WO2015034250A1 - 카드뮴에 특이적으로 결합하는 ｄｎａ 앱타머 및 이의 용도 - Google Patents

카드뮴에 특이적으로 결합하는 ｄｎａ 앱타머 및 이의 용도 Download PDF

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WO2015034250A1
WO2015034250A1 PCT/KR2014/008243 KR2014008243W WO2015034250A1 WO 2015034250 A1 WO2015034250 A1 WO 2015034250A1 KR 2014008243 W KR2014008243 W KR 2014008243W WO 2015034250 A1 WO2015034250 A1 WO 2015034250A1
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WO
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cadmium
dna aptamer
dna
aptamer
binding
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PCT/KR2014/008243
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김양훈
이상희
김윤철
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충북대학교 산학협력단
한국보건산업진흥원
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    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/115—Aptamers, i.e. nucleic acids binding a target molecule specifically and with high affinity without hybridising therewith ; Nucleic acids binding to non-nucleic acids, e.g. aptamers
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    • C12Q2541/00—Reactions characterised by directed evolution
    • C12Q2541/10—Reactions characterised by directed evolution the purpose being the selection or design of target specific nucleic acid binding sequences
    • C12Q2541/101—Selex

Definitions

  • the present invention relates to the activity of DNA aptamers and their aptamers specifically binding to cadmium among heavy metals, and more particularly, to various forms of the surrounding environment related to our daily lives such as mines, domestic wastewater, industrial wastes, and the like.
  • DNA aptamers capable of detecting, separating and removing cadmium, which is a harmful heavy metal in the environment;
  • Substrates having the purpose of detecting, separating or removing cadmium; A method of detecting cadmium; How to remove cadmium; A method for preparing a DNA aptamer; Cadmium removal filter; And a heavy metal purification system comprising the filter.
  • cadmium a harmful heavy metal with serious toxicity
  • various industrial fields such as automobiles, home appliances, and electronic devices
  • There is a serious environmental pollution problem such as 40 times as much cadmium is detected as tobacco. Accordingly, there is a demand for development of environment-friendly technologies that can effectively deal with cadmium contained in a large amount in the environment, such as industrial waste and mining areas.
  • DNA aptamers have recently been developed in many industrialized countries to develop and screen DNA aptamers specifically binding to specific target materials due to their high potential for application in various industrial fields such as environment and medicine. Much effort is being made. However, most of the DNA aptamers produced / developed to date have been developed and announced by large research institutes and multinational corporations in developed countries, and related core technologies and patents are also monopolized by developed countries. Limited.
  • the present inventors pay attention to aptamers showing high potential in the environment and industrial fields, and selex specific aptamers capable of specifically detecting and removing cadmium, which is a harmful heavy metal existing in the conventional environment, are used as SELEX (Systemic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment) technology was selected and separated, and the present invention was completed by confirming that the DNA aptamer having a specific sequence thus selected can specifically bind to cadmium in heavy metals.
  • SELEX Systemic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment
  • an object of the present invention is to provide a DNA aptamer capable of specifically binding to cadmium among heavy metals.
  • Another object of the present invention is to provide a composition which can effectively detect, isolate or remove cadmium using the DNA aptamer.
  • Another object of the present invention to provide a kit for detecting cadmium comprising the composition.
  • Another object of the present invention is to provide a substrate on which DNA aptamers are immobilized, which can effectively detect, separate or remove cadmium.
  • Another object of the present invention is to provide a method for effectively detecting cadmium using the DNA aptamer.
  • Another object of the present invention is to provide a method for effectively removing cadmium using the DNA aptamer.
  • Another object of the present invention is to provide a method for preparing a DNA aptamer that specifically binds to cadmium.
  • Another object of the present invention is to provide a filter that can effectively remove cadmium using the DNA aptamer.
  • Another object of the present invention is to provide a heavy metal purification system including the filter.
  • the present invention is a polynucleotide of any one of SEQ ID NOs: 1 to 10; Or a DNA aptamer specifically binding to cadmium, consisting of complementary polynucleotides thereof.
  • the present invention also provides a composition for detecting, separating or removing cadmium containing the aptamer.
  • the present invention provides a kit for detecting cadmium comprising the composition.
  • the present invention also provides a substrate to which at least one DNA aptamer of the DNA aptamer having a polynucleotide represented by SEQ ID NOS: 1 to 10 is immobilized.
  • the substrate may be a microtiter plate, a bead, a membrane or a chip.
  • the membrane may be a nitrocellulose membrane.
  • the substrate may have a purpose of detecting, separating or removing cadmium.
  • the present invention comprises the steps of contacting a sample suspected of containing cadmium and the DNA aptamer of claim 1; And it provides a method for detecting cadmium, comprising the step of confirming the binding of cadmium and DNA aptamer.
  • the present invention comprises the steps of contacting the sample suspected of containing cadmium and the DNA aptamer of claim 1 to form a cadmium and DNA aptamer complex; And it provides a method for removing cadmium, comprising the step of removing the complex.
  • the present invention comprises the steps of a) generating a DNA library through PCR amplification; b) selecting ssDNA from the amplified DNA library using asymmetric PCR; c) preparing a sensor chip fixed with cadmium; And d) separating DNA aptamers binding to cadmium through SELEX (Systemic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment) using the sensor chip.
  • SELEX Systemic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment
  • the cadmium-fixed sensor chip in step b) is prepared through the process of treating cadmium chloride (Cadium chloride) on the sensor chip is fixed nitrilotriacetic acid (surface nitrilotriacetic acid) on the surface Can be.
  • the present invention also provides a cadmium removal filter comprising a substrate on which at least one DNA aptamer is immobilized among the DNA aptamers having the polynucleotides represented by SEQ ID NOs: 1 to 10.
  • the present invention also provides a heavy metal purification system including the filter.
  • cadmium-specific DNA aptamer of the present invention Through the cadmium-specific DNA aptamer of the present invention, it was possible to provide a method for selectively detecting and effectively removing cadmium among heavy metals that are the main culprit of environmental pollution, which is the problem of cadmium pollution caused by the recent industrial development. It is expected to be used for solution.
  • securing such technologies enables the acquisition of key technologies for the detection and removal of environmental pollutants, which are currently monopolized by developed countries and multinational corporations, thereby transforming them into national environmental and bioindustry competitiveness and environmentally friendly next-generation processes. It is expected to be able to secure a wide range of industrial applications.
  • FIG. 1 shows a schematic diagram of fixing cadmium to a gold substrate in order to select a DNA aptamer specifically binding to cadmium.
  • Figure 2 shows the result of monitoring the process of cadmium is fixed when fixing the cadmium on the gold substrate through the Surface Plasmon Resonance (SPR) analysis system.
  • SPR Surface Plasmon Resonance
  • Figure 3 shows the amount of cadmium binding DNA aptamer recovered in each round of the SELEX procedure for the production of cadmium binding DNA aptamer.
  • Figure 4 shows the secondary structure of the Cd-1 cadmium-binding DNA aptamer selected to have a specific binding force with cadmium.
  • Figure 5 shows the secondary structure of the Cd-2 cadmium-binding DNA aptamer selected to have a specific binding force with cadmium.
  • Figure 6 shows the secondary structure of the Cd-3 cadmium-binding DNA aptamer selected to have a specific binding force with cadmium.
  • Figure 7 shows the secondary structure of the Cd-4 cadmium-binding DNA aptamer selected to have a specific binding force with cadmium.
  • Figure 8 shows the secondary structure of the Cd-5 cadmium-binding DNA aptamer selected to have a specific binding force with cadmium.
  • Figure 9 shows the secondary structure of the Cd-6 cadmium-binding DNA aptamer selected to have a specific binding force with cadmium.
  • Figure 10 shows the secondary structure of the Cd-7 cadmium-binding DNA aptamer selected to have a specific binding force with cadmium.
  • Figure 11 shows the secondary structure of the Cd-8 cadmium-binding DNA aptamer selected to have a specific binding force with cadmium.
  • Figure 12 shows the secondary structure of the Cd-9 cadmium-binding DNA aptamer selected to have a specific binding force with cadmium.
  • Figure 13 shows the secondary structure of the Cd-10 cadmium-binding DNA aptamer selected to have a specific binding force with cadmium.
  • FIG. 14 shows Cd-5 DNA aptamer and various other heavy metals (ArHNa 2 O 4, CoSO 4 , CdSO 4 , FeCl 2 , MgCl 2 , MnSO 4 , NiCl 2 , ZnCl 2 ), which showed the highest binding efficiency with cadmium. The result of confirming the specificity with cadmium through the evaluation of the bond strength.
  • FIG. 15 is an experimental schematic diagram for removing Cd-5 DNA aptamer that optimally binds with cadmium to a nitrocellulose membrane using a carboxyl-amine fixing method to remove cadmium from a real sample through a filter system.
  • the present invention relates to a DNA aptamer that specifically binds to cadmium.
  • aptamer refers to a structure of single-stranded DNA or RNA having high specificity and affinity for a specific target. Since aptamers have much higher affinity for targets, superior thermal stability, and can be synthesized in vitro than antibodies, which are used in the field of sensors, antibodies can be obtained by injecting antigens into animals. There is no need for it, so it is much more cost-effective and there is no restriction on the target material, which can synthesize aptamers for various targets, such as biomolecules such as proteins and amino acids, small organic chemicals such as environmental hormones or antibiotics, and bacteria. . Due to the properties of aptamers that specifically bind to target substances, a lot of research has recently been conducted to use aptamers for research in drug development, drug delivery systems, and biosensors.
  • Such DNA or RNA aptamers are separated by oligomers having high affinity and selectivity for specific chemical or biological molecules by evolutionary methods using oligonucleotide libraries called systemic evolution of ligands by exponential enrichment (SELEX).
  • SELEX systemic evolution of ligands by exponential enrichment
  • 'SELEX' used in the present invention refers to a method of identifying a DNA binding sequence of a molecule by selecting and amplifying a DNA or RNA having a high binding capacity to a specific molecule in a collection of randomly synthesized DNA or RNA.
  • the SELEX technique was used to select / develop DNA aptamers that can specifically bind to cadmium among heavy metals. As a result, a total of 10 DNA aptamers specific for cadmium were selected. In the present invention, these are named as Cd-1, Cd-2, Cd-3, Cd-4, Cd-5, Cd-6, Cd-7, Cd-8, Cd-9 and Cd-10, respectively, SEQ ID NO: Shown as 1 to 10.
  • the DNA aptamer specifically binding to the cadmium of the present invention any one of the polynucleotide of SEQ ID NO: 1 to 10; Its complementary polynucleotides; Or a variant of the sequence.
  • the variant refers to a nucleotide sequence having a functional characteristic similar to that of one nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1 to 10, although the nucleotide sequence is changed.
  • the DNA aptamer is at least 70%, more preferably at least 80%, even more preferably at least 90%, most preferably at least one nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 10 It may include base sequences having at least% sequence homology.
  • the "% sequence homology" for a polynucleotide is identified by comparing two optimally arranged sequences with a comparison region, wherein part of the polynucleotide sequence in the comparison region is the reference sequence (addition or deletion) for the optimal alignment of the two sequences. It may include the addition or deletion (ie, gap) compared to).
  • DNA aptamers according to one embodiment of the invention may be single-stranded DNA.
  • Single-stranded DNA aptamers can form tertiary structures and bind to cadmium, preferably divalent cadmium.
  • the present invention provides a polynucleotide of any one of SEQ ID NOs: 1 to 10; Its complementary polynucleotides; Or it relates to a composition for the detection, separation or removal of cadmium comprising a DNA aptamer specifically binding to cadmium, consisting of a variant of the sequence as an active ingredient.
  • the composition of the present invention includes a DNA aptamer that specifically binds to cadmium as an active ingredient and has a function of detecting, separating or removing cadmium, preferably divalent cadmium.
  • cadmium detection comprising the DNA aptamer of the present invention
  • the composition for separation or removal can be used in various forms.
  • the DNA aptamer of the present invention is immobilized on magnetic beads to bind cadmium
  • the bound DNA aptamer-cadmium complex can be separated using a magnet, and the cadmium is separated from the complex again. By doing so, cadmium can be selectively detected, separated or removed.
  • a method of detecting cadmium in a sample using a sensor connected with a DNA aptamer and a connector of the present invention can be used.
  • the present invention relates to a kit for detecting cadmium comprising the composition.
  • Kits of the present invention includes a polynucleotide of any one of SEQ ID NOs: 1 to 10 for detecting cadmium; Its complementary polynucleotides; Or DNA aptamers consisting of variants of the sequence, as well as one or more other component compositions, solutions or devices suitable for the analytical method.
  • the kit for detecting cadmium of the present invention may be coupled to a solid support with a label detectable by the DNA aptamer therein.
  • the detectable label refers to any chemical moiety bound to DNA aptamers, wherein the binding can be covalent or non-covalent.
  • the label is detectable and allows the nucleotide or nucleotide polymer to be detected by the practitioner of the invention.
  • Detectable labels include luminescent molecules, chemiluminescent molecules, fluorescent dyes, fluorescent quenching agents, colored molecules, radioactive isotopes, or scintillants.
  • Detectable labels are also useful linker molecules (e.g., biotin, avidin, streptavidin, HRP, protein A, protein G, antibodies or fragments thereof, Grb2, polyhistidine, Ni2 +, FLAG tag, myc tag) , Heavy metals, enzymes (examples include alkali phosphatase, peroxidase, and luciferase), electron donors / receptors, acridinium esters, dyes, and colorimetric substrates. It is also contemplated that a change in mass can be considered as a detectable label, as in the case of surface plasmon resonance detection. Those skilled in the art will readily recognize useful detectable labels not described above that may be used in the practice of the present invention.
  • the cadmium detection kit may include a biochip fixed with DNA aptamers modified at one end of biotin on a solid support surface coated with streptavidin.
  • streptavidin is a biomolecule such as avidin that binds well to biotin is easily used, that is, using avidin-biotin binding commonly used in the art.
  • the kit for detecting cadmium of the present invention may take the form of a bottle, a tub, a small sachet, an envelope, a tube, an ampoule, and the like, which are partially or wholly plastic, glass, paper, It may be formed from a foil, wax or the like.
  • the container may be equipped with a fully or partially separable stopper, which may initially be part of the container or attached to the container by mechanical, adhesive, or other means.
  • the container can also be equipped with a stopper, which can be accessed by its needle.
  • the kit may include an external package, which may include instructions for use of the components.
  • the present invention provides a polynucleotide of any one of SEQ ID NOs: 1 to 10; Its complementary polynucleotides; Or it relates to a substrate to which at least one DNA aptamer of the DNA aptamer consisting of variants of the sequence is immobilized.
  • the term substrate is a solid support on which the DNA aptamer of the present invention may be immobilized
  • the type of the substrate is not particularly limited as long as the DNA aptamer may be immobilized, and specifically, a microtiter plate and a bead.
  • the concept includes a bead, a membrane, a chip, and the like.
  • the material of the substrate may include glass, alumina, ceramics, carbon, synthetic polymers, natural polymers, gold, silver, copper, aluminum and silicon, but is not particularly limited thereto.
  • nitrocellulose when the substrate is in the form of a membrane, nitrocellulose may be used as the material.
  • the substrate to which the DNA aptamer of the present invention is immobilized may have a purpose of detecting, separating or removing cadmium by including a DNA aptamer capable of specifically binding to cadmium among heavy metals as an active ingredient.
  • the present invention provides a method for preparing a cadmium, comprising contacting a sample suspected of containing cadmium with DNA aptamer; And it relates to a method for detecting cadmium, comprising the step of confirming whether the binding of cadmium and DNA aptamer.
  • sample used in the present invention is a composition to be analyzed by containing or suspected of containing a target material of interest, ie, cadmium, seawater, drinking water, factory wastewater, livestock wastewater, waste, other liquids, soil, It may be characterized in that it is detected from a sample taken from any one or more of air, food, flora and fauna and flora and fauna tissue, but is not limited thereto.
  • a target material of interest ie, cadmium, seawater, drinking water, factory wastewater, livestock wastewater, waste, other liquids, soil
  • the liquid may be characterized in that the water, blood, urine, tears, sweat, saliva, lymph and cerebrospinal fluid, and the water, such as precipitation ( ⁇ ), sea water ( ⁇ ), lakes ( ⁇ ⁇ ) and rain (Sunsu) Including, waste includes sewage, wastewater, and the like, the flora and fauna includes the human body.
  • the animal and plant tissues include tissues such as mucous membranes, skin, skin, hair, scales, eyes, tongue, cheeks, hoofs, beaks, snouts, feet, hands, mouths, nipples, ears, and nose.
  • DNA aptamer used in the cadmium detection method of the present invention is any one of the polynucleotide of SEQ ID NO: 1 to 10; Its complementary polynucleotides; Or a DNA aptamer consisting of a variant of the sequence.
  • the present invention comprises the steps of contacting a sample suspected of containing cadmium and DNA aptamer to form a cadmium-DNA aptamer complex; And it relates to a method for removing cadmium, comprising the step of removing the complex.
  • DNA aptamer for use in the cadmium removal method of the present invention is any one of the polynucleotide of SEQ ID NO: 1 to 10; Its complementary polynucleotides; Or a DNA aptamer consisting of a variant of the sequence.
  • the present invention provides a method for producing a DNA library comprising a) generating a DNA library through PCR amplification; b) selecting ssDNA from the amplified DNA library using asymmetric PCR; c) preparing a sensor chip fixed with cadmium; And d) separating DNA aptamers binding to cadmium through SELEX (Systemic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment) using the sensor chip. It relates to a method for producing a DNA aptamer having one polynucleotide.
  • the cadmium-fixed sensor chip in step b) is to be prepared through the process of treating cadmium chloride (Cadium chloride) on the sensor chip is fixed nitrilotriacetic acid (surface nitrilotriacetic acid) on the surface Can be.
  • the present invention relates to a cadmium removal filter including a substrate on which at least one DNA aptamer of the DNA aptamer having the polynucleotide represented by SEQ ID NOs: 1 to 10 is immobilized.
  • the filter is a membrane filter to which at least one DNA aptamer of the DNA aptamer having a polynucleotide represented by SEQ ID NOS: 1 to 10 is immobilized, and may be a filter for removing cadmium of nitrocellulose material. .
  • the cadmium removal filter of the nitrocellulose material specifically, the step of labeling the DNA aptamer of the present invention with an amine through PCR; Reacting the labeled ssDNA aptamer at 85 ° C. for 5 minutes and then slowly cooling at room temperature to form a secondary structure;
  • the cadmium-binable DNA aptamer obtained through the above step may be prepared by fixing to a nitrocellulose membrane filter.
  • the reaction is to immobilize the cadmium binding DNA aptamer using a carboxyl-amine bond through the amine group of the aptamer and the carboxyl group residue exposed to the nitrocellulose membrane filter.
  • the cadmium removal filter of the present invention by applying a sample containing cadmium to the cadmium removal filter of the present invention it is possible to remove cadmium contained in the sample by reaction between the cadmium and the DNA aptamer in the filter.
  • the present invention relates to a heavy metal purification system comprising the cadmium removal filter.
  • the system of the present invention is a concept that includes devices, machines, devices, equipment and articles capable of purifying heavy metals based on cadmium removal filters.
  • the heavy metal purification system of the present invention is based on a cadmium removal filter, and may include a conventionally known filter capable of removing or purifying other heavy metals in addition to the present filter.
  • Any DNA library was amplified using PCR (Bioneer, Korea).
  • the reaction composition for amplification of 100 bp DNA library by PCR was 1-2 ⁇ l of template DNA, 5 ⁇ l of 10 ⁇ PCR buffer, 4 ⁇ l of each 2.5 mM dNTP mixture, 2 ⁇ l of 25 uM forward primer, 25 uM biotinylated reverse primer 2 ⁇ l, Ex Taq polymerase (TaKaRa, Japan) 0.3 ⁇ l (1 unit / ⁇ l) and 35.7 to 34.7 ⁇ l of water.
  • PCR reaction conditions were first denatured at 94 ° C.
  • Asymmetric PCR was performed to amplify only ssDNA out of the amplified dsDNA using the PCR technique.
  • the asymmetric PCR reaction composition was obtained by using 50 ⁇ l of template DNA obtained in Example 1-1, 10 ⁇ l of 10X PCR buffer, 8 ⁇ l of 10 mM dNTP mixture, 10 ⁇ l of 25 uM forward primer, and 1 ⁇ l of 25 uM biotinylated reverse primer. , 0.5 ⁇ l (1 unit / ⁇ l) of Ex Taq polymerase (Takara, Japan) and 20.5 ⁇ l of water.
  • the asymmetric PCR reaction conditions were first denatured at 94 ° C.
  • SPR Surface Plasmon Resonance
  • a sensor chip NTA (GE Healthcare) having a surface fixed with nitrilotriacetic acid was used.
  • the basic buffer of the sensor chip was HEPES ((4- (2-hydroxyethyl) -1- piperazineethanesulfonic acid), which is applied to the chip by flowing 50 mM EDTA for 5 minutes at a rate of 20 ⁇ l / min. All remaining metal ions were removed, and channel 2 of the sensor chip NTA from which all metal ions were removed was treated with 0.1 M cadmium chloride at a rate of 5 ⁇ l / min for 4 minutes to cadmium on the surface of the chip.
  • HEPES solution was added to 200 ⁇ l of ssDNA previously prepared through Example 1, boiled at 85 ° C. for 5 minutes, and denaturated. It was cooled slowly at room temperature to form a stable three-dimensional structure of ssDNA aptamer.
  • Example ⁇ 2-1> Into the cadmium-fixed cadmium sensor chip secured in the above Example ⁇ 2-1>, 200 ⁇ l of the ssDNA having the structure obtained in the above Example ⁇ 2-2> was placed at 10 ⁇ l / min at 25 ° C. The reaction was carried out for 10 minutes at a flow rate. Through this process, ssDNA that is not fixed with cadmium is washed out, and ssDNA having a binding force to cadmium is bound to cadmium fixed to the chip in response to cadmium-fixed sensor chip. Since ssDNA aptamer that does not specifically adhere to cadmium was removed by reacting for 30 minutes by flowing HEPES buffer at a flow rate of 20 ⁇ l / min at 25 °C.
  • DNA aptamer elution solution 50 mM EDTA; ethylenediaminetetraacetic acid.
  • the eluted solution was reacted at 85 ° C. for 5 minutes, and then purified using an ethanol precipitation technique after treatment with the same amount of PCI (phenol / chloroform / isoamyl alcohol).
  • Negative SELEX is carried out using Nitrilotriacetic acid (NTA) chip without cadmium immobilized between 7 and 8 times to remove ssDNA that adsorbs nonspecifically to sensor chip. It was. After treating 50 mM EDTA to equilibrate the sensor chip, 200 ⁇ l of ssDNA aptamer was added thereto and reacted at 25 ° C. at a flow rate of 10 ⁇ l / min for 10 minutes. After that, the aptamer not bound to the sensor chip flowed out of the flow to recover the aptamer, and was used in the next SELEX round.
  • NTA Nitrilotriacetic acid
  • the other aptamer bound to the sensor chip was removed because it was ssDNA non-specifically bound to the sensor chip.
  • SELEX was carried out up to 9 times, and the binding conditions of SELEX decreased the amount of ssDNA and reaction time as the number of times increased, and as the number of times increased, the reaction conditions were roughened to specifically bind to cadmium, a target substance, cadmium-binding DNA aptamer. To obtain.
  • the concentration of ssDNA eluted in each round was measured using nanodrops to quantitatively confirm SELEX progress and affinity of ssDNA aptamers eluted in each round.
  • ssDNA aptamers from round 1 to round 9 were amplified by PCR and asymmetric PCR was performed to secure ssDNA.
  • the concentration of ssDNA in each round was the same, and the reaction was again performed for 10 minutes on the cadmium-coupled sensor chip as in Example 2.3 above.
  • the concentration of each round of ssDNA aptamer eluted from the cadmium-fixed sensor chip was measured using nanodrops.
  • the concentration of 8 rounds was the highest with 550.3 ng / ⁇ l, and the concentration of 9 rounds was 536.9 ng / ⁇ l with lower concentration than the result of 8 rounds. It was confirmed that the round in which the cadmium binding DNA aptamer was formed was eight rounds. As a result, it was confirmed that the ssDNA obtained in the eighth round has the highest cadmium binding efficiency based on the result of securing the quantitative concentration through the nanodrop (see FIG. 3).
  • a total of 24 clones were obtained through the same method as above, and a clone having the same sequence was removed through a Clustal_X program, and a total of 10 cadmium-specific binding DNA aptamers were selected and secured.
  • Example 4 In order to quantify the affinity between the cadmium and the aptamer candidate group obtained in Example 4, the inventors secured a sensor chip fixed with cadmium in the same manner as in Example ⁇ 2-1>, and the SPR-based analysis system. Experiments were conducted to quantify the binding force between each aptamer candidate group and cadmium. First, in order to confirm the binding efficiency of the 10 cadmium-binding DNA aptamer candidate groups obtained in the eighth round determined to have high affinity with cadmium, the cadmium-binding sensor chip was carried out as in Example ⁇ 2-3>.
  • the prepared cadmium-binding DNA aptamer was sequentially flowed to the sensor chip (channel 1) and the cadmium-fixed sensor chip (channel 2) to confirm the affinity between the cadmium-binding DNA aptamer candidate group and cadmium.
  • each cadmium-binding DNA aptamer was analyzed to have a binding capacity of about nM of cadmium, and it was confirmed that Cd-5 had the best binding force with cadmium among the DNA aptamer candidate groups. Reference).
  • the structures of cadmium-binding DNA aptamer candidate groups obtained through the nanodrop spectrophotometer and SPR analysis could be imaged using a DNA mfold program provided by Rensselear polytechnic institute.
  • FIGS. 4 to 13 Secondary structures of cadmium-binding DNA aptamers selected as having specific binding strength with cadmium are shown in FIGS. 4 to 13.
  • a sensor chip SA coated with streptavidin was used.
  • the sensor chip SA activates the sensor chip by flowing 50mM NaOH and 1M NaCl mixture into the chip for 1 minute at a rate of 5 ⁇ l / min.
  • the aptamer was fixed in streptavidin by gradually flowing a 500 nM cadmium binding aptamer modified with biotin for 10 minutes at a rate of 5 ⁇ l / min.
  • the Cd-5 DNA aptamer showed an optimal reaction with cadmium CdSO 4 , while the reaction with other heavy metals was very insignificant. This confirmed that the cadmium binding DNA aptamer specifically binds only to cadmium.
  • the 5 'portion of the optimal cadmium-binding Cd-5 DNA aptamer discovered above was modified with amine, reacted at 85 ° C. for 5 minutes, and then cooled slowly at room temperature to form a secondary structure.
  • the cadmium-bound Cd-5 DNA aptamer thus obtained was fixed by binding to a nitrocellulose membrane filter having a carboxyl residue.
  • the nitrocellulose membrane was first treated with EDC (1-Ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide) and NHS (N-Hydroxysuccinimide), followed by binding to an amine-group modified Cd-5 aptamer. . Thereafter, the reactor other than the aptamer was removed by treating Ethanolamine to remove the remaining reactor in which the aptamer was not fixed.
  • the cadmium specific binding Cd-5 aptamer prepared above is used in a flask-based filter system, the cadmium in the sample may be removed (see FIG. 15).

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Abstract

본 발명은 중금속 중 카드뮴(cadmium)에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 및 그 앱타머의 활성에 관한 것으로서, 더욱 자세하게는 광산, 생활 폐수, 산업 폐기물 등과 같은 우리 일상생활과 관련된 주변 환경에 다양한 형태로 포함되어 있는 환경 내 유해 중금속인 카드뮴을 검출, 분리, 제거할 수 있는 DNA 앱타머; 이를 포함하는 카드늄의 검출, 분리 또는 제거용 조성물; 카드늄 검출용 키트; 카드늄의 검출, 분리 또는 제거의 용도를 갖는 기판; 카드뮴을 검출하는 방법; 카드뮴을 제거하는 방법; DNA 앱타머의 제조방법; 카드뮴 제거용 필터; 및 상기 필터를 포함하는 중금속 정화 시스템에 관한 것이다.

Description

카드뮴에 특이적으로 결합하는 ＤＮＡ 앱타머 및 이의 용도
본 발명은 중금속 중 카드뮴(cadmium)에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 및 그 앱타머의 활성에 관한 것으로서, 더욱 자세하게는 광산, 생활 폐수, 산업 폐기물 등과 같은 우리 일상생활과 관련된 주변 환경에 다양한 형태로 포함되어 있는 환경 내 유해 중금속인 카드뮴을 검출, 분리, 제거할 수 있는 DNA 앱타머; 이를 포함하는 카드늄의 검출, 분리 또는 제거용 조성물; 카드늄 검출용 키트; 카드늄의 검출, 분리 또는 제거의 용도를 갖는 기판; 카드뮴을 검출하는 방법; 카드뮴을 제거하는 방법; DNA 앱타머의 제조방법; 카드뮴 제거용 필터; 및 상기 필터를 포함하는 중금속 정화 시스템에 관한 것이다.
현재 각종 산업의 발달로 지구 환경은 급속히 오염되고 있으며, 특히 중금속의 오염은 생명체 잠재 독성과 관계를 가져 생체누적으로 인한 먹이 피라미드의 최종 소비자인 인간뿐 아니라, 모든 동식물에서 그 피해가 나타나고 있다. 특히 먹이 피라미드의 최종 소비자인 인간은 각종 중금속 기반의 독성오염물질의 섭취로 인한 발암률 증가, 기형아 출산 문제들에 무방비 상태로 노출되어 있다. 각종 독성오염물질 중 특히 카드뮴은 특히 제 2차 세계대전 중 일본에 발생한 이타이이타이병을 유발하는 중금속으로 잘 알려져 있으며, 현재 전기 도금, 은땜, 전선, 건전지 등에 쓰이는 금속이다. 주변 환경을 크게 오염시키는 물질로 카드뮴으로 오염된 토양이나 물을 기반으로 한 식품 및 식수의 섭취, 카드뮴 혼합물의 직접적 흡입 뿐만 아니라 호흡기를 통해서도 흡수가 되며, 체내 유입시 간과 신장에 축적되고 일정량이상 흡수시 신장에 손상과 간암을 유발하기도 하며, 드문 경우 뼈에 병변(골연화증, 골조송증, 특발성골절)을 유발하기도 한다.
상기한 바와 같이 심각한 독성을 갖는 유해 중금속인 카드뮴은 최근 자동차, 가전 및 전자기기 등의 다양한 산업 분야에서 활용되고 있어 자주 접하게 되는 독성이 강한 중금속으로 이에 따른 피해 문제가 대두되고 있으며, 광산의 갱내수 1L에는 담배의 40배에 달하는 카드뮴이 검출되는 등 환경오염 문제가 심각해지고 있다. 이에 산업 폐기물 및 광산 지역 등 환경에 다량으로 포함된 카드뮴을 효과적으로 처리할 수 있는 친환경적 기술 개발이 요구되고 있다.
이와 관련, 종래 환경 및 산업폐수에 포함되어 있는 카드뮴 및 여러 중금속을 제거하는 기술로는 일반적인 고형화/안정화, 매립처리, 흡착법, 토양 객토, 유리화, 식물 정화법 등이 알려져 있으며 이들 방법이 활용되고 있다.
그러나 이러한 방법들은 다양한 오염원에 의해 오염되어 있는 토양이나 오염수를 수거하여 특수 용액 등을 처리하여 물리 화학적으로 정화시키는 기법으로 오염 지역이 적은 경우에는 비교적 효과적으로 오염물을 제거하는 것이 가능하지만 표적하는 특정 오염물만을 특이적으로 제거할 수 없으며 2차적인 오염을 초래할 가능성을 가지고 있다. 특히, 카드뮴의 경우 불순물과 혼합된 경우가 많고, 구조가 복잡하여 다양한 구조물의 형태, 오염 현장의 다양한 pH, 온도 등의 유동적인 현장 상태에 적용되는 특이적으로 카드뮴만을 친환경적으로 회수하는 효율적인 방법이 아직까지 개발되지 못하고 있다. 이에 국내에서는 환경내의 카드뮴 노출을 검출하고 이를 제거하기 위한 방법의 개발이 필요한 실정이다.
한편, DNA 앱타머(aptamer)는 환경, 의료 등의 각종 산업 분야에서 높은 응용 잠재 가능성으로 인하여 최근 많은 선진국의 연구자들을 중심으로 특정 목적 물질에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머를 제작, 선별하기 위해 많은 노력을 기울이고 있다. 그러나 현재까지 제작/개발된 DNA 앱타머의 경우 대부분 선진국의 대형 연구소 및 다국적기업에 의해 개발, 발표된 것으로 관련 핵심 기술 및 특허권 또한 선진국에 의해 독점되어 있어 국내 연구자 및 산업체에서의 연구 및 활용이 매우 제한적이다.
이에 본 발명자들은 환경 및 산업분야에서 높은 잠재성을 보이는 앱타머에 주목하여, 종래 환경에 존재하는 유해 중금속인 카드뮴을 특이적으로 검출, 제거할 수 있는 카드뮴 특이적 앱타머를 SELEX(Systemic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment) 기법을 통해 선별/분리하였으며, 이렇게 선별된 특정 염기서열을 갖는 DNA 앱타머가 중금속 중 카드뮴에 특이적으로 결합할 수 있다는 사실을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 중금속 중에서도 카드늄에 특이적으로 결합할 수 있는 DNA 앱타머를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 DNA 앱타머를 이용하여 효과적으로 카드늄을 검출, 분리 또는 제거할 수 있는 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 조성물을 포함하는 카드늄 검출용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 효과적으로 카드늄을 검출, 분리 또는 제거할 수 있는 DNA 앱타머가 고정화된 기판을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 DNA 앱타머를 이용하여 효과적으로 카드뮴을 검출하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 DNA 앱타머를 이용하여 효과적으로 카드뮴을 제거하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 카드늄에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 DNA 앱타머를 이용하여 효과적으로 카드뮴을 제거할 수 있는 필터를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 필터를 포함하는 중금속 정화 시스템을 제공하는 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서,
본 발명은 서열번호 1 내지 10 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드; 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드로 이루어진, 카드늄에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 앱타머를 포함하는 카드늄의 검출, 분리 또는 제거용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 카드늄 검출용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 1 내지 10으로 표시되는 폴리뉴클레오티드를 가지는 DNA 앱타머 중 1종 이상의 DNA 앱타머가 고정화된 기판을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 기판은 마이크로티터 플레이트(microtiter plate), 비드(bead), 멤브레인(membrane) 또는 칩(chip)일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 멤브레인은 니트로셀룰로오스 멤브레인일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 기판은 카드늄의 검출, 분리 또는 제거의 용도를 가질 수 있다.
또한, 본 발명은 카드뮴을 함유하는 것으로 의심되는 시료와 제1항의 DNA 앱타머를 접촉시키는 단계; 및 카드뮴과 DNA 앱타머의 결합 여부를 확인하는 단계를 포함하는, 카드뮴을 검출하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 카드뮴을 함유하는 것으로 의심되는 시료와 제1항의 DNA 앱타머를 접촉시켜 카드뮴 및 DNA 앱타머 복합체를 형성하는 단계; 및 상기 복합체를 제거하는 단계를 포함하는, 카드뮴을 제거하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 a) PCR 증폭을 통해 DNA 라이브러리를 생성하는 단계; b) 상기 증폭된 DNA 라이브러리를 대상으로 비대칭 PCR 기법을 이용하여 ssDNA를 선별하는 단계; c) 카드뮴이 고정된 센서 칩을 준비하는 단계; 및 d) 상기 센서 칩을 이용 SELEX(Systemic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment) 기법을 통해 카드뮴에 결합하는 DNA 앱타머를 분리하는 단계를 포함하는, 카드뮴에 특이적으로 결합하고 서열번호 1 내지 10 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드를 갖는 DNA 앱타머의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 b) 단계에서 카드뮴이 고정된 센서 칩은 표면에 나이트릴로트라이아세트산(nitrilotriacetic acid)이 고정된 센서 칩에 카드뮴 클로라이드(Cadium chloride)를 처리하는 과정을 통해 준비될 수 있다.
또한, 본 발명은 서열번호 1 내지 10으로 표시되는 폴리뉴클레오티드를 가지는 DNA 앱타머 중 1종 이상의 DNA 앱타머가 고정화된 기판을 포함하는 카드뮴 제거용 필터를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 필터를 포함하는 중금속 정화 시스템을 제공한다.
본 발명의 카드뮴 특이적인 DNA 앱타머를 통해, 환경오염의 주범인 중금속 중 특히, 카드뮴을 선택적으로 검출하고 이를 효과적으로 제거하기 위한 방법을 제시 할 수 있었으며, 이는 최근 대두되는 산업발전에 의한 카드뮴오염 문제 해결에 활용될 수 있을 것으로 기대된다. 특히, 이와 같은 기술 확보는 현재 선진국 및 다국적 기업에 의해 독점되어 있는 환경오염물질 검출 및 제거 기술에 대한 핵심기술 확보를 가능하게 함으로써, 국가 환경 및 바이오산업 경쟁력 및 환경 친화적인 차세대 공정으로서의 전환 등의 폭 넓은 산업적 응용성을 확보할 수 있을 것으로 사료된다.
도 1은 카드뮴과 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머를 선별하기 위하여 골드 기판에 카드뮴을 고정하는 모식도를 나타낸 것이다.
도 2는 골드 기판에 카드뮴을 고정할 때 카드뮴이 고정되는 과정을 SPR (Surface Plasmon Resonance) 분석 시스템을 통해 모니터링 한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 카드뮴결합 DNA 앱타머의 제작을 위한 SELEX 과정의 각 라운드에서 카드뮴 결합 DNA 앱타머가 회수된 양을 나타낸 것이다.
도 4는 카드뮴과 특이적인 결합력을 보이는 것으로 선별된 Cd-1 카드뮴 결합 DNA 앱타머의 2차 구조를 나타낸 것이다.
도 5는 카드뮴과 특이적인 결합력을 보이는 것으로 선별된 Cd-2 카드뮴 결합 DNA 앱타머의 2차 구조를 나타낸 것이다.
도 6은 카드뮴과 특이적인 결합력을 보이는 것으로 선별된 Cd-3 카드뮴 결합 DNA 앱타머의 2차 구조를 나타낸 것이다.
도 7은 카드뮴과 특이적인 결합력을 보이는 것으로 선별된 Cd-4 카드뮴 결합 DNA 앱타머의 2차 구조를 나타낸 것이다.
도 8은 카드뮴과 특이적인 결합력을 보이는 것으로 선별된 Cd-5 카드뮴 결합 DNA 앱타머의 2차 구조를 나타낸 것이다.
도 9는 카드뮴과 특이적인 결합력을 보이는 것으로 선별된 Cd-6 카드뮴 결합 DNA 앱타머의 2차 구조를 나타낸 것이다.
도 10은 카드뮴과 특이적인 결합력을 보이는 것으로 선별된 Cd-7 카드뮴 결합 DNA 앱타머의 2차 구조를 나타낸 것이다.
도 11은 카드뮴과 특이적인 결합력을 보이는 것으로 선별된 Cd-8 카드뮴 결합 DNA 앱타머의 2차 구조를 나타낸 것이다.
도 12는 카드뮴과 특이적인 결합력을 보이는 것으로 선별된 Cd-9 카드뮴 결합 DNA 앱타머의 2차 구조를 나타낸 것이다.
도 13은 카드뮴과 특이적인 결합력을 보이는 것으로 선별된 Cd-10 카드뮴 결합 DNA 앱타머의 2차 구조를 나타낸 것이다.
도 14는 카드뮴과 결합 효율이 가장 좋은 것으로 나타난 Cd-5 DNA 앱타머와 다양한 다른 중금속(ArHNa2O4, CoSO4, CdSO4, FeCl2, MgCl2, MnSO4, NiCl2, ZnCl2)들과의 결합력 평가를 통한 카드뮴과의 특이성을 확인한 결과이다.
도 15는 카드뮴과 최적 결합하는 Cd-5 DNA 앱타머를 니트로셀룰로오스 멤브레인에 카르복실-아민 고정 방법을 이용하여 고정하여 실제 시료에서 카드뮴을 필터 시스템을 통해 제거하기 위한 실험 모식도이다.
하나의 양태로서, 본 발명은 카드뮴에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머에 관한 것이다.
본 발명에서 사용된 용어 앱타머(aptamer)란 특정 타겟에 대해 높은 특이성과 친화도를 가지는 단일가닥 DNA 또는 RNA의 구조체를 말한다. 앱타머는 센서 분야에서 이용되는 기존의 감지물질인 항체보다도 훨씬 타겟에 대한 친화도가 높고 열 안정성이 우수하며 시험관내(in vitro)에서 합성이 가능하기 때문에, 동물에게 항원을 주입하여 항체를 얻어낼 필요가 없어 비용 면에서 훨씬 우위에 있으며 타겟 물질에 제약이 없어 단백질, 아미노산 같은 생체분자나 환경호르몬이나 항생제 같은 작은 유기화학 물질, 박테리아 등의 다양한 타겟(target)에 대한 앱타머를 합성할 수 있다. 이렇게 표적 물질과 특이적으로 결합하는 앱타머의 특성으로 인해 최근 들어 앱타머를 신약개발, 약물전달 시스템 그리고 바이오센서 등의 연구에 이용하기 위해 많은 연구가 이루어지고 있다.
이러한 DNA 또는 RNA 앱타머는 SELEX(systematic evolution of ligands by exponential enrichment)라 불리는 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide) 라이브러리를 이용한 진화적인 방법에 의해 특정 화학분자나 생물학적 분자에 높은 친화력과 선별력을 갖고 결합하는 올리고머를 분리하여 수득할 수 있다(C. Tuerand L. Gold, Science 249, 505 - 510, 2005; A. D. Ellington and J. W. Szostak, Nature 346, 818 - 822, 1990; M. Famulok, et. al., Acc. Chem. Res. 33, 591 - 599, 2000; D. S. Wilson and Szostak, Annu. Rev. Biochem. 68, 611 - 647, 1999).
본 발명에서 사용된 용어 'SELEX'는 임의적으로 합성된 DNA 또는 RNA의 집합에서 특정 분자에 대해 높은 결합력을 지니는 DNA 또는 RNA를 선별하여 증폭시킴으로써 해당분자의 DNA 결합 서열을 알아내는 방법을 말한다.
본 발명의 하기 실시예에서는 중금속 중 카드뮴에 특이적으로 결합할 수 있는 DNA 앱타머를 선별/개발하고자 SELEX 기법을 이용하였으며, 그 결과 카드뮴에 특이적인 DNA 앱타머를 총 10개 선별하였다. 본 발명에서는 이들을 각각 Cd-1, Cd-2, Cd-3, Cd-4, Cd-5, Cd-6, Cd-7, Cd-8, Cd-9 및 Cd-10으로 명명하였으며, 서열번호 1 내지 10으로 나타내었다.
따라서 본 발명의 카드늄에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머는, 서열번호 1 내지 10 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드; 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드; 또는 상기 서열의 변이체로 이루어질 수 있다. 상기 변이체는 염기서열은 변화되지만, 서열번호 1 내지 서열번호 10으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종의 염기서열과 유사한 기능적 특성을 갖는 염기서열을 의미한다. 구체적으로, DNA 앱타머는 서열번호 1 내지 서열번호 10으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종의 염기서열과 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다.
폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 DNA 앱타머는 단일가닥 DNA일 수 있다. 단일가닥 DNA 앱타머는 3차 구조를 형성하여 카드뮴, 바람직하게는 2가 카드뮴에 결합할 수 있다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 서열번호 1 내지 10 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드; 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드; 또는 상기 서열의 변이체로 이루어진, 카드늄에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머를 유효성분으로 포함하는 카드늄의 검출, 분리 또는 제거용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 조성물은 카드늄에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머를 유효성분으로 포함하여 카드뮴, 바람직하게는 2가 카드뮴을 검출, 분리 또는 제거할 수 있는 기능을 갖는다.
따라서 환경 시료(해수, 음용수 등) 및 산업 폐수(공장 폐수, 축산 폐수 등)를 포함하는 시료에 존재하는 카드뮴을 효과적으로 검출, 분리 또는 제거하기 위해, 본 발명의 DNA 앱타머를 포함하는 카드뮴 검출, 분리 또는 제거용 조성물은, 다양한 형태로 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 DNA 앱타머를 자성비드에 고정화시켜 카드뮴을 결합시키게 되면 결합된 DNA 앱타머-카드뮴 복합체(complex)를 자석을 이용하여 분리할 수 있게 되고, 이 복합체로부터 다시 카드뮴을 분리함으로써 카드뮴을 선택적으로 검출, 분리 또는 제거할 수 있다. 또 다른 방법으로, 본 발명의 DNA 앱타머와 연결자로 연결된 센서를 이용하여 시료 중의 카드뮴을 검출하는 방법 등을 사용할 수 있다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 카드늄 검출용 키트에 관한 것이다.
본 발명의 키트에는 카드늄을 검출하기 위한 서열번호 1 내지 10 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드; 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드; 또는 상기 서열의 변이체로 이루어진 DNA 앱타머 뿐만 아니라, 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성성분 조성물, 용액 또는 장치가 포함될 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 카드늄 검출용 키트는 내부에 상기 DNA 앱타머가 검출 가능한 표지와 함께 고체 지지체에 결합될 수 있다. 상기 검출 가능한 표지는 DNA 앱타머에 결합된 임의의 화학적 모이어티를 의미하고, 상기에서 결합은 공유결합이거나 또는 비-공유결합일 수 있다. 바람직하게는, 표지는 검출가능하고, 상기 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 중합체가 발명의 실시자에게 검출될 수 있게 한다. 검출 가능한 표지는 발광 분자, 화학발광 분자, 형광색소, 형광 소멸제(fluorescent quenching agent), 착색 분자, 방사능 동위원소, 또는 신틸란트(scintillant)를 포함한다. 검출 가능한 표지는 또한 유용한 링커 분자(예를 들면, 비오틴, 아비딘, 스트렙타비딘, HRP, 단백질 A, 단백질 G, 항체 또는 그의 단편, Grb2, 폴리히스티딘, Ni2+, FLAG 택(tag), myc 택), 중금속, 효소(그의 예는 알칼리 포스파타아제, 퍼옥시다아제, 및 루시퍼라아제를 포함함), 전자 공여체/수용체, 아크리디늄 에스테르, 염료 및 비색분석 기질(calorimetric substrate)을 포함한다. 또한, 표면 플라스마 공명(surface plasmon resonance) 검출의 경우에서와 같이 질량의 변화가 검출가능한 표지로 간주될 수 있다는 것이 고려된다. 당업자는 본 발명의 실시에서 이용될 수 있는, 전술되지 않은 유용한 검출 가능한 표지를 용이하게 인식할 것이다.
본 발명의 일 구현 예에서는, 상기 카드늄 검출용 키트는 스트렙트아비딘(streptavidin)으로 표면 코팅된 고체 지지체에 한쪽 끝을 바이오틴(biotin)으로 변형한 DNA 앱타머가 고정된 바이오칩을 포함할 수 있다. 이는 스트렙트아비딘을 표면에 코팅하게 되면 바이오틴과 결합을 잘하는 아비딘과 같은 생체 분자가 쉽게 결합하는 것을 이용한 것으로, 다시 말해서 당 업계에서 통상적으로 사용하는 아비딘-바이오틴 결합을 이용한 것이다.
본 발명의 카드늄 검출용 키트는 병, 통(tub), 작은 봉지(sachet), 봉투(envelope), 튜브, 앰플(ampoule) 등과 같은 형태를 취할 수 있으며 이들은 부분적으로 또는 전체적으로 플라스틱, 유리, 종이, 호일, 왁스 등으로 부터 형성될 수 있다. 용기는, 처음에는 용기의 일부이거나 또는 기계적, 접착성, 또는 기타 수단에 의해 용기에 부착될 수 있는, 완전히 또는 부분적으로 분리가 가능한 마개를 장착할 수 있다. 또한 용기는 주사바늘에 의해 내용물에 접근할 수 있는, 스토퍼가 장착될 수 있다. 상기 키트는 외부 패키지를 포함할 수 있으며, 외부 패키지는 구성 요소들의 사용에 관한 사용설명서를 포함할 수 있다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 서열번호 1 내지 10 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드; 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드; 또는 상기 서열의 변이체로 이루어진 DNA 앱타머 중 1종 이상의 DNA 앱타머가 고정화된 기판에 관한 것이다.
본 발명에서 사용된 용어 기판은 본 발명의 DNA 앱타머가 고정화될 수 있는 고체 지지체로서, DNA 앱타머가 고정될 수 있는 형태이면 특별히 그 종류를 한정하지 아니하며, 자세하게는 마이크로티터 플레이트(microtiter plate), 비드(bead), 멤브레인(membrane) 및 칩(chip) 등을 포함하는 개념이다.
상기 기판의 소재는 유리, 알루미나, 세라믹, 탄소, 합성 고분자, 천연 고분자, 금, 은, 구리, 알루미늄 및 실리콘 등을 예시할 수 있으나, 특별히 이를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현 예에서는, 상기 기판이 멤브레인(membrane) 형태인 경우 그 재질로 니트로셀룰로오스를 사용할 수 있다.
이러한 본 발명의 DNA 앱타머가 고정화된 기판은, 중금속 중 카드늄에 특이적으로 결합할 수 있는 DNA 앱타머를 유효성분으로 포함함으로써 카드늄을 검출, 분리 또는 제거하는 용도를 가질 수 있다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 카드뮴을 함유하는 것으로 의심되는 시료와 DNA 앱타머를 접촉시키는 단계; 및 카드뮴과 DNA 앱타머의 결합 여부를 확인하는 단계를 포함하는, 카드뮴을 검출하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에서 사용하는 용어 시료란 관심 있는 타겟(target) 물질 즉, 카드뮴을 함유하거나 함유하고 있는 것으로 추정되어 분석이 행해질 조성물로, 해수, 음용수, 공장 폐수, 축산 폐수, 폐기물, 기타 액체, 토양, 공기, 식품, 동식물 장내 및 동식물 조직 중 어느 하나 이상에서 채취된 시료로부터 검출되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 이때, 액체는 물, 혈액, 소변, 눈물, 땀, 타액, 림프 및 뇌척수액 등임을 특징으로 할 수 있으며, 상기 물은 강수(江水), 해수(海水), 호수(湖水) 및 우수(雨水) 등을 포함하고, 폐기물은 하수, 폐수 등을 포함하며, 상기 동식물은 인체를 포함한다. 또한, 상기 동식물 조직으로는 점막, 피부, 외피, 털, 비늘, 안구, 혀, 뺨, 발굽, 부리, 주둥이, 발, 손, 입, 유두, 귀, 코 등의 조직을 포함한다.
본 발명의 카드뮴 검출방법에서 사용하는 DNA 앱타머는 서열번호 1 내지 10 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드; 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드; 또는 상기 서열의 변이체로 이루어진 DNA 앱타머일 수 있다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 카드뮴을 함유하는 것으로 의심되는 시료와 DNA 앱타머를 접촉시켜 카드뮴-DNA 앱타머 복합체를 형성하는 단계; 및 상기 복합체를 제거하는 단계를 포함하는, 카드뮴을 제거하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 카드뮴 제거방법에 사용하는 DNA 앱타머는 서열번호 1 내지 10 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드; 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드; 또는 상기 서열의 변이체로 이루어진 DNA 앱타머일 수 있다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 a) PCR 증폭을 통해 DNA 라이브러리를 생성하는 단계; b) 상기 증폭된 DNA 라이브러리를 대상으로 비대칭 PCR 기법을 이용하여 ssDNA를 선별하는 단계; c) 카드뮴이 고정된 센서 칩을 준비하는 단계; 및 d) 상기 센서 칩을 이용 SELEX(Systemic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment) 기법을 통해 카드뮴에 결합하는 DNA 앱타머를 분리하는 단계를 포함하는, 카드뮴에 특이적으로 결합하고 서열번호 1 내지 10 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드를 갖는 DNA 앱타머의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명의 일 구현 예에서는, 상기 b) 단계에서 카드뮴이 고정된 센서 칩은 표면에 나이트릴로트라이아세트산(nitrilotriacetic acid)이 고정된 센서 칩에 카드뮴 클로라이드(Cadium chloride)를 처리하는 과정을 통해 준비될 수 있다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 서열번호 1 내지 10으로 표시되는 폴리뉴클레오티드를 가지는 DNA 앱타머 중 1종 이상의 DNA 앱타머가 고정화된 기판을 포함하는 카드뮴 제거용 필터에 관한 것이다.
본 발명의 일 구현 예에서는, 상기 필터는 서열번호 1 내지 10으로 표시되는 폴리뉴클레오티드를 가지는 DNA 앱타머 중 1종 이상의 DNA 앱타머가 고정화된 멤브레인 필터로서, 니트로셀룰로오스 소재의 카드뮴 제거용 필터일 수 있다.
이러한 니트로셀룰로오스 소재의 카드뮴 제거용 필터는, 구체적으로 본 발명의 DNA 앱타머를 PCR을 통해 아민으로 표지하는 단계; 표지된 ssDNA 앱타머를 85℃에서 5분간 반응시킨 후 실온에서 서서히 식혀 2차 구조를 형성하는 단계; 상기 단계를 통해 수득한 카드뮴 결합 가능한 DNA 앱타머를 니트로셀룰로오즈 멤브레인 (Nitrocellulose membrane) 필터에 고정시키는 단계를 통해 제조될 수 있다.
상기의 반응은 니트로셀룰로오즈 멤브레인 필터에 노출되어 있는 카르복실그룹 잔기와 앱타머의 아민기를 통한 카르복실-아민 결합을 이용하여 카드뮴 결합 DNA 앱타머를 고정시킨 것이다.
본 발명의 일 구현 예에서는, 본 발명의 카드뮴 제거용 필터에 카드뮴이 포함된 시료를 적용하여 필터 내 DNA 앱타머와 카드뮴과의 반응을 통해 시료에 포함되어 있는 카드뮴을 제거할 수 있다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 카드뮴 제거용 필터를 포함하는 중금속 정화 시스템에 관한 것이다.
본 발명의 상기 시스템은 카드뮴 제거용 필터를 기반으로 하여 중금속을 정화할 수 있는 장치, 기계, 기기, 장비 및 물품을 포함하는 개념이다.
따라서 본 발명의 중금속 정화 시스템은 카드뮴 제거용 필터를 기반으로 하며, 본 필터 이외에 다른 중금속을 제거 또는 정화할 수 있는, 종래 알려진 필터 등을 포함할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1>
DNA 앱타머 제작 과정
<1-1> PCR 기법을 활용한 랜덤 DNA 라이브러리 증폭
카드뮴에 특이적으로 결합하는 단일 가닥의 카드뮴 결합 DNA 앱타머를 제작하기 위하여 40개의 랜덤 서열을 dA : dG : dC : dT = 1.5 : 1.15 : 1.25 : 1 비율로 포함하고 있는 100bp의 주형 DNA (5'-GGTAATACGACTCACTATAGGGAGATACCAGCTTATTCA ATT N40 - AGATTGCACTTACTATCT-3'; 서열번호 11)와 이를 증폭할 수 있는 프라이머 한 쌍을 bioneer(Korea)에 주문 제작하였다 (정방향 프라이머: 5'-GGTAATACGACTCACTATAGGGAGATACCAGCTTATTCAATT-3', 바이오티닐화된(biotinylated) 역방향 프라이머: 5'-바이오틴-AGATTGCACTTACTATCT-3'). 임의의 DNA 라이브러리는 PCR (Bioneer, Korea)을 이용하여 증폭하였다. PCR에 의한 100bp DNA 라이브러리의 증폭을 위한 반응 조성은 주형 DNA 1~2㎕, 10X PCR 완충용액 5㎕, 각 2.5 mM dNTP 혼합물 4㎕, 25 uM 정방향 프라이머 2㎕, 25uM 바이오티닐화된 역방향 프라이머 2㎕, Ex Taq 중합효소(TaKaRa, Japan) 0.3㎕ (1unit/㎕)와 35.7 ~ 34.7㎕의 물로 이루어져 있다. PCR 반응 조건은 우선 94℃에서 5분간 변성 시키고, 94℃에서 30 초, 52℃에서 30 초, 그리고 72℃에서 30초간 반응을 10주기 반복한 후, 72℃에서 5분간 추가로 신장시키는 반응을 이용하였다. PCR 반응 후 4㎕를 취하여, 2% 아가로스 겔을 이용하여 정확한 크기의 밴드가 나타나는지 확인하였다. 나머지 DNA는 PCR 정제 키트(Qiagen, USA)을 이용하여 DNA만을 회수하였다.
<1-2> 비대칭(asymmetric) PCR 기법을 활용한 ssDNA 증폭
PCR 기법을 이용하여 증폭한 dsDNA 중 ssDNA만을 증폭하기 위하여 비대칭 PCR를 수행하였다. 비대칭 PCR 반응 조성은 상기 실시예<1-1>을 통하여 획득한 주형 DNA 50㎕, 10X PCR 완충용액 10㎕, 10mM dNTP 혼합물 8㎕, 25uM 정방향 프라이머 10㎕, 25uM 바이오티닐화된 역방향 프라이머 1㎕, Ex Taq 중합효소 (Takara, Japan) 0.5㎕ (1 unit/㎕)와 20.5㎕의 물로 이루어져 있다. 비대칭 PCR 반응 조건은 우선 94℃에서 5분간 변성시키고, 94℃에서 30초, 52℃에서 30초, 그리고 72℃에서 30초간 반응을 20주기 반복한 후, 72℃에서 5분간 추가 신장시키는 반응을 이용하였다. PCR 반응 후 4㎕를 취하여, 2% 아가로스 겔을 이용하여 정확한 크기의 밴드가 나타나는지 확인하였으며, 나머지 DNA에는 나머지 DNA는 PCR 정제 키트(Qiagen, USA)을 이용하여 DNA만을 회수하였다.
<1-3> ssDNA의 선별 및 회수
비대칭 PCR을 이용하여 증폭한 PCR 산물 중 바이오틴이 붙어 있는 dsDNA 및 ssDNA를 제거하고 순수한 정방향의 ssDNA만을 확보하기 위하여, 1.2에서 획득한 DNA 50㎕에 증류수 50㎕를 첨가 후, 스트렙트아비딘(Pierce, USA) 50㎕를 첨가 하여 4℃에서 2시간 동안 반응시킨다. 반응이 끝난 후, 반응액은 4℃, 13,000 rpm의 원심분리기를 이용하여 10분간 원심분리한 후, 상층액만을 회수하여 1/10 부피의 3M NaOAc (pH 4.5)와 2~3 부피의 100% 에탄올을 첨가하여 -70℃에서 1시간 동안 방치한다. 반응 후에는 4℃에서 13,000 rpm으로 20분간 원심분리하여 DNA만을 회수한다. 회수된 DNA는 공기 중에서 말린 후, 50㎕의 증류수에 녹인다. 회수된 DNA 중 4㎕를 취하여 2% 아가로스 겔을 이용하여 정확한 크기의 밴드가 나타나는지 확인하였다. 나머지 DNA 중 2㎕를 취하여 S1 nuclease를 처리하고, 37℃에서 1시간 동안 반응시킨 후, 2% 아가로스 겔을 이용하여 회수한 ssDNA가 완벽하게 제거됨을 확인하였다.
<실시예 2>
SELEX 기법을 이용한 카드뮴과 특이적으로 결합하는 카드뮴 결합 DNA 앱타머 선별
<2-1> 카드뮴 고정 센서칩 제작
카드뮴에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 선별을 위하여, 본 발명자들은 SPR 검출 시스템 기기인 BIACORE 3000을 이용하여 표면 플라즈몬 공명 (Surface Plasmon Resonance, SPR) 기반의 SELEX 실험을 실시하였다.
카드뮴과 카드뮴 결합 DNA 앱타머를 선별하기 위하여, 표면이 나이트릴로트라이아세트산 (Nitrilotriacetic acid)이 고정된 센서 칩 NTA (GE Healthcare)를 이용하였다. 또한 센서칩의 기본 버퍼는 HEPES ((4-(2-hydroxyethyl)-1- piperazineethanesulfonic acid)를 이용하였음. 센서 칩 NTA는 50 mM EDTA를 20㎕/min의 속도로 5분 동안 칩에 흘려 칩에 잔여하는 금속 이온 성분을 모두 제거하였다. 금속 이온 성분을 모두 제거된 센서 칩 NTA의 채널 2번에는 0.1 M 카드뮴 클로라이드(Cadmium chloride)를 5㎕/min의 속도로 4분 동안 처리하여 칩 표면에 카드뮴을 고정하였다 (도 1 참고). 각 실험 후 센서 칩은 45 mM EDTA와 1mM의 BC가 혼합된 버퍼로 재생시켰다. 속도 변수는 BIA 평가프로그램 (BIACORE)으로 수득하였다. 카드뮴이 고정되는 여부는 BIA evaluation 4_1 프로그램을 통해 실시간으로 반응 양상을 확인하였다 (도 2 참고).
<2-2> SELEX에 이용될 ssDNA 앱타머 제작
카드뮴에 특이적으로 결합하는 카드뮴 결합 DNA 앱타머를 선별하기 위하여 상기의 실시예 1을 통해 기 제작 확보한 ssDNA 200㎕에 HEPES 용액을 첨가 한 후, 85℃에서 5분간 끓여 변성(Denaturation) 시켰다가 상온에서 서서히 식혀 ssDNA 앱타머의 안정한 3차원 구조를 형성시켰다.
<2-3> 카드뮴 결합 DNA 앱타머 선별을 위한 카드뮴 고정 센서칩을 활용한 SELEX 방법
상기의 실시예 <2-1>에서 확보한 카드뮴이 고정된 카드뮴 센서 칩에, 상기의 실시예 <2-2>에서 확보한 구조 형성한 ssDNA를 200 ㎕를 넣고 25 ℃에서 10 ㎕/min 의 유속으로 10분간 반응 시켰다. 본 과정을 통해 카드뮴이 고정되지 않은 ssDNA 는 씻겨 나가게 되고 카드뮴에 결합력이 있는 ssDNA는 카드뮴이 고정된 센서칩에 반응하여 칩에 고정된 카드뮴에 결합되어 있게 된다. 이후 카드뮴에 특이적으로 붙지 않는 ssDNA 앱타머는 25 ℃에서 20 ㎕/min 의 유속으로 HEPES 버퍼를 흘려 30분간 반응시킴으로써 모두 제거하였다. 또한 카드뮴에 특이적으로 결합하는 ssDNA 앱타머는 DNA 앱타머 용출 용액 (50 mM EDTA; ethylenediaminetetraacetic acid) 을 이용하여 카드뮴과 카드뮴에 고정된 DNA 앱타머를 용출하였다. 용리된 카드뮴 결합 DNA와 카드뮴을 분리 및 제거하기 위하여 용출된 용액을 85 ℃에서 5분간 반응시킨 후, 용리액과 동량의 PCI (phenol/chloroform/isoamyl alcohol) 처리 후, Ethanol precipitation 기법을 이용하여 정제 하였다.
<2-4> Negative SELEX을 통한 비특이적 ssDNA 제거
카드뮴이 아닌 센서칩에 비특이적으로 흡착하는 ssDNA를 제거하기 위하여 SELEX 7회와 8회 사이에는 카드뮴이 고정되어 있지 않은 나이트릴로트라이아세트산 (Nitrilotriacetic acid; NTA) 칩을 이용하여 Negative SELEX (NS)을 진행하였다. 50 mM EDTA를 처리 하여 센서칩을 Equilibration 한 후, 여기에 ssDNA 앱타머를 200 ㎕를 넣고 25 ℃에서 10 ㎕/min 의 유속으로 10분간 반응시켰다. 이후, 센서칩에 결합되지 않은 앱타머는 flow 에 흘러 나와서 앱타머를 회수 하여 다음 SELEX 라운드에 이용하였으며, 그 외 센서 칩에 결합되는 앱타머는 카드뮴 외 비특이적으로 센서칩에 결합하는 ssDNA이므로 제거하였다. SELEX는 총 9 회까지 진행하였으며, SELEX의 결합 조건은 횟수가 증가할수록 ssDNA 양과 반응 시간을 줄였으며, 횟수가 거듭될수록 반응 조건을 거칠게 하여 목표 물질인 카드뮴에 특이적으로 결합하는 카드뮴 결합 DNA 앱타머를 얻고자 하였다.
<실시예 3>
나노드랍(Nanodrop)을 이용한 정량적 친화성 테스트
SELEX를 9회까지 마친 후 SELEX 진행 여부 및 각 라운드에서 용리된 ssDNA 앱타머의 카드뮴과의 친화성을 정량적으로 확인하기 위하여 각 라운드에서 용리된 ssDNA의 농도를 나노드랍을 이용하여 측정하였다. 먼저 1 라운드부터 9 라운드까지의 ssDNA 앱타머를 PCR을 통하여 증폭하고, 비대칭 PCR을 진행하여 ssDNA를 확보하였음. 각 라운드의 ssDNA의 농도를 동일하게 하여 상기의 실시예 2.3에서 수행한 것과 같이 카드뮴 결합 센서칩에 다시 각각 10 분동안 반응시켰다. 그리고 카드뮴이 고정된 센서칩에서 용리한 각 라운드의 ssDNA 앱타머 각각을 나노드랍을 이용하여 농도를 측정하였다. 나노드랍을 활용하여 각 라운드의 농도를 측정한 결과, 8 라운드의 농도가 550.3 ng/㎕로 가장 높았으며, 9 라운드의 농도는 536.9 ng/㎕로 8 라운드의 결과 보다 농도가 떨어지는 것으로 보아 최적의 카드뮴 결합 DNA 앱타머가 형성된 라운드가 8 라운드임을 확인할 수 있었다. 이로서, 나노드랍을 통해 정량적인 농도를 확보한 결과를 토대로 8 라운드에서 획득한 ssDNA가 카드뮴 결합 효율이 가장 높다는 것을 확인할 수 있었다 (도 3 참고).
<실시예 4>
카드뮴과 특이적으로 결합하는 카드뮴 결합 DNA 앱타머 후보군의 클로닝
나노드랍을 통해 각 라운드에서 용리된 ssDNA 앱타머의 농도 측정을 통하여 카드뮴 결합 효율이 가장 높은 것으로 판단된 8 라운드의 ssDNA 앱타머에 대해 정방향 프라이머: 5'-GGTAATACGACTCACTATAGGGAGATACCAGCTTATTCAATT-3'와 역방향 프라이머: 5'-바이오틴-AGATTGCACTTACTATCT-3'를 이용한 PCR 수행으로 dsDNA를 획득하였다. 이렇게 획득한 dsDNA는 QIAGEN의 PCR 클로닝 키트를 이용하여 클로닝을 수행하였다. 클로닝은 T-벡터 (50ng/㎕) 1㎕와 PCR 산물 (20ng/㎕) 4㎕, 라이게이션 마스터 믹스 버퍼 5㎕를 섞어서 16℃에서 30분 동안 반응시키는 조건을 이용하였다. TA 클로닝한 ligate 10㎕는 200㎕의 DH5α와 섞은 후 42℃에서 1분 30초 동안 열충격 (heat shock)을 준 후 바로 얼음에 놓아둔다. 이후 여기에 800㎕의 LB broth를 첨가한 후, 37℃에서 1시간 동안 배양한다. 배양 후, 200㎕의 용액을 취하여 앰피실린(ampicillin, 50㎍/ml), 카나마이신(kanamycin, 50㎍/ml), X-gal(50㎍/ml), IPTG (5㎍/ml)이 포함되어 있는 LB 배양 플레이트(LB plate)에 스프레딩하고 37℃에서 15시간 동안 배양시킨 후 흰색 콜로니만을 선별하여 솔젠트(Solgent, Korea)에 의뢰하여 앱타머의 염기서열을 결정하였다.
상기와 같은 방법을 통해 총 24종의 클론을 확보하였으며, Clustal_X 프로그램을 통하여 동일한 서열은 가지는 클론을 제거하고 총 10종의 카드뮴 특이 결합 DNA 앱타머를 선정 확보 하였다.
<실시예 5>
SPR 분석 시스템을 이용한 카드뮴 결합 DNA 앱타머 후보군의 정량적 친화도 테스트
<5-1> 카드뮴 결합 DNA 앱타머 후보군의 카드뮴과의 친화도 테스트
카드뮴과 실시예 4에서 획득한 앱타머 후보군과의 친화도를 정량하기 위하여, 본 발명자들은 실시예 <2-1>에서와 같은 방법으로 카드뮴이 고정된 센서칩을 확보하였으며, SPR 기반의 분석 시스템을 활용하여 각각의 앱타머 후보군과 카드뮴과의 결합력을 정량화하기 위한 실험을 실시하였다. 먼저 카드뮴과의 친화력이 높을 것이라고 판단된 8 라운드에서 획득한 10 개의 카드뮴 결합 DNA 앱타머 후보군들의 카드뮴과의 결합 효율을 확인하기 위하여 실시예 <2-3>에서 수행한 것과 같이 카드뮴 결합 센서칩에 제작된 카드뮴 결합 DNA 앱타머는 아무것도 붙지 않은 센서 칩 (채널 1), 카드뮴이 고정된 센서 칩 (채널 2)에 순차적으로 흘려 카드뮴 결합 DNA 앱타머 후보군과 카드뮴간의 친화도를 확인하였다. Biacore를 활용한 실험 결과 각각의 카드뮴 결합 DNA 앱타머는 카드뮴과의 결합력이 nM 수준 정도 되는 것으로 분석되었으며, DNA 앱타머 후보군 중 Cd-5 가 카드뮴과의 결합력이 가장 좋은 것을 확인할 수 있었다 (하기 표 1 참고).
Figure PCTKR2014008243-appb-I000001
<실시예 6>
최적 카드뮴 결합 DNA 앱타머의 구조 결정
상기 나노드랍 스펙트로포토미터 및 SPR 분석을 통하여 획득한 카드뮴 결합 DNA 앱타머 후보군들의 구조는 Rensselear polytechnic institute에서 제공하는 DNA mfold 프로그램을 활용하여 이미지화할 수 있었다.
카드뮴과 특이적인 결합력을 보이는 것으로 선별된 카드뮴 결합 DNA 앱타머의 2차 구조는 도 4 내지 도 13에서 나타내었다.
<실시예 7>
SPR 분석을 통한 최적 카드뮴 결합 DNA　앱타머 Cu-A5와 다른 중금속간의 친화도 테스트
카드뮴 결합　DNA　앱타머 Cd-5와 다른 중금속간의 친화도를 측정하기 위하여 스트렙트아비딘으로 코팅되어 있는 센서 칩 SA를 이용하였다. 센서 칩 SA는 50mM NaOH와 1M NaCl 혼합액을 5㎕/min의 속도로 1분 동안 칩에 흘려 센서 칩을 활성화시킨다. 여기에 바이오틴으로 변형시킨 500 nM 카드뮴 결합 앱타머를 5㎕/min의 속도로 10분 동안 점차적으로 흘려 스트렙트아비딘에 앱타머를 고정시켰다. 이렇게 제작한 센서 칩에 8종의 1M의 다양한 중금속 용액(ArHNa2O4, CdSO4, CoSO4, FeCl2, MgCl2, MnSO4, NiCl2, ZnCl2)을 10㎕/min의 속도로 3분 동안 반응시켰다.
그 결과 도 14에서 나타낸 바와 같이, Cd-5 DNA 앱타머는 카드뮴 CdSO4과 최적의 반응을 일으킨 반면, 다른 중금속들과는 반응이 매우 미미한 것으로 나타났다. 이로서 카드뮴 결합 DNA 앱타머가 카드뮴에만 특이적으로 결합하는 것을 확인 할 수 있었다.
<실시예 8>
최적 카드뮴 결합 DNA 앱타머를 활용한 필터 시스템 기반 카드뮴 제거
상기에서 발굴한 최적 카드뮴 결합 Cd-5 DNA 앱타머의 5′부분을 아민으로 변형 (modification)한 후 85℃에서 5분간 반응시킨 후 실온에서 서서히 식혀 2차 구조를 형성한다. 이렇게 획득한 카드뮴 결합 Cd-5 DNA 앱타머는 카르복실 잔기를 가지고 있는 니트로셀룰로오스 멤브레인 필터에 결합시켜 고정시켰다. 고정시키기 위하여, 먼저 니트로셀룰로오스 멤브레인에 EDC (1-Ethyl-3-(3-dimethylamino- propyl) carbodiimide)와 NHS (N-Hydroxysuccinimide)를 처리한 후, 아민기로 변형한 Cd-5 앱타머를 결합시켰음. 이후, 앱타머가 고정되지 않은 나머지 반응기를 제거하기 위하여 Ethanolamine을 처리함으로써 앱타머 이외의 반응기를 제거하였음.
상기에서 제작한 카드뮴 특이결합 Cd-5 앱타머가 고정된 니트로셀룰로오스 멤브레인을 플라스크 기반의 필터 시스템에 활용하는 경우, 시료내의 카드뮴을 제거할 수 있을 것으로 사료된다(도 15 참고).
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (13)

  1. 서열번호 1 내지 10 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드; 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드로 이루어진, 카드늄에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머.
  2. 카드늄의 검출, 분리 또는 제거를 위한 제1항의 앱타머 용도.
  3. 제1항의 앱타머를 포함하는 카드늄 검출용 키트.
  4. 서열번호 1 내지 10으로 표시되는 폴리뉴클레오티드를 가지는 DNA 앱타머 중 1종 이상의 DNA 앱타머가 고정화된 기판.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 기판은 마이크로티터 플레이트(microtiter plate), 비드(bead), 멤브레인(membrane) 또는 칩(chip)인 것을 특징으로 하는 DNA 앱타머가 고정화된 기판.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 멤브레인은 니트로셀룰로오스 멤브레인인 것을 특징으로 하는 DNA 앱타머가 고정화된 기판.
  7. 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 기판은 카드늄의 검출, 분리 또는 제거의 용도를 갖는 것을 특징으로 하는 DNA 앱타머가 고정화된 기판.
  8. 카드뮴을 함유하는 것으로 의심되는 시료와 제1항의 DNA 앱타머를 접촉시키는 단계; 및 카드뮴과 DNA 앱타머의 결합 여부를 확인하는 단계를 포함하는, 카드뮴을 검출하는 방법.
  9. 카드뮴을 함유하는 것으로 의심되는 시료와 제1항의 DNA 앱타머를 접촉시켜 카드뮴 및 DNA 앱타머 복합체를 형성하는 단계; 및 상기 복합체를 제거하는 단계를 포함하는, 카드뮴을 제거하는 방법.
  10. a) PCR 증폭을 통해 DNA 라이브러리를 생성하는 단계;
    b) 상기 증폭된 DNA 라이브러리를 대상으로 비대칭 PCR 기법을 이용하여 ssDNA를 선별하는 단계;
    c) 카드뮴이 고정된 센서 칩을 준비하는 단계; 및
    d) 상기 센서 칩을 이용 SELEX(Systemic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment) 기법을 통해 카드뮴에 결합하는 DNA 앱타머를 분리하는 단계를 포함하는, 카드뮴에 특이적으로 결합하고 서열번호 1 내지 10 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드를 갖는 DNA 앱타머의 제조방법.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 b) 단계에서 카드뮴이 고정된 센서 칩은 표면에 나이트릴로트라이아세트산(nitrilotriacetic acid)이 고정된 센서 칩에 카드뮴 클로라이드(Cadium chloride)를 처리하는 과정을 통해 준비되는 것을 특징으로 하는 DNA 앱타머의 제조방법.
  12. 서열번호 1 내지 10으로 표시되는 폴리뉴클레오티드를 가지는 DNA 앱타머 중 1종 이상의 DNA 앱타머가 고정화된 기판을 포함하는 카드뮴 제거용 필터.
  13. 제12항의 필터를 포함하는 중금속 정화 시스템.
PCT/KR2014/008243 2013-09-05 2014-09-03 카드뮴에 특이적으로 결합하는 ｄｎａ 앱타머 및 이의 용도 WO2015034250A1 (ko)

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