JP2017505610A - 電気泳動技術を用いた単一細胞からのrna及びdnaの同時抽出及び分離 - Google Patents
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Abstract
単一細胞からRNA及びDNAを調製するためのデバイス及び方法を開示する。特に、本発明は、電気泳動的に単一細胞からRNA及びDNAを同時に抽出し、核酸を分離する方法に関する。核膜を破壊することなく原形質膜が選択的に破壊されるように、電場を用いて単一標的細胞を破壊する。核の移動度を選択的に低下させる篩いマトリックスの存在下で等速電気泳動(ITP)を行うことにより核から細胞質RNAを分離する。ITP中、細胞質RNAは、リーディング電解質とトレーリング電解質の間のITP界面に蓄積され、後で核DNAが含まれないように抽出することができる。方法は、プロセスの全ステップが完全に自動化されたマイクロ流体デバイス中で行うことができる。【選択図】図1C
Description
本発明は、概して、RNA及びDNAを調製するためのデバイス及び方法に関する。特に、本発明は、選択的細胞溶解(selective cell lysis)及び等速電気泳動を用いて単一細胞からRNA及びDNAを同時に抽出する方法に関する。
単一細胞レベルでのRNA及びDNA分析は、細胞集団内の不均一性(Heterogeneity)を理解するために重要であり、この研究のための新しいツールが登場しつつある(非特許文献1)。マイクロフルイディクスにおける近年の進歩はこの領域を改革し、単一細胞分析のための新たな能力を創出した(非特許文献2)。例えば、非特許文献3は、単一細胞溶解、RNA精製、及び相補的DNA(cDNA)合成を行う一体型マイクロ流体チップを実証した。これ以降、この技術は改良され(非特許文献4)、同様な技術が単一細胞の測定に用いられてきた(非特許文献5)。この技術は現在ではよく確立されているが、特別なシステム(例えば、液体をポンピングする及びバルビングする)を必要とする。更に、RNA量の計量という基本的考えは、RNAのcDNAへの変換、及びその後の定量的ポリメラーゼ連鎖反応(qPCR)等の酵素的プロセスによる増幅に頼っている。このような基本的アプローチは有効であるが、PCRは配列特異的偏りを導入することがよく知られているので(前述の非特許文献1)、最適でないかも知れない。このため、ほとんどの知見はin situでのハイブリダイゼーション又は染色による検証が必要である。
従来の自立型キャピラリー又はオンチップCEのいずれかを用いたキャピラリー電気泳動(CE)法も、単一細胞に由来する分子の取扱い及び分析に用いられてきた(非特許文献6)。しかし、増幅を用いないRNAの直接的検出に焦点を合わせた研究はほとんどない。非特許文献7は、単一細胞からのRNAの直接的測定を実証し、リボソームRNAの電気泳動図を得た。非特許文献7は、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)を用いて分離に用いたのと同じキャピラリー中で細胞溶解を行った。非特許文献7のプロトコールは、CEによりRNAを分離し、臭化エチジウム標識及びレーザー励起蛍光検出を用いてRNAを定量化した。その後の研究で、非特許文献7のグループは、細胞周期の種々の相(G1、S、G2、及びM)におけるRNA発現を調べ、各相にわたるRNAの総量及び個々のRNA配列の変化を報告している(非特許文献8)。彼らのCEの検出限界は単一細胞レベルよりはるかに低かった。しかし、彼らのプロトコールは、RNAの相対量のみを提供するものであり、RNA及びDNAの情報を同時に提供するものではなかった。
Kalisky et al.(2011)Annu.Rev.Genet.45:431−445
Zare et al.(2010)Annu.Rev.Biomed.Eng.12:187−201
Marcus et al.(Analytical Chemistry(2006)78:956−958)
White et al.(2011)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 108:13999−14004
Zhong et al.(2008)Lab on a Chip 8:68−74
Borland et al.(2008)Annu.Rev.Anal.Chem.1:191−227
Han and Lillard(Anal.Chem.(2000)72:4073−4079)
Han & Lillard(2002)Anal.Biochem.302:136−143
従って、単一細胞から全細胞質RNA(total cytoplasmic RNA)及び核DNAを抽出及び測定するより良い方法に対するニーズが残っている。
本発明は、一部、単一細胞からRNA及びDNAを同時に調製するための新規な方法の発見に基づく。特に、この方法は、細胞の原形質膜を選択的に破壊するために電場を利用し、細胞質RNAを核から分離するために等速電気泳動を利用する。
一実施形態では、本発明は、細胞からRNA及びDNAを調製する方法を含み、この方法は:(a)流体チャネル(fluidic channel)中に細胞を単離すること;(b)流体チャネルに電場を印加することにより、核膜を破壊することなく細胞の原形質膜を破壊すること;並びに、(c)下記(i)及び(ii)を用いて、細胞の内容物に対する等速電気泳動(ITP)をおこなうこと、を含む:(i)リーディング電解質(LE)及びトレーリング電解質(TE);細胞質RNAはリーディング電解質−トレーリング電解質界面に濃縮される、並びに(ii)核を遅らせる篩いマトリックス(sieving matrix);この遅れにより、細胞質RNAは細胞の核DNAから分離される。流体チャネルは、キャピラリーチューブ又はマイクロ流体デバイス中のエッチング形成されたチャネル(etched channel)であり得る。一実施形態では、細胞の原形質膜を破壊する両極性電圧パルスを生成することにより流体チャネルに電場が印加される。ITPを行った後、上記方法は、流体チャネルから核を除去すること、LE−TE界面から細胞質RNAを除去すること、及び/又は細胞質RNAから細胞片を除去することを更に含み得る。
別の実施形態では、本発明は、細胞から核RNA及び細胞質RNAを調製する方法を含み、この方法は、(a)流体チャネル中に細胞を単離すること;(b)流体チャネルに電場を印加することにより、核膜を破壊することなく細胞の原形質膜を破壊すること、及び(c)下記(i)及び(ii)を用いて、細胞の内容物に対する等速電気泳動(ITP)を行うこと、を含む:(i)リーディング電解質(LE)及びトレーリング電解質(TE);細胞質RNAはリーディング電解質−トレーリング電解質界面に濃縮される、並びに(ii)核を遅らせる篩いマトリックス;この遅れにより、細胞質RNAは核に含まれる核RNAから分離される。特定の実施形態では、上記方法は、核から核RNAを分離することを更に含む。一実施形態では、(例えばデオキシリボヌクレアーゼを用いて)酵素的にDNAを消化することにより核DNAが除去される。
特定の実施形態では、篩いマトリックスは、ブロックコポリマー、線状ポリマー、又は架橋ポリマーを含む。一実施形態では、篩いマトリックスはポリビニルピロリドン(PVP)を0.2%を超える濃度で含む。一実施形態では、PVPの濃度は約0.4%である。
特定の実施形態では、ITPは、pH4〜10の溶液中のLE及びTEを用いて行われる。一実施形態では、pHは約8.0〜約8.3である。例えば、ITPは、Tris及びHClを含むリーディング電解質(LE)含有溶液、並びにTris及びHEPESを含むトレーリング電解質(TE)含有溶液を用いて行われ得る(実施例1参照)。
別の実施形態では、上記方法は、流体チャネル中の電気浸透流を抑制するための薬剤を加えることを更に含む。電気浸透流を抑制するための薬剤としては、限定されるものではないが、ポリラクタム、置換ポリアクリルアミド誘導体、セルロースの水溶性メチルヒドロキシエチル誘導体、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、及びポリエチレングリコールが含まれる。一実施形態では、ポリラクタムはポリビニルピロリドンである。
別の実施形態では、上記方法は、細胞内と細胞外の媒質間の浸透圧の差を相殺するための浸透圧剤(osmotic agent)を添加することを更に含む。一実施形態では、浸透圧剤はスクロースである。
別の実施形態では、上記方法は核の核膜を破壊することを更に含む。核膜は、任意の化学的、機械的、電気的、又は熱的破壊方法を用いて破壊され得る。
別の実施形態では、上記方法は、RNA又はDNAに検出可能な標識を加えることを更に含む。一実施形態では、検出可能な標識は蛍光色素である。
本発明の方法は、細菌、真菌、植物、原生生物、又は動物を含む任意の原核生物又は真核生物に由来する任意の細胞からDNA及びRNAを調製するために用いることができる。細胞は、組織液又は体液等の細胞を含む生物学的サンプルから得ることができ、例えば、限定されるものではないが、血液、唾液;口腔スワブ検体(buccal swabbing)、糞便、尿、骨髄、髄液、リンパ液、皮膚、器官、及び生検に由来する細胞;又は培養培地中で生育した組換え細胞及び組織を含むインビトロ細胞培養物成分に由来し得る。
本明細書に記載の手法は、単独で用いられてもよく、核酸(例えば、RNA又はDNA)を単離又は精製するための任意の他の方法と組み合わせて用いられてもよい。例えば、個々の核酸を、固体支持体、例えば、限定されるものではないが、吸着ビーズ、磁気ビーズ、若しくはシリカ上での固定化により、又はゲル濾過、逆相、イオン交換、若しくはアフィニティークロマトグラフィーにより、更に精製してよい。または、電場に基づく方法を用いて所望の核酸分子を他の分子から分離することができる。電場に基づく方法の例としては、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、アガロースゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動、及びパルスフィールド電気泳動が含まれる。
別の実施形態では、上記方法は、細胞から抽出された細胞質RNA、核RNA、又は核DNAの量を計量することを更に含む。
別の実施形態では、上記方法は、少なくとも1つのRNA又はDNA分子を増幅することを更に含む。
本明細書に記載の方法は、プロセスの全ステップを完全に自動化したマイクロ流体デバイス中で行うことができる。マイクロ流体デバイスの例の説明については、例えば、実施例1並びに図1A〜1C、3A、及び3Bを参照されたい。一実施形態では、マイクロ流体デバイスは、接合部(junction)で連結された第1の流体チャネル及び第2の流体チャネルを少なくとも備え、各流体チャネルは、第1のリザーバーに連結された第1の末端及び第2のリザーバーに連結された第2の末端を有する。このようなデバイスを用いて、(a)篩いマトリックス及びリーディング電解質を含む溶液を第1のチャネルに充填すること;(b)第1のチャネルの第1のリザーバー中に細胞群を含むサンプルを導入し、第2のチャネルのリザーバーに真空を印加して単一細胞を第1のチャネル中へと移動させることにより、細胞を単離することによって、第1のチャネル中に細胞を単離すること;(c)単一細胞付近に第1のチャネルを通じた電場を印加することにより、核膜を破壊することなく単一細胞の原形質膜を破壊すること;(d)第1のチャネルの第1のリザーバーにトレーリング電解質を添加すること;及び(e)第1のチャネル中の単一細胞の内容物に対して等速電気泳動(ITP)を行うこと、を含む方法により、細胞を含む生物学的サンプルからDNA及びRNAを調製することができる。特定の実施形態では、上記方法は、デバイス中の別個の位置に核及び細胞質RNAを到達させることを更に含む。例えば、核及び細胞質RNAは、デバイス内の別個のリザーバー又はチャネルに分配され得る。一実施形態では、デバイスの第1の流体チャネルは、少なくとも1つのチャネル分岐点で2つ以上のチャネルに分かれており、核及び細胞質RNAが別個のチャネルに分配される。更に、細胞の内容物(例えば、核酸、タンパク質、脂質、小分子等)が、種々の別個のチャネル又はリザーバーへと更に分画及び分配されてもよい。
当業者は、本明細書の開示に鑑みて、本発明のこれら及び他の実施形態を容易に思いつくであろう。
本発明の実施には、特に断りのない限り、当該技術分野の技能に含まれる化学、生化学、細胞生物学、分子生物学、及び組換えDNA技術の従来の方法が用いられる。このような技術は文献に充分に説明されている。例えば、single Cell Analysis:Technologies and Applications(D. Anselmettied.,Wiley−Blackwell,2009);T.K.Khurana On−chip isotachophoresis assays for high sensitivity electrophoretic preconcentration,separation, and indirect detection(ProQuest,UMI Dissertation publishing, 2011);F.M.Everaerts,J.L.Beckers Isotachophoresis Theory,Instrumentation and Applications(Journal of chromatography library,Volume 6,Elsevier Science Ltd.,1976);A.L.Lehninger,Biochemistry(Worth Publishers,Inc.,current addition);Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(3rd Edition,2001);RNA:Methods and Protocols(Methods in Molecular Biology,edited by H.Nielsen,Humana Press,1st edition,2010);Rio et al.RNA:A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press;1st edition,2010);Farrell RNA Methodologies:Laboratory Guide for Isolation and Characterization(Academic Press;4th edition,2009);Methods In Enzymology(S.Colowick and N.Kaplan eds.,Academic Press,Inc.)参照。
前述又は後述に関わらず、本明細書に引用される全ての刊行物、特許、及び特許出願の全体を参照により援用する。
I.定義
本発明の説明において、以下の用語を使用し、これらの用語は以下に示すように定義されるものとする。
本発明の説明において、以下の用語を使用し、これらの用語は以下に示すように定義されるものとする。
単数形は、本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用される場合、文脈中で明白に単数でないと記載がない限り、複数の指示物を包含することに留意しなければならない。従って、例えば「RNA(an RNA)」への言及は、2つ以上のRNA分子の混合物等を含む。
本明細書において使用される場合、「生物学的サンプル」という用語は、細菌、真菌、原生生物、植物、及び動物に由来する細胞等の、原核生物又は真核生物に由来する任意の細胞、組織又は当該細胞を含む体液を含む。生物学的サンプルには、組織又は体液に由来する細胞、例えば、限定されるものではないが、血液、唾液、口腔スワブ検体により得られる細胞、糞便、尿、骨髄、髄液、リンパ液、皮膚、器官、及び生検が含まれ、並びに培養培地中で生育した組換え細胞及び組織を含むインビトロ細胞培養成分が含まれ得る。
「電気浸透流」という用語は、多孔性材料、キャピラリーチューブ、マイクロチャネル、又は他の流路(fluid conduit)にかかる印加電位によって誘導される液体の動きを指す。
特に所与の量に関連して「約」という用語は、プラス又はマイナス5パーセントの偏差を包含することが意図されている。
特に所与の量に関連して「約」という用語は、プラス又はマイナス5パーセントの偏差を包含することが意図されている。
II.発明を実施するための形態
本発明を詳細に説明する前に、本発明は、特定の調合物(formulation)又はプロセスパラメーターに限定されず、改変され得ると理解されるべきである。更に、本明細書で使用される用語は、発明の特定の実施形態を説明することのみを目的とし、限定することを意図していないと理解されるべきである。
本発明を詳細に説明する前に、本発明は、特定の調合物(formulation)又はプロセスパラメーターに限定されず、改変され得ると理解されるべきである。更に、本明細書で使用される用語は、発明の特定の実施形態を説明することのみを目的とし、限定することを意図していないと理解されるべきである。
本明細書に記載のものと同様又は同等な様々な方法及び材料が本発明の実施に使用され得るが、好ましい材料及び方法は本明細書に記載されている。
本発明は、単一細胞からRNA及びDNAを同時に調製するための新規な方法の発見に基づく。特に、単一細胞をサンプルから単離し、電場を用いて細胞を破壊し、その結果、核膜を破壊することなく原形質膜が選択的に破壊される。核の移動度を選択的に低下する篩いマトリックスの存在下で等速電気泳動(ITP)を行うことにより、核から細胞質RNAが分離される。ITP中、細胞質RNAは、リーディング電解質とトレーリング電解質との間のITP界面に蓄積し、後で、核DNAを含まないように抽出することができる。この方法は、プロセスの全ステップが完全に自動化されたマイクロ流体デバイス中で行うことができる(実施例1参照)。
本発明の理解を促進するために、この新規なRNA及びDNAの調製方法に関して以下により具体的に説明する。
本発明の等速電気泳動法は、単一細胞からのDNA及びRNAの同時抽出に用いられる。最初に、単一細胞が流体チャネル中に単離される。単一細胞は、サンプルを適切に希釈し、流体チャネル中に低単離体積で細胞をインジェクトすることにより、他の細胞を含む生物学的サンプルから単離することができる。細胞は、チャネル中に細胞を引っ張りこむために圧力又は真空を印加する等の任意の好適な手段によってチャネル中へと移動させることができる。次に、細胞付近にチャネルを通じた電場を印加して、核膜を破壊することなく原形質膜を選択的に破壊する。実施例1に記載されているように、電場は、細胞の原形質膜を選択的に破壊する両極性電圧パルスを生成することにより流体チャネルに印加され得る。その後、TE−LE界面に細胞質RNAが集中するように選択されるトレーリング電解質及びリーディング電解質を用いて細胞の内容物に対してITPを行う。好ましくは、TE及びLEは、混入種(例えば、破壊した細胞膜、タンパク質等)がトレーリングイオンより小さい又はリーディングイオンより大きい電気泳動移動度を有し、且つ細胞質RNAと一緒にTE−LE界面に集中しないように選択される。細胞質RNAを核から分離するために、核を遅らせ、核がTE−LE界面に集中することを防ぐ篩いマトリックスの存在下でITPを行う。ITP後、核及び細胞質RNAは流体チャネルから別個に除去することができ、所望であれば下流での用途(downstream applications)のために更に処理することができる。
方法のバリエーションにおいて、単一細胞から核RNA及び細胞質RNAを同時に抽出するために等速電気泳動が用いられる。同様に、流体チャネル中に細胞が単離され、流体チャネルに電場が印加されることにより、核膜を破壊することなく細胞の原形質膜が破壊される。核を遅らせる篩いマトリックスの存在下で細胞の内容物に対して等速電気泳動を行うことにより、核に含まれる核RNAから細胞質RNAが分離される。特定の実施形態では、上記方法は、核から核RNAを分離することを更に含む。例えば酵素的に(例えばデオキシリボヌクレアーゼを用いて)DNAを消化することにより、核DNAを核RNAから除去することができる。
本発明の方法は、細菌、真菌、植物、原生生物、又は動物を含む任意の原核生物又は真核生物に由来する任意の細胞から、DNA及びRNAを調製するために用いることができる。細胞は、細胞を含む生物学的サンプル、例えば組織又は体液から得ることができ、例えば、限定されるものではないが、血液、唾液、口腔スワブ検体から得られる細胞、糞便、尿、骨髄、髄液、リンパ液、皮膚、器官、及び生検;又は培養培地中で生育した組換え細胞及び組織を含むインビトロ細胞培養成分に由来し得る。上記方法は、生細胞又は固定細胞に適用することができる。
特定の実施形態では、流体チャネルは、マイクロ流体デバイス中又はキャピラリーチューブ中のエッチング形成されたチャネルである。チャネルは、シリケート又はボロシリケート等の非導電性材料で構成され得る。チャネルは、電気浸透流抑制のため、又はその他の有益な流れ改変効果のために処理されていてもよい。例えば、チャネルは、シラン処理剤(silanizing agent)、アルコール、酸、又は水を含む1又は複数の薬剤で前処理され得る。
本明細書に記載の方法は、プロセスの全ステップが完全に自動化されているマイクロ流体デバイス中で行うことができる。交差形状で形成された複数のマイクロチャネルを備えた例示的なマイクロ流体デバイスが実施例1に記載されている(図1A〜図1C、図3A、及び図3B参照)。一実施形態では、本発明は、接合部130で連結された第1の流体チャネル110及び第2の流体チャネル120を少なくとも備えるマイクロ流体デバイス100を含み、ここで、各流体チャネルは第1のリザーバーに連結された第1の末端及び第2のリザーバーに連結された第2の末端を有する(Nリザーバー140及びSリザーバー150が第1の流体チャネル110に連結され、Wリザーバー160及びEリザーバー170が第2の流体チャネル120に連結された、4個のリザーバーを備えたこのようなデバイスの模式図を示す図3A参照)。チャネルを通じた電場を印加するために電圧源180をデバイスに連結することができる。
特定の実施形態では、マイクロ流体デバイスは、デバイス中の別個の位置への核及び細胞質RNAの送達を可能にするようにデザインされている。一実施形態では、核と細胞質RNAとが等速電気泳動的に分離される流体チャネルは、1又は複数のチャネル分岐点を備え、ここでチャネルが2つ以上のチャネルに分かれ、核と細胞質RNAとが別個のチャネルに分配されることを可能にする。更に、デバイスは、細胞の他の成分(例えば、核RNA、タンパク質、脂質、小分子等)を別個のチャネル又はリザーバーへと分画及び分配することを可能にするための1又は複数の追加的なチャネル又はリザーバーを備えてよい。
このようなデバイスを用いて、(a)篩いマトリックス及びリーディング電解質を含む溶液を第1のチャネルに充填すること;(b)第1のチャネルの第1のリザーバー中に細胞群を含むサンプルを導入し、第2のチャネルのリザーバーに真空を印加して単一細胞を第1のチャネル中へと移動させることにより細胞を単離することによって、第1のチャネル中に細胞を単離すること;(c)単一細胞付近に第1のチャネルを通じた電場を印加することにより、核膜を破壊することなく単一細胞の原形質膜を破壊すること;(d)第1のチャネルの第1のリザーバーにトレーリング電解質を添加すること;及び(e)第1のチャネル中の単一細胞の内容物に対して等速電気泳動(ITP)を行うこと、を含む方法により、細胞を含む生物学的サンプルからDNA及びRNAが調製され得る。特定の実施形態では、上記方法は、デバイス中の別個の位置に核及び細胞質RNAを到達させることを更に含む。例えば、核及び細胞質RNAは、デバイス内の別個のリザーバー又はチャネルに分配され得る。一実施形態では、デバイスの第1の流体チャネルは、少なくとも1つのチャネル分岐点で2つ以上のチャネルに分かれ、ここで核と細胞質RNAとは別個のチャネルに分配される。更に、細胞の内容物(例えば、核酸、タンパク質、脂質、小分子等)が、種々の別個のチャネル又はリザーバーに更に分画及び分配され得る。
特定の実施形態では、pH4〜10のLE及びTEを含む溶液を用いてITPを行う。電解質としては、限定されるものではないが、LEとしての塩素イオン及びTEとしての6−アミノカプロン酸;LEとしてのTris及びHCl並びにTEとしてのTris及びHEPES;LEとしての6−アミノカプロン酸及びHCl並びにTEとしての6−アミノカプロン酸及びカプロン酸、又はBis−Tris及びジヒドロキシ安息香酸;並びにLEとしてのTris−HCl及びTEとしてのグリシン又はTRIS−グリシンが含まれ得る。イオン及びバッファーの濃度は適切な有効移動度が得られるように調整され得る。LE及びTE溶液の例としては、50mM Tris及び25mM HClを含むpH8.1のLE溶液、並びに50mM Tris及び25mM HEPESを含むpH8.3のTE溶液が挙げられる(実施例1参照)。
破壊により生じた核及び細胞片から細胞質RNAを分離するために篩いマトリックスの存在下でITPを行う。特定の実施形態では、篩いマトリックスは、ブロックコポリマー、線状ポリマー、又は架橋ポリマーを含む。共有結合により連結された2以上のホモポリマーサブユニットを含むブロックコポリマーが用いられ得る。あるいは、ホモポリマーサブユニットは、接続ブロック(junction block)として知られる介在非繰り返しサブユニットによって連結されていてもよい。ジブロックコポリマー及びトリブロックコポリマーを含むブロックコポリマーが用いられ得る。篩いマトリックスは、単一主鎖からなる線状コポリマー、又は1若しくは複数のポリマー側鎖を有する主鎖からなる分岐コポリマーを含み得る。イソプレン及びスチレンを含む複数の異なるモノマーがブロックコポリマーの調製における使用に知られている。好適な篩いポリマーとしては、線状低分子量ポリアクリルアミド又は低分子量ポリ(エチレンオキシド)(PEO)等の親水性ポリマーが挙げられる。特に、0.2%を超える濃度のポリビニルピロリドン(PVP)を含む篩いマトリックスが核の泳動を遅らせるのに有効であることが見出された(実施例1参照)。一実施形態では、篩いマトリックスはPVPを約0.4%の濃度で含む。
更に、電気浸透流を抑制するための薬剤を流体チャネルに加えてもよい。電気浸透流を抑制するための薬剤としては、限定されるものではないが、ポリラクタム(例えば、ポリビニルピロリドン)、置換ポリアクリルアミド誘導体、セルロースの水溶性メチルヒドロキシエチル誘導体、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、及びポリエチレングリコールが含まれる。
細胞内の媒質と細胞外の媒質と間の浸透圧の差を相殺するため、破壊前の細胞生存率を保つため、及び破壊後の核を損傷をうけていない状態に維持するために、浸透圧剤(例えば、スクロース)を更に加えてもよい。
ITPを行った後、DNA及び/又は核RNAを含む核の内容物を抽出するために、核の核膜を別個に破壊してもよい。核膜は、任意の化学的、機械的、電気的、又は熱的破壊法を用いて破壊され得る。一般的に用いられる方法としては、凍結融解サイクル;超音波処理;エレクトロポレーション;圧力;酵素的破壊;又は例えば乳鉢及び乳棒を用いた(典型的には洗剤又は液体N2の存在下で)又はビーズ式破砕機(bead beater)若しくは回転羽根を用いた粉砕による機械的破壊が挙げられる。化学的破壊剤の例としては、洗剤及び界面活性剤(例えば、Triton−X−100、Igepal CA−630、及びドデシル硫酸ナトリウム)、並びにポリアニオン(例えば、ヘパリン)が挙げられる。更に、酵素的又は化学的方法を、混入核成分(例えば、タンパク質、RNA、又はその他の巨大分子)を除去するために用いてもよい。例えば、DNAを単離する場合、混入RNAを除去するためにRNAヌクレアーゼを使用することができ;核RNAを単離する場合、混入DNAを除去するためにDNAヌクレアーゼを使用することができ;混入タンパク質を除去するためにプロテアーゼを使用することができる。ヌクレアーゼ阻害剤を用いて核酸の分解を防いでもよい。
所望であれば、核と細胞質RNAとの分離後、当該技術分野で周知の方法を用いて特定の目的のために個々の核酸分子(例えば、RNA又はDNA)を単離又は精製してもよい。例えば、シリカ、吸着ビーズ(例えば、オリゴ(dT)被服ビーズ、又はポリスチレン−ラテックス、ガラス繊維、セルロース、若しくはシリカから成るビーズ)、磁気ビーズ等の固体支持体上での固定化により、又は逆相、ゲル濾過、イオン交換、若しくはアフィニティークロマトグラフィーにより、核酸を精製してもよい。また、フェノール−クロロホルム抽出又はアルコール沈殿等の従来の方法により、核酸を懸濁液から単離することもできる。あるいは、電場に基づく方法を用いて、所望のRNA又はDNA分子をその他の分子から分離することができる。電場に基づく方法の例としては、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、アガロースゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動、及びパルスフィールド電気泳動が挙げられる。例えば、全体を参照により本明細書に援用する以下の文献を参照:Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(3rd Edition,2001);RNA:Methods and Protocols(Methods in Molecular Biology,edited by H.Nielsen,Humana Press,1st edition,2010);Rio et al. RNA:A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press;1st edition,2010);Farrell RNA Methodologies:Laboratory Guide for Isolation and Characterization(Academic Press;4th edition,2009);Zahringer(2012)Lab Times(2−2012):52−63;Garcia−Schwarz et al.(2012)Journal of Visualized Experiments 61:e3890;Hagan et al.(2009)Anal Chem.81(13):5249−5256; Righetti(2005)J.Chromatogr.A10 79(1−2):24−40;Gebaueret al.(2011)Electrophoresis 32(1):83−89。
本発明の方法は、単一細胞に由来するRNA及びDNAの絶対的計量(absolute quantification)及び分析に用いることができる。分離後、本明細書に記載の方法によって調製されたRNA及びDNA分子は、種々の目的、限定されるものではないが例えばシークエンシング、PCR、ライゲーション、トランスクリプトーム分析、マイクロアレイ分析、ノーザン分析、及びライブラリー構築に用いることができる。
III.実験
本発明を実施するための具体的実施形態の例を以下に示す。例は説明のみを目的として提供するものであり、決して本発明の範囲を限定することを意図しない。
本発明を実施するための具体的実施形態の例を以下に示す。例は説明のみを目的として提供するものであり、決して本発明の範囲を限定することを意図しない。
使用される数(例えば、量、温度等)に関して正確さが確保されるように努力したが、当然、いくらかの実験的誤差及び偏差が考慮されるべきである。
実施例1:単一細胞に由来するRNA及びDNAのオンチップ分離及び分析
単一細胞レベルでRNA及びDNAを同時に分析するための、電気泳動技術を用いて単一細胞からRNA及びDNAを抽出する技術を記載する。オンチップ電気破壊と等速電気泳動(ITP)との組合せを用いて単一生細胞を単離する。細胞を破壊し、全細胞質RNA及び核DNAを個々に抽出、濃縮、及び測定し、これらの全てが5分以内に行われる。ITP界面中へRNAを集中させることによりプロセスを分散に対して強く(robust)し、キャピラリー電気泳動(CE)及びcDNAハイブリダイゼーションに基づくアッセイ(Bahga et al.(2011)Anal.Chem.83:6154−6162;Eid et al.(2013)Analyst 138:3117−3120;及びGarcia−Schwarz & Santiago(2013)Angew.Chem.Int.Ed.Engl.52(44):11534−11537)等の下流分析との統合に適合する。
単一細胞レベルでRNA及びDNAを同時に分析するための、電気泳動技術を用いて単一細胞からRNA及びDNAを抽出する技術を記載する。オンチップ電気破壊と等速電気泳動(ITP)との組合せを用いて単一生細胞を単離する。細胞を破壊し、全細胞質RNA及び核DNAを個々に抽出、濃縮、及び測定し、これらの全てが5分以内に行われる。ITP界面中へRNAを集中させることによりプロセスを分散に対して強く(robust)し、キャピラリー電気泳動(CE)及びcDNAハイブリダイゼーションに基づくアッセイ(Bahga et al.(2011)Anal.Chem.83:6154−6162;Eid et al.(2013)Analyst 138:3117−3120;及びGarcia−Schwarz & Santiago(2013)Angew.Chem.Int.Ed.Engl.52(44):11534−11537)等の下流分析との統合に適合する。
方法
ITP化学
リーディング電解質(LE)は、0.4%ポリ(ビニルピロリドン)(PVP)及び1×SYBR Green IIを含む50mM Tris及び25mM HClとした(計算上のpH=8.1)。トレーリング電解質(TE)は、0.4%ポリ(ビニルピロリドン)(PVP)を含む50mM Tris及び25mM HEPESとした(最初の計算上のpH=8.3)。電気浸透流を抑制するため及びPVPの篩い効果により細胞片から抽出RNAを分離するためにPVPを含めた(適切なPVP濃度の選択についてはSIセクションS−2を参照)。Tris、HEPES、及びHClはシグマ アルドリッチ社(セントルイス、ミズーリ州)から、SYBR Green IIはインビトロジェン社(カールズバッド、カリフォルニア州)から、PVP(MW 1MDa)をアクロスオーガニック社(ACROS Organics;サーモフィッシャーサイエンティフィック社、ニュージャージー州)から入手した。全ての溶液はUltraPure DNase/RNaseフリー脱イオン(DI)水(ギブコインビトロジェン社、カールズバッド、カリフォルニア州)で調製した。
ITP化学
リーディング電解質(LE)は、0.4%ポリ(ビニルピロリドン)(PVP)及び1×SYBR Green IIを含む50mM Tris及び25mM HClとした(計算上のpH=8.1)。トレーリング電解質(TE)は、0.4%ポリ(ビニルピロリドン)(PVP)を含む50mM Tris及び25mM HEPESとした(最初の計算上のpH=8.3)。電気浸透流を抑制するため及びPVPの篩い効果により細胞片から抽出RNAを分離するためにPVPを含めた(適切なPVP濃度の選択についてはSIセクションS−2を参照)。Tris、HEPES、及びHClはシグマ アルドリッチ社(セントルイス、ミズーリ州)から、SYBR Green IIはインビトロジェン社(カールズバッド、カリフォルニア州)から、PVP(MW 1MDa)をアクロスオーガニック社(ACROS Organics;サーモフィッシャーサイエンティフィック社、ニュージャージー州)から入手した。全ての溶液はUltraPure DNase/RNaseフリー脱イオン(DI)水(ギブコインビトロジェン社、カールズバッド、カリフォルニア州)で調製した。
細胞調製
10%ウシ胎仔血清(ギブコ社)及び1%ペニシリン−ストレプトマイシン−グルタミン(ギブコ社)を含むRPMI−1640培地(ギブコ社)中で、37℃、5%CO2にてA20細胞系(マウスリンパ球細胞)を培養した。上記細胞をリン酸緩衝食塩水で1回洗浄し、50mM Tris、25mM HEPES、及び175mMスクロースを含むサンプルバッファー溶液に約5細胞/μLの濃度で懸濁し、実験まで氷上で保存した。サンプルバッファーに175mMスクロースを加えたのは、浸透圧を相殺するため、及び破壊まで細胞生存率を保つためである。少なくとも3時間はサンプルバッファーが細胞生存率に有意な悪影響を与えないことを確認した(図4参照)。全てのケースにおいて、調製した細胞サンプルは3時間以内に用いた。
10%ウシ胎仔血清(ギブコ社)及び1%ペニシリン−ストレプトマイシン−グルタミン(ギブコ社)を含むRPMI−1640培地(ギブコ社)中で、37℃、5%CO2にてA20細胞系(マウスリンパ球細胞)を培養した。上記細胞をリン酸緩衝食塩水で1回洗浄し、50mM Tris、25mM HEPES、及び175mMスクロースを含むサンプルバッファー溶液に約5細胞/μLの濃度で懸濁し、実験まで氷上で保存した。サンプルバッファーに175mMスクロースを加えたのは、浸透圧を相殺するため、及び破壊まで細胞生存率を保つためである。少なくとも3時間はサンプルバッファーが細胞生存率に有意な悪影響を与えないことを確認した(図4参照)。全てのケースにおいて、調製した細胞サンプルは3時間以内に用いた。
チャネル調製
図3Aは、マイクロ流体チップの形状を示す図である。各実験の前に、E及びSリザーバーに充填し、シングルスプリット真空ライン(single split vacuum line)を用いてN及びWリザーバーに真空を印加することにより、マイクロチャネルを予め調整した。以下の洗浄化学を用いた:1M NaOHで10分、脱イオン(DI)水で3分、その後、W及びNリザーバーに真空を印加することにより1分間乾燥。その後、E及びSリザーバーにLE溶液を充填し、マイクロチャネルに充填するために約1.5分間N及びWリザーバーに真空を印加した。真空ラインを用いてN及びWリザーバーを空にし、細胞を含むサンプル溶液2μLをWリザーバー中に、TE溶液20μLをNリザーバー中にピペッティングした。その後、インジェクションチャネル中に単一細胞を単離するためにSリザーバーに真空を印加した。インジェクションチャネル中に単一細胞を単離した後、真空を解除し、すぐに20μLのTE溶液をWリザーバーに入れた。
図3Aは、マイクロ流体チップの形状を示す図である。各実験の前に、E及びSリザーバーに充填し、シングルスプリット真空ライン(single split vacuum line)を用いてN及びWリザーバーに真空を印加することにより、マイクロチャネルを予め調整した。以下の洗浄化学を用いた:1M NaOHで10分、脱イオン(DI)水で3分、その後、W及びNリザーバーに真空を印加することにより1分間乾燥。その後、E及びSリザーバーにLE溶液を充填し、マイクロチャネルに充填するために約1.5分間N及びWリザーバーに真空を印加した。真空ラインを用いてN及びWリザーバーを空にし、細胞を含むサンプル溶液2μLをWリザーバー中に、TE溶液20μLをNリザーバー中にピペッティングした。その後、インジェクションチャネル中に単一細胞を単離するためにSリザーバーに真空を印加した。インジェクションチャネル中に単一細胞を単離した後、真空を解除し、すぐに20μLのTE溶液をWリザーバーに入れた。
可視化
20X(UPlanFl)、青色LED(LEDC7、Thor Laboratories社、ニュートン、ニュージャージー州);フィルターキューブ(XF23、オメガオプティカル社(Omega optical)、バーモント州);及び0.6x縮小レンズ(TV Lens C−0.6x、ニコン社)を備えた倒立落射蛍光顕微鏡(Eclipse TS100、ニコン社)を用いて抽出RNAのオンチップ可視化を行った。CCDカメラ(MicroMAX−1300Y、プリンストン・インスツルメンツ社)を用いて、100ms(ミリ秒)の露出時間及び2×2のビニングで画像を得た。
20X(UPlanFl)、青色LED(LEDC7、Thor Laboratories社、ニュートン、ニュージャージー州);フィルターキューブ(XF23、オメガオプティカル社(Omega optical)、バーモント州);及び0.6x縮小レンズ(TV Lens C−0.6x、ニコン社)を備えた倒立落射蛍光顕微鏡(Eclipse TS100、ニコン社)を用いて抽出RNAのオンチップ可視化を行った。CCDカメラ(MicroMAX−1300Y、プリンストン・インスツルメンツ社)を用いて、100ms(ミリ秒)の露出時間及び2×2のビニングで画像を得た。
細胞の電気破壊
Sリザーバーに真空を印加することにより、Wリザーバーから、Wリザーバーと交差部との間のインジェクションチャネル中に単一細胞を導入した。インジェクションチャネルの長さは7.38mmである。Nリザーバーと交差部との間の長さは3.925mmである。NリザーバーとWリザーバーとの間の比較的短い長さを利用して、NとWの間に両極性電圧パルスを印加して高く強い電場を付与した。インジェクションチャネル中の単離した単一細胞を10ms以内に電気的及び選択的に破壊した(細胞破壊プロセスのハイスピード観察についてはマルチメディアSI参照)。
Sリザーバーに真空を印加することにより、Wリザーバーから、Wリザーバーと交差部との間のインジェクションチャネル中に単一細胞を導入した。インジェクションチャネルの長さは7.38mmである。Nリザーバーと交差部との間の長さは3.925mmである。NリザーバーとWリザーバーとの間の比較的短い長さを利用して、NとWの間に両極性電圧パルスを印加して高く強い電場を付与した。インジェクションチャネル中の単離した単一細胞を10ms以内に電気的及び選択的に破壊した(細胞破壊プロセスのハイスピード観察についてはマルチメディアSI参照)。
FACS分析のプロトコール
70%エタノールにより約23℃で16時間、A20細胞を固定した。固定した細胞を1回洗浄し、Hoechst 33342(20μg/ml、シグマ アルドリッチ社)を含むHBSS及び2%FBSを用いて37℃で45分間染色した。その後、ピロニンY(1μg/ml、シグマ アルドリッチ社)を染色液に加え、細胞を37℃で15分間インキュベートした。スタンフォード共用FACS施設のLSR−II−UVフローサイトメーター(BDバイオサイエンス社)により全サンプルを分析した。
70%エタノールにより約23℃で16時間、A20細胞を固定した。固定した細胞を1回洗浄し、Hoechst 33342(20μg/ml、シグマ アルドリッチ社)を含むHBSS及び2%FBSを用いて37℃で45分間染色した。その後、ピロニンY(1μg/ml、シグマ アルドリッチ社)を染色液に加え、細胞を37℃で15分間インキュベートした。スタンフォード共用FACS施設のLSR−II−UVフローサイトメーター(BDバイオサイエンス社)により全サンプルを分析した。
補足方法
S−1.単一細胞の電気破壊
オンチップ電気破壊は、675Vcm−1のDCオフセット、75Hz及び900Vcm−1のAC電場を用いてMacClain et al.(Anal.Chem.(2003)75:5646−5655)によって最初に実証された。種々のオンチップ電気破壊がある。例えば、Gao et al.(Lab on a Chip(2004)4:47−52)及びMunce et al.(Anal.Chem.(2004)76:4983−4989)ではそれぞれ、高pHバッファー(pH=9.2)及び細胞捕捉微小構造によって誘発される機械的剪断の補助を用いて、比較的低いDC電場での電気細胞破壊が実証された。これらの研究では、細胞浸透圧を相殺するために高い塩濃度(100mMオーダー)の食塩水ベースのバッファーが用いられた。今回、本発明者らは、ITPに適合する細胞破壊バッファーを実現しつつオスモル濃度を上げるためにスクロースを用いたITP化学を提供する(図4参照)。
S−1.単一細胞の電気破壊
オンチップ電気破壊は、675Vcm−1のDCオフセット、75Hz及び900Vcm−1のAC電場を用いてMacClain et al.(Anal.Chem.(2003)75:5646−5655)によって最初に実証された。種々のオンチップ電気破壊がある。例えば、Gao et al.(Lab on a Chip(2004)4:47−52)及びMunce et al.(Anal.Chem.(2004)76:4983−4989)ではそれぞれ、高pHバッファー(pH=9.2)及び細胞捕捉微小構造によって誘発される機械的剪断の補助を用いて、比較的低いDC電場での電気細胞破壊が実証された。これらの研究では、細胞浸透圧を相殺するために高い塩濃度(100mMオーダー)の食塩水ベースのバッファーが用いられた。今回、本発明者らは、ITPに適合する細胞破壊バッファーを実現しつつオスモル濃度を上げるためにスクロースを用いたITP化学を提供する(図4参照)。
図3Bは、ITPの前に行われる電気破壊のための電圧シーケンスを示す。本発明者らは、各々の持続時間が100msの2つの個々のパルスを有する両極性パルスを用いた。パルスの両極的性質は、破壊中の細胞の移動を最小限に抑えるのに役立ち、これは破壊を可視化するのを助けた。その後すぐに、ITPを開始するため及び破壊細胞からRNAを抽出するために、電圧VW及びVNをDC電圧に切り替えることにより電位を印加した。
図1Dを実証するために、カルセイン(Calcein AM 8011、Biotium,Inc)で染めた細胞を用いて膜透過性を可視化した(図4も参照)。どちらの細胞も最初、カルセインによる蛍光を示した。パルス電場に晒された細胞(細胞1)は、細胞膜の破壊と一致して、その後のフレーム中で蛍光を急速に失った。対照的に、電場外のチャネル分岐部に位置した細胞(接合部とSリザーバーの間の細胞2)は蛍光を維持し、無傷のままであった。この選択的破壊は、非標的細胞からの混入を避けるために重要であった。
本発明者らは、高速カメラ(Phantom Micro−4M、ビジョンリサーチ社(Vision Research))を用いて単一細胞の電気破壊の高速時間分解イメージングを行った。これらの画像は、10ms以内に細胞膜が破壊されることを示した(高フレームレート動画についてはマルチメディアSI参照)。本発明者らは、インジェクションチャネル中の電場を270kV/mと推定した。従って、細胞の特徴的な直径14μmから、細胞膜に誘導された電位は約3Vオーダーであったと推定した。これは典型的な細胞膜の破壊電圧である約1Vと比べて充分高かった。
S−2.RNAを単離するためのPVP濃度の選択
全ての単一細胞実験において2つの(蛍光)核酸領域を観察した。第1の領域は、ITP界面に常に集中する高移動度ゾーンであった。本発明者らは、これは全細胞質RNAに起因すると考える。第2の領域は、およそ8μm及び10μmの特徴的な長軸半径及び短軸半径を有するほぼ楕円体であった(図1F参照)。第2の領域は、約0.2%以下のPVP濃度でのみITP界面に集中した。より高いPVP濃度では、第2の領域は決してITP界面に集中しなかった。本発明者らは、第2の領域は細胞核に起因すると考える。一連の予備実験の後、本発明者らは、PVP濃度が0.4%であると、細胞核がITP界面に一緒に集中することがないように細胞核の動きが充分に且つ繰り返し停止される、と決定した。低PVT及び高PVPでの分離及び集中の可視化を含む更なる情報についてはマルチメディアSIを参照されたい。
全ての単一細胞実験において2つの(蛍光)核酸領域を観察した。第1の領域は、ITP界面に常に集中する高移動度ゾーンであった。本発明者らは、これは全細胞質RNAに起因すると考える。第2の領域は、およそ8μm及び10μmの特徴的な長軸半径及び短軸半径を有するほぼ楕円体であった(図1F参照)。第2の領域は、約0.2%以下のPVP濃度でのみITP界面に集中した。より高いPVP濃度では、第2の領域は決してITP界面に集中しなかった。本発明者らは、第2の領域は細胞核に起因すると考える。一連の予備実験の後、本発明者らは、PVP濃度が0.4%であると、細胞核がITP界面に一緒に集中することがないように細胞核の動きが充分に且つ繰り返し停止される、と決定した。低PVT及び高PVPでの分離及び集中の可視化を含む更なる情報についてはマルチメディアSIを参照されたい。
本発明者らは、Hoechst 33342色素(B2261、シグマ アルドリッチ社;RNAではなくDNAに選択的)を用いた及びRNase(RNase A、キアゲン社)を用いた一連の実験により、2つの蛍光領域を細胞核及び全細胞質RNAに起因するとした本発明者らの推定を確認した。第1に、Hoechst 33342(RNaseは不使用)を用いた実験により、細胞核は有意な蛍光強度を示すが、ITP界面は陰性対照と比べて無視可能な蛍光しか示さないことが明らかになった(図5参照)。これは当然、細胞核がDNAを常に含むことと合致し、DNAはITP界面に集中していなかった。第2に、LE中に混合したRNaseを用いて行った実験を示す(図6参照)。RNaseを用いた場合、ITP集中ゾーンのシグナルは陰性対照のオーダーの値まで減少した(シグナル・ノイズ比、SNR=0.4オーダー)。これらの観察結果は、本発明者らの方法が、細胞核を後ろに残しつつ、ITPで細胞質RNAを集中させる、という結論を支持する。本発明者らによる細胞核対RNAの同定は、重ねた透過光及び蛍光の視覚化の使用を含む破壊前後の細胞形態の本発明者らの観察とも一致した。
S−3.実験較正曲線の作製
本発明者らは、RNA質量の絶対的計量のための較正曲線を構築するためにスパイク合成RNAを用いた一連のITP実験を用いた。本発明者らの較正プロセスは、Persat et al.(Anal.Chem.(2009)81:9507−9511;その全体を参照により本明細書に援用する)が用いたものと同様であった。本発明者らは、細胞実験と同じ条件及び溶液を用い、既知の濃度のRNAラダー(0.5〜10Kb RNA Ladder、インビトロジェン社)でスパイクした。Wリザーバーに2μLのサンプル溶液を加え、Sリザーバーに真空を印加することによってこれをインジェクションチャネル中にインジェクトした。Wリザーバー中の分注されたサンプル溶液の全部をマイクロチャネル中へとインジェクトし、その後、Sリザーバーから真空を解除し、Wリザーバー中にTE溶液を分注した。この方法により、本発明者らは、インジェクションチャネル中の溶液の12nLをサンプル溶液と交換した。その後、W、N、及びEリザーバーに電極を挿入し、ITP界面にRNAを集中させるためにITPプロセスを開始した。本発明者らは、ITPピークSNRを計量し、図7Aに示す較正曲線を構築した。データの平均で標準化した標準偏差は約12%であった。本発明者らは、この変動の少なくとも一部はピペッティング及び吸引を含む流体取扱いにおける誤差に起因すると考える。実線は、係数R2=0.98の線形回帰を示している。本発明者らは、この較正曲線を用いて、積分蛍光シグナルと絶対RNA量を0〜60pgの範囲で関係付けた。
本発明者らは、RNA質量の絶対的計量のための較正曲線を構築するためにスパイク合成RNAを用いた一連のITP実験を用いた。本発明者らの較正プロセスは、Persat et al.(Anal.Chem.(2009)81:9507−9511;その全体を参照により本明細書に援用する)が用いたものと同様であった。本発明者らは、細胞実験と同じ条件及び溶液を用い、既知の濃度のRNAラダー(0.5〜10Kb RNA Ladder、インビトロジェン社)でスパイクした。Wリザーバーに2μLのサンプル溶液を加え、Sリザーバーに真空を印加することによってこれをインジェクションチャネル中にインジェクトした。Wリザーバー中の分注されたサンプル溶液の全部をマイクロチャネル中へとインジェクトし、その後、Sリザーバーから真空を解除し、Wリザーバー中にTE溶液を分注した。この方法により、本発明者らは、インジェクションチャネル中の溶液の12nLをサンプル溶液と交換した。その後、W、N、及びEリザーバーに電極を挿入し、ITP界面にRNAを集中させるためにITPプロセスを開始した。本発明者らは、ITPピークSNRを計量し、図7Aに示す較正曲線を構築した。データの平均で標準化した標準偏差は約12%であった。本発明者らは、この変動の少なくとも一部はピペッティング及び吸引を含む流体取扱いにおける誤差に起因すると考える。実線は、係数R2=0.98の線形回帰を示している。本発明者らは、この較正曲線を用いて、積分蛍光シグナルと絶対RNA量を0〜60pgの範囲で関係付けた。
S−4.細胞核の画像処理
核の境界を同定するため及び核中の蛍光強度を積分するために、核の画像を分析した。そのために、各核について、焦平面を最高強度に定めた。特定された閾値より高い蛍光強度の領域として核を検出した。閾値の設定を自動化するために、閾値をIbk+σに設定した。式中、Ibkは、チャネル内の背景蛍光の平均強度であり、σは、この背景の標準偏差である。図8Aの蛍光画像は、細胞核及びこの閾値によって決定された境界の画像を示している。図8Bは、X−X’線に沿った強度のプロットを示している。閾値は、直線状の水平線として後者のプロット中に示されている。核のパラメーターは、MATLAB中の「regionprops」の関数を用いて得た。核中のDNAのこれらの積分強度測定値は、質量の絶対的計量ではなく相対質量値として表わされている。核の内側のDNAの絶対的計量は3つの理由から困難である。第1に、細胞核中への輸送に関連する標識効率及び細胞核中の色素の量子収率を絶対的な意味で決定するのは困難である。第2に、核中の絶対的DNA量の対照値を得ることが困難である。これは、(ITPゾーン中に集中したスパイクされたRNAを対照として使える)ITPゾーンに集中される遊離RNAのケースとは異なる。第3に、チャネル深さ内の焦平面の位置に応じて積分蛍光強度が約15%の変動を示したことに留意されたい。この変動は細胞核の3次元構造に関連していると考えられる。
核の境界を同定するため及び核中の蛍光強度を積分するために、核の画像を分析した。そのために、各核について、焦平面を最高強度に定めた。特定された閾値より高い蛍光強度の領域として核を検出した。閾値の設定を自動化するために、閾値をIbk+σに設定した。式中、Ibkは、チャネル内の背景蛍光の平均強度であり、σは、この背景の標準偏差である。図8Aの蛍光画像は、細胞核及びこの閾値によって決定された境界の画像を示している。図8Bは、X−X’線に沿った強度のプロットを示している。閾値は、直線状の水平線として後者のプロット中に示されている。核のパラメーターは、MATLAB中の「regionprops」の関数を用いて得た。核中のDNAのこれらの積分強度測定値は、質量の絶対的計量ではなく相対質量値として表わされている。核の内側のDNAの絶対的計量は3つの理由から困難である。第1に、細胞核中への輸送に関連する標識効率及び細胞核中の色素の量子収率を絶対的な意味で決定するのは困難である。第2に、核中の絶対的DNA量の対照値を得ることが困難である。これは、(ITPゾーン中に集中したスパイクされたRNAを対照として使える)ITPゾーンに集中される遊離RNAのケースとは異なる。第3に、チャネル深さ内の焦平面の位置に応じて積分蛍光強度が約15%の変動を示したことに留意されたい。この変動は細胞核の3次元構造に関連していると考えられる。
S−5.抽出RNAの絶対量とDNAの相対量の相関
図2Cに示すように、抽出RNA質量の計量された量と、対応する個々の細胞核の積分蛍光シグナルとの間の相関を調べた。有意な正の相関を示す0.62の相関係数(相関なしの帰無仮説に対してp=5.5×10−12)が得られた。セクションS−3に記載したように、本発明者らは、較正曲線を作製するために用いた実験間の変動係数として12%を得た。この変動は、それぞれ39%及び34%であるRNA及びDNAの計量の変動係数よりはるかに低い。従って、この強い正の相関は、抽出RNAの量で見られた変動が抽出効率の変動によるものではなかったことを示唆している。更に、正の相関及び較正実験の細胞データに対する相対的変動のこれらの観察の各々は、単一細胞データにおいて観察された変動が単なる測定上の実験的不確実性ではなく、生物学的変動に起因し得るという結論を支持する。
図2Cに示すように、抽出RNA質量の計量された量と、対応する個々の細胞核の積分蛍光シグナルとの間の相関を調べた。有意な正の相関を示す0.62の相関係数(相関なしの帰無仮説に対してp=5.5×10−12)が得られた。セクションS−3に記載したように、本発明者らは、較正曲線を作製するために用いた実験間の変動係数として12%を得た。この変動は、それぞれ39%及び34%であるRNA及びDNAの計量の変動係数よりはるかに低い。従って、この強い正の相関は、抽出RNAの量で見られた変動が抽出効率の変動によるものではなかったことを示唆している。更に、正の相関及び較正実験の細胞データに対する相対的変動のこれらの観察の各々は、単一細胞データにおいて観察された変動が単なる測定上の実験的不確実性ではなく、生物学的変動に起因し得るという結論を支持する。
図9は、抽出RNA量と核の相対積分蛍光を関連付けるデータの2次元ガウス混合分析を示す。本発明者らはMATLABの関数「gmdistribution.fit」を用いてこの分析を行った。データのフィッティングのために1、2、3、及び4つの2次元ガウス分布を調べた。表1に記載されているように赤池の情報量基準(AIC)及びベイズ情報量基準(BIC)の値に基づいてフィッティング結果を評価した。2次元ガウス分布の最小のAIC及びBIC値から、2つのガウス分布がデータのオーバーフィッティングのない最良のフィットをもたらすことが示唆された。
表1.100個の単一細胞から得られた1、2、3、及び4つの2次元ガウス分布を用いたフィットに対応するAIC及びBIC値。2つの2次元ガウス分布でAIC及びBICの両方が最小値となることから、2つのガウスフィットが適合度とオーバーフィッティングの最も良いトレードオフを提供することが示唆される。3及び4つのガウス分布を用いたフィッティングはオーバーフィッティングとなった。
結果
今回の研究で、本発明者らは、最初の単一細胞の単離後の末端チャネル電極の使用を除いて動く部品のない標準的な流体チップ中でプロセス全体を制御するために電場を用いた単一細胞アッセイにフォーカスした。本発明者らは、単一細胞の制御された操作及び破壊を実証した。破壊単一細胞の細胞質に由来するRNAはITPにより選択的に抽出、計量された。本発明者らのプロトコールは、RNAの絶対的計量、単一細胞に由来する半定量的DNA量を用いた相関分析、並びに単一細胞中のRNA及びDNAの量の不均一性の評価に用いることができる。
今回の研究で、本発明者らは、最初の単一細胞の単離後の末端チャネル電極の使用を除いて動く部品のない標準的な流体チップ中でプロセス全体を制御するために電場を用いた単一細胞アッセイにフォーカスした。本発明者らは、単一細胞の制御された操作及び破壊を実証した。破壊単一細胞の細胞質に由来するRNAはITPにより選択的に抽出、計量された。本発明者らのプロトコールは、RNAの絶対的計量、単一細胞に由来する半定量的DNA量を用いた相関分析、並びに単一細胞中のRNA及びDNAの量の不均一性の評価に用いることができる。
図1A〜図1Cは、本発明者らのアッセイの模式図を示している。本発明者らは、交差形状の既製のマイクロ流体チップ(モデルNS12A、キャリパーライフサイエンス社(Caliper Life Sciences)、カリフォルニア州)を用いた。このマイクロ流体チップは、幅90μm、深さ20μmのホウケイ酸ガラスマイクロチャネルからなる(図3A参照)。マイクロチャネルにLEバッファーを予め充填し、2μLのTEバッファー中の細胞懸濁液(およそ5細胞/μL)を西(W)リザーバーに添加した。南(S)リザーバーに真空を印加することによりこの低濃度溶液から個々の細胞を導入した。直径10〜15μmのほぼ球体として、インジェクションチャネル中に単離された生きた単一細胞が観察された(図1D)。単一細胞がインジェクションチャネル中、Wリザーバーと交差接合部との間に単離されたことを視覚的に確認した後、真空を解除し、20μLのTEバッファーをW及び北(N)リザーバーに加えた。白金ワイヤー電極をW、N、及び東(E)リザーバーに入れ、高電圧シーケンサー(HVS448 3000D、ラボスミス社(LabSmith))を用いて電極に電圧を印加した。最初に、単一細胞を破壊するために、WリザーバーとNリザーバーとの間に両極性電圧パルスを印加した(各パルス100ms幅、3000V振幅)。その後すぐに、DC電場を印加することによりITPを開始し、破壊細胞からRNAを抽出した。電圧シーケンスを図3Bに模式的に示す。RNAは同時に、LEに均一に混合したSYBR Green IIと複合体を形成し、本発明者らはそれを交差接合部の下流40mmで検出する。
本発明者らのインジェクションプロトコール及び末端チャネル電極は、インジェクションチャネルに位置した細胞のみを破壊した(補足情報(SI)セクションS−1参照)。細胞破壊プロセスは高い再現性があり、全ての観察において収率100%を示した。
本発明者らの破壊パルス完了後すぐのDC電場の印加は、個々の細胞由来のRNAをITPにおいて迅速に集中させた。図1Fは、単一細胞に由来するITP界面中の抽出RNAの代表的画像を示している。この画像は細胞破壊時から220秒後に得られた。本発明者らは、ITPゾーン中のRNA蛍光のシグナル・ノイズ比(SNR)を、背景を超える蛍光強度を陰性対照の標準偏差で割ったものと定義した。本発明者らの典型的なSNRは7.6であり、最小SNRは1.5であった。
全ての実験において、ITPで集中RNAゾーン、及び本発明者らによって細胞核に起因するとされた楕円体跡(trailing ellipsoidal body)が得られた(図1F及びSIセクションS−2参照)。核はITP界面と同じ方向に泳動し、このことは正味の負電荷を示しているが、核の流動速度は一連の実験間で有意に異なっていた。本発明者らは、この変動は、サイズ及び形態のばらつき並びにその他の差(例えば、表面タンパク質の数及びイオン化状態)に起因すると考える。対照的に、ITP集中ゾーンは常に、ITPの動力学から予想される流動速度(Crissman et al.(2003)Anal.Chem.75:5646−5655)で動き続けた。
本発明者らは、単一細胞を破壊し、全細胞質RNAから核を分離し、細胞質RNAを集中させて計量し、個々の核中の全DNAの相対測定値を得る実験を100回行った。本発明者らは、積分強度を用いてITP界面中のRNAの絶対量を計量するために、スパイク合成RNA(0.5〜10Kb RNA Ladder、インビトロジェン社)を用いた実験を用いて構築された較正曲線を用いた(SIセクションS−3参照)。図2Aは、測定された絶対RNA質量のヒストグラムを示す。更に、一連の実験に対して経時的に並べたRNAデータについては図7Bを参照されたい。ヒストグラムは、最も頻度の高い値が約11.0pgであることを示しており、平均は14.1pgであった。これらの測定値は、報告されている哺乳動物単一細胞に由来する全RNA(Wen et al.(2008)Anal.Chem.80:6472−6479)と一致する。平均値で標準化した標準偏差は39%であった(較正データにおける一連の実験間で観察された12%という値より有意に大きい。SIセクションS−3参照)。較正の繰り返しでの変動に対する変動の大きさから、本発明者らの細胞データにおいて観察された大きな変動は細胞集団の不均一性によるものであると結論付けられる(以下の更なる考察参照)。
これらの実験全てにおいて、本発明者らは、各細胞に特異的な更なる相関する測定値として細胞核の蛍光強度を積分した(SIセクションS−4の画像分析の詳細参照)。SIセクションS−2で考察したように、本発明者らのプロトコールにより破壊細胞から細胞質RNAのみが抽出され、DNAは核中に維持されることが確認された。細胞核に由来する積分蛍光強度は、単一細胞中のDNAの相対量の基準を提供する。DNAの相対量は更に、平均で標準化した標準偏差が34%である大きな変動を示した(推定される測定不確実性より有意に大きい。図2B参照)。DNA量分布は2個の別個のピークを示した:第1のピークは約4.5a.u.であり、第2のピークは約7.8a.u.であった(局所極大比1.7)。本発明者らは、これら2個のピークは、単一細胞がそれぞれシングルコピー及びダブルコピーのDNAを含むG0/G1及びG2/Mの細胞分裂相30に起因するものと考えた。細胞がDNAを合成するS期による寄与のため、ヒストグラム中の局所極大間の比は2より小さかったと考えられる。
本発明者らは、図2Cに示されるようにRNAの絶対量とDNAの相対量との間の相関を調べた。正の係数0.62の有意な相関が観察された(相関が観察されない帰無仮説に対してp値は5.5×10−12)。正の係数は、より多量のDNAがより多量のRNAと同時に発生することを示している。従って、本発明者らは、各測定の変動は、RNAの抽出効率ではなく細胞周期に起因すると考えた。更なる詳細についてはSIセクションS−5も参照されたい。
本発明者らは更に、図2Cのデータへの2次元ガウス分布のフィッティングに基づく分析も行った。2つの2次元ガウス分布で最良のフィッティング結果が観察され、このことは、100個の単一細胞が2つの別個の集団に由来したことを示唆している(SIセクションS−5も参照)。本発明者らは、図2A及び図2B中に線として2次元フィッティングの投影(projection)を示した。図2B中、本発明者らは、各集団がそれぞれ2個の別個のピークを有することを見出した。これは、G0/G1及びG2/M期に関連する2個の別個の集団が観察されたという結論を支持する。更に、図2Aに示されているように、抽出されたRNAの量について一致したフィッティング結果が観察された。
本発明者らは更に、蛍光活性化細胞選別機(FACS)を用いて同じ細胞培養に由来する細胞の分析を行うことにより本発明者らの技術を評価した。RNA及びDNAの相対的計量には、それぞれピロニンY及びHoechst 33342蛍光色素を用いたプロトコール(Gao et al.(2004)Lab on a Chip 4:47−52)を用いた。図2D〜図2FにFACS分析を要約する。本発明者らのアッセイとFACSの間に良好な定性的一致が観察された。本発明者らは、FACSによって提供される相対的RNA及び相対的DNA量の測定も、本発明者らのデータ同様、相関した二峰性分布を示すことを見出した。図2Fの相関図は5109個の細胞から得られたものであり、従って、本発明者らのアッセイより多くの詳細を示している。FACSは成熟したハイスループット技術であるので、はるかに多くの数の測定を提供する。しかし、FACSと異なり、本発明者らのアッセイは、RNAの絶対的計量を提供し、更に、チップ上で物理的に破壊してDNAをRNAから分離する。後者は、CE及びcDNAハイブリダイゼーションベースのアッセイ(Bahga et al.(2011)Anal.Chem.83:6154−6162;Eid et al.(2013)Analyst 138:3117−3120;Garcia−Schwarz & Santiago(2013)Angew.Chem.Int.Ed.Engl.52(44):11534−11537)等の下流分析との統合に好都合である。対照的に、FACSで得られる相対的DNA及び相対的RNA量は、保存、分画できず、個々の分析に利用できるようにすることはできない。本発明者らは、分析される細胞の数を増やすため及び更なる下流の相関分析を統合するために、将来、本発明者らの方法を更に自動化することを望む。
要約すると、本発明者らは、迅速且つ選択的な細胞破壊、核DNAからの細胞質RNAの分離;RNAの回収、集中、及び絶対的計量;並びに生きた単一細胞に由来するDNAの同時な相対的計量のための電気運動的方法を開発した。FACSとは異なり、本発明者らの技術は、絶対的RNA計量を実現し、物理的に破壊して、RNAをDNAから分離する。また、このアプローチは、DNA及びRNAを他の下流の関連する分析へと分画及び送達する機会も作り出す。本発明者らは、このような更なる統合を実証すること並びに本発明者らのアッセイを自動化して細胞、RNA、及び核の完全な電場制御並びに画像分析に基づく細胞の同定及び制御を含めることを望む。
本発明の好ましい実施形態を図解及び説明したが、その中で本発明の精神及び範囲から逸脱することなく種々の変更が可能であることが理解されよう。
Claims (60)
- 細胞からRNA及びDNAを調製する方法であって、
(a)流体チャネル中に前記細胞を単離すること;
(b)前記流体チャネルに電場を印加することにより、核膜を破壊することなく前記細胞の原形質膜を破壊すること;並びに
(c)下記(i)及び(ii)を用いて、前記細胞の内容物に対する等速電気泳動(ITP)を行うこと
(i)リーディング電解質(LE)及びトレーリング電解質(TE);細胞質RNAはリーディング電解質−トレーリング電解質界面に濃縮される、並びに
(ii)核を遅らせる篩いマトリックス;この遅れにより前記細胞質RNAは前記細胞の核DNAから分離される、
を含む前記方法。 - 前記流体チャネルへの電場の印加が、前記細胞の前記原形質膜を破壊する両極性電圧パルスを生成することを含む、請求項1に記載の方法。
- 個々のパルスの持続時間がそれぞれ約100ミリ秒である、請求項2に記載の方法。
- 前記細胞の原形質膜に誘導される電位が約3ボルトである、請求項2に記載の方法。
- 前記流体チャネル中の前記電場が約270kV/mである、請求項2に記載の方法。
- 前記細胞質RNAから細胞片を除去することを更に含む、請求項1に記載の方法。
- 前記等速電気泳動後に、核を除去することを更に含む、請求項1に記載の方法。
- 前記LE−TE界面から前記細胞質RNAを除去することを更に含む、請求項1に記載の方法。
- 前記核の核膜を破壊することを更に含む、請求項1に記載の方法。
- 前記核膜の破壊が、化学的、機械的、電気的、又は熱的破壊方法を用いて行われる、請求項9に記載の方法。
- 前記RNA又は前記DNAに検出可能な標識を加えることを更に含む、請求項1に記載の方法。
- 前記検出可能な標識が蛍光色素である、請求項1に記載の方法。
- 前記細胞質RNAの量を計量することを更に含む、請求項1に記載の方法。
- 前記核DNAの量を計量することを更に含む、請求項1に記載の方法。
- 前記篩いマトリックスが、ブロックコポリマー、線状ポリマー、又は架橋ポリマーを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記篩いマトリックスがポリビニルピロリドン(PVP)を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記PVPの濃度が0.2%より高い、請求項16に記載の方法。
- 前記PVPの濃度が約0.4%である、請求項17に記載の方法。
- 前記流体チャネル中の電気浸透流を抑制するための薬剤を加えることを更に含む、請求項1に記載の方法。
- 前記電気浸透流を抑制するための薬剤が、ポリラクタム、置換ポリアクリルアミド誘導体、セルロースの水溶性メチルヒドロキシエチル誘導体、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、及びポリエチレングリコールからなる群から選択される、請求項19に記載の方法。
- 前記ポリラクタムがポリビニルピロリドンである、請求項20に記載の方法。
- 細胞内媒質と細胞外媒質との浸透圧の差を相殺するために浸透圧剤を加えることを更に含む、請求項1に記載の方法。
- 前記浸透圧剤がスクロースである、請求項22に記載の方法。
- 前記等速電気泳動が、Tris及びHClを含むリーディング電解質含有溶液を用いて行われる、請求項1に記載の方法。
- 前記等速電気泳動が、Tris及びHEPESを含むトレーリング電解質含有溶液を用いて行われる、請求項1に記載の方法。
- 前記リーディング電解質及び前記トレーリング電解質が、pH4〜10の溶液に含まれる、請求項1に記載の方法。
- 前記pHが約8.0〜約8.3である、請求項26に記載の方法。
- 少なくとも1つのRNA又はDNAを増幅することを更に含む、請求項1に記載の方法。
- 少なくとも1つのRNA又はDNAを単離することを更に含む、請求項1に記載の方法。
- 電場に基づく方法によりRNA分子又はDNA分子を分離することを更に含む、請求項1に記載の方法。
- 前記電場に基づく方法が、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、アガロースゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動、及びパルスフィールド電気泳動からなる群から選択される、請求項30に記載の方法。
- 前記方法が、前記流体チャネルを備えたマイクロ流体デバイス中で行われる、請求項1に記載の方法。
- 前記マイクロ流体デバイスが、接合部で連結された少なくとも第1の流体チャネルと第2の流体チャネルとを備え、
前記流体チャネルのそれぞれが、第1のリザーバーに連結された第1の末端と、第2のリザーバーに連結された第2の末端と、を有する、請求項32に記載の方法。 - 前記第1の流体チャネルが、少なくとも1つのチャネル分岐点で2つ以上のチャネルに分かれ、前記核と前記細胞質RNAとを別個のチャネルに分配することができる、請求項33に記載の方法。
- (a)前記篩いマトリックス及び前記リーディング電解質を含む溶液を前記第1の流体チャネルに充填すること;
(b)前記第1の流体チャネルの前記第1のリザーバー中に細胞群を含むサンプルを導入し、前記第2の流体チャネルのリザーバーに真空を印加して単一細胞を前記第1の流体チャネル中へと移動させることにより前記細胞を単離することによって、前記第1の流体チャネル中に細胞を単離すること;
(c)前記単一細胞付近に前記第1の流体チャネルを通じた電場を印加することにより、前記核膜を破壊することなく前記単一細胞の原形質膜を破壊すること;
(d)前記第1の流体チャネルの前記第1のリザーバーにトレーリング電解質を加えること;及び
(e)前記第1の流体チャネル中の前記単一細胞の内容物に対する等速電気泳動(ITP)を行うこと
を含む、請求項33に記載の方法。 - 前記核と前記細胞質RNAとを前記マイクロ流体デバイス中の別個の位置に到達させることを更に含む、請求項35に記載の方法。
- 前記核及び前記細胞質RNAが、前記デバイス内の別個のリザーバー又はチャネルに分配される、請求項36に記載の方法。
- 細胞から核RNA及び細胞質RNAを調製する方法であって、
(a)流体チャネル中に前記細胞を単離すること;
(b)前記流体チャネルに電場を印加することにより、核膜を破壊することなく前記細胞の原形質膜を破壊すること;並びに
(c)下記(i)及び(ii)を用いて、前記細胞の内容物に対する等速電気泳動(ITP)を行うこと
(i)リーディング電解質(LE)及びトレーリング電解質(TE);前記細胞質RNAはリーディング電解質−トレーリング電解質界面に濃縮される、
(ii)核を遅らせる篩いマトリックス;この遅れにより前記細胞質RNAは前記核に含まれる核RNAから分離される、
を含む方法。 - 前記核から前記核RNAを分離することを更に含む、請求項38に記載の方法。
- 核DNAから前記核RNAを分離することを更に含む、請求項38に記載の方法。
- デオキシリボヌクレアーゼを用いて酵素的に前記DNAを消化することを含む、請求項40に記載の方法。
- 前記方法が、前記流体チャネルを備えたマイクロ流体デバイス中で行われる、請求項38に記載の方法。
- 前記マイクロ流体デバイス中の別個の位置に前記核と前記細胞質RNAとを到達させることを更に含む、請求項42に記載の方法。
- 前記核及び前記細胞質RNAが、前記デバイス内の別個のリザーバー又はチャネルに分配される、請求項43に記載の方法。
- 前記篩いマトリックスが、ブロックコポリマー、線状ポリマー、又は架橋ポリマーを含む、請求項38に記載の方法。
- 前記篩いマトリックスがポリビニルピロリドン(PVP)を含む、請求項38に記載の方法。
- 前記PVPの濃度が0.2%より高い、請求項46に記載の方法。
- 前記PVPの濃度が約0.4%である、請求項47に記載の方法。
- 前記流体チャネル中の電気浸透流を抑制するための薬剤を加えることを更に含む、請求項38に記載の方法。
- 前記電気浸透流を抑制するための薬剤が、ポリラクタム、置換ポリアクリルアミド誘導体、セルロースの水溶性メチルヒドロキシエチル誘導体、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、及びポリエチレングリコールからなる群から選択される、請求項49に記載の方法。
- 前記ポリラクタムがポリビニルピロリドンである、請求項50に記載の方法。
- 細胞内媒質と細胞外媒質との浸透圧の差を相殺するために浸透圧剤を加えることを更に含む、請求項38に記載の方法。
- 前記浸透圧剤がスクロースである、請求項52に記載の方法。
- 前記等速電気泳動が、Tris及びHClを含むリーディング電解質含有溶液を用いて行われる、請求項38に記載の方法。
- 前記等速電気泳動が、Tris及びHEPESを含むトレーリング電解質含有溶液を用いて行われる、請求項38に記載の方法。
- 前記リーディング電解質及び前記トレーリング電解質が、pH4〜10の溶液に含まれる、請求項38に記載の方法。
- 前記pHが約8.0〜約8.3である、請求項56に記載の方法。
- (a)第1のリザーバーに連結された第1の末端と、第2のリザーバーに連結された第2の末端と、を備える第1の流体チャネル;及び
(b)第1のリザーバーに連結された第1の末端と、第2のリザーバーに連結された第2の末端と、を備え、接合部で前記第1の流体チャネルに連結されている、第2の流体チャネル
を備えるマイクロ流体デバイス。 - 電圧源を更に備える、請求項58に記載のマイクロ流体デバイス。
- 前記第1の流体チャネルが、少なくとも1つのチャネル分岐点で2つ以上のチャネルに分かれる、請求項58に記載のマイクロ流体デバイス。
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