CN116970612A - 特异性结合il-29蛋白的核酸适配体及衍生物、应用、试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了特异性结合IL‑29蛋白的核酸适配体及衍生物、应用、试剂盒，包括SEQ IDNo.1所示的核苷酸序列；或者，与SEQ ID No.1核苷酸序列具有高同源性并且能够特异性结合IL‑29蛋白的核苷酸序列；或者由SEQ ID No.1所示的核苷酸序列衍生的能够特异性结合IL‑29蛋白的核苷酸序列。本发明提供了一种具有高度特异性、化学性质稳定、易于保存和标记的能够结合IL‑29蛋白的核酸适配体及其衍生物，还相应提供所述核酸适配体的筛选方法与应用。

Description

特异性结合IL-29蛋白的核酸适配体及衍生物、应用、试剂盒

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，涉及核酸适配体，尤其涉及特异性结合IL-29蛋白的核酸适配体及衍生物、应用、试剂盒。

背景技术

适配体(aptamer)是单链DNA或RNA寡核苷酸片段，可特异性结合多种目标分子，如蛋白质、金属离子、细菌、维生素等。通过指数富集系统进化技术(Systematic evolutionof ligand by exponential enrichment,SELEX)可从随机的寡核苷酸文库中筛选得到与靶标分子特异性结合的单链DNA或RNA。适配体与靶标结合主要通过折叠形成特定的三维结构而与靶标通过氢键、范德华力等相互作用力在特定条件下实现高亲和力结合。与传统的抗原抗体结合相比较，适配体不仅具有与抗体相类似的功能，而且还有许多独有的优势。通过SELEX筛选得到的适配体合成方便、成本低，可直接进行体外合成；根据不同的实验需求可对适配体进行不同的基团修饰；稳定性高，高温耐受性好；筛选得到的适配体有高度的特异性，甚至可以分辨单个基团。由于适配体的诸多优势近年来受到诸多研究人员的青睐，适配体被应用于各种传感器的构建，在医疗诊断、环境污染物检测、食品危害物检测等领域受到了广泛应用。

白细胞介素-29(Interleukin-29,IL-29)是近年来发现的一种细胞因子，又称为干扰λ(Interferon,IFNλ)，是一种分泌蛋白，主要由成熟的树突状细胞和巨噬细胞产生，与IL-28A和IL-28B同属干扰素-λ(interferon-λ,IFN-λ)家族。IL-29通过结合特殊异二聚体受体复合物起始信号的转导和发挥生物学作用，其与Ⅰ型IFN共享相同的Jak-STAT信号传导途径，促进一种共同基因的表达。故IL-29表现出一些与Ⅰ型IFN相同的性质，如抗病毒、抗增殖、体内抗肿瘤以及免疫调节等生物学活性。近年来有关于IL-29生物学活性的研究日益广泛和深入，IL-29独特的细胞靶向性也引起越来越多的关注。IL-29显示出与IFNα相似的抗病毒、抗肿瘤活性，而其受体分布的组织特异性可有效降低毒副作用，因此，IL-29具有潜在的临床应用前景，有望研发成为临床疗效高且副作用比Ⅰ型IFN小的新一代干扰素。目前IL-29的检测主要是基于抗原抗体的检测，试剂盒昂贵，应用受限。因此仍需要更为精确、稳定、便捷、价格优惠的IL-29检测方法。核酸适配体可与靶标特异性结合，有望用于IL-29的临床检测和应用。现有监测方法主要缺陷在于：所需样本量多、检测时间长、灵敏度低、价格昂贵。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的目的是提供一种具有高度特异性、化学性质稳定、易于保存和标记的能够结合IL-29蛋白的核酸适配体及其衍生物，还相应提供所述核酸适配体的筛选方法，试剂盒与应用。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供了特异性结合IL-29蛋白的核酸适配体，包括SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；或者，与SEQ ID No.1核苷酸序列具有高同源性并且能够特异性结合IL-29蛋白的核苷酸序列；或者由SEQ ID No.1所示的核苷酸序列衍生的能够特异性结合IL-29蛋白的核苷酸序列。

作为本发明的一种优选方案，所述具有高同源性是指与SEQ ID No.1所示的核苷酸序列至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％的同源性。

作为本发明的一种优选方案，所述核酸适配体包含与所述核苷酸序列互补的核苷酸序列并且保持所述亲和力。

作为本发明的一种优选方案，所述核酸适配体的核苷酸序列包含碱基修饰并且保持所述亲和力。

作为本发明的一种优选方案，所述碱基修饰为硫代修饰、磷酸化修饰、甲基化修饰、氨基化修饰、巯基化修饰、硒取代氧修饰或连接同位素修饰。

本领域技术人员应该理解，作为对上述技术方案的改进，可对上述核酸适配体的核苷酸序列上的某一位置进行修饰，例如，磷酸化、甲基化、氨基化、巯基化、用硫取代氧、用硒取代氧或连接同位素化等，条件是这样修饰后得到的核酸适配体序列具有合乎需要的性质，例如，可以具有与修饰前的母体核酸适配体序列相等或更高的结合IL-29蛋白的亲和力，或虽然亲和力没有明显提升但是具有更高的稳定性。

作为本发明的一种优选方案，所述核酸适配体的核苷酸序列包含标记物并且保持所述亲和力。

作为本发明的一种优选方案，所述标记物为荧光标记物，放射性标记物、治疗性标记物、生物素标记物、地高辛标记物、纳米发光材料标记物、小肽标记物、siRNA标记物或酶标记物。

本领域技术人员应该理解，作为对上述技术方案的改进，可在上述核酸适配体的核苷酸序列上连接荧光物质，放射性物质、治疗性物质、生物素、地高辛、纳米发光材料、小肽、siRNA或酶标记等，条件是这样修饰后得到的核酸适配体序列具有合乎需要的性质，例如，可以具有与修饰前的母体核酸适配体序列相等或更高的结合IL-29蛋白的亲和力，或虽然亲和力没有明显提升但是具有更高的稳定性。

换言之，以上不论是经部分取代或经过修饰后的核酸适配体序列，都具有原核酸适配体基本相同或类似的分子结构、理化性质和功能，都可应用于与IL-29蛋白的结合。

第二方面，本发明还提供核酸适配体衍生物，所述衍生物是由前述所有技术方案中所述核酸适配体的核苷酸序列的骨架衍生出的硫代磷酸酯骨架，或者是前述所有技术方案中所述核酸适配体改造成的相应肽核酸。

第三方面，本发明还提供了一种前述核酸适配体或者核酸适配体衍生物的应用。例如，本发明的核酸适配体或其衍生物可以用于IL-29蛋白的检测，可以使用本发明的核酸适配体或其衍生物来检测受试者的IL-29蛋白的含量。

或者，所述核酸适配体或者所述核酸适配体衍生物在生物传感器上的应用。

以上不论是衍生出的核酸适配体还是衍生出的其他衍生物，都具有与原核酸适配体基本相同或类似的分子结构、理化性质和功能。

第四方面，本发明提供一种检测IL-29蛋白的试剂盒，所述试剂盒包括本发明第一方面所述的核酸适配体。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1)核酸适配体与抗体相比分子量小，稳定性更好，易改造修饰，无免疫原性，制作周期短，可以通过人工合成等优势，免去了动物免疫、饲养、蛋白提取和纯化等一系列流程，因此核酸适配体是一种非常理想的分子探针。针对于IL-29蛋白的核酸适配体还没有人公布且没有人应用该适配体，因此，本领域对针对IL-29蛋白有高结合亲和力的核酸适配体存在需求。

2)核酸适配体相较于抗体，更稳定，由于是化学合成，批间差异几乎没有；并将该核酸适配体成功用于IL-29蛋白的检测。

3)本发明经过筛选得到的适配体具有特异性高、稳定性高、方便合成且分子量低易于修饰且有望替代抗体用于IL-29蛋白的检测及生物传感器等产品的制备。

附图说明

图1是本发明的SEQ ID No.1所示序列的模拟二级结构。

图2是实施例1各轮正反筛洗脱比。

图3是本发明核酸适配体的序列的SPR检测结果。

图4是核酸适配体IL-29-14与IL-29蛋白的亲和力检测结果。

图5是实施例4显色结果。

图6是实施例4的浓度与吸光度结果。

图7是实施例4的浓度与吸光度线性结果。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

特异性结合IL-29蛋白的ssDNA核酸适配体的筛选

1.设计DNA文库和引物

随机单链DNA文库：5’-CTACGGTGCCTTGAAGTGAC-N(36)-CATAGCAGGTCACTTCCAGG-3’；其中，“N(36)”表示36个任意的核苷酸碱基连接而成的序列。该文库由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

引物信息如表1所示，由通用生物(安徽)股份有限公司合成。

表1.IL-29引物及其序列

引物分别用缓冲液DPBS(DPBS：100mM，NaCl：150mM，KCl：1mM，MgCl2：1mM，CaCl2：1mM；PH 7.4，25℃)配制成100μM的贮存液，于-20℃保存备用。

2.磁珠法筛选

采用磁珠法筛选，共计筛选7轮，每一轮的筛选流程见表2。

表2.IL-29蛋白适配体筛选流程

具体筛选方法如下：

一)羧基磁珠固定IL-29及BSA

(1)IL-29偶联：取60μL羧基磁珠用ddH₂O洗4次，加入EDC和NHS各50μL混合活化25min，活化后用ddH₂O洗一次，加入10ug IL-29(义翘神州，货号12339-HNAH)及90μL pH5.0醋酸钠室温偶联60min。偶联后加入100μL乙醇胺室温孵育10min，用pH7.4 DPBS洗四次，记作MB-正筛。

(2)BSA偶联：取50μL羧基磁珠用ddH2O洗4次，加入EDC和NHS各50μL混合活化25min，活化后用ddH2O洗一次，加入BSA(10mg/mL)室温偶联60min。偶联后加入100μL乙醇胺室温孵育10min，用pH7.4 DPBS洗四次，记作MB-反筛。

2)文库变复性

取1OD随机单链核苷酸文库，12000rpm离心10分钟，将文库离心到管底，用pH7.4DPBS缓冲液溶解至10μM，分装到PCR管进行变复性处理。处理过程如下：PCR仪设定程序95℃保持10min，此步骤目的是使折叠的链解开，然后4℃保持5min，再25℃保持5min。

3)反筛

文库变复性后首先与偶联好的BSA磁珠混合，于垂直旋转仪上室温孵育；孵育结束后于磁力架上进行磁吸，收集上清，记作pool-；BSA磁珠用DPBS洗四次，磁珠加200μLDPBS沸水浴10min，收集上清记作Elution-。将pool-与IL-29磁珠进行正筛。

4)正筛

pool-与IL-29磁珠混合孵育，孵育结束后于磁力架进行磁吸，收集上清，记作pool+；IL-29磁珠用DPBS洗四次，磁珠加200μLDPBS沸水浴10min，收集上清记作Elution+。

5)Q-PCR扩增

分别取2μL Elution-及Elution+加入30μL小扩mix于八联排PCR管进行Q-PCR扩增扩增条件如下：95℃预变性2分钟，95℃变性60秒，60℃退火60秒，72℃延伸60秒，共25个循环。依据Q-PCR结果判断文库的富集程度。

6)PCR扩增

以elution+中的核酸分子为模板，用乳浊液PCR(ePCR)进行扩增：将全部模板elution+加入2mL PCR mix中混匀，加入4倍体积的ePCR微液滴生成油，涡旋制备乳浊液；将乳浊液分成100μL/管加入到PCR管中，扩增条件如下：95℃预变性2分钟，95℃变性60秒，60℃退火60秒，72℃延伸60秒，共32个循环，4℃保存。PCR mix的配方见表3。

扩增产物用正丁醇纯化：收集所有的ePCR产物于15mL尖底离心管中，加入2倍体积的正丁醇，在旋涡混合器上震荡以充分混匀；台式离心机，9000rpm(转/分钟)离心10分钟；移弃上相(正丁醇)，得到浓缩的PCR扩增产物，按体积比1:1加入TBE/尿素变性缓冲液，煮沸变性15分钟使DNA变性，将所有的样品进行尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，300V电压下电泳至溴酚蓝到达胶底部，使加长的FAM标记的链与反向的链分开，7M尿素变性聚丙烯酰胺凝胶配方如表4。

表3.ePCR mix配方

表4.变性聚丙烯酰胺凝胶配方

成分	用量
		尿素	3.78g
40％聚丙烯酰胺	1.8mL
		5×TBE	1.8mL
ddH2O	2.25mL
		10％APS	60μL
TEMED	15μL

切胶回收FAM标记的链：将凝胶取出放在塑料膜上,用干净的刀片将目的条带直接切下，将胶条转移至1.5mLEP管中并捣碎，加入1mL ddH2O后沸水浴10分钟将胶中的ssDNA转移至溶液中，离心去除胶的碎片，留上清。上清用正丁醇纯化，方法同上。得到DNA单链用3KD的透析袋透析过夜，即可作为下一轮筛选的文库。

磁珠法重复筛选7轮，每次操作均以前一次操作中得到的次级文库为起始核酸文库，各轮正、反筛的洗脱比如图2所示。筛选过程中用SPR检测DNA单链文库对IL-29蛋白识别能力的变化，当DNA单链文库对IL-29蛋白的识别能力满足要求，即筛选后的DNA单链文库与靶标的结合能力高于筛选起始投入的文库，将所得产物经克隆测序分析，最终得到核酸适配体。

所述筛选方法中，逐轮增加筛选压力，以增进筛选核酸适配体的富集程度，缩短筛选进程。所述增加筛选压力包括减少投入的单链DNA文库的量、靶标蛋白的用量和两者的孵育时间，增加清洗时间，清洗次数以及加大反筛磁珠的用量。

7)筛选文库亲和力检测

将得到的富集文库产物经克隆测序分析后，挑选若干条序列由上海生工合成，检测亲和力，亲和力检测方法详见实施例2。确定了1条序列具有很强的结合能力，且验证后具有理想的结合IL-29蛋白的亲和力，将它命名为IL-29-14(SEQ ID NO.1)。核酸适配体IL-29-14(SEQ ID NO.1)的二级结构预测图如下图所示。实例2进一步展示了IL-29在筛选过程的亲和力变化，可见随着筛选轮数的进行，有亲和力的文库正在不断富集，筛选效果良好。

IL-29-14(SEQ ID NO.1)：

CTACGGTGCCTTGAAGTGACGACCCCGCACTCAGCGACCGTGTGTTGTGCATCGTCCATAGCAGGTCACTTCCAGG。

SEQ ID NO.1二级结构预测图如图1所示。

实施例2

表面等离子共振(SPR)检测筛核酸适配体文库与IL-29蛋白亲和力

实验方法：

1)取一张CM5芯片(购买自GE公司，货号BR100530)，芯片用1％ SDS NaOH清洗芯片两次，流速为30μL/min，时间180s，400μL 50mM NaOH清洗一次，流速为30μL/min，时间180s。

2)芯片活化，偶联，封闭。(FC1-1活化后偶联BSA 7000Ru，FC1-2活化后偶联IL-29蛋白5000Ru)；

3)用0.1M NHS与0.4M EDC的混合试剂(1:1)活化1通道，时间600s，流速5μL/min。

4)PH 4.5的醋酸钠溶液将BSA稀释，按照1:10的比例稀释，进样FC1-1通道，时间600s，流速5μL/min，连到芯片表面的值有7000RU。用PH 5.0的醋酸钠溶液将IL-29蛋白稀释，按照1:20的比例稀释，进样FC1-2通道，时间600s，流速5μL/min，连到芯片表面的值有5000RU。

5)PH 8.5乙醇胺溶液封闭1通道，时间600s，流速5μL/min。

6)亲和力检测：将筛选所得文库用DPBS稀释至500nM*200μL进样，设定程序：通道为1；进样240s，流速为30μL/min，解离时间60s；1.5M NaCl进行再生，再生条件为：进样时间60s，流速为30μL/min。

实验结果：如图3所示，随筛选进行，1至7轮文库亲和呈上升趋势，筛选效果良好，且与对照蛋白没有结合，特异性良好。

实施例3

表面等离子共振检测核酸适配体与IL-29蛋白的亲和力

委托安徽通用生物合成核酸适配体IL-29-14(SEQ ID NO:1)，用DPBS缓冲液稀释成：15.625、31.250、62.500、125、250、500nM。

将IL-29蛋白偶联到CM5芯片表面：先用50mM NaOH清洗芯片，进样20μL，流速10μL/min，然后用将等体积的EDC水溶液和NHS水溶液混合后进样50μL活化芯片，流速5μL/min。将IL-29蛋白用pH 5.0的10mM醋酸钠稀释至终浓度为50μg/mL后进样，进样体积50μL，流速5μL/min，IL-29蛋白偶联量为4500Ru。进样完成后，进乙醇胺封闭芯片，流速5μL/min，进样50μL。

检测：使用表面等离子共振仪(GE Healthcare，型号：Biacore 8000)设定动力学检测参数，进样30μL/min*3min，解离30μL/min*5min，再生1M NaCl 30μL/min*0.5min，将稀释好各个浓度的核酸适配体IL-29-14进样。

核酸适配体IL-29-14与IL-29蛋白的亲和力检测结果如图4所示，可以看出，随适配体浓度的不断升高，适配体结合蛋白的值也不断升高，且具有良好的线性关系，这些数据说明SPR仪均检测到IL-29-14与IL-29蛋白有很强的结合，经过系统的拟合，最终给出的KD值为7.05nM。

实施例4

ELISA验证核酸适配体与IL-29蛋白亲和力

取一块新的酶标板，在A1-A8孔中用包被缓冲液(0.05M Na2CO3/NaHCO3缓冲液pH9.6)将IL-29蛋白稀释8个梯度：1.95ng/mL、0.96ng/mL、0.48ng/mL、0.24ng/mL、0.12ng/mL、0.06ng/mL、0.03ng/mL和0ng/mL，包被过夜。包被完成后，去上清，清洗一遍。用1×pH 9.6碳酸盐包被液将BSA蛋白稀释至10mg/mL，每孔加入150μL，封闭板上多余的位点，时间为24h，去上清，用DPBS(含0.05％吐温-20)清洗1遍，甩干。

A1-A8孔加入100μL 1nM的IL-29-14单克隆(生物素修饰)，室温孵育1h。孵育结束后用DPBS(含0.05％吐温-20)清洗3遍，清洗时放置在摇床上，每次10分钟，每次清洗结束，甩干。加入SA-HRP(购自碧云天，货号A0303)用DPBS按照1:25000(v/v)配制，室温摇床孵育30分钟。用DPBS(含0.05％吐温-20)清洗3遍，清洗时放置在摇床上，每次10分钟，每次清洗结束，甩干。每孔加入100μL TMB显色液，在室温显色1分钟，肉眼观察颜色变化。

结果如图所示(图5与图6)，从左至右蛋白浓度逐渐降低，显色也逐渐变浅，且蛋白浓度与吸光度在0.24ng/mL-1.95ng/mL范围内成正比(图7)，浓度与吸光度线性关系较好，说明IL-29-14单克隆与IL-29蛋白具有较好的亲和力。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。

Claims (10)

1.特异性结合IL-29蛋白的核酸适配体，其特征在于，包括SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；或者，与SEQ ID No.1核苷酸序列具有高同源性并且能够特异性结合IL-29蛋白的核苷酸序列；或者由SEQ ID No.1所示的核苷酸序列衍生的能够特异性结合IL-29蛋白的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的特异性结合IL-29蛋白的核酸适配体，其特征在于，所述具有高同源性是指与SEQ ID No.1所示的核苷酸序列至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％的同源性。

3.根据权利要求1或2所述的特异性结合IL-29蛋白的核酸适配体，其特征在于，所述核酸适配体包含与所述核苷酸序列互补的核苷酸序列并且保持亲和力。

4.根据权利要求1或2所述的特异性结合IL-29蛋白的核酸适配体，其特征在于，所述核酸适配体的核苷酸序列包含碱基修饰并且保持亲和力。

5.根据权利要求4所述的特异性结合IL-29蛋白的核酸适配体，其特征在于，所述碱基修饰为硫代修饰、磷酸化修饰、甲基化修饰、氨基化修饰、巯基化修饰、硒取代氧修饰或连接同位素修饰。

6.根据权利要求1或2所述的特异性结合IL-29蛋白的核酸适配体，其特征在于，所述核酸适配体的核苷酸序列包含标记物并且保持亲和力。

7.根据权利要求6所述的特异性结合IL-29蛋白的核酸适配体，其特征在于，所述标记物为荧光标记物，放射性标记物、治疗性标记物、生物素标记物、地高辛标记物、纳米发光材料标记物、小肽标记物、siRNA标记物或酶标记物。

8.特异性结合IL-29蛋白的核酸适配体衍生物，其特征在于，所述核酸适配体衍生物是由权利要求1-7任一项所述核酸适配体的核苷酸序列的骨架衍生出的硫代磷酸酯骨架，或者是由权利要求1-7任一项所述核酸适配体改造成的相应肽核酸。

9.权利要求1-7任一项所述的特异性结合IL-29蛋白的核酸适配体或权利要求8所述的核酸适配体衍生物的应用，其特征在于，所述核酸适配体或者所述核酸适配体衍生物检测IL-29蛋白上的应用或者生物传感器上的应用。

10.检测IL-29蛋白的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1-7任一项所述的特异性结合IL-29蛋白的核酸适配体或者权利要求8所述的核酸适配体衍生物。