KR20090032276A - 옥시테트라사이클린에 특이적으로 결합하는 ｄｎａ 앱타머및 그 제조방법 - Google Patents

옥시테트라사이클린에 특이적으로 결합하는 ｄｎａ 앱타머및 그 제조방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20090032276A
KR20090032276A KR1020070097352A KR20070097352A KR20090032276A KR 20090032276 A KR20090032276 A KR 20090032276A KR 1020070097352 A KR1020070097352 A KR 1020070097352A KR 20070097352 A KR20070097352 A KR 20070097352A KR 20090032276 A KR20090032276 A KR 20090032276A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
dna
oxytetracycline
magnetic beads
aptamer
otc
Prior art date
Application number
KR1020070097352A
Other languages
English (en)
Other versions
KR100930973B1 (ko
Inventor
구만복
모하메드 제이브드 후세인 니아지 콜칼
김연석
김윤진
이수진
Original Assignee
고려대학교 산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 고려대학교 산학협력단 filed Critical 고려대학교 산학협력단
Priority to KR20070097352A priority Critical patent/KR100930973B1/ko
Priority to PCT/KR2008/005696 priority patent/WO2009041776A2/en
Publication of KR20090032276A publication Critical patent/KR20090032276A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR100930973B1 publication Critical patent/KR100930973B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/115—Aptamers, i.e. nucleic acids binding a target molecule specifically and with high affinity without hybridising therewith ; Nucleic acids binding to non-nucleic acids, e.g. aptamers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)

Abstract

본 발명은 옥시테트라사이클린에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 랜덤 DNA 라이브러리로부터 선택된 옥시테트라사이클린에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 및 그 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 랜덤 DNA pool로부터 항생물의 한 종류인 옥시테트라사이클린에 대해 특이적으로 높은 친화도를 보이는 DNA 앱타머를 SELEX process의 변형된 방법인 FluMag-SELEX process를 이용하여 선별하고, 선별된 DNA 앱타머들의 염기서열, 특성 및 옥시테트라사이클린에 대한 결합력을 분석하였다. 따라서 본 발명의 DNA 앱타머를 이용하여 상하수원, 식뭄, 인체 등으로부터 잔류 항생물질의 검출을 보다 효과적 수행할 수 있다.
옥시테트라사이클린, 항생물질, SELEX, DNA 앱타머, 생물농축

Description

옥시테트라사이클린에 특이적으로 결합하는 ＤＮＡ 앱타머 및 그 제조방법 {DNA aptamer binding to Oxytetracycline with specificity and production method thereof}
본 발명은 옥시테트라사이클린(Oxytetracycline)에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 랜덤 DNA 라이브러리로부터 선택된 옥시테트라사이클린에 특이적으로 결합 가능한 DNA 앱타머 및 그 제조방법에 관한 것이다.
옥시테트라사이클린(Oxytetracycline, OTC)은 매우 광범위하게 사용되는 항생제인 테트라사이클린(tetracycline) 그룹의 하나이다. 이것은 동물용 약품으로 일반적으로 사료 첨가물 또는 성장 촉진인자로 사용되어 사육동물의 성장률을 높이는데 이용되거나 우럭, 광어 등의 양식 수산물, 축산물의 감염 예방 차원에서 직접 투여되기도 한다. 그러나 문제되는 점은 동물의 사료 찌꺼기나 배설물에 들어있던 잔류 OTC가 토양이나 물에 흡수되어 있다가 환경에서의 여러 경로를 통하여 사람에 게까지 영향을 줄 수 있다는 것이다. 특히 임산부나 소아에게 미치는 영향으로는 치아와 뼈가 황갈색으로 변할 수 있고, 태아의 골격발육을 지연시켜 기형아 출산 위험성이 높은 것으로 알려지고 있다.
또한 OTC 등의 항생제가 잔류되어 있는 축수산물을 장기간 섭취할 경우에 생체 내에 내성이 생겨 면역력을 떨어뜨리는 등 부작용이 생길 수 있다. 다시 말해 동물들에 대한 항생제 오남용으로 인해 일반적인 식중독균이 ‘다제내성균’(슈퍼 박테리아)이 되어버린다면, 일반적으로 사용하는 항생제로는 식중독을 치료할 수 없게 된다는 것이고 이를 낫게 하기 위해서 더 독한 항생제를 투여하는 악순환이 반복되는 것이다. 따라서 항생제의 오남용을 방지하는 것은 물론이고 식품의 안전성을 확보하기 위해 잔류되어 있는 항생제를 검출해 내는 방법을 개발하는 것 또한 필요한 실정이다.
앱타머(aptamer)는 특정 타겟에 대해 높은 특이성과 친화도를 가지는 단일가닥 DNA 또는 RNA의 구조체를 말한다. 앱타머는 센서 분야에서 이용되는 기존의 감지물질인 항체보다도 훨씬 타겟에 대한 친화도가 높고, 열 안정성이 우수하며 시험관내(in vitro)에서 합성이 가능하기 때문에, 동물에게 항원을 주입하여 항체를 얻어낼 필요가 없어 비용 면에서 훨씬 우위에 있으며, 타겟물질에 제약이 없어 단백질, 아미노산 같은 생분자나 환경호르몬이나 항생제 같은 작은 유기화학 물질, 박테리아 등의 다양한 타겟에 대한 앱타머를 합성할 수 있다. 이렇게 표적 물질과 특이적으로 결합하는 앱타머의 특성으로 인해 최근 들어 앱타머를 신약개발, 약물전달 시스템 그리고 바이오센서 등의 연구에 이용하기 위해 많은 연구가 이루어지고 있다. 따라서 앱타머는 극미량의 잔류 항생제의 검출방법에 도입하기에 매우 적절한 물질이며, 이를 활용한 나노바이오 기술을 이용하여 다른 특정 물질을 검출하는데도 응용할 수 있다.
기존의 잔류항생제 검출방법은 잔류 항생제가 녹아있는 성분에 따라 각기 다른 시험용액을 조제하여 잔류항생제를 추출, 정제하여 액체크로마토그래피로 정량하는 방법을 사용한다. 어떤 물질에서든 특이적으로 옥시테트라사이클린에 결합하여 검출이 가능한 앱타머와는 달리 기존의 방법은 녹인 물질에 따른 시험법도 소수이며, 시험용액을 각기 조제하는 데에도 번거롭다. 또한 추출, 정제 과정 중에 옥시테트라사이클린의 손실이 있을 수도 있으므로 정확한 정량이 어렵다. 잔류의약품이나 잔류항생제등의 저분자를 검출할 수 있는 우리의 기술과는 달리 기존의 앱타머 개발은 대부분 의료 진단용 바이오센서 개발이나 신약 개발에 사용하기 위해 단백질을 질병 관련 표적물질로 하는 앱타머 연구가 주된 목표였다. 이러한 잔류의약품, 항생제 및 환경호르몬 등과 같은 저분자 유해물질 결합 특이적 앱타머들은 상수원 및 하천에 잔류하는 물 시료 뿐 아니라 인체 등 생체 내에서의 잔류 유해물질 검출 및 진단 기술과 같은 의료 기술로의 적용이 가능한데 비하여 기존의 잔류항생제 검출은 식품이나 물에만 적합한 방법만 제시되어 왔다.
이에, 본 발명자들은 상기 종래기술들의 문제점들을 극복하기 위하여 예의 연구노력한 결과, 항생물질의 한 종류인 옥시테트라사이클린에 대해 특이적으로 높은 친화도를 보이는 핵산 구조체인 DNA 앱타머를 개발하였다. 또한, 상기 옥시테트라사이클린에 특이적으로 결합 가능한 DNA 앱타머를 포함하는 조성물을 제조하여 식품, 상하수원, 인체 등으로부터 잔류 항생물질을 효과적으로 검출할 수 있음을 확인하고, 본　발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 주된 목적은 옥시테트라사이클린에 대해 특이적으로 높은 친화도를 보이는 DNA 앱타머 및 그 제조방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 DNA 앱타머를 이용한 옥시테트라사이클린 검출용 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 옥시테트라사이클린(Oxytetracycline)에 특이적으로 결합 가능한 DNA 앱타머를 제공한다. 본 발명에서는 상기 옥시테트라사이클린에 특이적으로 결합 가능한 DNA 앱타머를 SELEX process를 이용하여 선별하였다. 본 발명에 사용된 SELEX process는 임의적으로 합성된 DNA 또는 RNA의 집합에서 특정 분자에 대해 높은 결합력을 지니는 DNA 또는 RNA를 선별하여 증폭시킴으로써 해당 분자의 DNA 결합 서열을 알아내는 방법 (Louis C. Bock, Linda C. Griffin, John A. Latham, Eric H. Vermaas, John J. Toole. 1992. Selection of single-stranded DNA molecules that bind and inhibit human thrombin. Nature 355, 564-566)을 말한다.
본 발명의 DNA 앱타머에서, 상기 DNA 앱타머는 상기 SELEX process에 의해 선택된 옥시테트라사이클린에 특이적으로 결합하는 어떠한 염기서열의 DNA 앱타머일 수 있으나, 바람직하게는 서열번호 1 내지 서열번호 15중 어느 하나의 염기서열 을 갖는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 옥시테트라사이클린(oxytetracycline)에 특이적으로 결합 가능한 DNA 앱타머의 제조방법을 제공한다:
a) 옥시테트라사이클린과 자성비드(magnetic beads)를 붕산염(borate) 버퍼용액에서 반응시켜 공유결합을 유도하는 단계;
b) 양 끝에 PCR용 프라이머 영역을 포함하고 중앙에 30-50개의 임의의 염기를 가지는 DNA pool과 상기 공유결합으로 얻은 옥시테트라사이클린-자성비드를 버퍼용액에서 혼합하여 상온에서 결합을 유도하는 단계;
c) 상기 옥시테트라사이클린-자성비드에 결합된 DNA를 자석을 이용하여 분리하는 단계;
d) 상기 분리된 옥시테트라사이클린-자성비드로부터 DNA를 분리시키는 단계; 및
e) 상기 PCR용 프라이머 영역에 상보적인 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 수행하여 옥시테트라사이클린에 특이적으로 결합하는 DNA를 증폭시키는 단계.
본 발명의 방법에서, 상기 a)단계의 공유결합은 옥시테트라사이클린의 아미노기(amino group)와 자성비드의 토실기(tosyl group)의 공유결합인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 방법에서, 상기 a)단계 후, 공유결합된 옥시테트라사이클린-자성비드에서 옥시테트라사이클린과 결합하지 않은 자성비드의 토실기를 에탄올아 민(ethanol amine) 용액으로 40-50℃에서 6-18시간 동안 불활성화 시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 방법에서, 상기 d)단계에서 DNA의 분리는 70-90℃에 3-10분간 두어 DNA를 옥시테트라사이클린-자성비드로부터 분리하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 방법에서, 상기 e)단계에서 프라이머 쌍 중 하나에 플루오레세인(fluorescein)이 붙여진 프라이머를 사용하여 PCR을 수행한 후, 전기영동을 통해 상기 플루오레세인에 의해 변성된 단일가닥 DNA를 분리하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 옥시테트라사이클린에 특이적으로 결합 가능한 DNA 앱타머를 포함하는 옥시테트라사이클린 검출용 조성물을 제공한다.
본 발명의 조성물에서, 상기 DNA 앱타머는 제 1항의 앱타머인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 옥시테트라사이클린 조성물은 잔류 허용기준을 초과하는 항생제 중에서 가장 많이 검출되는 항생제인 옥시테트라사이클린(Oxytetracycline, OTC)을 검출하기 위한 것으로, 잔류 항생제는 매우 적은 양으로 식품이나 환경에 존재하더라도 생물농축현상 등과 같은 여러 환경적인 경로에 의해서 최종 소비자인 사람에게 영향을 미칠 수 있기 때문에, 축수산물에서 광범위하게 사용되고 있는 잔류 항생물질을 검출 및 제거하는 기술이 필요하다. 따라서 옥시테트라사이클린의 검출을 위해 본 발명의 DNA 앱타머를 이용하여 어떠한 형태로도 사용할 수 있다. 예를 들 어, 본 발명의 DNA 앱타머를 자성비드에 고정화시켜 옥시테트라사이클린을 결합시키게 되면 결합된 DNA 앱타머-옥시테트라사이클린 복합체(complex)를 자석을 이용하여 분리할 수 있게 되고, 이 복합체로부터 다시 옥시테트라사이클린을 분리함으로써 옥시테트라사이클린만을 선택적으로 검출할 수 있게 된다. 또한 본 발명의 DNA 앱타머-자성비드를 본 발명의 실시예에 기술된 방법 이외에도 본 발명의 DNA 앱타머와 연결자로 연결된 센서를 이용하여 시료 중의 옥시테트라사이클린을 검출하는 방법 등을 사용할 수 있다.
본 발명의 조성물을 이용하는 옥시테트라사이클린의 제거방법의 한 예를 들면, 상기 DNA 앱타머가 고정화된 자성비드를 컬럼(column)에 채운 후 옥시테트라사이클린을 포함하는 시료를 통과시켜 옥시테트라사이클린만을 선택적으로 제거할 수 있다.
이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다.
1) 자성 비드에 옥시테트라사이클린(Oxytetracycline, OTC) 고정
OTC의 아미노기(amino group)와 자성비드의 토실기(tosyl group)는 공유결합을 형성하게 되는데 이것을 위해 OTC와 자성비드를 버퍼용액에 넣고 반응시킨다. OTC가 결합된 자성비드는 자석을 이용해서 분리가 가능하며 같은 버퍼용액으로 비드를 세척하여 결합하지 않은 OTC를 제거한다.
2) OTC(Oxytetracycline) 결합 특이적 DNA 앱타머 개발
표적 물질 특이적인 앱타머를 개발하기 위한 방법으로는 일반적으로 SELEX(Systematic Evolution of Ligand by Exponential Enrichment) 방법이 널리 사용되고 있다. 본 발명에서는 일반적인 SELEX를 변형한 FluMag-SELEX process를 이용하여 OTC에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머를 개발하였다. 본 발명에 이용된 FluMag-SELEX process는 DNA 증폭단계에서 형광 표지된 프라이머(fluorescence labelled primer)를 사용함으로써 이어지는 PAGE를 이용한 PCR product sepatarion (dsDNA->ssDNA)과정에서 형광을 띠는 밴드만 취하면 되는 이점을 이용하기 위한 변형이며, 타겟과 결합하는/결합하지 않는 DNA를 구별해내는 방법으로 자석(magnet)을 이용한 SELEX 방법이다. 기존의 다른 SELEX의 경우, 방사선 표지(radioactive label), capillary electrophoresis, membrane filter 등을 이용했었는데, 경비가 많이 들고 핸들링 하기가 어려운 단점이 있다. PCR product를 분리하기 위해서는 chromatography, affinity column 등이 이용되었지만 가격이 비싸고, 효율이 떨어지는 문제가 있다(R. Stoltenburg, C. Reinemann, B. Strehlitz (2005) Anal Bioanal Chem 383: 83-91).
이를 위하여 먼저 76개의 임의의 염기를 가진 DNA pool을 합성하였으며, 이 DNA pool을 OTC가 고정되어 있는 자성 비드와 함께 버퍼용액에 넣고 혼합하여 결합 반응을 시킨 후 자석을 이용해 OTC와 결합하지 않은 DNA를 제거하였다. 고온 처리를 하여 OTC와 결합한 DNA를 자성비드에서부터 분리시킨 다음 에탄올 침전법으로 용리된 DNA를 확보하였다.
OTC에 특이적으로 결합하는 DNA의 양을 늘리기 위해 PCR을 수행하고 PCR 반 응물을 정제한 후 고농도의 요소(urea)가 들어있는 폴리아크릴아마이드 젤로 전기영동을 하여 분리된 두 개의 단일 가닥 DNA를 얻었다. 적합한 DNA 밴드를 젤 추출(gel extraction)한 후 다시 에탄올 침전법으로 분리된 DNA를 확보한다. 이 때 확보된 DNA pool은 다시 처음의 OTC가 고정되어 있는 자성비드 용액과 혼합하여 OTC와 반응시킨다. 이러한 일련의 과정을 반복하여 90%이상이 OTC에 결합하는 DNA pool을 얻은 후 DNA pool을 TOPO cloning kit를 이용하여 클로닝(cloning)하고 얻어진 콜로니에서부터 DNA를 추출하여 염기분석을 시행할 결과, 서로 다른 15개의 OTC에 특이적으로 결합하는 핵산 구조체를 확보하였다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
실시예 1. 자성비드에 옥시테트라사이클린(OTC)의 결합
옥시테트라사이클린(OTC, Sigma Co.)의 아미노기(amino group)와 자성비드(M-280 Tosylactivated magnetic beads, Dynal Biotech ASA, Norway)의 토실기(tosyl group)는 공유결합을 형성하게 되는데, 이것을 위해 10 mM의 OTC와 0.2× 109 개의 자성비드를 버퍼용액(0.1 M borate buffer, pH 10.5)에 넣고 45 ℃에서 24 시간 반응시켰다. OTC가 결합된 자성비드(옥시테트라사이클린-자성비드)는 자석을 이용해서 분리가 가능하며 같은 버퍼용액으로 비드를 세척하여 결합하지 않은 OTC를 제거하였다. OTC가 결합된 자성비드는 세척 후 0.5M의 에탄올아민 용액(ethanol amine, pH 8.0)과 45℃에서 12시간 반응시켜 OTC와 결합하지 않은 토실기를 불활성시켰다. 활성을 가지고 있는 토실기가 남아있으면 분자간의 여러 가지 상호작용, 예컨대, 반데르발스 결합, hydrophobic interaction 등으로 인해 nonspecific binding이 일어날 수 있기 때문에 활성이 거의 없다고 알려진 에탄올아민 용액으로 활성기를 차단(blocking)시켰다. 수차례 세척 후 버퍼용액(0.1 M borate, pH 9.5)에 자성 비드를 혼합하여 4℃에서 보관하였다.
실시예 2. 임의의 염기서열을 가지는 DNA pool 합성
76mer DNA pool로서 양 끝에 PCR을 위한 프라이머 영역(primer region)이 있고 중앙에 40개의 임의의 염기를 가진 DNA pool을 아래와 같은 방법으로 합성하였다. 본 발명에 사용된 DNA pool은 Genotech Inc. Korea에 화학적으로 합성을 의뢰하였다.
CGTACGGAATTCGCTAGC-N40-GGATCCGAGCTCCACGTG
실시예 3. 옥시테트라사이클린과 결합하는 DNA 앱타머의 선별
실시예 2에서 합성된 랜덤 DNA pool을 9.35 μmole의 OTC가 고정되어 있는 자성 비드와 함께 버퍼용액(20mM Tris-Cl buffer, pH 7.6 contained 100mM NaCl, 2mM MgCl2, 5mM KCL, 1mM CaCl2 및 0.02% Tween 20)에 넣고 혼합하여 30분간 상온에서 반응시킨 후 OTC와 결합하지 않은 DNA를 제거하기 위해 위의 혼합액이 들어있는 튜브를 자석에 고정시켜서 OTC와 결합하지 않은 DNA를 제거하고, 결합력이 약한 DNA를 제거하기 위해 버퍼용액으로 5회 세척하였다. OTC와 결합한 DNA를 용리하기 위해서는 튜브를 80℃에서 5분간 두어 DNA를 자성비드에서부터 분리시킨 다음 에탄올 침전법으로 용리된 DNA를 확보하였다. 이렇게 얻어진 OTC에 결합하는 DNA의 양을 측정하였다. 도 3에서는 eluted ssDNA의 양이 각각의 선별단계(selection round)에서 얻어진 OTC에 결합하는 DNA의 양을 보여준다.
실시예 4. 옥시테트라사이클린과 결합 가능한 DNA 앱타머 pool의 제조
OTC 결합 특이적인 DNA의 양을 늘리기 위해 이미 알고 있는 프라이머 영역을 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR 생산물은 두 가닥의 DNA이므로 이를 단일가닥으로 분리하기 위한 과정을 위하여, 아래와 같이 하나의 프라이머에는 플루오레세인(fluorescein)을 고정하였다.
forward (APTFf) 5’-fluorescein-CGTACGGAATTCGCTAGC
reverse (APTR) 5’-CACGTGGAGCTCGGATCC-3’
PCR 반응물을 정제키트(purification kit)를 이용하여 정제한 후 이중가닥의 DNA를 단일가닥으로 만들기 위해 폴리아크릴아마이드젤 전기영동을 실시하였다. 10%의 폴리아크릴아마이드 젤에는 6M의 요소(urea), 20%의 포름아마이드(formamaid)가 포함되어 있어 전기영동 후에는 두 개의 밴드가 생기는데, 이는 전기영동 과정에서 두 가닥의 DNA가 변성되어 플루오레세인이 붙어있는 DNA 가닥은 위에, 붙어있지 않은 DNA 가닥은 아래에 각각 위치하게 된다. 플루오레세인이 붙어 있는 DNA 밴드를 잘라내어 젤 추출(gel extraction)을 실시한 후 다시 에탄올 침전법으로 분리된 DNA를 확보하였다. 이 때 확보된 DNA pool은 다시 처음의 OTC가 고정되어 있는 자성비드 용액과 혼합하여 OTC와 반응시켰다. 이러한 과정의 모식도를 도 2에 나타내었고, 일련의 과정(FluMag-SELEX process)을 한 번의 선별(selection)이라 하면 총 7번의 선별과정을 거쳐 최종적으로 90% 이상이 OTC에 결합하는 DNA pool을 얻었다. 2번째와 4번째 선별 후에는 각각 에탄올아민과 테트라사이클린으로 count selection을 실시함으로써 비특이적으로 결합하는 DNA를 차단하고 OTC에만 높은 친화도를 가지고 특이적으로 결합하는 DNA pool을 확보하였다. 도 3에서 각각의 선별(selection)에서 OTC가 고정된 자성비드에서부터 용리된 ssDNA의 퍼센트를 제시하였다. 최종적으로 얻어진 DNA pool을 TOPO cloning kit를 이용하여 클로닝(cloning)하고 얻어진 콜로니에서부터 DNA를 추출하여 염기분석을 시행할 결과, 서로 다른 15 종의 OTC에 특이적으로 결합하는 핵산 구조체를 확보하였다.
실시예 5. 15종의 DNA 앱타머의 염기서열 분석 및 OTC 친화도 측정
서로 다른 15 종의 OTC에 높은 친화도를 가지고 특이적으로 결합하는 DNA의 염기서열을 분석한 결과를 하기 표 1에 제시하였다. 또한 이 15 종의 OTC 앱타머의 2차 구조를 m-fold 프로그램을 이용하여 예측한 결과를 도 4에 나타내었다.
[표 1]. 옥시테트라사이클린에 높은 친화도를 가지고 특이적으로 결합하는 서로 다른 15종의 DNA 앱타머의 염기서열
Figure 112007069472560-PAT00001
상기 15종의 DNA 앱타머 중에서 OTC에 대한 친화도가 가장 높은 5종의 앱타머를 다음과 같이 선택하였다.
50μM의 OTC와 153 nM의 각각의 OTC 앱타머를 버퍼용액(20 mM Tris-Cl buffer pH 7.6 contained 100mM NaCl, 2mM MgCl2, 5mM KCL, 1mM CaCl2 및 0.02% Tween 20)에 넣고 상온에서 30분간 반응시킨 후 반응물을 Microcon filter(YM 10)(Millipore Co., USA)에 넣고 30,000× g에서 11분간 원심분리 하였다. 앱타머와 결합하여 filter 위에 남은 OTC와 filter를 통과한 앱타머와 결합하지 않은 OTC의 농도를 375nm에서의 흡광도를 측정하여 OTC와의 결합력이 가장 높은 앱타머 No.2, No.4, No.5, No.8, No.20을 선정하였다.
실시예 6. 5종의 DNA 앱타머의 OTC와의 결합력 분석
서로 다른 15 종의 OTC에 특이적으로 결합하는 앱타머 중에서 가장 친화도가 높은 5개의 앱타머의 OTC와의 결합을 분석하였다. 50μM의 OTC와 0부터 500nM의 서로 다른 농도의 앱타머를 버퍼용액(20mM Tris-Cl buffer pH 7.6 contained 100mM NaCl, 2mM MgCl2, 5mM KCL, 1mM CaCl2 및 0.02% Tween 20)에 넣고 상온에서 30분간 반응시켰다. 해리상수를 구하기 위해서 반응물을 Microcon filter(YM 10)에 넣고 30,000× g에서 11분간 원심분리 하였다. 앱타머와 결합하여 filter 위에 남은 OTC와 filter를 통과한 앱타머와 결합하지 않은 OTC의 농도는 375nm의 흡광도를 측정하였다.
각각의 앱타머 양에 대한 결합된 OTC의 농도는 비선형 회귀법과 단일 부위 포화형 리간드 결합법으로 Sigmaplot 8.0을 이용하여 plotting되었고, 여기에 y=Bmax* X/Kd + X 식이 이용되었다(y는 포화도, Bmax는 최대 결합 위치, Kd는 해리상수, X는 결합하지 않은 앱타머).
그 결과를 하기 표 2에 나타내었고, No.4의 Kd값이 9.613 nM, No.5의 Kd값이 11.13 nM로서 OTC와 매우 강력하게 결합하는 것이 확인되었고, 각 앱타머의 OTC에 대한 결합곡선을 도 5에 제시하였다.
[표 2]. 5종의 앱타머의 해리상수 값
Figure 112007069472560-PAT00002
실시예 7. 5종의 DNA 앱타머의 OTC 결합 특이성 확인
OTC 앱타머가 OTC에만 특이적으로 결합하는 것을 보여주기 위한 대조군으로 OTC의 아날로그인 테트라사이클린(tetracycline)과 독시사이클린(doxycycline)이 사용되었다. 또한 이미 실시예 4에서와 같이 2, 4번째의 selection 다음에 count selection을 실시하였으므로 비특이적인 결합이 거의 없음을 확신할 수 있었다. 그럼에도 OTC에 강하게 결합하는 앱타머가 다른 화학물질에는 결합하지 않고 오직 OTC에만 특이적으로 결합한다는 것을 보여주는 실험을 실시하였다.
먼저 각각의 테트라사이클린과 독시사이클린을 자성 비드에 고정하였다. 그 다음 테트라사이클린이 고정된 자성비드와 5종의 OTC 앱타머(No 2, 4, 5, 8, 20)를 각각 혼합하여 버퍼용액(20mM Tris-Cl buffer pH 7.6 contained 100mM NaCl, 2mM MgCl2, 5mM KCL, 1mM CaCl2 및 0.02% Tween 20)에 넣고 상온에서 30분간 반응시킨 후 자석을 이용하여 테트라사이클린에 결합하지 않은 앱타머를 분리하였다. 또한 자성비드 혼합액에 열처리를 하여 테트라사이클린에 결합해 있던 DNA를 분리하고, 에탄올 침전법으로 자성비드에서부터 용리시킨 DNA의 양을 측정하였다. 독시사이클린도 상기와 같은 과정을 통해 나온 결과를 보면, 테트라사이클린에 대한 No.4의 결합은 3.2%, No.5의 결합은 2.5%, 독시사이클린에 대한 No.4의 결합은 1.7%, No.5는 0%로서 거의 결합하지 않는 것으로 확인이 되어 No.4, No.5를 포함한 5종의 OTC 앱타머(No. 2, 4, 5, 8, 20)의 OTC에 대한 결합의 특이성이 증명되었다. 이 결과는 도 6에 제시하였다.
이상 설명한 바와 같이, 본 발명에 따르면 옥시테트라사이크린에 특이적으로 결합 가능한 DNA 앱타머를 이용하면 물 또는 식품 등에 존재하는 극미량의 잔류 항생물질을 보다 민감하게 검출할 수 있다. 또한 본 발명의 DNA 앱타머를 포함하는 항생물질 제거방법 및 장치에 이용하여 극소량의 항생물질이 포함되어 있는 시료에서 타겟물질만을 선택적으로 제거할 수 있다. 따라서 식품 또는 환경에 존재하는 극소량의 항생물질로 인한 항생제 내성 박테리아의 발생 및 생물농축현상 등으로부터 인간을 보호하는 데 이용될 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 옥시테트라사이클린의 화학구조를 나타낸다.
도 2는 옥시테트라사이클린에만 특이적으로 결합하는 핵산 구조체를 개발하는 방법을 모식화한 것이다.
도 3은 각각의 선별(selection)에서 옥시테트라사이클린이 고정된 자성비드에서부터 용리된 ssDNA의 퍼센트를 나타낸다.
도 4는 옥시테트라사이클린에 특이적으로 결합하는 15종의 핵산 구조체 앱타머의 염기서열을 m-fold program을 이용하여 예측한 2차 구조 모식도이다.
도 5는 옥시테트라사이클린과의 결합력이 가장 큰 5 종의 옥시테트라사이클린-앱타머의 결합곡선을 나타낸다.
도 6은 본 발명의 앱타머가 옥시테트라사이클린에 대하여만 선택적 특이성을 보여주고 비슷한 구조를 가지는 다른 화학물질에 대해서는 친화도가 없음을 보여주는 그래프이다.
<110> Korea University Industry-Academy Cooperation Foundation <120> DNA aptamer binding to Oxytetracycline with specificity and production method thereof <160> 15 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OTC binding DNA aptamer <400> 1 cgtacggaat tcgctagccg accgcaggtg cactgggcga cgtctctggg tgtggtgtgg 60 atccgagctc cacgtg 76 <210> 2 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OTC binding DNA aptamer <400> 2 cgtacggaat tcgctagcgg gcgggcaaat gcgatactgt gggcagaggg tggtggcggg 60 atccgagctc cacgtg 76 <210> 3 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OTC binding DNA aptamer <400> 3 cgtacggaat tcgctagccg acgcgcgttg gtggtggatg gtgtgttaca cgtgttgtgg 60 atccgagctc cacgtg 76 <210> 4 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OTC binding DNA aptamer <400> 4 cgtacggaat tcgctagcac gttgacgctg gtgcccggtt gtggtgcgag tgttgtgtgg 60 atccgagctc cacgtg 76 <210> 5 <211> 67 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OTC binding DNA aptamer <400> 5 cgtacggaat tcgctagccg gggtatgtgg tgtgacgtta tgcgtgtggg gatccgagct 60 ccacgtg 67 <210> 6 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OTC binding DNA aptamer <400> 6 cgtacggaat tcgctagcgg gcgggcgtgg actacatgct tggtgtcatt gggtggcggg 60 atccgagctc cacgtg 76 <210> 7 <211> 77 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OTC binding DNA aptamer <400> 7 cgtacggaat tcgctagcgg cactacaann tggggagggg tgtcatgtct tcngggtgtg 60 gatccgagct ccacgtg 77 <210> 8 <211> 77 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OTC binding DNA aptamer <400> 8 cgtacggaat tcgctagcgg cactacaann tggggagggg tgncatgtct tcngggtgtg 60 gatccgagct ccacgtg 77 <210> 9 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OTC binding DNA aptamer <400> 9 cgtacggaat tcgctagcgg gcggagcgtg ggtgggtgga gttggctggg cgcgtgctgg 60 atccgagctc cacgtg 76 <210> 10 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OTC binding DNA aptamer <400> 10 cgtacggaat tctctagcgg ggggagcggt gtacatgacg ggatgtcgcg ttcggtgggg 60 atccgagctc cacgtg 76 <210> 11 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OTC binding DNA aptamer <400> 11 cgtacggaat tcnctagcgg ggcgcgtgtc gtaggatgtg gtgttgcgtg gccgtggtgg 60 atccgagctc cacgtg 76 <210> 12 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OTC binding DNA aptamer <400> 12 cgtacggaat tcgctagccc acgaacggta tcgcatgttc ccggtggtca cggtgtgtgg 60 atccgagctc cacgtg 76 <210> 13 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OTC binding DNA aptamer <400> 13 cgtacggaat tcgctagcgg gcgggaggat gtccaggtgg cgatggtctg tccgtggtgg 60 atccgagctc cacgtg 76 <210> 14 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OTC binding DNA aptamer <400> 14 cgtacggaat tcgctagcat gtgctgncgt ggacgccngt tcgngtactt agnggggtgg 60 atccgagctc cacgtg 76 <210> 15 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OTC binding DNA aptamer <400> 15 cgtacggaat tcgctagccg agttgagccg ggcgcggtac gggtactggt atgtgtgggg 60 atccgagctc cacgtg 76

Claims (9)

  1. 옥시테트라사이클린(Oxytetracycline)에 특이적으로 결합 가능한 DNA 앱타머.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 DNA 앱타머는 서열번호 1 내지 서열번호 15 중 어느 하나의 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 옥시테트라사이클린에 특이적으로 결합 가능한 DNA 앱타머.
  3. 하기 단계를 포함하는 옥시테트라사이클린(oxytetracycline)에 특이적으로 결합 가능한 DNA 앱타머의 제조방법:
    a) 옥시테트라사이클린과 자성비드(magnetic beads)를 붕산염(borate) 버퍼용액에서 반응시켜 공유결합을 유도하는 단계;
    b) 양 끝에 PCR용 프라이머 영역을 포함하고 중앙에 30-50개의 임의의 염기를 가지는 DNA pool과 상기 공유결합으로 얻은 옥시테트라사이클린-자성비드를 버퍼용액에서 혼합하여 상온에서 결합을 유도하는 단계;
    c) 상기 옥시테트라사이클린-자성비드에 결합된 DNA를 자석을 이용하여 분리하는 단계;
    d) 상기 분리된 옥시테트라사이클린-자성비드로부터 DNA를 분리시키는 단계; 및
    e) 상기 PCR용 프라이머 영역에 상보적인 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 수행하여 옥시테트라사이클린에 특이적으로 결합하는 DNA를 증폭시키는 단계.
  4. 제 3항에 있어서, 상기 a)단계의 공유결합은 옥시테트라사이클린의 아미노기(amino group)와 자성비드의 토실기(tosyl group)의 공유결합인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 3항에 있어서, 상기 a)단계 후, 공유결합된 옥시테트라사이클린-자성비드에서 옥시테트라사이클린과 결합하지 않은 자성비드의 토실기를 에탄올아민(ethanol amine) 용액으로 40-50℃에서 6-18시간 동안 불활성화 시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 3항에 있어서, 상기 d)단계에서 DNA의 분리는 70-90℃에 3-10분간 두어 DNA를 옥시테트라사이클린-자성비드로부터 분리하는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 3항에 있어서, 상기 e)단계에서 프라이머 쌍 중 하나에 플루오레세인(fluorescein)이 붙여진 프라이머를 사용하여 PCR을 수행한 후, 전기영동을 통해 상기 플루오레세인에 의해 변성된 단일가닥 DNA를 분리하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 옥시테트라사이클린에 특이적으로 결합 가능한 DNA 앱타머를 포함하는 옥시테트라사이클린 검출용 조성물.
  9. 제 8항에 있어서, 상기 DNA 앱타머는 제 1항의 앱타머인 것을 특징으로 하는 조성물.
KR20070097352A 2007-09-27 2007-09-27 옥시테트라사이클린에 특이적으로 결합하는 ｄｎａ 앱타머및 그 제조방법 KR100930973B1 (ko)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR20070097352A KR100930973B1 (ko) 2007-09-27 2007-09-27 옥시테트라사이클린에 특이적으로 결합하는 ｄｎａ 앱타머및 그 제조방법
PCT/KR2008/005696 WO2009041776A2 (en) 2007-09-27 2008-09-25 Dna aptamer binding to oxytetracycline with specificity and production method thereof

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR20070097352A KR100930973B1 (ko) 2007-09-27 2007-09-27 옥시테트라사이클린에 특이적으로 결합하는 ｄｎａ 앱타머및 그 제조방법

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20090032276A true KR20090032276A (ko) 2009-04-01
KR100930973B1 KR100930973B1 (ko) 2009-12-10

Family

ID=40512021

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR20070097352A KR100930973B1 (ko) 2007-09-27 2007-09-27 옥시테트라사이클린에 특이적으로 결합하는 ｄｎａ 앱타머및 그 제조방법

Country Status (2)

Country Link
KR (1) KR100930973B1 (ko)
WO (1) WO2009041776A2 (ko)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101263449B1 (ko) * 2010-12-30 2013-06-14 주식회사 아이센스 설파디메톡신에 특이적으로 결합하는 ｄｎａ 앱타머
WO2015034250A1 (ko) * 2013-09-05 2015-03-12 충북대학교 산학협력단 카드뮴에 특이적으로 결합하는 ｄｎａ 앱타머 및 이의 용도
KR101528482B1 (ko) * 2013-05-10 2015-06-15 호서대학교 산학협력단 옥시테트라사이클린에 특이적으로 결합하는 핵산 앱타머

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101342710B1 (ko) 2012-02-14 2013-12-16 고려대학교 산학협력단 테트라사이클린계 화합물에 특이적으로 결합할 수 있는 핵산 앱타머 및 그 용도
KR101617205B1 (ko) * 2013-10-16 2016-05-02 고려대학교 산학협력단 테뷰코나졸, 메페나셋 및 이나벤파이드에 특이적으로 결합할 수 있는 핵산 압타머 및 그 용도
KR101342080B1 (ko) 2013-10-25 2013-12-18 고려대학교 산학협력단 테트라사이클린계 화합물에 특이적으로 결합할 수 있는 핵산 앱타머 및 그 용도
KR101717767B1 (ko) * 2014-03-12 2017-03-17 한국과학기술연구원 여러 종류의 미생물에 공통적으로 결합하는 범용 핵산 앱타머 및 그의 제조 방법
CN106526168B (zh) * 2016-11-10 2018-08-24 重庆师范大学 一种快速检测多西环素残留的核苷酸适配体探针试剂盒及其应用
CN106823467A (zh) * 2017-01-23 2017-06-13 北京美正生物科技有限公司 一种玉米赤霉烯酮适配体亲和柱及其制备方法和用途

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101263449B1 (ko) * 2010-12-30 2013-06-14 주식회사 아이센스 설파디메톡신에 특이적으로 결합하는 ｄｎａ 앱타머
KR101528482B1 (ko) * 2013-05-10 2015-06-15 호서대학교 산학협력단 옥시테트라사이클린에 특이적으로 결합하는 핵산 앱타머
WO2015034250A1 (ko) * 2013-09-05 2015-03-12 충북대학교 산학협력단 카드뮴에 특이적으로 결합하는 ｄｎａ 앱타머 및 이의 용도

Also Published As

Publication number Publication date
WO2009041776A2 (en) 2009-04-02
KR100930973B1 (ko) 2009-12-10
WO2009041776A3 (en) 2009-06-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR100930973B1 (ko) 옥시테트라사이클린에 특이적으로 결합하는 ｄｎａ 앱타머및 그 제조방법
CN113151282B (zh) 结合新型冠状病毒(SARS-CoV-2)核衣壳蛋白的核酸适配体及其用途
US6180348B1 (en) Method of isolating target specific oligonucleotide ligands
CN113061610B (zh) 结合新型冠状病毒(SARS-CoV-2)棘突蛋白S1亚基的核酸适配体及其用途
JP2018526030A (ja) 結合していない標的についてのアプタマーの選抜のための方法
KR100961532B1 (ko) 테트라사이클린 및 그 유도체에 특이적으로 결합하는21종의 단일가닥 핵산 구조체 앱타머와 그 생산방법
CN110241119B (zh) 心肌肌钙蛋白i特异性核酸适配体及其筛选方法和应用
KR101097365B1 (ko) 키랄 구조의 이부프로펜에 입체선택적으로 결합하는 ｄｎａ 앱타머 및 그 제조방법
KR101617205B1 (ko) 테뷰코나졸, 메페나셋 및 이나벤파이드에 특이적으로 결합할 수 있는 핵산 압타머 및 그 용도
KR20130044981A (ko) 글라이포세이트에 특이적으로 결합하는 ｄｎａ 앱타머
CN112029771B (zh) 一种特异性结合哌替啶的核酸适配体及其应用
KR101024860B1 (ko) 디클로페낙에 특이적으로 결합하는 ｄｎａ 앱타머 및 그 제조방법
CN109371031A (zh) 一种特异性结合牛血清白蛋白核酸适配体的筛选方法
KR100930974B1 (ko) 레티놀 결합 단백질(ｒｂｐ4)에 특이적으로 결합하는ｄｎａ 앱타머 및 그 제조방법
KR101401534B1 (ko) 비브리오 파라해모라이티쿠스 생균의 표면에 특이적으로 결합하는 ｄｎａ 앱타머 및 이의 용도
KR102503021B1 (ko) 아플라톡신 g1에 특이적으로 결합하는 dna 앱타머 및 이의 용도
CN104774923B (zh) 一种测定转录调控复合体的方法
KR20140013107A (ko) 비브리오 파라해모라이티쿠스 생균의 표면에 특이적으로 결합하는 ｄｎａ 앱타머 및 이의 용도
KR101678946B1 (ko) 25-하이드록시 비타민 디3에 특이적으로 결합할 수 있는 핵산 앱타머 및 그 용도
KR20170042077A (ko) 조류독감바이러스에 특이적으로 결합할 수 있는 앱타머 및 그 용도
CN117660460A (zh) 一种结合人rest协阻抑因子3蛋白的核酸适配体及其应用
KR101612882B1 (ko) 이프로벤포스(Iprobenfos)에 특이적으로 결합할 수 있는 핵산 앱타머 및 그 용도
CN106636105A (zh) 金黄色葡萄球菌肠毒素c2的核酸适配体c203及其筛选方法和应用
KR101649729B1 (ko) 베스핀에 특이적으로 결합가능한 앱타머 및 이를 이용한 바이오 센서
KR101616524B1 (ko) 베스핀에 특이적으로 결합가능한 앱타머 및 이를 이용한 바이오 센서

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20121004

Year of fee payment: 4

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20130717

Year of fee payment: 5

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20151030

Year of fee payment: 7

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20160928

Year of fee payment: 8

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20181025

Year of fee payment: 10