1P)と核酸塩基とを反応させることを含んでな
る方法に関する。
【００１０】 この反応は、デオキシリボヌクレオシドが生成するようにデオキシリボース部
分を核酸塩基に転移させることのできる酵素によって触媒される。好ましくは、
反応は、チミジンホスホリラーゼ(TP、EC 2.4.2.4)またはプリンヌクレオシドホ
スホリラーゼ(PNP、EC 2.4.2.1)によって触媒される。これらの酵素および以下
に記載の他の酵素のEC名称については、標準的な書籍Enzyme Nomenclature 1992
, E.C.Webb編, Academic Press, Inc.に記載されている。
【００１１】 これらの酵素および以下に記載の他の酵素は、天然の供給源、すなわち、真核
生物、原核生物および好熱生物を含む古細菌から選択される任意の好適な生物に
由来する天然タンパク質として入手可能である。さらに、これらの酵素は、該酵
素をコードするDNAでトランスフォームまたはトランスフェクトされた任意の好
適な宿主細胞から得られる組換えタンパク質として入手可能である。宿主細胞は
、真核細胞、原核細胞または古細菌細胞であってよい。天然または組換えのTPま
たはPNPの特定の好ましい供給源は、大腸菌のような原核生物である。組換えTP
は、1999年4月23日に寄託された大腸菌pHSP 282株(CNCM I-2186)から単離するこ
とが可能である。この株は、大腸菌 deoA(チミジンホスホリラーゼ)インサート
を含有するプラスミドでトランスフォームされた組換え大腸菌株である。組換え
PNPは、1999年4月23日に寄託された大腸菌pHSP 283株(CNCM I-2187)から単離す
ることが可能である。この株は、大腸菌 deoD(プリンヌクレオシドホスホリラー
ゼ)インサートを含有するプラスミドでトランスフォームされた組換え大腸菌株
である。TP遺伝子のヌクレオチド配列および対応するアミノ酸配列は、配列番号
1および2で示される。PNP遺伝子のヌクレオチド配列および対応するアミノ酸配
列は、配列番号15および16ならびに3および4で示される。
【００１２】 デオキシリボース単位の転移先である核酸塩基は、任意の好適な核酸塩基から
選択されるであろう。たとえば、核酸塩基は、チミン、ウラシル、アデニン、グ
アニンまたはヒポキサンチンのような天然に存在する核酸塩基であってよい。し
かしながら、天然に存在しないその類似体、たとえば、2-チオ-ウラシル、6-ア
ザ-ウラシル、5-カルボキシ-2-チオウラシル、6-アザ-チミン、6-アザ-2-チオ-
チミンおよび2,6-ジアミノ-プリンもまた、酵素基質として好適であることに注
目すべきである。
【００１３】 好ましくは、無機リン酸は反応から除去される。この除去は、好ましくは、(i
)無機ピロリン酸への変換、(ii)沈殿/錯化および／または(iii)基質リン酸化に
より達成される。
【００１４】 無機ピロリン酸への変換は、リン酸化された基質からリン酸基が切り離されて
無機リン酸と反応することにより無機ピロリン酸(PPi)が生成するように、リン
酸化された基質、好ましくはたとえばフルクトース二リン酸(FDP)のようなポリ
リン酸化された基質からのリン酸転移によって行うことが可能である。このリン
酸転移は、好ましくは、PPi依存性ホスホリラーゼ/キナーゼによって、たとえば
、フルクトース二リン酸(FDP)および無機リン酸からフルクトース-6-リン酸(F6P
)および無機ピロリン酸への反応を触媒するPPi依存性ホスホフクルトキナーゼ(P
FK-PPi、EC 2.7.1.90)によって触媒される。PPi依存性キナーゼ/ホスホリラーゼ
およびそれをコード化する遺伝子の好ましい供給源は、プロピオニバクテリウム
・フロイデンライシイ (シャーマニイ) (Propionibacterium freudenreichii (s
hermanii))またはジャガイモ塊茎である。
【００１５】 さらに、無機リン酸は、沈殿および／または錯化によって反応から除去するこ
とが可能であり、この処理は、リン酸を沈殿させることのできるカルシウムイオ
ンまたは第二鉄イオンのような多価金属イオンを添加することによって、あるい
は、リン酸を錯化させることのできる錯形成化合物を添加することによって行う
ことが可能である。ピロリン酸形成と錯化/沈殿とを組み合わせて行うことも可
能であることに注目すべきである。
【００１６】 さらに、無機リン酸の除去は、基質リン酸化によって行うことも可能である。
それにより、無機リン酸は好適な基質に転移され、リン酸化された基質が生成さ
れる。基質は、好ましくは、糖類、たとえば、スクロースまたはマルトースのよ
うな二糖類から選択される。基質として二糖を使用すると、単糖およびリン酸化
された単糖が得られる。リン酸転移は、スクロースホスホリラーゼ(EC 2.4.1.7)
またはマルトースホスホリラーゼ(EC 2.4.1.8)のような好適なホスホリラーゼ/
キナーゼによって触媒される。これらの酵素の好ましい供給源は、ロイコノスト
ク・メゼンテロイデス(Leuconostoc mesenteroides)、シュードモナス・サッケ
ロフィラ(Pseudomonas saccherophila)(スクロースホスホリラーゼ)、および、
ロイコバシラス・ブレビス(Lactobacillus brevis)(マルトースホスホリラーゼ)
である。
【００１７】 リン酸化された基質は、追加の酵素反応と組み合わせることによりさらに反応
させて、たとえば、ガラクトシドにすることが可能である(Ichikawa et al., Te
trahedron Lett.36 (1995), 8731-8732)。このほか、基質リン酸化によるリン酸
除去を上述したような他のリン酸除去方法と組み合わせることも可能であること
に注目すべきである。
【００１８】 本発明の方法の出発化合物であるデオキシリボース1-リン酸(dR1P)は、やや不
安定な化合物であり、それを単離するのは困難である。本発明の好ましい実施形
態では、d1RPは、室温および中性pHで比較的安定しているデオキシリボース5-リ
ン酸(dR5P)から現場で生成される。この反応は、好適な酵素によって、たとえば
、先に概説したような任意の好適な供給源から取得しうるデオキシリボムターゼ
(EC 2.7.5.1)またはホスホペントースムターゼ(PPM、EC 5.4.2.7)によって触媒
される。反応は、好ましくは、アクチベーターとしてMn2+またはCo2+などの二価
金属カチオンの存在下で行われる。デオキシリボムターゼの好ましい供給源は腸
内細菌である。天然または組換えのPPMの特に好ましい供給源は、大腸菌のよう
な原核生物である。組換えPPMは、1999年4月23日に寄託された大腸菌pHSP 275株
(CNCM I-2188)から単離することが可能である。この株は、大腸菌 deo B(ホスホ
ペントースムターゼ)インサートを含有するプラスミドでトランスフォームされ
た組換え大腸菌株である。PPM遺伝子のヌクレオチド配列および対応するアミノ
酸配列は、配列番号17および18ならびに5および6で示される。
【００１９】 dR5Pは、グリセルアルデヒド3-リン酸(GAP)をアセトアルデヒドと縮合させる
ことによって生成することが可能である。この反応は、好適な酵素によって、好
ましくはホスホペントースアルドラーゼ(PPA、EC 4.1.2.4)によって触媒される
。反応は、リン酸化された糖の形成に有利な平衡定数を呈する(Keq = [dR5P]/[
アセトアルデヒド]×[GAP] = 4.2×103×M-1)。PPAは、アルデヒドとの相互作用
により不安定なシッフ塩基中間体を生成する。天然または組換えのPPAの特定の
好ましい供給源は、大腸菌のような原核生物である。組換えPPAは、1999年4月23
日に寄託された大腸菌pHSP 276株(CNCM I-2189)から単離することが可能である
。この組換え大腸菌株は、deoC(ホスホペントースアルドラーゼ)インサートを含
有するプラスミドでトランスフォームされる。PPA遺伝子のヌクレオチド配列お
よび対応するアミノ酸配列は、配列番号19および20ならびに7および8で示される
。
【００２０】 GAPはきわめて不安定な化合物であるため、好ましくはフルクトース1,6-二リ
ン酸(FDP)、ジヒドロキシアセトン(DHA)および／またはグリセロールリン酸(GP)
から選択される好適な前駆体から現場で生成しなければならない。特に、前駆体
としてはFDPが好ましい。
【００２１】 FDPアルドラーゼIおよびFDPアルドラーゼIIから選択されるFDPアルドラーゼ(E
C 4.1.2.13)によって、FDPをGAPおよびジヒドロキシアセトンリン酸に変換する
ことができる(Keq = [FDP]/[GAP]×[DHAP] = 104M-1)。2つの化学的に異なる経
路を介して同等な最終生成物(GAPおよびDHAP)を与えるFDPアルドラーゼの2つの
ファミリーをこの反応に使用することが可能である。FDPアルドラーゼIは、PPA
のようにシッフ塩基中間体を形成して、FDPアルドラーゼIIは、活性部位に共有
結合する金属(Zn2+)を使用して、最終生成物を生じる。FDP-アルドラーゼIは真
核生物に特徴的なものであるが、種々の細菌で見いだされる。FDP-アルドラーゼ
IIは原核生物でより頻繁に見いだされる。FDP-アルドラーゼをアセトアルデヒド
の存在下でFDPと反応させると、後者の化合物は、DHAPとの相互作用によりデオ
キシキシルロース1-リン酸(dX1P)と呼ばれる望ましからぬ縮合副生成物を生じる
可能性がある。したがって、反応は、好ましくは、望ましからぬ副生成物の生成
が低減されるかまたは完全に抑制されるように行われる。
【００２２】 天然または組換えのFDPアルドラーゼの特に好ましい供給源は、原核生物また
は真核生物である。たとえば、FDPアルドラーゼは、ウサギ筋肉から単離するこ
とが可能である。さらに、FDPアルドラーゼは、大腸菌のような細菌から取得す
ることも可能である。組換えFDPアルドラーゼは、大腸菌fba(フルクトース二リ
ン酸アルドラーゼ)インサートを含有するプラスミドでトランスフォームされた
組換え大腸菌pHSP 284株(CNCM I-2190)から単離することが可能である。大腸菌
FDPアルドラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列および対応するアミノ酸配列は、配
列番号9および10で示される。
【００２３】 一方、GAPは、DHAおよびATPから生成させることが可能である。このときジヒ
ドロキシアセトンリン酸(DHAP)およびADPが生成され、それに続いて、グリセロ
キナーゼ(GK、EC 2.7.1.30)およびトリオースリン酸イソメラーゼ(TIM、EC 5.3.
1.1)により触媒される反応でDHAPがGAPに異性化される。好適なグリセロキナー
ゼは、大腸菌から取得可能であり、好適なトリオースリン酸イソメラーゼは、ウ
シまたはブタの筋肉から取得可能である。
【００２４】 本発明のさらなる実施形態では、GAPは、グリセロールリン酸(GP)および02か
ら生成させることが可能である。このときDHAPおよびH202が生成され、それに続
いて、グリセロリン酸オキシダーゼ(GPO、EC 1.1.3.21)およびトリオースリン酸
イソメラーゼ(TIM、EC 5.3.1.1)により触媒される反応でDHAPがGAPに異性化され
る。好適なグリセロリン酸オキシダーゼは、アエロコッカス・ビリダンス(Aeroc
occus viridans)から取得可能である。
【００２５】 本発明のこのほかの実施形態では、デオキシリボース5-リン酸(dR5P)がデオキ
シリボースのリン酸化によって生成される。好ましくは、この反応は、好適な酵
素の存在下で、例えば、原核生物、特に腸チフス菌(Salmonella typhi)から取得
しうるデオキシリボキナーゼ(dRK、EC 2.7.1.5)の存在下で、かつATPの存在下で
行われる。腸チフス菌のdRK遺伝子のヌクレオチド配列および対応するアミノ酸
配列は、配列番号11および12で示される。
【００２６】 先に概説したような反応によって、酵素TPおよび／またはPNPにより受容され
る核酸塩基を含有しているデオキシリボヌクレオシドが得られる。TPは、チミジ
ン(T)、ウラシル(U)および他の関連ピリミジン化合物に特異的である。PNPは、
基質としてアデニン、グアニン、ヒポキサンチンまたは他のプリン類似体を用い
る。
【００２７】 この場合、デオキシシトシン(dC)のように直接的な縮合によって取得できない
デオキシリボヌクレオシドの合成では、追加の酵素反応が必要となる。このとき
、第2の核酸塩基を含有する第2のリボヌクレオシドが生成するように、第1の核
酸塩基を含有するデオキシリボヌクレオシドを第2の核酸塩基と反応させる。第2
の核酸塩基は、好ましくは、シトシンおよびその類似体、たとえば、5-アザシト
シンから選択される。しかしながら、この核酸塩基交換反応によって、6-メチル
プリン、2-アミノ-6-メチルメルカプトプリン、6-ジメチルアミノプリン、2,6-
ジクロロプリン、6-クロログアニン、6-クロロプリン、6-アザチミン、5-フルオ
ロウラシル、エチル-4-アミノ-5-イミダゾールカルボキシレート、イミダゾール
-4-カルボキサミドおよび1,2,4-トリアゾール-3-カルボキサミドのような他の核
酸塩基を対応するデオキシリボヌクレオシドに変換することも可能であることに
注目すべきである(Beaussire and Pochet, Nucleosides & Nucleotides 14 (199
5), 805-808, Pochet et al., Bioorg.Med.Chem.Lett.5 (1995), 1679-1684, Po
chet and Dugue, Nucleosides & Nucleotides 17 (1998), 2003-2009, Pistotni
k et al., Anal.Biochem.271 (1999), 192-199)。この反応は、好ましくは、第1
のデオキシリボヌクレオシドから第2の核酸塩基に、たとえばシトシンにグリコ
シル部分を転移させるヌクレオシド2-デオキシリボシルトランスフェラーゼ(NdT
、EC 2.4.2.6)と呼ばれる酵素によって触媒される。天然または組換えNdTの好ま
しい供給源は、乳酸杆菌属、特にライヒマン菌(Lactobacillus leichmannii)の
ような原核生物である。組換えのNdTは、1999年4月23日に寄託された組換え大腸
菌pHSP 292株(CNCM I-2191)から単離することが可能である。この株は、ライヒ
マン菌NdT(ヌクレオシド2-デオキシリボシルトランスフェラーゼ)インサートを
含有するプラスミドでトランスフォームされたものである。NdT遺伝子のヌクレ
オチド配列および対応するアミノ酸配列は、配列番号13および14で示される。
【００２８】 本発明のさらなる態様は、デオキシリボヌクレオシドのin vitro酵素的合成を
行う方法であって、(i)グリセルアルデヒド3-リン酸(GAP)をアセトアルデヒドと
縮合させてデオキシリボース5-リン酸(dR5P)にするステップ、(ii)デオキシリボ
ース5-リン酸を異性化させてデオキシリボース1-リン酸(dR1P)にするステップ、
および(iii)デオキシリボヌクレオシドと無機リン酸が生成するようにデオキシ
リボース1-リン酸と核酸塩基とを反応させるステップを含んでなる方法である。
【００２９】 先に概説したように、グリセルアルデヒド3-リン酸は、FDP、DHAおよび／また
はGPから生成させることが可能である。好ましくは、FDPを出発物質として使用
する。
【００３０】 望ましからぬ副生成物の形成およびアセトアルデヒドの有害な作用を回避する
ために、好ましくは好適な手段により反応過程を制御する。この場合、好ましく
は、たとえば、反応中、少しずつまたは連続的にアセトアルデヒドを添加するこ
とによりおよび／または過剰のアセトアルデヒドを除去することにより、ステッ
プ(ii)におけるアセトアルデヒド濃度が比較的低くなるように、たとえば100 mM
未満、特に50 mM未満になるように反応を行う。さらに、ステップ(ii)の前に、
過剰の出発物質および／または副生成物、特にフルクトース1,6-二リン酸および
／またはデオキシキシルロース1-リン酸(dX1P))を除去することが好ましい。こ
の除去は、化学的および／または酵素的方法によって、たとえば、第二鉄塩でFD
Pを沈殿させるかまたはジヒドロキシアセトンリン酸によりX1Pを酵素的に劣化さ
せることによって行うことが可能である。この代わりにまたはこれに加えて、ス
テップ(ii)の前に出発物質および／または副生成物、特にフルクトース1,6-二リ
ン酸および／またはデオキシキシルロース1-リン酸が反応混合物中に実質量で存
在しないように、好ましくは10 mM未満になるように、反応条件を調節してもよ
い。
【００３１】 さらに他の実施形態では、本発明は、デオキシリボヌクレオシドのin vitro酵
素的合成を行う方法であって、(i)デオキシリボースをリン酸化させてデオキシ
リボース5-リン酸にするステップ、(ii)デオキシリボース5-リン酸を異性化させ
てデオキシリボース1-リン酸にするステップ、および(iii)デオキシリボヌクレ
オシドと無機リン酸が生成するようにデオキシリボース1-リン酸と核酸塩基とを
反応させるステップを含んでなる方法に関する。好ましくは中間生成物を単離し
ながら、より好ましくはワンポット反応として、これらの反応を行う。より良好
な収率を得るために、ステップ(iii)から無機リン酸を除去することが好ましい
。
【００３２】 上記のプロセスによって、dA、dG、dT、dUおよびdTのような天然に存在するデ
オキシリボヌクレオシドだけでなく、天然に存在しない核酸塩基および／または
天然に存在しないデオキシリボース糖（たとえば、2'-デオキシ-3'-アジド-デオ
キシリボースまたは2'-デオキシ-4'-チオ-デオキシリボース）を含有するその類
似体を生成させることも可能である。
【００３３】 得られたデオキシリボヌクレオシドは、既知の方法に従ってさらなる生成物に
変換してもよい。これらのさらなる反応ステップとしては、デオキシリボヌクレ
オシド一、二または三リン酸、H-ホスホナートあるいはホスホルアミダイトの合
成が挙げられる。これに加えてまたはこの代わりに、放射性標識基または化学的
標識基のような標識基をデオキシリボヌクレオシドに導入してもよい。
【００３４】 本発明のさらなる態様は、第2の核酸塩基を含有するデオキシリボヌクレオシ
ドが生成するように第1の核酸塩基を含有するデオキシリボヌクレオシドを第2の
核酸塩基と反応させることを含むin vitro酵素的合成プロセスに用いる酵素を調
製するための、ヌクレオシド2-デオキシリボシルトランスフェラーゼ(NdT、EC 2
.4.2.6)をコードする単離された核酸分子の使用である。第2の核酸塩基は、好ま
しくは、シチジンおよびその類似体、2,6-ジクロロ-プリン、6-クロロ-グアニン
、6-クロロ-プリン、6-アザ-チミンおよび5-フルオロ-ウラシルから選択される
。第1の核酸塩基は、好ましくは、チミン、グアニン、アデニンまたはウラシル
から選択される。
【００３５】 より好ましくは、NdTをコードする核酸分子には、(a)配列番号13で示されるヌ
クレオチド配列またはその相補的配列、(b)遺伝暗号の縮重の範囲内で(a)の配列
に対応するヌクレオチド配列あるいは(c)ストリンジェント条件下で配列(a)およ
び／または(b)にハイブリダイズするヌクレオチド配列が含まれる。配列番号13
の配列のほかに、本発明にはまた、該ポリペプチドをコードするヌクレオチド配
列が包含される。すなわち、それらは、遺伝暗号の縮重の範囲内の配列およびス
トリンジェント条件下で上記の配列のうちの1つとハイブリダイズするヌクレオ
チド配列に相当する。これらのヌクレオチド配列は、組換えDNA法および突然変
異誘発法により配列番号13から、あるいは天然の供給源から、たとえば、他の乳
酸杆菌株から、取得することが可能である。
【００３６】 本発明に相応したストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、Sambro
ok et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor La
boratory Press (1989), 1.101-1.104に記載されている条件として定義される。
これによれば、ストリンジェント条件下のハイブリダイゼーションとは、55℃で
、好ましくは62℃で、最も好ましくは68℃で、1×SSC緩衝液および0.1% SDSを用
いて1時間にわたり、特に、55℃で、好ましくは62℃で、最も好ましくは68℃で
、0.2×SSC緩衝液および0.1% SDS中で1時間にわたり、洗浄した後、依然として
正のハイブリダイゼーションシグナルが観察されることを意味する。
【００３７】 さらに、本発明にはまた、配列番号13で示されるヌクレオチド配列に対してヌ
クレオチドレベルで少なくとも70%の同一性、特に好ましくは少なくとも80%、最
も好ましくは少なくとも90%の同一性を有するヌクレオチド配列が包含される。
同一性パーセントは、次式により決定される。
【数１】 式中、Iは同一性パーセントであり、Lは基本配列の長さであり、そして、nは基
本配列に対する配列のヌクレオチド差またはアミノ酸差の数である。
【００３８】 本発明のさらなる別の主題は、先に記載の核酸分子の少なくとも1つのコピー
を発現調節配列と機能しうる形で連結して含んでなる組換えベクターである。ベ
クターは、任意の原核性または真核性のベクターであってよい。原核性ベクター
の例は、バクテリオファージ(たとえば、バクテリオファージλ)のような染色体
ベクターおよびプラスミド(たとえば、Sambrook et al., 前掲, Chapter 1-4を
参照されたい)のような染色体外ベクターである。ベクターはまた、真核性ベク
ター、たとえば、酵母ベクターまたは高等生物細胞に好適なベクター、たとえば
プラスミドベクター、ウイルスベクターまたは植物ベクターであってもよい。好
適な真核性ベクターについては、たとえば、Sambrook et al., 前掲, Chapter 1
6に記載されている。本発明はさらに、上記の核酸または組換えベクターでトラ
ンスフォームされた組換え細胞に関する。細胞は、任意の細胞、たとえば、原核
細胞または真核細胞であってよい。原核細胞、特に、大腸菌細胞がとりわけ好ま
しい。
【００３９】 本発明は、上記の核酸によってコードされたNdT活性を有する単離されたポリ
ペプチドおよびデオキシリボヌクレオシドを調製するためのその使用を対象とす
る。好ましくは、ポリペプチドは、配列番号14で示されるアミノ酸配列またはそ
れに対する同一性が少なくとも70%、特に好ましくは少なくとも80%、最も好まし
くは少なくとも90%であるアミノ酸配列を有している。
【００４０】 最後に、本発明はまた、デオキシリボヌクレオシドのin vitro合成を行う方法
に用いる酵素を調製するための、チミジンホスホリラーゼ(TP)、プリンヌクレオ
シドホスホリラーゼ(PNP)、ホスホペントースムターゼ(PPM)、ホスホペントース
アルドラーゼ(PPA)、FDPアルドラーゼおよびデオキシリボキナーゼ(dRK)の活性
を有する単離された核酸分子の使用に関する。好ましくは、これらの核酸は、(a
)配列番号1、3、5、7、9もしくは11で示されるヌクレオチド配列またはそれらの
相補的配列、(b)遺伝暗号の縮重の範囲内で(a)の配列に対応するヌクレオチド配
列あるいは(c)ストリンジェント条件下で配列(a)および／または(b)にハイブリ
ダイズするヌクレオチド配列から選択される。
【００４１】 上記の核酸によってコードされるTP、PNP、PPM、PPA、FDPアルドラーゼまたは
dRKの活性を有する単離されたポリペプチドは、デオキシリボヌクレオシドを調
製するために使用することが可能である。好ましくは、これらのポリペプチドは
、配列番号2、4、16、6、18、8、20、10もしくは12で示されるアミノ酸配列また
はそれに対する同一性が少なくとも70%、特に好ましくは少なくとも80%、最も好
ましくは少なくとも90%であるアミノ酸配列を有している。
【００４２】 dRKをコードする単離された核酸分子は、デオキシリボースをリン酸化してデ
オキシリボース5-リン酸にするステップを含むデオキシリボヌクレオシドの酵素
的合成を行うin vitro法に用いる酵素を調製するために使用することが可能であ
る。ここで、該核酸分子は、(a)配列番号11で示されるヌクレオチド配列または
その相補的配列、(b)遺伝暗号の縮重の範囲内で(a)の配列に対応するヌクレオチ
ド配列あるいは(c)ストリンジェント条件下で(a)および／または(b)の配列にハ
イブリダイズするヌクレオチド配列を含んでいる。それに対応して、dRK活性を
有する単離されたポリペプチドは、先に概説したようにデオキシリボヌクレオシ
ドの酵素的合成を行うin vitro法に好適である。
【００４３】 大腸菌pHSP 282株(CNCM I-2186)、pHSP 283株(CNCM I-2187)、pHSP 275株(CNC
M I-2188)、pHSP 276株(CNCM 2189)、pHSP 284株(CNCM I-2190)およびpHSP 292
株(CNCM I-2191)をブダペスト条約の規則に準拠して1999年4月23日にCollection
Nationale de Culture de Microorganismes, Institut Pasteur, 25, Rue de D
octeur Roux, 75724 Paris Cedex 15へ寄託した。
【００４４】実施例1 酵素の供給源 アエロコッカス・ビリダンス（Aerococcus viridans）由来のL-グリセロール3
-リン酸オキシダーゼ(1.1.3.21)、スクロースホスホリラーゼ(2.4.1.7)、プロピ
オニバクテリウム・フロイデンライシイ（Propionibacterium freudenreichii）
由来のフルクトース6-リン酸キナーゼ(2.7.1.90)、ウサギ筋肉アルドラーゼ(RAM
A)、ギ酸デヒドロゲナーゼ、グリセロールリン酸デヒドロゲナーゼ(GDH)、トリ
オースリン酸イソメラーゼ(TIM)、カタラーゼ、グリセロール3-リン酸オキシダ
ーゼおよびマルトースホスホリラーゼは、供給業者(Roche Diagnostics, Sigma)
から、または文献に記載の手法に従って、取得した。
【００４５】 FDPアルドラーゼII(4.1.2.13)、ホスホペントースアルドラーゼ(PPA、EC 4.1.
2.4)、ホスホペントースムターゼ(PPM、EC 5.4.2.7)、チミジンホスホリラーゼ(
TP、EC 2.4.2.4)、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ(PNP、EC 2.4.2.1)、ヌク
レオシド2-デオキシリボシルトランスフェラーゼ(NdT、EC 2.4.2.6)は、CNCMに
寄託された大腸菌株から取得した(上記参照)。
【００４６】実施例2 デオキシアデノシン合成のプロトコル アセトアルデヒド(最終濃度250mM)、FDPアルドラーゼII(0.5U/ml)、PPA(2.5U/
ml)を20mlの100mMフルクトース-1,6-二リン酸(FDP)、pH7.6に添加し、４℃にて
一晩インキュベートすることにより反応混合物Aを調製した。
【００４７】 室温でMnCl2(最終濃度0.6mM)、グルコース1,6-二リン酸(15μM)、PPM(1.5U/ml
)、PNP(0.4U/ml)、SP(1.5U/ml)ペントースリン酸アルドラーゼ、PPA(2U/ml)およ
びFDPアルドラーゼII(0.5U/ml)を10mlの0.9Mスクロース、pH 7.6に添加すること
により混合物Bを調製した。
【００４８】 20℃の温度で2mlのAをBに添加した。1時間後、2.5mlのAを添加した。さらに1
時間後、3.0mlのAを添加した。さらに1.5時間後、3.5mlのAを添加した。さらに1
.5時間後、4mlのAを添加し、そしてさらに1〜1.5時間後、5mlのAを添加して一晩
放置した。
【００４９】 Aを添加するごとに反応混合物中のFDP、dR5P、dX1PおよびdAの量を測定して収
率を計算した。アセトアルデヒドの濃度は20〜30mMの間に保持した。結果を表1
に示す。
【００５０】
【表１】
【００５１】 FDPの初期量は1.92mmolであった。反応終了後の量は0.150mmolであった。した
がって、1.77mmolが消費されたことになる。これは理論上3.54mmol当量のdAに相
当する。dAの生成量は1.82mmolであったので、収率はFDP量を基準にして51.4%で
ある。
【００５２】実施例3 FeCl 3 による過剰のFDPの除去 1.4g(2.55mmol)の三ナトリウム-フルクトース-1,6-二リン酸-八水和物および4
30μl(335mg、7.6mmol)のアセトアルデヒドを4℃の水15mlに溶解させた。水酸化
ナトリウム溶液によりpHを7.9に調節した。150Uのペントースリン酸アルドラー
ゼ(PPA)を添加し、そして冷水(4℃)を加えて20mlにした。50Uの大腸菌アルドラ
ーゼIIを添加した後、混合物を4℃で保存した。2時間後、さらに75UのPPAおよび
50μlのアセトアルデヒド(390mg、8.9mmol)を添加した。20時間後、500Uのトリ
オースリン酸イソメラーゼ(TIM)を添加した。120時間後、溶液には、約68mMのFD
P、約12mMのdX1Pおよび約45mMのdR5Pが含まれていた。0.01M塩酸中の塩化鉄(III
)の2M溶液900μlを添加することにより反応を停止させた。沈殿物を遠心分離お
よび洗浄した。得られた溶液には、約4mMのdX1P、約9mMのFDPおよび約25mMのdR5
Pが含まれていた。
【００５３】実施例4 DHAPを介した分解による過剰のFDPおよびdX1Pの除去 576mg(1.05mmol)の三ナトリウム-フルクトース-1,6-二リン酸-八水和物を8ml
の水に溶解させ、水酸化ナトリウム溶液によりpHを8.1に調節した。75UのPPAお
よび27Uのウサギ筋肉アルドラーゼ(RAMA)を添加し、そして水を加えて10mlにし
た。570μl(440mg、10mmol)のアセトアルデヒドを添加した。反応液を4℃で保存
した。100時間後、溶液には、約110mMのdX1P、約5mMのFDPおよび約85mMのdR5P(
約870μmol)が含まれていた。pHが2に達するまで塩酸を添加することにより、反
応を停止させた。pHが5.5になるように水酸化ナトリウム溶液を添加した後、溶
液を保存した。
【００５４】 dX1Pを除去するために、アセトアルデヒドを蒸発させ、溶液を水で希釈して30
mlにした。それを3mlの2.65Mギ酸ナトリウム溶液(8mmol)と混合し、pHが7.4に到
達するまで水酸化ナトリウム溶液を添加した。23Uのギ酸デヒドロゲナーゼ(FDH)
、6mgのNADH、16UのRAMAおよび20Uのグリセロールリン酸デヒドロゲナーゼ(GDH)
を添加した。
【００５５】 室温で24時間後において、dX1PおよびFDPの濃度は3mM未満であり、dR5Pの損失
は10%未満である。
【００５６】実施例5 G3Pを介したdR5Pの調製 1.1g(2.0mmol)の三ナトリウム-フルクトース-1,6-二リン酸-八水和物を8mlの
水に溶解させた。1.58molの2.65Mギ酸ナトリウム溶液(4.2mmol)および14.2mgのN
ADHを添加した。NaOHによりpHを7.0に調節した。36UのRAMA、50Uのトリオースリ
ン酸イソメラーゼ(TIM)、34UのGDHおよび35UのFDHを添加した後、水を加えて12m
lにした。
【００５７】 室温で40時間インキュベートした後、FDPの含有量は3mM未満であった。pHが2
に達するように塩酸で酸性化することにより、酵素を変性させた。続いて、溶液
のpHを4に調節し、そして固形分を遠心分離し、濾別した。精製時の稀釈により
、全体積は25mlに達した。この中には約160mMのグリセロール3-リン酸(G3P)が含
まれていた。
【００５８】 4mlの上記溶液(約640μmolのG3P)を水酸化ナトリウム溶液によりpHを7.8に調
節した。7.8kUのカタラーゼ、500UのTIMおよび13Uのグリセロール3-リン酸オキ
シダーゼを添加する。この混合物を開放フラスコ中で非常にゆっくり攪拌した。
30分後、18UのPPAを添加した。30μlのアセトアルデヒドを小分け(23.5mg、530
μmol)して30、60、120、180および240分後に添加した。24時間後、さらに15Uの
PPA、2.5kUのTIMおよび100μl(78mg、1.8mmol)のアセトアルデヒドを添加した。
30時間後、さらに100μlのアセトアルデヒドを添加してからバッチを密封した。
合計45時間後、dR5P濃度が約60mMとなり、反応が終了した。2'-デオキシアデノ
シン(たとえば、実施例7)を調製するためには、過剰のアセトアルデヒドを留去
しなければならない。
【００５９】実施例6 少量のdX1PまたはFDPを含有するdR5P溶液の調製 pH 7.4を有する60mmol/lのFDPと120mmol/lのアセトアルデヒドとの溶液を15℃
の温度に保持した。その5mlを4UのアルドラーゼII、2UのTIMおよび40UのPPAと混
合し、15℃に保持した。4、8.5、16.5および24時間後に、12UのPPAおよび100μl
の34体積％アセトアルデヒド水溶液(26.4mg、600μmol)をそれぞれ添加した。40
時間後、室温に達するまで溶液を放置した。90時間後、反応溶液は、約3mMのFDP
、約4mMのdX1Pおよび少なくとも70mMのdR5Pの濃度に達した。反応を停止させて
アセトアルデヒドを除去するために、体積の約20%を留去した。
【００６０】実施例7 酢酸バリウムを利用するdR5Pからのデオキシアデノシン(dA)の調製 実施例3〜6によって調製された溶液の形態のdR5Pを使用した。たとえば、70mM
のdR5Pを含有するように希釈された実施例6の溶液10ml(700μmolのdR5P)を、40m
g(300μmol)のアデニン、41μg(50nmol)のテトラシクロヘキシルアンモニウム-
グルコース-1,6-二リン酸、396μg(2μmol)の酢酸マンガンII四水和物、10Uのペ
ントースリン酸ムターゼ(PPM)および30Uのプリン-ヌクレオシドホスホリラーゼ(
PNP)と混合した。3時間後、さらに27mg(200μmol)のアデニンおよび26mg(100μm
ol)の酢酸バリウムを添加した。
【００６１】 4時間後、さらに酢酸バリウム26mgを添加し、7時間後、さらにアデニン40mgを
添加した。10時間後、反応が終了した。溶液は、45mMのdA濃度を有していた。
【００６２】実施例8 スクロースホスホリラーゼを利用するdR5Pからのデオキシアデノシン(dA)の調製 55mMのdR5Pに希釈された実施例6の溶液10ml(550μmolのdR5P)を、81mg(600μm
ol)のアデニン、41μg(50nmol)のテトラシクロヘキシルアンモニウム-グルコー
ス-1,6-二リン酸、396μg(2μmol)の酢酸マンガンII四水和物、10Uのペントース
リン酸ムターゼ(PPM)、15Uのプリンヌクレオシドホスホリラーゼ(PNP)、25Uのス
クロースホスホリラーゼおよび340mg(1mmol)のショ糖と混合した。
【００６３】 室温で3時間後、反応が終了した。溶液は、約50mMのdA濃度を有していた。
【００６４】実施例9 マルトースホスホリラーゼを利用するdR5Pからのデオキシアデノシン(dA)の調製 55mMに希釈されたdR5Pの溶液10mlを、pH7.0で、81mg(600μmol)のアデニン、4
1μg(50nmol)のグルコース1,6-二リン酸、396μg(2μmol)の酢酸マンガンII四水
和物、5単位のペントースリン酸ムターゼ(PPM)、10単位のプリンヌクレオシドホ
スホリラーゼ(PNP)、20単位のマルトースホスホリラーゼおよび1080mg(3mmol)の
マルトースと混合した。
【００６５】 室温で12時間後、反応が終了した。溶液は、49mMのdA濃度を有していた。
【００６６】実施例10 スクロースホスホリラーゼを利用するdR5Pからのデオキシシトシン(dC)の調製 70mMに希釈されたdR5Pの溶液20mlを、pH7.0で、5.4mgのアデニン(0.04mmol)、
155mgのシトシン(1.4mmol)、82μg(100nmol)のグルコース1,6-二リン酸、792μg
(4μmol)の酢酸マンガンII四水和物、20単位のPPM、30単位のPNP、50単位の2-デ
オキシリボシルトランスフェラーゼ(NdT)、50単位のスクロースホスホリラーゼ
および2.05g(6mmol)のスクロースと混合した。
【００６７】 30℃で18時間後、溶液は、62mMのdC濃度を有していた。
【００６８】実施例11 スクロースホスホリラーゼを利用するdR5Pからのデオキシグアノシン(dG)の調製 70mMに希釈されたdR5Pの溶液20mlを、pH7.0で、91mgのグアニン(0.6mmol)、82
μg(100nmol)のグルコース1,6-二リン酸、792μg(4μmol)の酢酸マンガンII四水
和物、20単位のPPM、10単位のPNP、20単位のスクロースホスホリラーゼおよび2.
05g(6mmol)のスクロースと混合した。
【００６９】 37℃で18時間後、生成したdGは0.5mmolに相当する。
【００７０】実施例12 dA合成の2ステップ手順 第1のステップにおいて、大腸菌由来のFDP-アルドラーゼII(AldII)、大腸菌由
来のペントースリン酸アルドラーゼ(PPA)および大腸菌由来のトリオースリン酸
イソメラーゼ(TIM)を、本質的に実施例6に従ってフルクトース-1.6-二リン酸(FD
P)およびアセトアルデヒド(AcAld)に添加することにより、dR5Pを調製した。FDP
三ナトリウム塩を75mMの最終濃度でAcAld(100mMの最終濃度)と混合した。水酸化
ナトリウムを添加することによりpHを7,4に調節した。PPA(12kU/l)、Ald II(0,3
kU/l)およびTIM(2,5kU/l)を添加することにより反応を開始させた。4時間後に11
7mMのAcAldを、7時間後に117mmのAcAld、PPA 6kU/l、TIM 2,5kU/lを、そして12
時間後に117mMのAcAldを添加した。反応は21℃で行った。NADH(300mMトリエタノ
ールアミン緩衝液pH7.6中0,26mM)の存在下でグリセロール-3-リン酸デヒドロゲ
ナーゼ(GDH)、ウサギ筋肉アルドラーゼ(RAMA)、トリオースリン酸イソメラーゼ(
TIM)、ペントースリン酸アルドラーゼ(PRA)を段階的に用いて酵素的アッセイを
行うことにより変換率をモニターした。変換率を図1に示す。
【００７１】 約95mMのdR5Pが生成した後、65℃まで10分間加熱することにより酵素を不活性
化させ、そしてエバポレーションにより過剰のAcAldを除去した。第2のステップ
において、300μMのMnCl2、5μMのグルコース-1.6-二リン酸、大腸菌由来のペン
トースリン酸ムターゼ(PPM、2kU/l)、大腸菌由来のプリンヌクレオシドホスホリ
ラーゼ(PNP、1kU/l)の存在下でアデニン(A、最終濃度58mM))を添加することによ
り、64mMの最終濃度のdR5Pをデオキシアデノシン(dA)に変換した。合成は20℃、
pH7.4で行った。一方の実験では、200mMのスクロースおよびロイコノストク・メ
ゼンテロイデス（Leuconostoc mes.）由来の0.6kU/lのスクロースホスホリラー
ゼ(SP)をt=2時間で添加し(図2の矢印、菱形、実線を参照されたい)、他方の実験
では、SPの添加を省略した(正方形、点線)。RP-HPLC(カラムHypersil ODS 5μm
、250×4,6mm; 溶離液: 30mMリン酸カリウム、5mM硫酸水素テトラブチルアンモ
ニウム pH 6.0/1%アセトニトリル、流速: 1 ml/分、カラム温度: 35℃、検出: 2
60nmのUV)により変換率をモニターした。変換率を図2に示す。
【００７２】実施例13 大腸菌由来のFDP-アルドラーゼII(AldII)、大腸菌由来のペントースリン酸ア
ルドラーゼ(PPA)および大腸菌由来のトリオースリン酸イソメラーゼ(TIM)を、本
質的に実施例6に従ってフルクトース-1.6-二リン酸(FDP)およびアセトアルデヒ
ド(AcAld)に添加することにより、dR5Pを調製した。エバポレーションにより過
剰のAcAldを除去した。300μMのMnCl2、5μMのグルコース-1.6-二リン酸、大腸
菌由来のペントースリン酸ムターゼ(PPM、1.5kU/l)、大腸菌由来のプリンヌクレ
オシドホスホリラーゼ(PNP、1kU/l)の存在下でアデニン(A、最終濃度58mM))を添
加することにより、60mMの最終濃度のdR5Pをデオキシアデノシン(dA)に変換した
。合成は20℃、pH7.4で行った。24時間後、200mMの最終濃度のスクロースおよび
ロイコノストク・メゼンテロイデス（Leuconostoc mes.）由来のスクロースホス
ホリラーゼ(1kU/l)を添加した。RP-HPLC(dA、A、実施例12を参照されたい)、そ
れぞれの酵素的アッセイ(dR5P、NADH(300mMトリエタノールアミン緩衝液pH7.6中
0.26mM)の存在下でグリセロール-3-リン酸デヒドロゲナーゼ(GDH)、ウサギ筋肉
アルドラーゼ(RAMA)、トリオースリン酸イソメラーゼ(TIM)、ペントースリン酸
アルドラーゼ(PRA)を段階的に用いる)および無機リン酸(Sigma, Proc. No. 360-
UV)のリンモリブデン酸錯化により、変換率をモニターした。これを図3に示す。
【００７３】実施例14 本質的に実施例6に従ってdR5Pを調製した。次に、200mMのスクロース、300μM
のMnCl2、5μMのグルコース-1.6-二リン酸、大腸菌由来のペントースリン酸ムタ
ーゼ(PPM、2.5kU/l)、大腸菌由来のプリンヌクレオシドホスホリラーゼ(PNP、1k
U/l)、ロイコノストク・メゼンテロイデス（Leuconostoc mes.）由来のスクロー
スホスホリラーゼ(SP、1,5kU/l)の存在下で2,6-ジアミノプリン(DAP、最終濃度7
7mM))を添加することにより、80mMの最終濃度のdR5Pをデオキシ-6-アミノグアノ
シン(dG-NH2)に変換した。合成は20℃、pH7.4で行った。2,5時間後、5時間後、2
0,5時間後に、追加量の酵素を添加した。すなわち、2,5時間後にPPM(2,5kU/l)、
PNP(1kU/l)、SP(1,5 kU/l)、5時間後にPPM(2,5kU/l)、SP(1,5 kU/l)、20,5時間
後にPPM(2,5kU/l)、SP(1,5 kU/l)を添加した。RP-HPLC(カラムHypersil ODS 5μ
m、250×4,6mm; 溶離液: 30mMリン酸カリウム、5mM硫酸水素テトラブチルアンモ
ニウム pH 6.0/1%アセトニトリル、流速: 1 ml/分、カラム温度: 35℃、検出: 2
16nmのUV)により変換率をモニターした。変換率を図4に示す。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 実施例12によるdR5Pの合成を示す。
【図２】 実施例12によるデオキシアデノシンの合成を示す。
【図３】 実施例13によるデオキシアデノシンの合成を示す。
【図４】 実施例14によるdG-NH2の合成を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，Ｃ Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ， ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ， ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ティッシャー，ウィルヘルム ドイツ連邦共和国 ディー−82380 パイ セエンベルグ，フィンケンウェグ ５ (72)発明者 イーレンフェルト，ハンス−ゲオルグ ドイツ連邦共和国 ディー−82393 イッ フェルドルフ，ラーベン コプフシュトラ ーセ ５ (72)発明者 バーズ，オクタヴィアン フランス国 エフ−92160 アントーニー， アレ デ ラ ブーゲーヴィレ，３ (72)発明者 サカモト，ヒロシ フランス国 エフ−92190 ムードー， センティーユ デ ヤーディーズ，３ (72)発明者 ピストニク，エリザベート フランス国 エフ−94000 クレティユ， リュ デ ラ フォーセ オー ムワン ス，11 (72)発明者 マリエール，フィリップ フランス国 エフ−91450 エチオールズ， アレ サン マルタン，２ (72)発明者 プシェ，シルヴィー フランス国 エフ−75012 パリ，リュ ゴセック，５ Ｆターム(参考） 4B024 AA20 BA10 CA02 DA06 HA08 4B050 CC03 DD02 LL05 4B064 AF33 CA19 CB30 CC24 CD15 4B065 AA26X AB01 AC14 CA29

Claims (46)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 デオキシリボース1-リン酸(dR1P)と核酸塩基とを反応させて
    、デオキシリボヌクレオシドと無機リン酸を生成することからなる、デオキシリ
    ボヌクレオシドのin vitro酵素的合成法。
  2. 【請求項２】 前記無機リン酸が除去される、請求項１に記載の方法。
  3. 【請求項３】 前記反応がチミジンホスホリラーゼ(TP、EC 2.4.2.4)または
    プリンヌクレオシドホスホリラーゼ(PNP、EC 2.4.2.1)によって触媒される、請
    求項１または２に記載の方法。
  4. 【請求項４】 前記核酸塩基が、チミン、ウラシル、アデニン、グアニン、
    およびヒポキサンチンならびにそれらの類似体、たとえば、2-チオ-ウラシル、6
    -アザ-ウラシル、5-カルボキシ-2-チオ-ウラシル、6-アザ-チミン、6-アザ-2-チ
    オ-チミンおよび2,6-ジアミノ-プリンからなる群より選択される、請求項１〜３
    のいずれか1項に記載の方法。
  5. 【請求項５】 前記無機リン酸の除去が、(i)無機ピロリン酸への変換、(ii
    )沈澱、(iii)錯化および／または(iv)基質リン酸化によって達成される、請求項
    １〜４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 【請求項６】 前記無機リン酸が、フルクトース-6-リン酸(F6P)の形成下に
    おけるフルクトース-二リン酸(FDP)からのリン酸転移によってピロリン酸に変換
    される、請求項５に記載の方法。
  7. 【請求項７】 前記リン酸転移が、PPi依存性ホスホフルクトキナーゼ(PFK-
    PPi、EC 2.7.1.90)によって触媒される、請求項６に記載の方法。
  8. 【請求項８】 前記無機ピロリン酸が沈殿によって除去される、請求項６ま
    たは７に記載の方法。
  9. 【請求項９】 前記無機リン酸が、単糖およびリン酸化された単糖の形成下
    で、二糖、特にスクロースまたはマルトースに転移される、請求項５に記載の方
    法。
  10. 【請求項１０】 前記リン酸転移が、スクロースホスホリラーゼ(EC 2.4.1.
    7)またはマルトースホスホリラーゼ(EC 2.4.1.8)によって触媒される、請求項９
    に記載の方法。
  11. 【請求項１１】 前記リン酸化された単糖をさらに反応させる、請求項１０
    に記載の方法。
  12. 【請求項１２】 前記デオキシリボース-1-リン酸がデオキシリボース5-リ
    ン酸(dR5P)から生成される、請求項１〜１１のいずれか1項に記載の方法。
  13. 【請求項１３】 前記反応がデオキシリボムターゼ(EC 2.7.5.1)またはホス
    ホペントースムターゼ(PPM、EC 5.4.2.7)によって触媒される、請求項１２に記
    載の方法。
  14. 【請求項１４】 前記デオキシリボース-5-リン酸が、グリセルアルデヒド3
    -リン酸(GAP)とアセトアルデヒドとの縮合によって生成される、請求項１２また
    は１３に記載の方法。
  15. 【請求項１５】 前記反応がホスホペントースアルドラーゼ(PPA、EC 4.1.2
    .4)によって触媒される、請求項１４に記載の方法。
  16. 【請求項１６】 前記グリセルアルデヒド3-リン酸が、フルクトース1,6-二
    リン酸、ジヒドロキシアセトン(DHA)および／またはグリセロールリン酸から生
    成される、請求項１４または１５に記載の方法。
  17. 【請求項１７】 前記グリセルアルデヒド3-リン酸が、FDP-アルドラーゼI
    およびFDP-アルドラーゼIIから選択されるFDP-アルドラーゼ(EC 4.1.2.13)によ
    って触媒される反応において、フルクトース1,6-二リン酸から生成される、請求
    項１６に記載の方法。
  18. 【請求項１８】 前記グリセルアルデヒド3-リン酸が、グリセロキナーゼ(G
    K、EC 2.7.1.30)およびトリオースリン酸イソメラーゼ(TIM、EC 5.3.1.1)によっ
    て触媒される反応において、ジヒドロキシアセトンリン酸(DHAP)およびADPの形
    成と、それに続くDHAPからGAPへの異性化の下で、ジヒドロキシアセトンおよびA
    TPから生成される、請求項１６に記載の方法。
  19. 【請求項１９】 前記グリセルアルデヒド3-リン酸が、グリセロリン酸オキ
    シダーゼ(GPO、EC 1.1.3.21)およびトリオースリン酸イソメラーゼ(TIM、EC 5.3
    .1.1)によって触媒される反応において、ジヒドロキシアセトンリン酸(DHAP)お
    よびH202の形成と、それに続くDHAPからGAPへの異性化の下で、グリセロールリ
    ン酸(GP)および02から生成される、請求項１６に記載の方法。
  20. 【請求項２０】 前記デオキシリボース5-リン酸がデオキシリボースのリン
    酸化によって生成される、請求項１２または１３に記載の方法。
  21. 【請求項２１】 前記反応がデオキシリボキナーゼ(dRK、EC 2.7.1.15)によ
    って触媒される、請求項２０に記載の方法。
  22. 【請求項２２】 腸チフス菌(Salmonella typhi)から得られるdRKが使用さ
    れ、該dRKが、(a)配列番号11で示されるヌクレオチド配列またはその相補的配列
    、(b)遺伝暗号の縮重の範囲内で(a)の配列に対応するヌクレオチド配列、あるい
    は(c)ストリンジェント条件下で(a)および／または(b)の配列にハイブリダイズ
    するヌクレオチド配列によってコードされている、請求項２１に記載の方法。
  23. 【請求項２３】 第2の核酸塩基を含有するデオキシリボヌクレオシドの形
    成下で、第1の核酸塩基を含有するデオキシリボヌクレオシドを第2の核酸塩基と
    さらに反応させる、請求項１〜２２のいずれか1項に記載の方法。
  24. 【請求項２４】 前記第2の核酸塩基が、シチジンおよびその類似体、たと
    えば、5-アザ-シチジン、2,6-ジクロロ-プリン、6-クロロ-グアニン、6-クロロ-
    プリン、6-アザ-チミンおよび5-フルオロ-ウラシルから選択される、請求項２３
    に記載の方法。
  25. 【請求項２５】 前記反応がヌクレオシド2-デオキシリボシルトランスフェ
    ラーゼ(NdT、EC 2.4.2.6)によって触媒される、請求項２４に記載の方法。
  26. 【請求項２６】 ライヒマン菌(Lactobacillus leichmannii)から得られるN
    dTが使用され、該NdTが、(a)配列番号13で示されるヌクレオチド配列またはその
    相補的配列、(b)遺伝暗号の縮重の範囲内で(a)の配列に対応するヌクレオチド配
    列、あるいは(c)ストリンジェント条件下で(a)および／または(b)の配列にハイ
    ブリダイズするヌクレオチド配列によってコードされている、請求項２５に記載
    の方法。
  27. 【請求項２７】 デオキシリボヌクレオシドのin vitro酵素的合成法であっ
    て、 (i)グリセルアルデヒド3-リン酸(GAP)をアセトアルデヒドと縮合させてデオキ
    シリボース5-リン酸(dR5P)にするステップ、 (ii)デオキシリボース5-リン酸を異性化させてデオキシリボース1-リン酸(dR1
    P)にするステップ、および (iii)デオキシリボース1-リン酸と核酸塩基とを反応させて、デオキシリボヌ
    クレオシドと無機リン酸を生成させるステップ、 を含んでなる、上記方法。
  28. 【請求項２８】 前記反応が、中間生成物を単離することなく行なわれる、
    請求項２７に記載の方法。
  29. 【請求項２９】 前記グリセルアルデヒド3-リン酸(GAP)が、フルクトース1
    ,6-二リン酸(FDP)、ジヒドロキシ-アセトン(DHA)および／またはグリセロールリ
    ン酸(GP)から生成される、請求項２７または２８に記載の方法。
  30. 【請求項３０】 ステップ(ii)の前に過剰のアセトアルデヒドが除去される
    、請求項２７〜２９のいずれか１項に記載の方法。
  31. 【請求項３１】 ステップ(ii)の前に過剰の出発物質および／または副生成
    物、特にフルクトース1,6-二リン酸および／またはデオキシキシルロース1-リン
    酸(dX1P)が除去される、請求項２７〜３０のいずれか１項に記載の方法。
  32. 【請求項３２】 ステップ(ii)の前に実質的な量の出発物質および／または
    副生成物、特にフルクトース1,6-二リン酸および／またはデオキシキシルロース
    1-リン酸が存在しないようにして、前記反応を行なう、請求項２７〜３０のいず
    れか１項に記載の方法。
  33. 【請求項３３】 デオキシリボヌクレオシドのin vitro酵素的合成を行う方
    法であって、 (i)デオキシリボースをリン酸化させてデオキシリボース5-リン酸にするステ
    ップ、 (ii)デオキシリボース5-リン酸を異性化させてデオキシリボース1-リン酸にす
    るステップ、および (iii)デオキシリボース1-リン酸と核酸塩基とを反応させて、デオキシリボヌ
    クレオシドと無機リン酸を生成させるステップ、 を含んでなる、上記方法。
  34. 【請求項３４】 前記反応が、中間生成物を単離することなく行なわれる、
    請求項３３に記載の方法。
  35. 【請求項３５】 前記無機リン酸が除去される、請求項２７〜３４のいずれ
    か１項に記載の方法。
  36. 【請求項３６】 前記デオキシリボヌクレオシドをさらに反応させることを
    含む、請求項１〜３５のいずれか1項に記載の方法。
  37. 【請求項３７】 前記さらに反応させることが、デオキシリボヌクレオシド
    一、二または三リン酸の合成、H-ホスホナートの合成、あるいはホスホルアミダ
    イトの合成を含む、請求項３６に記載の方法。
  38. 【請求項３８】 第2の核酸塩基を含有するデオキシリボヌクレオシドの形
    成下で第1の核酸塩基を含有するデオキシリボヌクレオシドを第2の核酸塩基とさ
    らに反応させることを含むデオキシリボヌクレオシドのin vitro酵素的合成法に
    用いる酵素を調製するための、ヌクレオシド2-デオキシリボシルトランスフェラ
    ーゼ(NdT、EC 2.4.2.6)をコードする単離された核酸分子の使用であって、該核
    酸分子が、(a)配列番号13で示されるヌクレオチド配列またはその相補的配列、(
    b)遺伝暗号の縮重の範囲内で(a)の配列に対応するヌクレオチド配列、あるいは(
    c)ストリンジェント条件下で(a)および／または(b)の配列にハイブリダイズする
    ヌクレオチド配列を含む、上記使用。
  39. 【請求項３９】 前記第2の核酸塩基が、シチジンおよびその類似体、たと
    えば、6-メチルプリン、2-アミノ-6-メチルメルカプトプリン、6-ジメチルアミ
    ノプリン、5-アザシチジン、2,6-ジクロロプリン、6-クロログアニン、6-クロロ
    プリン、6-アザチミン、5-フルオロウラシル、エチル-4-アミノ-5-イミダゾール
    カルボキシレート、イミダゾール-4-カルボキサミド、および1,2,4-トリアゾー
    ル-3-カルボキサミドから選択される、請求項３８に記載の使用。
  40. 【請求項４０】 前記第1の核酸塩基が、アデニン、グアニン、チミン、ウ
    ラシルおよびヒポキサンチンから選択される、請求項３８または３９に記載の使
    用。
  41. 【請求項４１】 前記核酸分子が、発現調節配列に機能的に連結された形で
    組換えベクターに含まれている、請求項３８〜４０のいずれか1項に記載の使用
    。
  42. 【請求項４２】 前記核酸が組換え細胞に含まれている、請求項３８〜４１
    のいずれか1項に記載の使用。
  43. 【請求項４３】 請求項２４に従ってヌクレオシドを調製するための、NdT
    活性を有する単離されたポリペプチドの使用。
  44. 【請求項４４】 デオキシリボースをリン酸化してデオキシリボース5-リン
    酸にするステップを含むデオキシリボヌクレオシドのin vitro酵素的合成法に用
    いる酵素を調製するための、デオキシリボキナーゼ(dRK、EC 2.7.1.5)をコード
    する単離された核酸分子の使用であって、該核酸分子が、(a)配列番号11で示さ
    れるヌクレオチド配列またはその相補的配列、(b)遺伝暗号の縮重の範囲内で(a)
    の配列に対応するヌクレオチド配列、あるいは(c)ストリンジェント条件下で(a)
    および／または(b)の配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む、上記
    使用。
  45. 【請求項４５】 デオキシリボースをリン酸化してデオキシリボース5-リン
    酸にするステップを含むデオキシリボヌクレオシドのin vitro酵素的合成法のた
    めの、dRK活性を有する単離されたポリペプチドの使用。
  46. 【請求項４６】 受託番号I-2186、I-2187、I-2188、I-2189、I-2190および
    I-2191の下でCNCMに寄託された組換え細菌株。
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