CN114686485A - 结合新型冠状病毒（sars-cov-2）S蛋白多肽的核酸适配体及其用途 - Google Patents

结合新型冠状病毒（sars-cov-2）S蛋白多肽的核酸适配体及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了结合新型冠状病毒(sars‑cov‑2)S蛋白多肽的核酸适配体及其用途。该氨基酸序列为S蛋白关键致病区域和特异性区域。该适配体的高特异性及高亲和力达到精确识别新型冠状病毒(s ars‑cov‑2)的目的。其应用于检测药物中，可以实现高通量、快速精准检测、精度高、稳定性好等优点，更好适应新型冠状病毒的快速检测问题。

Description

结合新型冠状病毒（sars-cov-2）S蛋白多肽的核酸适配体及 其用途
技术领域
本发明涉及生物检测领域。
背景技术
新型冠状病毒致病性强、传染快，现有的检测手段包括核酸检测、抗体检测和抗原检测。
新冠病毒有四种主要的结构蛋白：刺突蛋白(Spike protein， S蛋白)，核衣壳蛋白(Nucleocapsid，N蛋白)，膜蛋白(Membrane protein，M蛋白)和包膜蛋白(Envelopeprotein，E蛋白)。人体一旦感染病毒，这些结构蛋白可作为免疫原刺激浆细胞产生特异性抗体。已经批准的抗原检测产品，多是以新冠病毒N蛋白作为抗原检测的靶标。抗原检测的样本来源通常是鼻腔、咽喉或唾液等，其一大特点是可快速出结果，可实现对疑似人群的早期分流，操作相对简便，价格也是三种检测方式中较为便宜的一种，但现有的抗原检测的灵敏度较低。
现有的研究表明，新型冠状病毒致病性强、传染快，主要通过其外膜S蛋白与人类宿主细胞ACE受体相互作用，进而与宿主细胞融合、病毒大量复制、宿主致病等系列反应。与此同时，冠状病毒的S蛋白也是不同毒株之间的重要标识区、可具有毒株识别的特异性。
发明内容
本发明的目的是提供一种来自于新型冠状病毒(sars-cov-2)S 蛋白的靶标多肽，其特征在于:所述靶标多肽的氨基酸序列为SEQ I D NO.1；
所述SEQ ID NO.1的氨基酸序列如下：
DKNTVAVKYKTKDGGNSDSKSKRSDNKVTADAGKYGDCG。
基于上述的靶标多肽的应用，所述靶标多肽SEQ ID NO.1应用于识别新型冠状病毒(sars-cov-2)。
本发明要求保护一种基于上述的靶标多肽的应用，所述靶标多肽SEQ ID NO.1作为特异性识别新型冠状病毒(sars-cov-2)的靶点。
本发明要求保护一种基于上述的靶标多肽的应用，基于所述靶标多肽SEQ IDNO.1获取适配体。
本发明要求保护一组适配体，所述适配体的核酸序列为SEQ ID NO.2、SEQ IDNO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、 SEQ ID NO.7或SEQ ID NO.8；
SEQ ID NO.2：GGTGACTGCTACTGTGTTGGCCCTACCGGGG GTTTTTTATTATGTGTCGTATGTCAGTTGATCGCCACACATCCAA GCAGAACC
SEQ ID NO.3：GGTGACTGCTACTGTGTTGGCCCTCCGGGGG AAAATAGCTCCAATACATATGGAGTTACGGTCG CCACACATCC AAGCAGAACC
SEQ ID NO.4：GGTGACTGCTACTGTGTTGGCCCTACGGGGT CATATTAGTGTCTTCCATTCTGTGTCAGTTGGCCCACACATCCA AGCAGAACC
SEQ ID NO.5：GGTGACTGCTACTGTGTTGGGCCCAGAAGCT CAAAAAGATTACACCTAACCTTCCCCGGAGGGGCCACACATCC AAGCAGAACC
SEQ ID NO.6：GGTGACTGCTACTGTGTTGGCCCTACGGGGT TGAACGTTCGATATTCGTGGTACAACATGAGCGCCACACATCC AAGCAGAACC
SEQ ID NO.7：GGTGACTGCTACTGTGTTGGCCCTACGGGGT TTACAATGATAAATCTTCATCCGATGCGCCTGC CCACACATCC AAGCAGAACC
SEQ ID NO.8：GGTGACTGCTACTGTGTTGGGCCTCCGGGGG GTACGTGAATTTTCGCTACAATTCCACTGCGTACCACACATCCA AGCAGAACC。
进一步，上述的适配体，是基于所述的靶标多肽(靶标物质)S EQ ID NO.1获得。
本发明要求保护基于上述的适配体的应用，其特征在于：所述适配体应用于结合新型冠状病毒(sars-cov-2)S蛋白多肽。
本发明要求保护基于上述的适配体的应用，其特征在于：所述适配体应用于制备识别如权利要求1所述的靶标多肽的药物。
本发明要求保护基于上述的适配体的应用，其特征在于：所述适配体应用于制备识别新型冠状病毒(sars-cov-2)S蛋白的药物。
本发明要求保护基于上述的适配体的应用，其特征在于：所述适配体应用于制备识别新型冠状病毒(sars-cov-2)的药物。
本发明的技术效果是毋庸置疑的，该氨基酸序列为S蛋白关键致病区域和特异性区域。该适配体的高特异性及高亲和力达到精确识别新型冠状病毒(sars-cov-2)的目的。其应用于检测药物中，可以实现高通量、快速精准检测、精度高、稳定性好等优点，更好适应新型冠状病毒的快速检测问题。
附图说明
图1.S蛋白全长序列的生物信息分析
图2.源自S蛋白的三个多肽的生物信息分析；
图3.模板多肽人工合成后的HPLC纯化
图4.模板多肽人工合成后的HPLC纯化
图5.原始DNA文库的建立
图6.1-10轮SELEX筛选适配体的PCR退火温度
图7.1-10轮SELEX筛选适配体的电泳图
图8.1-10轮SELEX筛选适配体的亲和力
图9.针对48个适配体序列实验的荧光强度。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明，但不应该理解为本发明上述主题范围仅限于下述实施例。在不脱离本发明上述技术思想的情况下，根据本领域普通技术知识和惯用手段，做出各种替换和变更，均应包括在本发明的保护范围内。
实施例1：
本实施例公开一种来自于新型冠状病毒(sars-cov-2)S蛋白的靶标多肽，其特征在于:所述靶标多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO. 1；
所述SEQ ID NO.1的氨基酸序列如下：
DKNTVAVKYKTKDGGNSDSKSKRSDNKVTADAGKYGDCG。
参见图1，图1为新型冠状病毒(sars-cov-2)S蛋白全长序列的生物信息分析本申请通过研究分析(参见图2，对多段多肽的研究分析结果)，确定图中S1为最佳多肽，即上述SEQ ID NO.1。
实施例2：
本实施例基于实施例1的SEQ ID NO.1氨基酸序列进行合成。如图3和图4所示，本实施例针对合成序列MS鉴定和HPLC纯化。
实施例3：
本实施例针对合成的氨基酸序列，如图5所示，进行DNA文库序列及合成、HPLC纯化、原始库建立电泳：
其中：
ssDNA库5′-GGTGACTGCTACTGTGTTGG-N44-CCACACATCC AAGCAGAACC-3′
上游引物5′-GGTGACTGCTACTGTGTTGG-3′
下游引物5′-GGTTCTGCTTGGATGTGTGG-3′
本实施例进行SELEX筛选，1-10轮SELEX筛选过程的退火温度图如图6。每轮筛选过程中，PCR的退火温度不全相同，需要通过T度实验探索确定，1-10轮SELEX筛选的退火温度见图6。从图中所见，随着筛选的进行，PCR反应的退火温度呈现逐渐升高趋势。
1-10轮SELEX筛选适配体的电泳图如图7。每一轮筛选均获得较清晰的适配体条带。
1-10轮SELEX筛选适配体的亲和力(荧光强度)如图8，随着筛选的进行，适配体的亲和力逐渐升高。
测序与序列分析，获得一组适配体，所述适配体的核酸序列为S EQ ID NO.2、SEQID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7或SEQ ID NO.8；
SEQ ID NO.2：GGTGACTGCTACTGTGTTGGCCCTACCGGGG GTTTTTTATTATGTGTCGTATGTCAGTTGATCGCCACACATCCAA GCAGAACC
SEQ ID NO.3：GGTGACTGCTACTGTGTTGGCCCTCCGGGGG AAAATAGCTCCAATACATATGGAGTTACGGTCG CCACACATCC AAGCAGAACC
SEQ ID NO.4：GGTGACTGCTACTGTGTTGGCCCTACGGGGT CATATTAGTGTCTTCCATTCTGTGTCAGTTGGCCCACACATCCA AGCAGAACC
SEQ ID NO.5：GGTGACTGCTACTGTGTTGGGCCCAGAAGCT CAAAAAGATTACACCTAACCTTCCCCGGAGGGGCCACACATCC AAGCAGAACC
SEQ ID NO.6：GGTGACTGCTACTGTGTTGGCCCTACGGGGT TGAACGTTCGATATTCGTGGTACAACATGAGCGCCACACATCC AAGCAGAACC
SEQ ID NO.7：GGTGACTGCTACTGTGTTGGCCCTACGGGGT TTACAATGATAAATCTTCATCCGATGCGCCTGC CCACACATCC AAGCAGAACC
SEQ ID NO.8：GGTGACTGCTACTGTGTTGGGCCTCCGGGGG GTACGTGAATTTTCGCTACAATTCCACTGCGTACCACACATCCA AGCAGAACC。
进一步，本实施例采用了包括上述序列的48个适配体序列进行实验，源自新冠肺炎病毒S蛋白的多肽包被荧光酶标板(不透光)，以荧光标记的48个适配体序列分别与之结合，测定荧光强度。其中，编号为FAM-3、FAM-19、FAM-22、FAM-23、FAM-45、FAM-68、 FAM-94的实验组荧光强度>10000(见表1)，上述实验组的序列分别对应SEQ ID NO.2～8。
表1：
Figure BDA0003595606930000041
Figure BDA0003595606930000051
进一步，本实施例中，、选取荧光值>13000的四个适配体，通过两两组合的夹心ELISA法，检测哪些组合的荧光值最高。结果如表2所示，提示19-19，19-68，19-03，19-22组合的检测效率较高，其中19-19最高。
适配体编号及标记方法 03-FAM 19-FAM 22-FAM 68-FAM
03-Biotin 20842 45567 33067 39312
19-Biotin 60324 78556*** 57449 36815
22-Biotin 40404 50369 34933 54147
68-Biotin 53736 67629 38970 36572
Figure IDA0003595606990000011
Figure IDA0003595606990000021

Claims (10)

1.一种来自于新型冠状病毒(sars-cov-2)S蛋白的靶标多肽，其特征在于:所述靶标多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO.1；
所述SEQ ID NO.1的氨基酸序列如下：DKNTVAVKYKTKDGGNSDSKSKRSDNKVTADAGKYGDCG。
2.一种基于权利要求1所述的靶标多肽的应用，其特征在于：所述靶标多肽应用于识别新型冠状病毒(sars-cov-2)。
3.一种基于权利要求1所述的靶标多肽的应用，其特征在于：所述靶标多肽作为特异性识别新型冠状病毒(sars-cov-2)的靶点。
4.一种基于权利要求1所述的靶标多肽的应用，其特征在于：基于所述靶标多肽获取适配体。
5.一组适配体，其特征在于：所述适配体的核酸序列为SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7或SEQ ID NO.8；
SEQ ID NO.2：GGTGACTGCTACTGTGTTGGCCCTACCGGGGGTTTTTTATTATGTGTCGTATGTCAGTTGATCGCCACACATCCAAGCAGAACC
SEQ ID NO.3：GGTGACTGCTACTGTGTTGGCCCTCCGGGGGAAAATAGCTCCAATACATATGGAGTTACGGTCG CCACACATCCAAGCAGAACC
SEQ ID NO.4：GGTGACTGCTACTGTGTTGGCCCTACGGGGTCATATTAGTGTCTTCCATTCTGTGTCAGTTGGCCCACACATCCAAGCAGAACC
SEQ ID NO.5：GGTGACTGCTACTGTGTTGGGCCCAGAAGCTCAAAAAGATTACACCTAACCTTCCCCGGAGGGGCCACACATCCAAGCAGAACC
SEQ ID NO.6：GGTGACTGCTACTGTGTTGGCCCTACGGGGTTGAACGTTCGATATTCGTGGTACAACATGAGCGCCACACATCCAAGCAGAACC
SEQ ID NO.7：GGTGACTGCTACTGTGTTGGCCCTACGGGGTTTACAATGATAAATCTTCATCCGATGCGCCTGC CCACACATCCAAGCAGAACC
SEQ ID NO.8：GGTGACTGCTACTGTGTTGGGCCTCCGGGGGGTACGTGAATTTTCGCTACAATTCCACTGCGTACCACACATCCAAGCAGAACC。
6.根据权利要求5所述的适配体，其特征在于：所述适配体是基于权利要求1所述的靶标多肽(靶标物质)获得。
7.基于权利要求5所述的适配体的应用，其特征在于：所述适配体应用于结合新型冠状病毒(sars-cov-2)S蛋白多肽。
8.基于权利要求5所述的适配体的应用，其特征在于：所述适配体应用于制备识别如权利要求1所述的靶标多肽的药物。
9.基于权利要求5所述的适配体的应用，其特征在于：所述适配体应用于制备识别新型冠状病毒(sars-cov-2)S蛋白的药物。
10.基于权利要求5所述的适配体的应用，其特征在于：所述适配体应用于制备识别新型冠状病毒(sars-cov-2)的药物。
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CN116286830A (zh) * 2022-12-30 2023-06-23 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 一种核酸适配体

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