CN111676274B - 一种检测核酸聚合酶活性的检测方法 - Google Patents

一种检测核酸聚合酶活性的检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种检测核酸聚合酶活性的检测方法，检测核酸聚合酶延伸活性的模板为单链DNA，所述单链DNA与对应单链DNA设计的引物结合后加入核酸聚合酶进行qPCR链式反应，基于反应结果分析核酸聚合酶的活性。该检测方法解决了以PCR反应所产生的引物二聚体以及非特异性产物为检测结果的复杂体系，其能够直接以单链DNA作为模板，评估核酸聚合酶的延伸活性。

Description

一种检测核酸聚合酶活性的检测方法
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，特别是涉及一种检测核酸聚合酶活性的检测方法。
背景技术
聚合酶链式反应(polymerasechainreaction，PCR)是常用的分子检测技术，PCR技术是以双链DNA作为模板，单链寡核苷酸为引物，通过热稳定的DNA聚合酶在一定反应环境内催化引物按碱基互补配对原则沿着模板链延伸。经过热变性、退火、延伸三个步骤的重复循环，实现在体外将特定的核苷酸片段进行指数级扩增的目的。
PCR发生循环反应时对不同的循环步骤有不同的温度，要求的温度分别为变性(90℃左右)、退火(50℃左右)、延伸(70℃左右)。Taq DNA聚合酶在90℃以上仍能保持一定活性，因而是PCR反应常用的聚合酶。
TaqDNA聚合酶的最高生物学活性温度在70℃～75℃，然而PCR反应在升温时(20℃～70℃)，TaqDNA聚合酶仍然有一定的聚合酶活性，如果没有进行热启动封闭，那么聚合酶就可能在该环境下进行催化延伸，容易使PCR反应发生引物二聚体以及非特异性的扩增，影响产物的特异性。因此如何在初始循环的热变性前将TaqDNA聚合酶及高保真聚合酶的延伸活性进行抑制成为了现今的研究热点。研究发现可以通过对酶进行化学修饰、物理隔绝法、抗原抗体法、设计特殊的引物或者用基因工程的方法对酶进行结构改造来将TaqDNA聚合酶在未达到最适反应温度前的酶延伸活性进行抑制，实现热启动的目的。
目前检测聚合酶的延伸活性的抑制效果常用的手段是通过设计某些特定的容易出现非特异扩增的引物，以某些复杂的双链DNA为模板，进行PCR反应(变性、复性、延伸)，最后通过产物电泳的方法，观察电泳条带的结果(非特异条带、引物二聚体)是否存在或量的多少来判断非特异扩增结果，进而推测在初始变性前(20℃～70℃)聚合酶的延伸活性是否被抑制。上述检测方法操作繁杂，不能快速完成检测。
针对上述问题，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测核酸聚合酶活性的检测方法，该检测方法解决了以PCR反应所产生的引物二聚体以及非特异性产物为检测结果的复杂体系，其能够直接以单链DNA作为模板，评估核酸聚合酶的延伸活性。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种检测核酸聚合酶活性的检测方法,检测核酸聚合酶延伸活性的模板为单链DNA，所述单链DNA与对应单链DNA设计的引物结合后加入核酸聚合酶进行qPCR链式反应，基于反应结果分析核酸聚合酶的活性。
优选的，所述单链DNA的序列如SEQ ID NO:1所示。
优选的，对应单链DNA设计的引物序列如SEQ ID NO:2所示。
优选的，所述单链DNA的结构为：
Figure BDA0002562613460000031
优选的，所述检测核酸聚合酶活性的检测方法所针对的核酸聚合酶为Taq DNA聚合酶和高保真聚合酶。
优选的，单链DNA、对应单链DNA设计的引物、10×PCR buffer、dNTP、H2O和荧光染料组成初步反应体系，所述单链DNA与对应单链DNA设计的引物的结合在初步反应体系中完成。
优选的，所述初步反应体系的反应条件为95℃反应3min后自然冷却。
优选的，向初步反应体系中加入核酸聚合酶进行qPCR链式反应，所述qPCR链式反应的反应程序为：37℃，20s预变性，然后按37℃反应3s,37℃反应3min进行链式循环反应99次。
优选的，所述初步反应体系中各组分的含量为：
Figure BDA0002562613460000032
Figure BDA0002562613460000041
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
本发明提供了一种检测核酸聚合酶活性的检测方法，该检测方法是以单链DNA作为模板，单链DNA与对应单链DNA设计的引物在初步反应体系中结合后，加入核酸聚合酶进行qPCR链式反应，基于反应结果即能够分析核酸聚合酶的活性，该检测方法反应体系简单、反应温和，该检测方法能够准确且快速简洁的评估核酸聚合酶的延伸活性，其解决了以PCR反应所产生的引物二聚体以及非特异性产物为检测结果的复杂体系。
附图说明
图1为单链DNA的结构。
图2为实施例2中抗体封闭核酸聚合酶活性的扩增曲线。
图3为实施例2中抗体封闭核酸聚合酶活性的溶解曲线。
图4为实施例3中抗体封闭核酸聚合酶活性的扩增曲线。
图5为实施例3中抗体封闭核酸聚合酶活性的溶解曲线。
图6为实施例4中核酸聚合酶活性检测的扩增曲线。
图7为实施例5中核酸聚合酶活性检测的扩增曲线。
具体实施方式
为了使本领域的人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合本发明的附图，对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的其它类同实施例，都应当属于本申请保护的范围。
实施例1
本具体实施例中提供的检测核酸聚合酶活性的检测方法是以人工合成的单链DNA作为模板构建检测体系，单链DNA的序列如SEQ ID NO:1所示，单链DNA的结构如图1所示。在单链DNA选择时要选择二级结构尽量少的序列，这是因为DNA二级结构的打开需要一定的能量，设计单链模板时，二级结构少可以保证在较低温度下(如37度)形成完全单链状态，便于引物结合及延伸。
对应单链DNA设计相应的引物，对应单链DNA设计的引物序列如SEQ ID NO:2所示。
本具体实施例中提供的检测核酸聚合酶活性的检测方法的具体步骤为：
(1)以10×PCR buffer、H2O、dNTP、单链DNA模板和对应单链DNA设计的引物和荧光染料作为初步反应体系进行反应使初步反应体系中的单链模板和引物结合，初步反应体系的反应条件为95℃反应3min后自然冷却。
(2)向初步反应体系中加入核酸聚合酶进行qPCR链式反应，qPCR链式反应的反应程序为：37℃，20s预变性，然后按37℃反应3s,37℃反应3min进行链式循环反应99次。
(3)基于qPCR链式反应的结果分析核酸聚合酶的活性。
进一步的，步骤(1)的初步反应体系中各组分的含量为：
Figure BDA0002562613460000051
步骤(2)中核酸聚合酶的加入量根据核酸聚合酶的活性来定。
步骤(2)中qPCR链式反应的反应程序不仅限于上述公开的程序，qPCR链式反应使用恒温延伸作为反应条件即可，反应设定的温度可根据检测预实验时反应结果的快慢来调节设定。
本具体实施例采用了荧光染料法进行qPCR链式反应来检测核酸聚合酶活性，本方案还可以采用其他的qPCR链式反应来检测核酸聚合酶活性，例如探针法。
本具体实施例中提供的检测核酸聚合酶活性的检测方法所针对的核酸聚合酶为Taq DNA聚合酶，尤其适用于Taq酶和高保真聚合酶。
实施例2检测核酸聚合酶活性的检测方法的验证实验一
以Taq DNA聚合酶(KAPA 2G FAST DNA聚合酶，KAPA Biosystem)、能够封闭TaqDNA聚合酶活性的1抗体(菲鹏生物股份有限公司(Fapon Biotech Inc.),Taqantibody)、不能够封闭Taq DNA聚合酶活性的2抗体(菲鹏生物股份有限公司(Fapon Biotech Inc.),Pfuantibody)和KAPA 2G快速热启动DNA聚合酶(KAPA Hot Start 2G Fast，KAPA Biosystem，该酶结合了一个能够使它在首次变性步骤前失活的抗体)为实验材料，以实施例1提供的检测核酸聚合酶活性的检测方法为检测验证方法，具体为：
(1)分别构建五组初步反应体系：
Figure BDA0002562613460000061
(2)五组初步反应体系均在95℃反应3min后自然冷却，使得单链模板和引物充分结合。
(3)分别向五组初步反应体系中加入1μl 0.5U的KAPA 2G FAST DNA聚合酶、1μl0.5U的KAPA 2G FAST DNA聚合酶和1抗体的混合物、1μl 0.5U的KAPA 2GFAST DNA聚合酶和2抗体的混合物、1μl 0.5U的KAPA 2G快速热启动DNA聚合酶和1μl H2O进行qPCR链式反应，qPCR链式反应的反应程序为：37℃，20s预变性，然后按37℃反应3s,37℃反应3min进行链式循环反应99次，最后建立熔解曲线，基于扩增曲线和溶解曲线评估抗体封闭Taq DNA聚合酶活性。
按上述试验方法进行试验，试验结果如图2和图3所示，图2和图3中标记1、2、3、4、5分别对应加入KAPA 2G FAST DNA聚合酶的无抗体体系、加入KAPA 2GFAST DNA聚合酶和2抗体的混合物的第一封闭体系、加入KAPA 2G快速热启动DNA聚合酶的第二封闭体系、加入KAPA 2G FAST DNA聚合酶和1抗体的混合物的第三封闭体系、加入1μl H2O的无酶体系。由图2和图3可以看出，能够封闭TaqDNA聚合酶活性的1抗体可以封闭Taq DNA聚合酶，KAPA 2G快速热启动DNA聚合酶在首次变性步骤前处于失活状态，不能够促使反应体系进行延伸反应，不能封闭Taq DNA聚合酶活性的2抗体不能够封闭Taq DNA聚合酶，Taq DNA聚合酶依旧就有延伸活性，Taq DNA聚合酶是具有延伸活性的，其能够实现单链DNA的延伸。上述试验结果与预期试验结果相同，表明本发明提供的检测核酸聚合酶活性的检测方法是可行的。
实施例3检测核酸聚合酶活性的检测方法的验证实验二
本实施例的实验材料与实验方法均与实施例2相同，不同之处在于：向初步反应体系中加入的KAPA 2G快速热启动DNA聚合酶先经过95度2min处理后再加入。
本具体实施例的试验结果如图4和5所示，图4和图5中标记1、2、3、4、5分别对应加入KAPA 2G FAST DNA聚合酶的无抗体体系、加入KAPA 2G FAST DNA聚合酶和2抗体的混合物的第一封闭体系、加入经过95度2min处理后的KAPA2G快速热启动DNA聚合酶的体系、加入KAPA 2G FAST DNA聚合酶和1抗体的混合物的第三封闭体系、加入1μl H2O的无酶体系。由图4和图5可以看出，能够封闭Taq DNA聚合酶活性的1抗体可以封闭Taq DNA聚合酶，KAPA2G快速热启动DNA聚合酶经过95度2min处理后具有延伸活性，其能够实现单链DNA的延伸，不能封闭Taq DNA聚合酶活性的2抗体不能够封闭Taq DNA聚合酶，Taq DNA聚合酶依旧就有延伸活性，Taq DNA聚合酶是具有延伸活性的，其能够实现单链DNA的延伸。上述试验结果与预期试验结果相同，表明本发明提供的检测核酸聚合酶活性的检测方法是可行的。
按照本发明提供的检测核酸聚合酶活性的检测方法检测核酸聚合酶活性，对照实施例2中未经高温处理的KAPA 2G快速热启动DNA聚合酶不具有活性，不能够促使反应体系进行延伸反应，经95度2min处理后具有延伸活性，能够实现单链DNA的延伸，此结果再次验证了本发明提供的检测核酸聚合酶活性的检测方法是可行的。
实施例4检测核酸聚合酶活性的检测方法的验证实验三
以KAPA HiFi高保真酶(KAPA Biosystem)为实验材料，对不同酶活力单位的KAPAHiFi高保真酶进行酶活力验证实验，正常情况下，酶活力单位数高的酶活性大。以实施例1提供的检测核酸聚合酶活性的检测方法为检测验证方法，具体为：
(1)分别构建四组初步反应体系：
Figure BDA0002562613460000081
(2)四组初步反应体系均在95℃反应3min后自然冷却，使得单链模板和引物充分结合。
(3)分别向四组初步反应体系中加入1μl H2O、1μl 0.05U的KAPA HiFi高保真酶、1μl 0.1U的KAPA HiFi高保真酶和1μl 0.5U的KAPA HiFi高保真酶进行qPCR链式反应，qPCR链式反应的反应程序为：然后按37℃反应3s,37℃反应30s进行链式循环反应99次，基于扩增曲线评估高保真酶的活性。
按上述试验方法进行试验，试验结果如图6所示，图6中标记1、2、3、4分别为加入0.5U的KAPA HiFi高保真酶的体系、0.1U的KAPA HiFi高保真酶的体系、0.05U的KAPA HiFi高保真酶的体系和H2O的无酶体系。由图6可以看出，酶活力单位数高的酶活性大。上述试验结果与预期试验结果相同，表明本发明提供的检测核酸聚合酶活性的检测方法是可行的，其可以用于评估高保真聚合酶的延伸活性。
实施例5检测核酸聚合酶活性的检测方法的验证实验四
以Taq DNA聚合酶(KAPA 2G FAST DNA聚合酶，KAPA Biosystem)为实验材料，对不同酶活力单位的KAPA 2G FAST DNA聚合酶进行酶活力验证实验，正常情况下，酶活力单位数高的酶活性大。以实施例1提供的检测核酸聚合酶活性的检测方法为检测验证方法，具体为：
(1)分别构建四组初步反应体系：
Figure BDA0002562613460000082
Figure BDA0002562613460000091
(2)四组初步反应体系均在95℃反应3min后自然冷却，使得单链模板和引物充分结合。
(3)分别向四组初步反应体系中加入1μl H2O、1μl 0.05U的KAPA 2G FAST DNA聚合酶、1μl 0.1U的KAPA 2G FAST DNA聚合酶和1μl 0.5U的KAPA 2G FAST DNA聚合酶进行qPCR链式反应，qPCR链式反应的反应程序为：60℃反应3s，60℃反应30s进行链式循环反应99次，基于扩增曲线评估Taq DNA聚合酶的活性。
按上述试验方法进行试验，试验结果如图7所示，图7中标记1、2、3、4分别为加入0.5U的KAPA 2G FAST DNA聚合酶的体系、0.1U的KAPA 2G FAST DNA聚合酶的体系、0.05U的KAPA 2G FAST DNA聚合酶的体系和H2O的无酶体系。由图7可以看出，起始阶段，酶活力单位数高的酶活性大。上述试验结果与预期试验结果相同，表明本发明提供的检测核酸聚合酶活性的检测方法是可行的，其可以用于评估Taq DNA聚合酶的延伸活性。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
序列表
<110> 北京启衡星生物科技有限公司
<120> 一种检测核酸聚合酶活性的检测方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
agacctagaa ttgcgtatga ttaacagaat atagaggtgg aggcgaaata tgggccagag 60
ttattgacta gcgatgtgtc tctcaaaggt aaaaatgttt 100
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aaacattttt acctttga 18

Claims (5)

1.一种检测核酸聚合酶活性的检测方法，其特征在于，检测核酸聚合酶延伸活性的模板为单链DNA，所述单链DNA与对应单链DNA设计的引物结合后加入核酸聚合酶进行qPCR链式反应，基于反应结果分析核酸聚合酶的活性，所述检测核酸聚合酶活性的检测方法所针对的核酸聚合酶为Taq DNA聚合酶和高保真聚合酶，所述单链DNA的序列如SEQ ID NO:1所示，对应单链DNA设计的引物序列如SEQ ID NO:2所示，所述单链DNA的结构为：
Figure FDA0003569812210000011
2.根据权利要求1所述的检测核酸聚合酶活性的检测方法，其特征在于，单链DNA、对应单链DNA设计的引物、10×PCR buffer、dNTP、H2O和荧光染料组成初步反应体系，所述单链DNA与对应单链DNA设计的引物的结合在初步反应体系中完成。
3.根据权利要求2所述的检测核酸聚合酶活性的检测方法，其特征在于，所述初步反应体系的反应条件为95℃反应3min后自然冷却。
4.根据权利要求2所述的检测核酸聚合酶活性的检测方法，其特征在于，向初步反应体系中加入核酸聚合酶进行qPCR链式反应，所述qPCR链式反应的反应程序为：37℃，20s预变性，然后按37℃反应3s,37℃反应3min进行链式循环反应99次。
5.根据权利要求2所述的检测核酸聚合酶活性的检测方法，其特征在于，所述初步反应体系中各组分的含量为：
Figure FDA0003569812210000021
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