KR101859615B1 - 표피 성장 인자 수용체 특이적 결합 dna 앱타머 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 동물세포 생장 촉진을 위한 배양첨가제로서의 표피 성장 인자 수용체(Epidermal Growth Factor Receptor, EGFR) 특이적 결합 DNA 앱타머 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명자들은 기존의 배지첨가제의 단점을 보안 및 대체할 수 있는 새로운 첨가제를 연구하던 중, 본 발명의 DNA 앱타머가 EGF 단백질의 대체제로 EGFR 단백질과 특이적으로 결합하는 것을 확인하였으므로 새로운 형태의 동물세포 배양배지 및 배지첨가제로 유용하게 이용될 수 있다.

Description

표피 성장 인자 수용체 특이적 결합 DNA 앱타머 및 이의 용도{EGFR-specific DNA aptamer as incubation additives for promotion of mammalian cell growth and uses thereof}

본 발명은 표피 성장 인자 수용체(Epidermal Growth Factor Receptor, EGFR) 특이적 결합 DNA 앱타머 및 이의 용도에 관한 것이다.

최근 의약용으로 개발되는 단백질 제품의 개발과 생산이 점차 증가하고 있으며, 이러한 단백질 제품 생산에는 미생물, 효모, 식물세포, 동물세포 등의 생명체 시스템이 주로 이용되고 있다. 단백질이 세포로부터 발현될 때, 각각의 생명체 시스템마다 단백질 발현 속도, 품질, 비용, 배양과 조작의 난이도 면에서 여러 가지 장단점이 존재하기 때문에, 목적에 따른 적절한 발현 생명체 시스템의 선택은 단백질 제품 생산 과정에서 중요하게 고려되어야 한다. 그 중 진핵세포인 포유동물세포는 단백질이 합성된 후 그 단백질이 적절한 생물학적 활성을 가질 수 있도록 변형하는 단계인 '번역 후 과정(posttranslation)'이 다른 생명체 시스템보다 뛰어나므로 고품질의 활성형 단백질 생산이 가능하다는 큰 장점이 있다. 따라서 동물세포는 의약용으로 사용 가능한 양질의 단백질을 발현하고 산업적으로 생산하기 위한 수단으로 가장 많이 사용되고 있으며, 따라서 경제적, 기술적으로 효율적인 동물세포 배양기술은 새로운 고부가가치 생물의약품 개발 및 생산에 있어 매우 중요하게 고안되어야 한다.

동물세포의 생장 및 분화에는 각종 growth factor가 필수적으로 요구되는데, 이러한 growth factor들은‘혈청'에 포함되어 있다. 혈청은 배지와는 다른 별개의 첨가물로서 세포 종류나 배양 목적에 따라 사용자가 적절한 농도로 무혈청 배지에 혼합하여 사용되고 있다. 현재 동물세포를 배양하는 배지에는 세포 종류와 배양 목적에 따라 3%~10% 농도로 혈청이 첨가되는 것이 일반적이다. 혈청 내에는 세포 분화와 생장을 촉진할 수 있는 여러 종류의 growth factor들이 존재하며, 혈청 내에 존재하는 대표적인 growth factor로는 표피생장인자(epidermal growth factor, EGF)가 있다.

이와 같이 혈청 성분은 동물세포 배양에 반드시 필요하지만, 고가라는 단점이 있고 소의 태아로부터 채취되므로 복합배지처럼 조성이 불분명할 뿐만 아니라 생산시기, 설비 등에 따라 품질과 조성에 차이가 나타날 수 있다. 따라서 재현성과 일관성이 보장되어야하는 민감한 실험이나 배양 과정에서는 이것이 커다란 문제가 될 수 있으며, 이를 보완하기 위해 혈청이 제외된 무혈청(저혈청) 배지에 특정 growth factor만을 적정량 첨가하여 배양에 사용하기도 하지만 이 경우에도 마찬가지로 growth factor의 가격이 고가이며 실험 과정이 번거로워질 수 있다는 단점이 있다. 따라서, 상기와 같은 혈청배지 사용 시 나타날 수 있는 문제점들을 보완하면서 조성 성분이 분명한 제한배지 내에서 안정적이고 효율적인 동물세포 배양이 가능하게 하기 위해서는 혈청 내 growth factor의 역할을 대신할 수 있는 새로운 물질의 개발이 요구되는 실정이다.

이에, 본 발명자들은 기존의 무혈청 배양 배지 첨가제 소재 및 배양기술의 단점을 보완하기 위하여 EGFR의 세포외 부위에 특이적으로 결합하는 소재인 'EGFR 결합 DNA 앱타머'를 선별·제작하고, EGF의 역할을 대신하는 무혈청 또는 저혈청 배양 배지 첨가제 개발에 응용하고자 하였다.

대한민국 등록특허 제10-1457509호 대한민국 등록특허 제10-1602689호

따라서, 본 발명의 목적은 표피 성장 인자 수용체(Epidermal Growth Factor Receptor, EGFR)에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머(aptamer)를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 DNA 앱타머를 포함하는 동물세포 배양배지를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 DNA 앱타머를 포함하는 기능성 화장품 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 DNA 앱타머의 제조 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 서열번호 1 내지 서열번호 5 중 어느 하나의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드(oligonucleiotide)인 것을 특징으로 하는 표피 성장 인자 수용체(EGFR)에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머(aptamer)을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 본 발명은 상기 DNA 앱타머는 표지물질을 더 포함하여 구성되는 것을 특징으로 한다. 상기 DNA 앱타머는 형광물질, 아민기, 바이오틴 및 티올기로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 표지물질이 상기 DNA 앱타머의 5' 말단 또는 3' 말단에 표지될 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 DNA 앱타머는 DNA 앱타머를 구성하는 하나 이상의 뉴클레오타이드의 리보스 2' 위치의 하이드록시기가, 수소원자, 불소원자, -OR, -COOR 및 아미노기로 이루어진 군 중에서 선택된 어느 하나로 치환된 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 표피 성장 인자 수용체(EGFR) 단백질은 사람 표피 성장 인자 수용체(서열번호 12) 또는 His-융합 표피 성장 인자 수용체 단백질일 수 있다.

또한, 본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 5로 구성된 올리고뉴클레오티드들 중에서 선택된 어느 하나 이상의 DNA 앱타머를 포함하는 동물세포 배양배지를 제공한다. 본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 배지는 무혈청 또는 저혈청 배지인 것이 바람직하다. 본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 DNA 앱타머는 표피 성장 인자(EGF) 대체하는 용도로 사용된다.

또한, 본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 5로 구성된 올리고뉴클레오티드들 중에서 선택된 어느 하나 이상의 DNA 앱타머를 포함하는 기능성 화장품 조성물을 제공한다. 본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 조성물은 피부세포의 재생을 촉진하는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은

1) PCR과 비대칭(asymmetric) PCR 기법을 이용하여 DNA 앱타머를 증폭하고, 단일가닥 DNA 앱타머를 선별하는 단계;

2) Ni-NTA 아가로오스 레진에 polyhistidine이 태깅된 EGFR 단백질을 고정시킨 구조체를 만드는 단계; 및

3) 위의 구조체를 이용한 SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment) 기법을 통해 EGFR 단백질에 결합하는 DNA 앱타머를 선별하는 단계;

를 포함하는 EGFR 단백질에 특이적으로 결합하는 EGFR 결합 DNA 앱타머의 제작 방법을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 3) 단계는 최적 친화력(affinity)을 갖는 SELEX 라운드 선별을 위한 실시간 PCR 단계; 최적 SELEX 라운드에서 PDGFRβ 결합 DNA 앱타머 후보군 선별을 위한 PCR 및 클로닝 단계; PDGFRβ 결합 DNA 앱타머 후보군의 PDGFRβ에 대한 친화력을 측정하는 단계; 및 선별된 PDGFRβ 결합 DNA 앱타머 후보군의 DNA 서열 결정 단계를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 DNA 앱타머는 표피 성장 인자 수용체(EGFR)에 특이적으로 이를 활성화시킴으로써 세포의 성장 및 분열을 위한 신호전이 과정을 유도하며, 이에 따라 동물세포의 성장 및 분열을 촉진시킬 수 있다. 따라서 본 발명의 DNA 앱타머는 동물세포의 배양배지나 기능성 화장품의 원료 등으로 사용될 수 있다. 특히 본 발명의 DNA 앱타머는 혈청 내의 EGF을 대체하여, 현재 의료용 단백질 및 항체 생산에 필수적으로 사용되는 동물세포배양의 문제점인 공급 및 가격의 불안정성 등을 해결할 수 있을 것으로 기대된다.

도 1은 동물세포의 인지질이중층 세포막에 관통하여 존재하는 EGFR 단백질에 리간드인 EGF가 결합하며 세포 내 연쇄적 인산화 반응을 개시하여 세포의 생장 및 분화를 촉진시키는 원리를 간단하게 나타낸 그림이다.
도 2는 앱타머를 선별하는 실험 방법인 SELEX(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment) 기법을 시각화하여 나타낸 그림이다.
도 3은 SELEX 과정 중 단일가닥 DNA를 제작하는 과정의 전기영동 결과 사진이다. 모든 사진은 DNA를 2% 농도의 아가로오스 겔 상에 전개시킨 뒤 브로민화 에티듐(ethidiumbromide, EtBr)로 염색한 뒤 UV 하에 관찰하였다.
A : 도 1A는 PCR 산물의 전기영동 결과이다.
레인 M : 100 bp DNA ladder(elpis).
레인 1 : PCR 증폭 산물.
B : 도 1B는 PCR 정제산물의 전기영동 결과이다.
레인 M : 100 bp DNA ladder(elpis).
레인 1 : PCR 정제 산물.
C : 도 1B는 비대칭 PCR 산물의 전기영동 결과이다.
레인 M : 100 bp DNA ladder(elpis).
레인 1 : 비대칭 PCR 산물.
도 4는 EGFR 단백질 포함 구조체의 모식도이다.
도 5은 총 12회의 SELEX 라운드를 마친 후, 매 라운드마다 회수된 단일가닥 DNA 앱타머 풀의 농도를 미소 분광광도계(microspectrophotometer)로 측정한 값을 막대그래프로 나타낸 것이다. 네거티브 셀렉션 라운드 이후 라운드 중 회수된 앱타머 풀의 농도가 가장 놓은 라운드를 화살표로 표시하였다.
도 6는 표면 플라즈몬 공명(SPR) 실험 기법으로 최종 5종의 앱타머의 EGFR 단백질에 대한 친화력을 해리상수 값으로 도출한 뒤 막대그래프로 나타낸 것이다.
도 7는 Rensselear polytechnic institute에서 제공하는 DNA mfold 프로그램을 이용하여 앱타머의 2차 구조를 예측한 결과이다 2차 구조에 해당하는 델타지 값을 각 그림의 좌측상단에 기재하였다.
A: 도 5A는 카드뮴 결합 앱타머 1번의 서열을 기반으로 해당 앱타머의 3차원 구조를 예측한 결과이다.
B: 도 5B는 카드뮴 결합 앱타머 2번의 서열을 기반으로 해당 앱타머의 3차원 구조를 예측한 결과이다.
C: 도 5C는 카드뮴 결합 앱타머 3번의 서열을 기반으로 해당 앱타머의 3차원 구조를 예측한 결과이다.
D: 도 5D는 카드뮴 결합 앱타머 4번의 서열을 기반으로 해당 앱타머의 3차원 구조를 예측한 결과이다.
E: 도 5E는 카드뮴 결합 앱타머 4번의 서열을 기반으로 해당 앱타머의 3차원 구조를 예측한 결과이다.
도 8은 24 well plate에 각각의 조건배지를 사용하여 헬라 세포를 3일 간 배양하며 24시간 마다 세포 수를 측정한 결과를 꺾은 선 그래프로 나타낸 것이다. 모든 조건 배지에 혈청은 포함되지 않았다.
Negative cont. 1: DMEM 배지에 Sodium Selenite 5 ng/ml, Transferrin 5 ㎍/ml의 농도로 포함시킨 배지에서 헬라 세포를 배양한 결과이다.
Negative cont. 2: DMEM 배지에 Sodium Selenite 5 ng/ml, Transferrin 5 ㎍/ml, PDGF protein 5 ng/ml, Insulin protein 5 ㎍/ml의 농도로 포함시킨 배지에서 헬라 세포를 배양한 결과이다.
EGF protein: DMEM 배지에 Sodium Selenite 5 ng/ml, Transferrin 5 ㎍/ml, PDGF protein 5 ng/ml, Insulin protein 5 ㎍/ml, EGF protein 1 ng/ml의 농도로 포함시킨 배지에서 헬라 세포를 배양한 결과이다.
Aptamer 1: DMEM 배지에 Sodium Selenite 5 ng/ml, Transferrin 5 ㎍/ml, PDGF protein 5 ng/ml, Insulin protein 5 ㎍/ml, 1번 앱타머 5 ng/ml의 농도로 포함시킨 배지에서 헬라 세포를 배양한 결과이다.
Aptamer 2: DMEM 배지에 Sodium Selenite 5 ng/ml, Transferrin 5 ㎍/ml, PDGF protein 5 ng/ml, Insulin protein 5 ㎍/ml, 2번 앱타머 5 ng/ml의 농도로 포함시킨 배지에서 헬라 세포를 배양한 결과이다.
Aptamer 3: DMEM 배지에 Sodium Selenite 5 ng/ml, Transferrin 5 ㎍/ml, PDGF protein 5 ng/ml, Insulin protein 5 ㎍/ml, 3번 앱타머 5 ng/ml의 농도로 포함시킨 배지에서 헬라 세포를 배양한 결과이다.
Aptamer 4: DMEM 배지에 Sodium Selenite 5 ng/ml, Transferrin 5 ㎍/ml, PDGF protein 5 ng/ml, Insulin protein 5 ㎍/ml, 4번 앱타머 5 ng/ml의 농도로 포함시킨 배지에서 헬라 세포를 배양한 결과이다.
Aptamer 5: DMEM 배지에 Sodium Selenite 5 ng/ml, Transferrin 5 ㎍/ml, PDGF protein 5 ng/ml, Insulin protein 5 ㎍/ml, 5번 앱타머 5 ng/ml의 농도로 포함시킨 배지에서 헬라 세포를 배양한 결과이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

이하의 설명에 있어, 당업자에게 주지 저명한 기술에 대해서는 그 상세한 설명을 생략할 수 있다. 또한, 본 발명을 설명함에 있어서, 관련된 공지 기능 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략할 수 있다. 또한, 본 명세서에서 사용되는 용어들은 본 발명의 바람직한 실시예를 적절히 표현하기 위해 사용된 용어들로서, 이는 사용자, 운용자의 의도 또는 본 발명이 속하는 분야의 관례 등에 따라 달라질 수 있다. 따라서, 본 용어들에 대한 정의는 본 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 내려져야 할 것이다. 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.

본 발명은 표피 성장 인자 수용체(Epidermal Growth Factor Receptor, EGFR)에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머(aptamer) 및 이의 용도에 관한 것이다.

본 발명자들은 기존의 배지첨가제의 단점을 보안 및 대체할 수 있는 새로운 첨가제를 개발하고자 연구한 결과, 본 발명의 DNA 앱타머는 세포막에 막관통 단백질 형태로 존재하며 EGF와 결합시 세포 생장 및 분화를 촉진하는 신호전달 경로를 매개하는 리셉터 단백질인 EGFR 단백질을 목적으로, 무혈청(저혈청) 배지 조건에서 EGF를 대신하여 EGFR과 높은 친화력으로 결합하는 것으로, 기존의 배지첨가제의 단점을 보완 및 대체할 수 있는 새로운 무혈청 또는 저혈청 배양 배지첨가제로 효과적으로 이용할 수 있음을 입증함으로써 본 발명을 완성하였다.

상기 EGF는 53개의 아미노산으로 이루어진 6.2 kDa에 달하는 단백질로, 상피세포의 생장과 분화를 촉진시키는 역할을 한다. 일단 EGF가 세포막에 막관통 단백질 형태로 존재하는 표피 성장 인자 수용체 (epidermal growth factor receptor, EGFR)의 세포외 활성부위에 결합함으로서 세포 내 신호전달 경로를 개시한다. EGF가 EGFR의 활성부위에 결합하면 첫 번째로 EGFR의 C-말단이자 세포내 티로신잔기 부위가 인산화효소에 의해 인산화 되고, 이후 이 인산화를 세포 내 신호전달 경로에서 감지하여 신호전달 단백질들의 연쇄적 인산화(polyphosphorylation)가 개시되는 원리이다(도 1 참조). 이처럼 EGFR이 EGF에 의해 적절히 자극되어야만 세포 분화나 생장, 확산, 이동을 촉진하는 신호전달 체계가 이루어져 비로소 정상적인 세포생장과 분화가 가능하게 되므로, EGF는 동물세포 배양 시 혈청 또는 별도의 단백질 첨가물의 형태로 반드시 공급되어야 하는 growth factor이다.

본 명세서에서 용어 "DNA 앱타머(aptamer)"는 특정 분자에 고친화성 및 특이성으로 결합할 수 있는 DNA 핵산 분자를 의미한다. 본 명세서에서 "DNA 앱타머"는 "DNA 올리고뉴클레오타이드"와 혼용하여 사용한다. 앱타머(aptamer)는 짧은 길이의 올리고머로 안정된 삼차구조를 형성하여 표적물질과 특이적인 결합력을 가지는 특징을 가지고 있다. 또한, 앱타머는 DNA나 RNA인 핵산으로 구성되어 있어 단백질로 이루어진 항체보다 안정적이며, 다양한 표적 물질(단백질, 펩타이드, 금속, 화학물질 등)과 특이적으로 결합이 가능하다는 장점을 가지고 있다. 뿐만 아니라, 화학적 합성 기법을 이용해 제작이 가능하기 때문에 단시간, 저비용으로 대량 생산이 가능하며, 한번 제작, 생산 후 동일한 능력을 가지는 앱타머를 지속적으로 생산 가능한 탁월한 장점을 갖고 있다. 이와 더불어 주변의 pH와 온도에 매우 안정성이 높아 최근 표적 물질의 탐지 및 질환 진단 센서 개발 등 환경, 의료 등 다양한 분야에서의 활용 가능성이 높이 평가되고 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 표피 성장 인자 수용체(Epidermal Growth Factor Receptor, EGFR) 단백질과 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머는 서열번호 1 내지 서열번호 5의 염기서열로 이루어진 군중에서 선택된 어느 하나의 염기서열을 갖거나, 이러한 염기서열과 90％ 이상의 동일성을 갖는 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드일 수 있다.상기 DNA 앱타머는 상기 DNA 앱타머를 구성하는 하나 이상의 뉴클레오타이드의 리보스 2' 위치의 하이드록시기가 수소원자, 불소원자, -OR, -COOR 및 아미노기로 이루어진 군 중에서 선택된 어느 하나로 치환된 것일 수 있다. 또한, 상기 DNA 앱타머는 표지물질을 더 포함하여 구성될 수도 있는데, 상기 표지물질은 형광물질, 아민기, 바이오틴 및 티올기로 이루어진 군 중에서 선택된 어느 하나의 표지물질이 상기 DNA 앱타머의 5' 말단 또는 3' 말단에 표지되는 것일 수 있다.

본 명세서에서 용어 "올리고뉴클레오타이드"는 일반적으로 길이가 약 200개 미만을 갖는 뉴클레오타이드 중합체를 지칭하며, 이에는 DNA 및 RNA가 포함될 수 있으며, 바람직하게는 DNA 핵산 분자이다. 뉴클레오타이드는 데옥시리보뉴클레오타이드, 리보뉴클레오타이드, 변형된 뉴클레오타이드 또는 염기 및/또는 이들의 유사체, 또는 DNA 또는 RNA 폴리머라제에 의해 또는 합성 반응에 의해 중합체 내로 도입될 수 있는 모든 기질일 수 있다. 뉴클레오타이드 구조에 대한 변형이 존재하는 경우, 이러한 변형은 올리고뉴클레오타이드 중합체의 합성 전에 또는 후에 추가될 수 있다. 뉴클레오타이드 서열은 비-뉴클레오타이드 성분에 의해 중단될 수 있다. 올리고뉴클레오타이드는 합성 후에, 예를 들어 표지와의 결합에 의해 추가로 변형시킬 수 있다.

본 발명의 DNA 앱타머는 전형적으로는 타겟 분자의 결합에 대한 시험관내 선택법에 의해 얻을 수 있다. 타겟분자에 특이적으로 결합하는 앱타머를 선택하는 방법은 당분야에서 공지되어 있다. 예를 들어, 유기 분자, 뉴클레오타이드, 아미노산, 폴리펩타이드, 세포 표면상의 마커분자, 이온, 금속, 염, 다당류가 각 리간드에 특이적으로 결합할 수 있는 앱타머를 분리하는 적절한 타겟 분자가 될 수 있다. 앱타머의 선별은 SELEX 방법으로공지된 생체내 또는 시험관내 선택 기술을 이용할 수 있다(Ellington et al., Nature 346, 818-22, 1990; 및Tuerk et al., Science 249, 505-10, 1990). 앱타머의 선별 및 제조에 대한 구체적인 방법은 미국특허5,582,981, WO 00/20040, 미국특허 5,270,163, Lorsch and Szostak, Biochemistry, 33:973 (1994), Mannironi et al.,Biochemistry 36:9726 (1997), Blind, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:3606-3610 (1999), Huizenganand Szostak, Biochemistry, 34:656-665 (1995), WO 99/54506, WO 99/27133, WO 97/42317 및 미국특허 5,756,291에 기재되어 있으며, 상기 문헌들은 본 명세서에 참조로써 삽입된다.

본 발명의 EGFR 단백질과 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머는 바람직하게는 서열번호 1 내지 서열번호 5의 염기서열로 이루어진 군 중에서 선택된 어느 하나의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드이다. 이러한 DNA 앱타머는 본 명세서 도 7에 도시된 2차 구조를 형성할 것으로 추정된다. 또한, 본 발명의 EGFR 단백질과 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머는 EGFR 단백질과 결합하는 특성을 유지하면서, 상기 서열번호 1 내지 서열번호 5의 염기서열로 이루어진 군 중에서 선택된 어느 하나의 염기서열과 실질적인 동일성을 나타내는 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드도 포함하는 것으로 해석된다.

상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 뉴클레오타이드 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘 (Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981) Needleman and Wunsch, J.Mol. Bio. 48:443 (1970); Pearson and Lipman, Methods in Mol. Biol. 24: 307-31 (1988); Higgins and Sharp, Gene 73:237-44 (1988); Higgins and Sharp, CABIOS 5:151-3 (1989); Corpet et al., Nuc. Acids Res. 16:10881-90 (1988); Huang et al., Comp. Appl. BioSci. 8:155-65 (1992) and Pearson et al., Meth. Mol. Biol. 24:307-31 (1994))을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 90％ 이상의 동일성, 보다 바람직하게는 최소 95％ 이상의 동일성, 가장 바람직하게는 최소 98％ 이상의 동일성을 나타내는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다.

본 발명의 다른 양태로서, 본 발명의 DNA 앱타머는 다음의 단계를 통하여 선별된다.

1) PCR과 비대칭(asymmetric) PCR 기법을 이용하여 DNA 앱타머를 증폭하고, 단일가닥 DNA 앱타머를 선별하는 단계;

2) Ni-NTA 아가로오스 레진에 polyhistidine이 태깅된 EGFR 단백질을 고정시킨 구조체를 만드는 단계; 및

3) 위의 구조체를 이용한 SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment) 기법을 통해 EGFR 단백질에 결합하는 DNA 앱타머를 선별하는 단계.

본 발명의 일실시예에 의하면, 본 발명의 최적 친화력(affinity)을 갖는 EGFR 결합 DNA 앱타머의 선별은 다음의 단계를 통하여 선별된다.

최적 친화력(affinity)을 갖는 SELEX 라운드 선별을 위한 실시간 PCR 단계;

최적 SELEX 라운드에서 EGFR 결합 DNA 앱타머 후보군 선별을 위한 PCR 및 클로닝 단계; EGFR 결합 DNA 앱타머 후보군의 EGFR에 대한 친화력을 측정하는 단계; 및 선별된 EGFR 결합 DNA 앱타머 후보군의 DNA 서열 결정 단계.

본 발명의 일실시예에서, 상기 DNA 앱타머는 우선적으로 동물세포의 세포막에 존재하는 EGFR 단백질의 세포 외 활성부위에 높은 특이성과 선택성을 가지고 결합하고, EGFR의 세포 내 티로신 잔기의 인산화를 유도할 수 있으며, 이로 인해 개시되는 세포 내 신호전달 경로들로 인해 궁극적으로는 동물세포의 생장을 촉진할 수 있는 기능을 지닌 핵산 분자이다. 단일가닥 형태의 DNA 앱타머는 in vitro 상에서 SELEX(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment) 기법을 통해 랜덤 DNA 라이브러리로부터 선별되며 최종적으로 선별된 EGFR-결합 DNA 앱타머에 대해서는 surface plasmon resonance(SPR) 실험을 통해 그 결합력을 평가한다(도 2 참조).

한편, 본 발명의 DNA 앱타머는 표피 성장 인자 수용체(EGFR)에 특이적으로 결합하여 이를 활성화시킴으로써 세포의 성장 및 분열을 위한 신호전이 과정을 유도하며, 결과적으로 동물세포의 성장 및 분열을 촉진시킬 수 있다(도 8 참고).

따라서, 본 발명의 DNA 앱타머는 동물세포의 배양배지 첨가제로 사용될 수 있다. 본 발명에 있어서, 동물세포는 인간을 포함한 동물로부터 기원한 기능적 및 구조적 기본 단위이며, 인간을 포함한 동물로부터 기원한 세포이면 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서 본 발명의 동물세포는 이로 제한되는 것은 아니나, 줄기세포, 근육세포, 생식세포, 피부 내 세포(예로, 섬유아세포, 각질세포) 등을 포함한다. 본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 배양배지는 무혈청 또는 저혈청 배지인 것이 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니다. “무혈청” 또는 “저혈청” 배지는 인간을 포함한 동물로부터 유래된 혈청을 일정 함량 이상 함유하지 않는 임의의 동물세포 배양배지를 의미한다. 상기 임의의 동물세포 배양배지는 당업계에 공지되어 있는 적절한 세포 배양 배지(예를 들어, DMEM 배지, HAM 배지, IMDM 배지, RPMI 1640 배지 등)를 선택하여 사용할 수 있다. 이들 배지는 염, 비타민, 완충액, 에너지 공급원, 아미노산, 기타 물질을 포함할 수 있다. 또한, 이들 배지는 세포의 성장을 위한 범용적인 영양분을 포함한다. 본 발명의 DNA 앱타머는 동물 유래 혈청을 대체하여 배지에 첨가되더라도 배지 내의 세포의 증식을 촉진하고 활성화할 수 있다. 본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 동물세포 배양용 무혈청 배지는 필요에 따라 항생제, 항진균제 및 오염을 야기하는 마이코플라스마 억제제를 포함할 수 있으며, 필요에 따라, 글루타민 등의 산화영양소와 소디움 피루베이트 등의 에너지 대사물질을 더 첨가할 수 있다.

다른 하나의 양태로서, 본 발명의 DNA 앱타머는 동물세포 성장 및 분열촉진 효과를 이용하여 피부세포의 재생을 촉진시킬 수 있는 기능성 화장품 조성물을 제공한다. 기능성은 피부세포의 성장 및 분열과 관련된 것으로, 피부질환 또는 피부세포의 기능 저하 또는 손실 등의 원인에 의하여 피부의 외관 등에 나타나는 현상을 완화, 억제 또는 향상시키는 것을 의미한다. 구체적으로 본 발명의 기능성 화장품 조성물은 피부 재생 뿐만 아니라 피부질환의 완화, 주름의 개선, 피부노화 억제, 피부탄력의 개선, 피부 상처의 회복 등에도 효능이 있을 것으로 기대된다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 본 발명의 기능성 화장품 조성물은 당업계에서 통상적으로 사용되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있다. 상기 제형의 예로는 겔, 크림, 로션, 오일, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션, 스프레이 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 화장품 조성물은 유효 성분과 담체 성분을 포함할 수 있다. 예컨대, 화장품의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성 또는 식물성 기름, 왁스, 파라핀, 전분, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있고, 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있으며, 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용될 수 있다. 또한, 본 발명의 화장품 조성물은 유효 성분과 담체 성분 이외에, 화장품 조성물에 통상적으로 이용되는 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 보조제를 포함할 수 있다.

이하에서는 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 다만, 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다 할 것이다.

실시예 1: EGFR 단백질의 준비

1-1. Polyhistidine -tagged 재조합 EGFR 단백질의 준비

EGFR 단백질과 특이적으로 결합하는 앱타머를 선별하기에 앞서, 구체적으로 앱타머를 결합시킬 도메인을 설정하고 실험시 단백질과 앱타머 간 결합과 분리실험에 적합하도록 변형된 형태의 EGFR 단백질을 준비한다. 우선 앱타머는 EGFR의 세포 외 활성부위에 결합하도록 유도되어야 하므로 EGFR의 세포 외 부위, 막관통 부위, 세포 내 부위 중 세포 외 부위만을 앱타머 선별 실험에 사용한다. 그리고 단백질과 앱타머의 결합과 분리 과정에는 Ni-NTA agarose resin과 histidine 간의 친화반응을 활용할 계획이므로, C-말단에 polyhistidine이 부착되도록 재조합된 형태의 EGFR 단백질을 사용한다.

본 실험에는 ACRO Biosystems사의 recombinant human EGFR/ErbB1 protein을 구입하여 사용하였다. 이 단백질은 human EGFR 단백질 중 25번째 아미노산(류신)부터 645번째 아미노산(세린)까지의 범위에 해당하고, C-말단에 polyhistidine이 재조합되어 있는 형태이며 동결건조된 상태의 재조합 EGFR 단백질은 1X PBS 완충용액에 약 0.25 ㎍/㎕의 농도로 수화시킨 뒤 SELEX 실험의 한 라운드 당 15 ㎕씩 사용되었다. 기 농도의 단백질 용액 15 ㎕에는 3.69 ㎍의 단백질이 포함되어 있으며 이를 pmol 단위로 환산하면 53.09 pmol에 해당하는데, 앱타머는 이에 10배에 달하는 530.9 pmol로 결합시켰다.

실시예 2: DNA 앱타머 풀의 제작

2-1. PCR 증폭기법을 통한 랜덤 서열의 앱타머 라이브러리의 제작

EGFR 단백질을 표적으로 하는 단일가닥의 DNA 앱타머를 제작하기 위하여 40 개의 ramdom nucleotide를 dA : dG : dC : dT = 1.5 : 1.15 : 1.25 : 1 비율로 가지는 서열을 포함하는 100 bp의 주형 DNA와 이를 증폭할 수 있는 프라이머 두 가지를 Bioneer (Korea)에 주문 제작하였다(정방향 프라이머 : 5' - GGTAATACGACTCACTATAGGGAGATACCAGCTTATTCAATT - 3'(서열번호 6), biotinylated 역방향 프라이머 : 5' - biotin - AGATTGCACTTACTATCT - 3'(서열번호 7)). 랜덤 서열의 앱타머 라이브러리는 PCR machine (Bioneer, Korea)을 이용하여 증폭하였다.

PCR에 의한 100 bp DNA 라이브러리의 증폭을 위한 반응 용액 조성은 10X taq polymerase 완충용액 5 ㎕, 2.5 mM dNTP mixture 4 ㎕, 25 uM 정방향 프라이머 2 ㎕, 25 uM biotinylated 역방향 프라이머 2 ㎕, 주형 DNA 1 ㎕, taq polymerase (TaKaRa, Japan) 0.3 ㎕ (1 unit/㎕)와 35.7 ㎕의 증류수로 구성하였다. PCR 증폭반응은 95℃에서 5분간 pre-denaturation, 95℃에서 30초간 denaturation, 55℃에서 30초간 annealing, 그리고 72℃에서 30초간 extension을 총 15 cycle 반복한 후, 72℃에서 7분간 추가로 extension 시킨 뒤 반응을 종결하는 구성으로 진행하였다. PCR 반응 후 4 ㎕를 취하여, 0.5X TAE 완충용액 2 % 아가로스 겔(agarose gel)을 이용하여 PCR 결과를 확인하였다(도 3(A)). 확인 결과, PCR 반응으로 증폭된 100 bp의 aptamer pool이 100 bp marker 옆에서 단일밴드를 형성한 것으로 보아 주형 DNA의 증폭 반응이 알맞게 일어난 것을 알 수 있었다.

그 후에 PCR purification은 PCR purification kit (Qiagen, USA)를 이용하여 PCR 산물 정제를 수행하였다. PCR 산물과 kit에서 제공한 PB 완충용액 (5 M Gu-HCl, 30 % isopropanol)을 PCR 산물 양의 5배 부피를 넣어 혼합 후에 컬럼에 넣고 5분 반응 후 원심분리 (25℃, 13,000 rpm, 30초)를 하였다. 그 후 기타 이물질을 제거하기 위해 PE 완충용액 (10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 80 % ethanol)을 0.75 ㎖ 넣은 후 원심분리 (25℃, 13,000 rpm, 30초)하였고, 마지막으로 증류수 50 ㎕에 녹여 앱타머 pool을 얻었다. 앱타머 pool을 4 ㎕를 취하여, 0.5X TAE 완충용액 2 % 아가로스 겔을 이용하여 확인한 결과 100 bp marker의 옆에서 단일밴드를 형성하였으며, PCR 정제 키트의 수율의 한계로 인한 농도 손실로 밴드가 이전보다 옅어졌지만 정제과정을 통해 불순물들이 제거되어 더 깨끗한 형태의 밴드가 나타난 것을 확인하였다(도 3(B)).

2-2. 비대칭 PCR 기법을 통한 단일가닥 DNA 풀의 제작

정방향의 단일가닥 DNA만으로 이루어진 앱타머 풀을 확보하기 위해 비대칭 PCR 기법을 활용하였다. 비대칭 PCR은 PCR 반응 용액 조성분 중 정방향 프라이머의 양을 역방향 프라이머의 양보다 5배 내지 10배 가량 과다하게 포함시킨 후 PCR 증폭 반응을 진행하여 PCR 산물이 정방향의 단일가닥 DNA로 구성되도록 유도하는 실험기법이다. 비대칭 PCR 반응 용액 조성은 10X taq polymerase 완충용액 10 ㎕, 2.5 mM dNTP mixture 8 ㎕, 25 uM 정방향 프라이머 10 ㎕, 25 uM biotinylated 역방향 프라이머 1 ㎕, 주형 DNA 5 ㎕, taq polymerase (TaKaRa, Japan) 0.5 ㎕ (1 unit/㎕)와 65.5 ㎕의 증류수로 구성하였으며, 비대칭 PCR 증폭반응은 95℃에서 5분간 pre-denaturation, 95℃에서 30초간 denaturation, 55℃에서 30초간 annealing, 그리고 72℃에서 30초간 extension을 총 15 cycle 반복한 후, 72℃에서 7분간 추가로 extension시킨 뒤 반응을 종결하는 방법으로 진행하였다. 비대칭 PCR 반응 후 일반 PCR과 마찬가지로 4 ㎕를 취하여 0.5X TAE 완충용액 2 % 아가로스 겔을 이용하여 정확한 100 bp 크기의 밴드가 나타난 것을 확인하였다(도 3(C)).

비대칭 PCR 산물에 1 ㎕의 tRNA, 세 배 부피의 100% 에탄올을 첨가하여 -20℃에서 12시간 반응한 뒤, 4℃ 조건에서 13,000 rpm으로 20분간 원심분리하여 1.5 microtube 상에 육안으로 보이는 DNA pellet을 확보하였다. 확보한 DNA pellet을 충분히 말린 후, 각각의 microtube 당 100 ㎕의 증류수에 재현탁시켜 비대칭 PCR 산물의 정제를 완료하였다.

2-3. 단일가닥 DNA의 선별

정제한 비대칭 PCR의 산물로부터 단일가닥 DNA만으로 이루어진 앱타머를 제작하기 위해 스트렙트아비딘(streptavidin)과 바이오틴(biotin)간의 친화력 반응을 활용하였다. 정제한 비대칭 PCR 산물을 85℃ heat block에서 5분간 반응시키고 즉시 얼음에서 5분간 반응시켰다. 그 후에 스트렙트아비딘 아가로스 레진 (streptavidin agrose resin, Thermo Scientific, USA)을 DNA양의 절반만큼 첨가하여 상온에서 1시간 동안 반응시켰고 반응 효율의 증가를 위해 반응시간 동안 교반하였다.

반응이 끝난 후에 원심분리 (4℃, 13,000 rpm, 15 분)를 통해 biotinylated 가닥을 pellet 형태로 제거하였다. 상층액을 새로운 microtube에 옮겼다. 상층액에 동량의 PCI (phenol : chloroform : isoamyl alcohol, 25 : 24 : 1, SIGMA, USA)를 처리한 후에 vortexing하였으며 원심분리 (4℃, 13,000 rpm, 15 분)를 하였다. 그 후에 1/10배 부피의 3 M NaOAc(pH 4.5)와 3배 부피의 100% 에탄올을 첨가하여 -70℃에서 1시간 이상 반응하였다. 반응 후에 원심분리 (4℃, 13000 rpm, 20분)한 후 상층액을 제거하고 65℃ heat block에서 25분간 건조 시킨 후, 50 ㎕의 증류수에 재현탁시켜 단일가닥 DNA pool 용액을 얻었다.

실시예 3: EGFR-결합 앱타머 발굴을 위한 SELEX

3-1. 단일가닥 DNA 앱타머의 3차원 구조 형성

제작한 단일가닥 DNA의 농도를 미소분광광도계(nano-drop)으로 측정한 뒤, EGFR-앱타머 결합 기준 농도인 530.9 pmol이 되도록 증류수로 희석하여 총 100 ㎕의 부피를 만든 후에 2X PBS 완충용액을 100 ㎕ 넣어 주었다. 혼합물을 85℃ heat block에서 5분간 반응시키고 1시간 동안 상온에서 식히면서 단일가닥 DNA 자체의 3차원 구조를 형성하도록 유도한 뒤, 얼음에서 5분간 반응시켜 구조를 고정하였다.

3-2. 단일가닥 DNA 앱타머와 EGFR 단백질의 결합

제작한 앱타머와 EGFR 단백질을 결합시키기 위해 이전 실험에서 3차 구조를 형성해둔 단일가닥 DNA 앱타머와 C 말단에 polyhistidine이 재조합된 EGFR을 정량하여 혼합한 뒤 1X PBS buffer로 총량을 100 ㎕로 맞추고 4℃에서 하룻밤 동안 반응시켰다.

하룻밤 동안 충분히 결합시킨 앱타머와 EGFR 단백질 복합체를 Ni-NTA agarose resin에 결합시키기 위해, 우선 Ni-NTA agarose resin(Qiagen, USA) 200 ㎕를 microtube에 옮긴 뒤, 원심분리(4℃, 13,000 rpm, 5분)하여 상층액을 제거하였다. Resin이 남은 microtube에 1X binding buffer(500 mM sodium chloride, 20 mM tris-HCl, 5 mM imidazole) 500 ㎕를 넣고 4℃의 교반기에서 10분간 반응하고 원심분리(4℃, 13,000 rpm, 5분)하여 상층액을 제거하고 이 과정을 한 번 더 반복하였다. 그 다음 1X PBS buffer 500 ㎕를 넣고 인버팅으로 섞어준 뒤 원심분리(4℃, 13,000 rpm, 5분)하여 상층액을 제거하고 이 과정을 한 번 더 반복하였다.

앞서 하룻밤 동안 결합시킨 앱타머-EGFR 복합체를 포함한 샘플 100 ㎕와 1X PBS buffer 300 ㎕를 준비한 Ni-NTA agarose resin에 혼합하고 4℃의 교반기에서 1 시간 동안 반응하여 resin의 니켈 이온과 EGFR 단백질의 polyhistidine tail이 결합하도록 유도하였다(도 4). 그 후 원심분리(4℃, 13,000 rpm, 10분)하여 상층액을 제거하고, 앱타머-EGFR 복합체가 결합되어 있는 resin을 세척해주기 위해 남아있는 resin에 1X PBS buffer 500 ㎕를 넣고 4℃의 교반기에서 10분간 반응시킨 뒤 원심분리(4℃, 13,000 rpm, 10분)하여 상층액을 모두 회수하여 새로운 microtube에 보관한다. 이러한 과정을 2회 더 반복하여 총 3회 세척하였다.

3-3. EGFR 단백질에 특이적인 앱타머의 회수

세척된 resin에서 EGFR 단백질에 결합하고 있던 앱타머만을 용리해내기 위해 resin에 1X PBS buffer 200 ㎕를 넣고 85℃ heating block에서 5분간 반응하고, 곧바로 얼음에서 5분간 식혀준 뒤 원심분리(4℃, 13,000 rpm, 10분)하여 상층액을 모두 회수하여 새로운 microtube에 따로 보관하였으며, 이 과정을 한 번 더 반복하여 총 2회의 용리된 앱타머 샘플을 확보하였다.

위에서 확보한 3회의 세척 샘플과 2회의 용리샘플에 각각 동량의 PCI (phenol : chloroform : isoamylalchol = 25 : 24 : 1) 용액을 넣고 vortexing 한 뒤, 원심분리(4℃, 13,000 rpm, 15분)하여 각각의 상층액을 회수하여 새로운 microtube에 옮겼다. 그 후에 1/10배 부피의 3 M NaOAc(pH 4.5)와 3배 부피의 100% 에탄올을 첨가하여 -70℃에서 4시간 이상 반응하는 방법으로 에탄올 침전법을 수행하여 정제된 앱타머 풀을 얻었다.

확보한 앱타머 pool의 농도를 미소 분광광도계(microspectrophotometer)으로 측정한 뒤, PCR 증폭반응의 주형 DNA로 사용하여 다음 SELEX 라운드를 진행하는 방법으로 실험을 진행하였고, 총 12회의 SELEX 라운드를 진행하였다.

실시예 4: 최적 결합력을 보이는 앱타머의 선별

4-1. 미소 분광광도계와 정량 PCR기법을 이용한 최적 라운드 선별

총 12회 반복한 SELEX 라운드 과정에서 얻어진 각 라운드의 앱타머 풀의 농도를 미소 분광광도계(nano-drop, Thermo Scientific, USA)를 이용하여 측정하였다(표 1). 단일가닥 형태의 DNA 농도 수치를 측정하여 분석한 결과, 후반 라운드인 11 라운드와 12 라운드가 대체적으로 높게 나타났다(도 5).

SELEX 라운드가 모두 종료된 후 각각의 라운드에서 회수된 앱타머 풀의 농도를 다시 한 번 정확하게 비교하기 위해 실시간 PCR 기법을 통한 정량 PCR을 진행하였다. Negative selection 라운드 이전의 농도는 EGFR 단백질과 Ni-NTA agarose resin이 결합한 구조체에서 EGFR 단백질 이외의 부분에 결합하는 앱타머까지 포함된 농도이므로 신뢰가 떨어진다. 따라서 측정한 농도 중 negative selection 라운드 이후의 라운드며 SELEX의 후반 라운드들인 9 라운드, 10 라운드, 11 라운드, 12 라운드의 앱타머 풀에 대하여 정량 PCR을 진행하였다. 실험의 오차를 보정하기 위해 template로 사용할 각 라운드의 회수된 앱타머 pool을 두 차례 10진 희석하여 준비하였고, 각각의 샘플은 세 튜브씩 제작하였다. 정량 PCR 반응을 위한 반응 용액 조성은 2X SYBR green(iQ SYBR Green Supermix, Bio-rad, USA) 10 ㎕, 정방향과 역방향 프라이머(정방향 프라이머 : 5' - GGTAATACGACTCACTATAGGGAGATACCAGCTTATTCAATT - 3'(서열번호 8), 역방향 프라이머 : 5' - AGATTGCACTTACTATCT - 3'(서열번호 9)) 각각 1 ㎕, 주형 DNA 1 ㎕, 그리고 7 ㎕의 증류수로 구성하였다. 정량 PCR 증폭반응은 QIAgen사의 실시간 PCR 기계로 95℃에서 5분간 pre-denaturation, 95℃에서 30초간 denaturation, 55℃에서 30초간 annealing, 그리고 72℃에서 30초간 extension을 총 40 cycle 반복한 후, 72℃에서 7분간 추가로 extension 시킨 뒤 반응을 종결하는 구성으로 진행하였다. 실험 결과로 나타난 증폭곡선에 따른 C(t)값을 확인하였을 때, 11 라운드와 12 라운드의 C(t)값이 가장 낮게 나온 것을 볼 수 있다(표 2). 이는 해당 두 라운드에서 회수된 앱타머 풀의 농도가 가장 높다는 의미이며, EGFR 단백질과의 친화력이 높은 앱타머 분자가 다수 포함되어 있다는 의미로 분석할 수 있다. 이와 같은 미소 분광광도계 측정 결과 및 정량 PCR 결과에 따라, 각각의 라운드에서 회수된 앱타머 풀 중 가장 농도가 높은 11 라운드와 12 라운드를 SELEX 실험의 최적의 라운드로 선정하였다.

4-2. T-벡터 클로닝을 통한 앱타머의 서열분석 및 최종 앱타머 후보군 확보

최적의 round를 선별한 후 그 round의 앱타머 pool에 대한 T-벡터 클로닝을 수행하였다. T-벡터 클로닝은 T-Blunt PCR cloning kit (SolGent, Korea)를 이용하였고, T-Blunt vector 1 ㎕와 PCR 산물 4 ㎕, 6 X T-Blunt 완충용액 1 ㎕을 혼합하여 25℃에서 10분간 반응시키는 방법으로 클로닝을 진행하였다.

T-벡터 클로닝을 수행한 ligate 6 ㎕는 100 ㎕의 DH5 competent cell과 섞은 후 42℃에서 30초 동안 열 충격 (heat shock)을 주어 transformation 하였고, 뒤이어 얼음에 2분간 방치하여 DH5 competent cell을 안정시켰다. 그리고 900 ㎕의 SOC배지 (0.5 % yeast extract, 2% tryptone, 10 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM MgSO4, 20 mM Glucose)를 첨가한 후, 37℃ 180 rpm의 shaking incubator에서 45분간 배양하였다. 배양 후, blue-white selection을 통해 클로닝 및 transformation이 성공적으로 수행된 cell을 선별하기 위해 ampicillin (50 ㎍/㎖), kanamycin (50 ㎍/㎖), X-gal (50 ㎍/㎖), Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG, 5 ㎍/㎖)이 포함되어 있는 LB plate에 200 ㎕의 배양액을 도말하고 37℃에서 하룻밤 동안 배양시킨 후 흰색 집락만을 선별하여 colony PCR을 실시하였다. Maxime PCR premix kit (iNtRON, Korea)를 사용하였으며, kit에서 제공된 1 ㎕의 혼합물에 M13 정방향 프라이머 (-20) : 5' - GTAAAACGACGGCCAG - 3'(서열번호 10), M13 역방향 프라이머 (-20) : 5' - CAGGAAACAGCTATGAC - 3'(서열번호 11)를 각각 1 ㎕, 증류수 17 ㎕를 혼합하여 총 20 ㎕의 PCR 혼합물을 만들어 colony PCR을 수행하였다. PCR 조건은 95℃에서 5분간 pre-denaturation, 95℃에서 30초간 denaturation, 55℃에서 30초간 annealing, 그리고 72℃에서 30초간 extension을 총 25 Cycle 반복한 후, 72℃에서 5분간 final-extension시키는 조건으로 수행하였다. 그 후에 0.5 X TAE 완충용액 2% 아가로스 겔을 이용하여 DNA 절편의 크기를 확인하였다. 클로닝된 절편의 크기가 정확하게 확인된 집락들은 ampicillin이 5 ㎕ 포함된 5 ㎖의 LB 배지에 접종하여 shaking incubator (37℃, 180 rpm)에 서 하룻밤 동안 배양하였다.

그 후에 plasmid DNA purification kit (iNtRON, Korea)를 이용하여 추출한 plasmid DNA를 Solgent (Korea)에 M13 정방향 프라이머 방향으로 서열분석을 의뢰하여 앱타머의 서열분석을 진행하였다. 분석된 plasmid DNA 중 프라이머 상보서열 및 앱타머 서열을 찾아 크기가 올바른지 분석하였다. 서열분석을 통해 앱타머 후보군을 추리고 확보된 서열 중에 서로 동일한 서열이 있는지의 여부와 서열 간 유사도를 clustal X (Plate-forme de Bio-informatique, France)를 이용하여 대조한 뒤, 랜덤 서열이 겹치지 않으며 프라이머 상보 서열이 온전한 42종의 앱타머 후보군을 선별하였다.

실시예 6: SPR 실험을 통한 앱타머의 친화력 평가 및 구조예측

6-1. EGFR 단백질에 결합하는 앱타머 42종의 친화력 평가

상기 실시예 5에서 확보한 42종의‘EGFR 결합 DNA 앱타머’후보군들에 대하여 EGFR 단백질의 세포 외 부위에 결합하는 친화력을 정량화된 수치로 측정하기 위하여, 본 발명자들은 Biacore 3000 (GEhealthcare, UK) 기기를 이용하여 표면 플라즈몬 공명 (Surface Plasmon Resonance, SPR) 실험을 실시하였다. 실험에 사용한 센서 칩은 표면이 카르복실기로 코팅된 센서 칩 CM5 (sensor chip CM5)이며, EGFR 단백질을 칩 표면에 고정시키기에 앞서 CM5 표면을 NHS-에스테르로 활성화시키는 단계를 거쳤다. 우선 센서 칩 CM5의 표면에 0.1 M N-hydroxysuccinimide (NHS)와 0.4 M N-ethyl-N'-(dimethylaminopropy l) carbodiimide (EDC) 혼합액을 5 ㎕/min의 속도로 10분 간 흘려주어 카르복실기를 활성화시켰다. 준비된 센서 칩 표면에 polyhistidine 이 태깅된 EGFR 단백질을 고정하기 위하여 10 mM sodium acetate 완충용액(pH 5.0)에 EGFR 단백질을 20 ng/ml로 용해시킨 용액을 5 ㎕/min의 속도로 7분 씩 총 두 번 흘려주어 칩 표면에 EGFR 단백질을 부착시켰다. 그 위에 1 M ethanolamine hydrochloride 용액을 5 ㎕/min의 속도로 7분 흘려주어 센서 칩 표면에 비어있는 카르복실기를 blocking함으로서 앱타머가 EGFR 단백질 이외의 카르복실기 등에 직접적으로 결합하는 것을 방지하였다. 각 앱타머 샘플은 10 ㎕/min의 속도로 7분씩 흘려주어 결합되는 정도를 측정하였으며, 각 앱타머 샘플을 실험한 센서 칩 표면은 regeneration buffer(1 M NaCl, 50 mM NaOH)로 워싱하여 앱타머만을 제거한 뒤 다음 앱타머 샘플 실험을 진행하는 방식으로 반복적으로 진행하였다.

상기의 실험을 수행한 뒤 BIAevolution software를 통해 분석한 결과, 42종의 EGFR 결합 앱타머 후보군들에 대하여 EGFR 단백질과 앱타머 간의 친화력을 정량한 값인 해리상수 (Kd, dissocation)을 얻을 수 있었으며, 그 값의 크기에 따라 후보군들 중 EGFR 단백질과 가장 큰 친화력을 가지고 결합하는 5종의 앱타머를 최종적으로 선별할 수 있었다. 최종적으로 선별된 5종의 앱타머는 18번, 21번, 22번, 23번, 29번 앱타머였으며 이에 해당하는 해리상수 값은 각각 1.1 ×10^-12 M, 8.85×10^-13 M, 1.91×10^-12 M, 2.23×10^-13 M, 8.76×10^-13 M이었다(도 6). 각각의 앱타머는 번호가 작은 순서대로 1번부터 5번까지 다시 넘버링 하였다(표 3).

서열번호	앱타머 서열	크기
1	5'-GGTAA TACGA CTCAC TATAG GGAGA TACCA GCTTA TTCAA TTGAG CTCTT ATCAC ATCCT TGTGC GCGGA GAGCT GGTGT CGAGA TAGTA AGTGC AATCT-3’	100 mer
2	5'-GGTAA TACGA CTCAC TATAG GGAGA TACCA GCTTA TTCAA TTGAG GCGTA TGCTC CCTTA GGCGT CTGCT GGCCA TTACG TGAGA TAGTA AGTGC AATCT-3’	100 mer
3	5'-GGTAA TACGA CTCAC TATAG GGAGA TACCA GCTTA TTCAA TTTGG CTGTT GCGCT CTCGG ACTTG TTGGT GTCTT GGTTG CGAGA TAGTA AGTGC AATCT-3’	100 mer
4	5'-GGTAA TACGA CTCAC TATAG GGAGA TACCA GCTTA TTCAA TTGGC GTGCT CCTGC GACCC GACAG TCCTC ACTCC ATGCG CGAGA TAGTA AGTGC AATCT-3’	100 mer
5	5'-GGTAA TACGA CTCAC TATAG GGAGA TACCA GCTTA TTCAA TTCTG GAAGT CTGTG CGTGG CGCTT GGAGA GTTCT GATGT TGAGA TAGTA AGTGC AATCT-3’	100 mer

6-2. 최종 앱타머 5종의 구조형성 시뮬레이션

최종적으로 선별한 5종의 'EGFR 결합 DNA 앱타머'들이 실험 조건에서 어떠한 2차 구조를 형성하는지 예측해보기 위해, mfold website의 DNA fold 프로그램을 이용하여 핵산의 염기서열기반 구조형성 시뮬레이션을 진행하였다. 각각의 제시되는 모델 중 델타지(△G) 값이 가장 낮은 모델을 해당 앱타머의 예측되는 구조로 선정하였다.(도 7)

실시예 7: 앱타머의 동물세포 배양배지 첨가 효능실험

7-1. 최종 5종 앱타머의 동물세포 생장촉진 효능실험

상기 실시예 6을 통해 확보한 5종의 'EGFR 결합 DNA 앱타머'에 대하여 실제 동물세포 배양 배지 내에서 세포의 생장 촉진효과가 있는지 효능을 평가하기 위해 세포배양 실험을 실시하였다. 실험에 사용된 기본 배지는 혈청이 제외된 Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM, Thermo Fisher Scientific, USA)이며 이 배지에 최소한의 growth factor만을 첨가한 뒤, EGF 단백질과 EGFR 결합 DNA 앱타머를 각각 추가적으로 첨가하여 세포가 생장곡선을 측정하는 방법으로 생장촉진 효과를 비교하였다. 배지에 첨가한 성분과 농도는 표 4에 나타내었다(표 4).

실험에 사용한 동물세포는 헬라 KCTC HC18802 세포로, ATCC에서 헬라 ATCC CCL-2로 판매 중인 세포를 분양받았다. 헬라 세포의 계대배양은 T75 cell culture flask filter caps(SPL, South Korea)에 5% 혈청을 포함한 DMEM 배지에서 이루어졌으며, 8번째 passage의 세포로 본 실험을 진행하였다.

T75 플라스크의 부착면에 헬라 세포가 70~80% 배양되었을 때, 세포를 수확하기 위하여 기존의 배지를 제거한 후 1X PBS 완충용액 5 ml로 한 차례 워싱하여 잔여 배지를 제거하였다. 그리고 Trypsin-EDTA 용액(biowest, France) 5 ml을 플라스크에 넣고 부착면에 고루 퍼지게 한 상태로 37℃ CO₂ incubator에서 2분간 반응시켜 세포가 부착면으로부터 모두 탈락하도록 유도했다. 탈락한 세포를 포함한 trypsin-EDTA 용액에 5% 혈청을 포함한 DMEM 5 ml를 넣어 trypsin의 활성을 중지시킨 뒤, 해당 용액을 conical tube에 옮겨 상온에서 2000 rpm으로 3분간 원심분리하여 헬라 세포의 pellet을 얻었다. 상층액을 모두 제거하고 얻어진 pellet에 5% 혈청을 포함한 DMEM 1 ml을 넣어 파이펫팅으로 세포를 조심스럽게 풀어준 뒤, 0.4% trypan blue(SIGMA, USA)로 염색하여 세포의 수를 측정하였다. 세포 수 측정 결과를 토대로 부착세포용 24 well cell culture plate의 각 well 당 10^-4개의 세포를 seeding한 뒤, 5% 혈청을 포함한 DMEM 배지를 500 ㎕씩 넣고 24시간 동안 헬라 세포를 부착시켰다. 세포가 부착면에 부착한 것을 확인하고 각각의 well 마다 실험 조건에 맞는 동량의 배지로 교체해준 뒤 3일간 배양하며 각 24시간 마다 Cell Counting Kit-8(DOJINDO laboratory, USA)시약을 첨가하고 37℃ CO2 incubator에서 70분간 배양하여 시약에 대한 반응으로 나타나는 탁도를 ELISA reader의 450 nm의 파장으로 측정하였다. 이 값을 스탠다드 커브에 적용시켜 흡광도에 해당하는 세포의 개수로 환산하여 세포 생장곡선 결과를 도출하였다.

그 결과, negative control 1 배지에서는 세포가 24시간 이후 점차 감소하는 형태를 보였으며 이는 세포 생장에 기본적으로 요구되는 growth factor들의 부재로 인하여 세포가 생장하지 못하고 사멸하여 떨어져 나갔기 때문인 것으로 보인다. Negative control 2 배지에서는 negative control 2 배지보다는 세포의 생장이 일어난 것으로 보이나, 3일간 관찰한 결과 최종 세포 생장량은 EGF protein 또는 앱타머 포함 배지보다 낮게 나타났다. EGF protein을 넣은 배지에서는 negative control과 앱타머 포함 배지보다 세포의 생장이 안정적으로 증가하며 최종 세포 생장량 또한 실험 조건들 중 가장 높은 것을 확인하였으며, 앱타머 5종을 각각 포함한 배지에서는 EGF protein 포함 배지보다는 낮지만, 3일간의 모든 관찰 일자에서 두 가지 negative control보다 세포의 생장량이 높은 것으로 나타났다. 이 결과를 토대로,‘EGFR 특이 결합 앱타머’가 배지 내에서 EGF protein과 비슷한 역할을 하는 것으로 유추할 수 있으며, 적절한 농도조절 또는 앱타머 혼합 과정 등을 통해 앱타머의 배지 내 세포 생장촉진 효과를 더욱 향상시킬 수 있을 것으로 사료된다.

이상으로 본 발명의 내용을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 이하 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다.

<110> Chungbuk National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> EGFR-specific DNA aptamer as incubation additives for promotion of mammalian cell growth and uses thereof <130> PN1607-231 <160> 12 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EGFR aptamer 1 <400> 1 ggtaatacga ctcactatag ggagatacca gcttattcaa ttgagctctt atcacatcct 60 tgtgcgcgga gagctggtgt cgagatagta agtgcaatct 100 <210> 2 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EGFR aptamer 2 <400> 2 ggtaatacga ctcactatag ggagatacca gcttattcaa ttgaggcgta tgctccctta 60 ggcgtctgct ggccattacg tgagatagta agtgcaatct 100 <210> 3 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EGFR aptamer 3 <400> 3 ggtaatacga ctcactatag ggagatacca gcttattcaa tttggctgtt gcgctctcgg 60 acttgttggt gtcttggttg cgagatagta agtgcaatct 100 <210> 4 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EGFR aptamer 4 <400> 4 ggtaatacga ctcactatag ggagatacca gcttattcaa ttggcgtgct cctgcgaccc 60 gacagtcctc actccatgcg cgagatagta agtgcaatct 100 <210> 5 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EGFR aptamer 5 <400> 5 ggtaatacga ctcactatag ggagatacca gcttattcaa ttctggaagt ctgtgcgtgg 60 cgcttggaga gttctgatgt tgagatagta agtgcaatct 100 <210> 6 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 6 ggtaatacga ctcactatag ggagatacca gcttattcaa tt 42 <210> 7 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> biotinylated reverse primer <400> 7 agattgcact tactatct 18 <210> 8 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 8 ggtaatacga ctcactatag ggagatacca gcttattcaa tt 42 <210> 9 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 9 agattgcact tactatct 18 <210> 10 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> M13 forward primer <400> 10 gtaaaacgac ggccag 16 <210> 11 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> M13 reverse primer <400> 11 caggaaacag ctatgac 17 <210> 12 <211> 627 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> EGF Receptor(EGFR) <400> 12 Leu Glu Glu Lys Lys Val Cys Gln Gly Thr Ser Asn Lys Leu Thr Gln 1 5 10 15 Leu Gly Thr Phe Glu Asp His Phe Leu Ser Leu Gln Arg Met Phe Asn 20 25 30 Asn Cys Glu Val Val Leu Gly Asn Leu Glu Ile Thr Tyr Val Gln Arg 35 40 45 Asn Tyr Asp Leu Ser Phe Leu Lys Thr Ile Gln Glu Val Ala Gly Tyr 50 55 60 Val Leu Ile Ala Leu Asn Thr Val Glu Arg Ile Pro Leu Glu Asn Leu 65 70 75 80 Gln Ile Ile Arg Gly Asn Met Tyr Tyr Glu Asn Ser Tyr Ala Leu Ala 85 90 95 Val Leu Ser Asn Tyr Asp Ala Asn Lys Thr Gly Leu Lys Glu Leu Pro 100 105 110 Met Arg Asn Leu Gln Glu Ile Leu His Gly Ala Val Arg Phe Ser Asn 115 120 125 Asn Pro Ala Leu Cys Asn Val Glu Ser Ile Gln Trp Arg Asp Ile Val 130 135 140 Ser Ser Asp Phe Leu Ser Asn Met Ser Met Asp Phe Gln Asn His Leu 145 150 155 160 Gly Ser Cys Gln Lys Cys Asp Pro Ser Cys Pro Asn Gly Ser Cys Trp 165 170 175 Gly Ala Gly Glu Glu Asn Cys Gln Lys Leu Thr Lys Ile Ile Cys Ala 180 185 190 Gln Gln Cys Ser Gly Arg Cys Arg Gly Lys Ser Pro Ser Asp Cys Cys 195 200 205 His Asn Gln Cys Ala Ala Gly Cys Thr Gly Pro Arg Glu Ser Asp Cys 210 215 220 Leu Val Cys Arg Lys Phe Arg Asp Glu Ala Thr Cys Lys Asp Thr Cys 225 230 235 240 Pro Pro Leu Met Leu Tyr Asn Pro Thr Thr Tyr Gln Met Asp Val Asn 245 250 255 Pro Glu Gly Lys Tyr Ser Phe Gly Ala Thr Cys Val Lys Lys Cys Pro 260 265 270 Arg Asn Tyr Val Val Thr Asp His Gly Ser Cys Val Arg Ala Cys Gly 275 280 285 Ala Asp Ser Tyr Glu Met Glu Glu Asp Gly Val Arg Lys Cys Lys Lys 290 295 300 Cys Glu Gly Pro Cys Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu 305 310 315 320 Phe Lys Asp Ser Leu Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe Lys 325 330 335 Asn Cys Thr Ser Ile Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala Phe 340 345 350 Arg Gly Asp Ser Phe Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu 355 360 365 Asp Ile Leu Lys Thr Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile Gln 370 375 380 Ala Trp Pro Glu Asn Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu Glu 385 390 395 400 Ile Ile Arg Gly Arg Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val 405 410 415 Val Ser Leu Asn Ile Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu Ile 420 425 430 Ser Asp Gly Asp Val Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala 435 440 445 Asn Thr Ile Asn Trp Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr 450 455 460 Lys Ile Ile Ser Asn Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln 465 470 475 480 Val Cys His Ala Leu Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro 485 490 495 Arg Asp Cys Val Ser Cys Arg Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys Val 500 505 510 Asp Lys Cys Asn Leu Leu Glu Gly Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu Asn 515 520 525 Ser Glu Cys Ile Gln Cys His Pro Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met Asn 530 535 540 Ile Thr Cys Thr Gly Arg Gly Pro Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala His 545 550 555 560 Tyr Ile Asp Gly Pro His Cys Val Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val Met 565 570 575 Gly Glu Asn Asn Thr Leu Val Trp Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His Val 580 585 590 Cys His Leu Cys His Pro Asn Cys Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro Gly 595 600 605 Leu Glu Gly Cys Pro Thr Asn Gly Pro Lys Ile Pro Ser His His His 610 615 620 His His His 625

Claims (12)

1. 서열번호 5의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드(oligonucleiotide)인 것을 특징으로 하는 표피 성장 인자 수용체(Epidermal Growth Factor Receptor, EGFR)에 특이적으로 결합하며 동물세포의 성장 및 분열을 촉진하는 DNA 앱타머(aptamer).
2. 제 1항에 있어서, 표피 성장 인자 수용체(EGFR)는 세포막 단백질인 것을 특징으로 하는 DNA 앱타머(aptamer).
3. 제 1항에 있어서, 상기 DNA 앱타머는 표지물질을 더 포함하여 구성되는 것을 특징으로 하는 DNA 앱타머.
4. 제 3항에 있어서, 상기 DNA 앱타머는 형광물질, 아민기, 바이오틴 및 티올기로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 표지물질이 상기 DNA 앱타머의 5' 말단 또는 3' 말단에 표지되는 것을 특징으로 하는 DNA 앱타머.
5. 제 1항에 있어서, 상기 DNA 앱타머는 하나 이상의 뉴클레오타이드의 리보스 2' 위치의 하이드록시기가 수소원자, 불소원자, -OR, -COOR 및 아미노기로 이루어진 군 중 어느 하나로 치환된 것을 특징으로 하는 DNA 앱타머.
6. 제1항의 DNA 앱타머를 포함하는 무혈청 또는 저혈청 동물세포 배양 배지.
7. 삭제
8. 제6항에 있어서, 상기 DNA 앱타머는 표피성장인자(Epidermal Growth Factor, EGF) 대체제로 사용되는 것을 특징으로 하는 배양배지.
9. 제1항의 DNA 앱타머를 유효성분으로 포함하는 피부세포 재생 촉진용 기능성 화장품 조성물.
10. 삭제
11. 1) PCR과 비대칭(asymmetric) PCR 기법을 이용하여 DNA 앱타머를 증폭하고, 단일가닥 DNA 앱타머를 선별하는 단계;
    2) 상기 단일가닥 DNA 앱타머가 3차원 구조를 형성하도록 유도하는 단계;
    3) 상기 3차원 구조를 형성한 DNA 앱타머와 C 말단에 polyhistidine이 태깅된 EGFR 단백질을 혼합하여 DNA 앱타머-EGFR 복합체를 형성하는 단계;
    4) 상기 3)단계에서 형성된 DNA 앱타머-EGFR 복합체를 Ni-NTA 아가로오스 레진(resin)에 혼합한 후 교반하여 resin의 니켈 이온과 EGFR 단백질의 polyhistidine tail이 결합하도록 유도하는 단계;
    5) 원심분리 후 상층액을 제거하고, DNA 앱타머-EGFR 복합체가 결합되어 있는 레진을 세척하는 단계;
    6) 상기 세척된 레진에서 EGFR 단백질에 결합하고 있던 DNA 앱타머만을 용리시킨 후 정제하는 단계;
    7) 상기 정제된 DNA 앱타머를 PCR 증폭 반응의 주형 DNA로 사용하여 다음 SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment) 라운드를 진행하여 총 12회의 SELEX 라운드를 진행하는 단계; 및
    8) 상기 총 12회의 SELEX 라운드 과정에서 얻어진 각 라운드의 DNA 앱타머를 분석하는 단계를 포함하며,
    상기 8) 단계는 최적 친화력(affinity)을 갖는 SELEX 라운드 선별을 위한 실시간 PCR 단계;
    최적 SELEX 라운드에서 EGFR 결합 DNA 앱타머 후보군 선별을 위한 PCR 및 클로닝 단계;
    EGFR 결합 DNA 앱타머 후보군의 EGFR에 대한 친화력을 측정하는 단계; 및
    선별된 EGFR 결합 DNA 앱타머 후보군의 DNA 서열 결정 단계;를 포함하며, 상기 DNA 서열은 서열번호 5의 서열인 것을 특징으로 하는 EGFR 단백질에 특이적으로 결합하는 EGFR 결합 DNA 앱타머의 제조 방법.
12. 삭제

Images