JP2017060413A - 核酸分析用のサンプル調製方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】血液培養ボトル等から採取した血液培養液に含まれる培養された微生物由来の核酸を分析する方法であって、血液培養液に界面活性剤を含まない液体を加えて遠心し、遠心で得られた沈渣を懸濁した沈渣懸濁液を核酸分析の対象試料とする。
【選択図】 なし
Description
これらの方法には、核酸抽出工程あるいは溶菌工程に要する手間と時間により検査の迅速性が失われるという欠点がある。
すなわち、本発明は以下のような構成からなる。
[項1]
以下の(I)〜(III)の工程のみからなる、核酸分析用のサンプル調製方法。
(I)血液培養液に、界面活性剤を含まない液体を加え混和し懸濁液を作製する工程
(II)工程(I)で作製した懸濁液を遠心分離し、上清と沈渣に分離した溶液から上清を除去する工程
(III)工程(II)で残った沈渣に、界面活性剤を含まない液体を加え混和し懸濁液を作製する工程
[項2]
工程(III)の後に、下記の工程(II‘)を実施したあと再び工程(III)を実施するサイクルを、1回または複数回挿入する、項1に記載の方法。
(II‘)工程(III)で作製した懸濁液を遠心分離し、上清と沈渣に分離した溶液から上清を除去する工程
[項3]
項1または2に記載の方法において、さらに以下の工程(VI)を実施する方法。
(IV)工程(III)で作製した沈渣懸濁液を、界面活性剤を含まない液体で2〜10000倍に希釈する工程
[項4]
界面活性剤を含まない液体が、水、緩衝液およびアルカリ性溶液からなる群から選ばれるいずれか1つ以上である、項1〜3のいずれかに記載の方法。
[項5]
界面活性剤を含まない液体が水である、項4に記載の方法。
[項6]
項1〜5のいずれかに記載の方法で調製した核酸分析用のサンプルに含まれる核酸を分析する、核酸分析方法。
(I)血液培養液に、界面活性剤を含まない液体を加え混和し懸濁液を作製する工程
(II)工程(I)で作製した懸濁液を遠心分離し、上清と沈渣に分離した溶液から上清を除去する工程
(III)工程(II)で残った沈渣に、界面活性剤を含まない液体を加え混和し懸濁液を作製する工程
(II‘)工程(III)で作製した懸濁液を遠心分離し、上清と沈渣に分離した溶液から上清を除去する工程
ここで、挿入するサイクル数は特に制限されないが、好ましくは1〜10回、さらに好ましくは1〜5回、さらに好ましくは1〜2回、さらに好ましくは1回である。
前記のサイクルは、工程(II)で得られた沈渣をさらに1回ないしは複数回洗浄する工程である。この洗浄工程を加えることで、核酸を分析する工程をより正確に行うことが可能となる。
(IV)工程(III)で作製した沈渣懸濁液を、界面活性剤を含まない液体で2〜10000倍に希釈する工程
好ましくは、水と緩衝液、または水とアルカリ性溶液の組合せである。
緩衝液のpHは7以上であることが好ましい。さらに好ましいpHの下限は7.5である。緩衝液のpHの好ましい上限は9である。
緩衝液の濃度は10mM以上であることが好ましい。緩衝液の好ましい上限は100mMである。さらに好ましいpHの上限は20mMである。
本発明における「核酸分析方法」は、核酸を検出する方法、または、核酸を検出することにより微生物を同定する方法である。核酸の検出方法は従来公知の各方法を用いることができ特に限定されないが、好ましくは、(1)核酸増幅反応により核酸を増幅する工程、(2)該増幅産物を検出する工程、の二つの工程を含む方法である。
血液培養に用いる培地も特に限定されず、例えば市販の血液培養ボトルに含まれている培地をそのまま用いることができる。
(1)試料の調製
メチシリン耐性コアグラーゼ陰性ブドウ球菌を含む血液培養液150μLと精製水800μLとを混合し、3000gで3分間遠心して上清を除去し沈渣のみとした。この沈渣を500μLの精製水(イオン交換水)で懸濁し、懸濁液を試料とした(R1)。また、別途、前記沈渣を500μLのTEバッファー(10mM、pH8.0)で懸濁し、懸濁液を試料とした(R2)。
また、メチシリン感受性のコアグラーゼ陰性ブドウ球菌を含む血液培養液に対しても上記と同様の処理を行い試料とした(S1、S2)。
上記試料または精製水(陰性コントロールとして使用)にそれぞれ下記試薬を添加し、PCR法を利用してメチシリン耐性遺伝子(mecA遺伝子)を検出した。核酸増幅は下記条件で実施した。核酸増幅にはGeneAmp PCR System9700(アプライドバイオシステムズ製)を使用した。
核酸増幅産物は1×TAEアガロースゲルを用いた電気泳動によって確認した。電気泳動は100Vで30分間行い、泳動後のアガロースゲルはエチジウムブロマイドで染色し、紫外線照射によって増幅産物を可視化し確認した。
以下の試薬を含む20μL溶液を調製した。
mecA遺伝子増幅用核酸プライマー(配列番号1) 10μMを0.2μL
mecA遺伝子増幅用核酸プライマー(配列番号2) 10μMを0.2μL
×10緩衝液 2μL
2mM dNTP 2μL
Blend Taq polymerase(東洋紡製) 0.5U
試料または精製水 1μL
94℃・2分間
(以上を1サイクル)
94℃・1分間
55℃・30秒間
72℃・1分30秒間
(以上を37サイクル)
72℃・3分30秒間
(以上を1サイクル)
図1は電気泳動の結果である。メチシリン感受性コアグラーゼ陰性ブドウ球菌からはmecA遺伝子の増幅産物は検出されなかった。一方、メチシリン耐性コアグラーゼ陰性ブドウ球菌からはmecA遺伝子の増幅産物が検出された。沈渣を懸濁する液体は精製水であってもTEバッファーであっても結果に違いは見られなかった。以上から、本発明を実施することで血液培養試料から容易に核酸分析試料を調製できること、試料の調製は精製水を用いてもバッファーを用いても可能であることが示された。
(1)試料の調製
黄色ブドウ球菌を培養した血液培養液200μLと精製水600μLを混合し、3000gで3分間遠心して上清を除去し沈渣のみとした。この沈渣に精製水900μLを加えて再度遠心し、この沈渣を500μLの精製水でそれぞれ懸濁した。この懸濁液をそのまま、および精製水で10倍、100倍、1000倍、10000倍、100000倍に希釈したものを試料とした。
上記試料にそれぞれ下記試薬を添加し、リアルタイムPCR法を利用して黄色ブドウ球菌特異的ヌクレアーゼ遺伝子(nuc遺伝子)を検出した。検出はCt値の算出により確認した。リアルタイムPCRは下記条件で実施した。リアルタイムPCRにはRotor−Gene Q(キアゲン製)を使用した。
以下の試薬を含む20μL溶液を調製した。
nuc遺伝子増幅用核酸プライマー(配列番号3) 10μMを0.6μL
nuc遺伝子増幅用核酸プライマー(配列番号4) 10μMを0.6μL
THUNDERBIRD(登録商標) SYBR qPCR Mix(東洋紡製) 10μL
精製水 6.8μL
試料 2μL
95℃・1分
(以上を1サイクル)
95℃・15秒間
60℃・30秒間
60℃のステップで蛍光取得
(以上を40サイクル)
本実施例の結果を表1に示す。血液培養液より調製した沈渣懸濁液は希釈なしから1000000倍希釈したものまで全てでCt値が得られ、核酸増幅が生じたことが確認できた。Ct値とは増幅産物が一定量に達したときのサイクル数を示す数値であり、一般的には核酸増幅の対象となる標的核酸が多い反応系ほどCt値は低くなる傾向があるが、何らかの核酸増幅阻害要因が発生するとCt値が高値になる。
本実施例でのCt値を確認すると、沈渣懸濁液を希釈しない場合よりも10〜1000倍に希釈した方がCt値が低くなっていた。この現象が生じる一つの可能性としては血液成分の残渣や血液培養ボトルに含まれる活性炭など核酸増幅を阻害する物質が含まれていることが考えられる。本実施例の結果は、沈渣懸濁液を適当に希釈することで例えば前記の様な阻害物質も希釈し、結果としてさらに増幅効率を向上させられることを示している。
また、本実施例では工程(II‘)を1回挿入して試料を調製しており、該試料が核酸分析の対象として使用可能であることを示した。
(1)試料の調製
実施例1で用いた血液培養液をそのまま使用した。
(2)核酸増幅
上記試料または精製水にそれぞれ下記試薬を添加し、PCR法を利用してメチシリン耐性遺伝子(mecA遺伝子)を検出した。核酸増幅は下記条件で実施した。核酸増幅にはGeneAmp PCR System9700(アプライドバイオシステムズ製)を使用した。
核酸増幅産物は1×TAEアガロースゲルを用いた電気泳動によって確認した。電気泳動は100Vで30分間行い、泳動後のアガロースゲルはエチジウムブロマイドで染色し、紫外線照射によって増幅産物を可視化し確認した。
試料または精製水
実施例1と同じ
実施例1と同じ
血液培養液を直接核酸分析の試料とした場合、核酸増幅産物は可視化されなかった。
(1)試料の調製
黄色ブドウ球菌を培養した血液培養液200μLと精製水800μLを混合し、3000gで3分間遠心して上清を除去し沈渣のみとした。この沈渣に精製水900μLを加えて懸濁したのち再度遠心し、この沈渣を500μLの下記(A)で列挙される5種類の液体でそれぞれ懸濁した。これらの懸濁液を試料とした。
(A)精製水
トリス塩酸バッファー(20mM、pH7.5)
トリス塩酸バッファー(20mM、pH8.3)
水酸化カリウム溶液(20mM)
水酸化ナトリウム溶液(20mM)
(2)リアルタイムPCR法
上記試料にそれぞれ下記試薬を添加し、リアルタイムPCR法を利用してメチシリン耐性遺伝子(mecA遺伝子)を検出した。検出はCt値の算出により確認した。リアルタイムPCRは下記条件で実施した。リアルタイムPCRにはRotor−Gene Q(キアゲン製)を使用した。
以下の試薬を含む20μL溶液を調製した。
mecA遺伝子増幅用核酸プライマー(配列番号1) 10μMを0.6μL
mecA遺伝子増幅用核酸プライマー(配列番号2) 10μMを0.6μL
THUNDERBIRD(登録商標) SYBR qPCR Mix(東洋紡製) 10μL
精製水 6.8μL
試料 2μL
95℃・1分
(以上を1サイクル)
95℃・15秒間
60℃・45秒間
60℃のステップで蛍光取得
(以上を40サイクル)
本実施例の結果を表2に示す。今回用いた5種類の液のいずれでも、調製した沈渣懸濁液からmecA遺伝子の増幅を示すCt値が得られた。従って、いずれの液を用いて沈渣を調製しても、調製された沈渣は核酸分析の試料となりうることが示された。
個々の沈渣懸濁液を試料とした場合のCt値を比較すると、最も良好な結果を示したのは精製水であり、以降、水酸化カリウム、トリス緩衝液(pH8.3)、トリス緩衝液(pH7.5)、水酸化ナトリウムの順であった。
Claims (6)
- 以下の(I)〜(III)の工程のみからなる、核酸分析用のサンプル調製方法。
(I)血液培養液に、界面活性剤を含まない液体を加え混和し懸濁液を作製する工程
(II)工程(I)で作製した懸濁液を遠心分離し、上清と沈渣に分離した溶液から上清を除去する工程
(III)工程(II)で残った沈渣に、界面活性剤を含まない液体を加え混和し懸濁液を作製する工程 - 工程(III)の後に、下記の工程(II‘)を実施したあと再び工程(III)を実施するサイクルを、1回または複数回挿入する、請求項1に記載の方法。
(II‘)工程(III)で作製した懸濁液を遠心分離し、上清と沈渣に分離した溶液から上清を除去する工程 - 請求項1または2に記載の方法において、さらに以下の工程(VI)を実施する方法。
(IV)工程(III)で作製した沈渣懸濁液を、界面活性剤を含まない液体で2〜10000倍に希釈する工程 - 界面活性剤を含まない液体が、水、緩衝液およびアルカリ性溶液からなる群から選ばれるいずれか1つ以上である、請求項1〜3のいずれかに記載の方法。
- 界面活性剤を含まない液体が水である、請求項4に記載の方法。
- 請求項1〜5のいずれかに記載の方法で調製した核酸分析用のサンプルに含まれる核酸を分析する、核酸分析方法。
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