CN111349718A - 用于病原核酸扩增的引物组、病原核酸检测文库构建方法和病原检测方法 - Google Patents
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Abstract
一种用于病原核酸扩增的引物组、病原核酸检测文库构建方法和病原检测方法，本发明的引物组包括至少一对多重扩增引物，多重扩增引物包括正向引物和反向引物，每条正向引物和反向引物的结构包括通用引物扩增结构序列、样本标签序列和病原核酸特异性结合序列，通用引物扩增结构序列用于通用引物扩增，样本标签序列用于识别样本来源，病原核酸特异性结合序列用于特异性结合病原核酸目标区域。本发明采用多重扩增技术富集病原核酸目标基因序列，通过将样本标签序列与样本相连，可明确样本来源，同时实现多个样本混合一起进行文库制备，提高检测通量。
Description
技术领域
本发明涉及病原检测技术领域，具体涉及一种用于病原核酸扩增的引物组、病原核酸检测文库构建方法和病原检测方法。
背景技术
随着高通量测序技术的进步，测序服务对象和应用细分领域不断拓展，高通量测序的市场规模不断增大。高通量测序技术在病原微生物分型检测、病原微生物鉴定及细菌耐药监测方面进入快速发展，应用前景广阔。
(一)病原微生物分型检测方面，例如人乳头瘤病毒核酸分型检测。宫颈癌是全球女性的第二位高发癌，其发病主要与高危型人乳头瘤病毒(HPV)的持续感染有关。每年约有50万新发病例，25万死亡病例，其中发展中国家占2/3。目前已经鉴定出超过200多种HPV型别，其中超过100多种HPV型别会感染皮肤、呼吸道和肛门生殖道粘膜，超过40种HPV型别会感染子宫颈。基于诱导病变的危险程度，可将HPV区分为低危型(例如：HPV6、11、42、43、44型等)和高危型(例HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68型等)。因此，HPV感染的及早发现和正确分型对宫颈癌的预防至关重要。然而，HPV的检测方法，仍有待改进。
目前国内已经获得国家食品药品监督管理总局批准上市的HPV核酸检测试剂盒共有50多种，涉及检测技术有PCR-荧光探针技术(例如公开号为CN101487063A的专利申请“人乳头瘤病毒感染基因扩增荧光检测试剂盒”)、PCR-反向斑点杂交技术(例如公开号为CN107090520A的专利申请“一种运用反向点杂交法快速检测HPV基因型的试剂盒”)、基因芯片检测技术(例如公开号为CN103409553A的专利申请“一种用于高通量分型检测人乳头瘤病毒的基因芯片、试剂及其试剂盒”)、PCR-表面等离子谐振法以及杂交捕获-化学发光法等。以上检测技术均有准确性高、操作简单、检测周期短等优点，但缺点是检测通量低，检测成本高，不适用于大人群筛查。公开号为WO2013071520A1的专利申请“用于病毒检测的方法和系统”，提供了一种使用双标签进行HPV核酸分型检测的方法，实现了高通检测测序检测，大大降低了检测成本，但由于使用的是接头连接的文库制备方法，操作相对比较繁杂。
(二)病原微生物鉴定方面，例如人感染丙型肝炎病毒鉴定检测。丙型肝炎呈全球性流行，全球约1.85亿人感染丙肝病毒(HCV)。慢性HCV感染可进展为肝硬化、肝癌甚至死亡。直接抗病毒药物(DAAs)的出现大大提高了丙型肝炎治疗效果。在中国HCV感染者约2500万人，且近年来新报告的丙型肝炎病例呈稳步增长趋势，已成为相当大的医疗负担，我国2016年HCV感染的总病例数为9,758,760例，其中仅1,775,471例患者被诊断，诊断率仅占18％。因此，HCV感染的及早发现对丙型肝炎的预防和治疗至关重要。
目前国内常用的人感染丙型肝炎病毒鉴定检测技术包括两种类型，一种是抗原抗体检测技术，主要方法为酶联免疫吸附测定法(ELISA)，另一种是核酸检测技术(Nucleicacid technology，NAT)，主要方法为PCR-荧光法。已经获得国家食品药品监督管理总局批准上市的试剂盒共有30个，其中22个是使用酶联免疫吸附测定法(ELISA)的试剂盒；其余8个为使用PCR-荧光法的试剂盒，而且均为乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人类免疫缺陷病毒1型核酸联合检测的试剂盒。无论酶联免疫吸附测定法，还是PCR-荧光法，均有灵敏度高，快速、简便、易于标准化等优点，但均存在检测通量小的缺点。
(三)细菌耐药监测方面，例如大肠杆菌耐药基因检测。随着临床上用药抗菌药物日益增多，特别是许多广谱抗生素及新型抗生素在临床上的广泛应用，使细菌耐药性成为全球关注的焦点，其中肠杆菌属细菌是目前临床感染中最重要的病原菌，对抗生素的耐药极其显著。2014年，我国细菌耐药监测报告显示，全国医院上报的1593006株革兰氏阴性菌中，大肠杆菌耐药菌有465136株，占29.2％；2015年，我国细菌耐药监测报告显示，全国医院上报的1705720株革兰氏阴性菌中，大肠杆菌耐药菌有510140株，占29.9％，与2014年同期相比增加10.8％。因此，细菌耐药菌株的监测，对指导临床抗菌药物的合理使用具有重要意义。
目前国内大肠杆菌耐药基因最常用的检测方法是药敏培养法，例如江苏三联生物工程有限公司的大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌药敏试剂盒(苏食药监械(准)字2014第2400971号)，提供了一种同时检测哌拉西林、头孢曲松、氯霉素、庆大霉素、左氧氟沙星、氨苄西林、阿莫西林四环素等23种抗菌药物的药敏试验试剂盒。药敏培养法操作简单，重复性好，但不适合大规模的检测。FilmArray、Roche、Unyvero等公司均提供了使用PCR-荧光定量法检测细菌耐药基因的技术，PCR-荧光定量法检测自动化程度高、检测周期短、操作简便，但检测覆盖的耐药基因少，检测通量低。其外，Life公司提供了一种覆盖12个细菌18个耐药基因的多重PCR扩增测序检测技术，该技术检测灵敏度高，适用样本类型广泛，但检测成本昂贵。
综上，在病原微生物分型检测、病原微生物鉴定及细菌耐药监测的市场不断扩大过程中，现有技术部分检测成本昂贵、部分操作复杂；而且普遍存在检测通量不足等缺点，不适用大人群筛查检测，远远满足不了日益增长的市场检测需求。
发明内容
本发明提供一种用于病原核酸扩增的引物组、病原核酸检测文库构建方法和病原检测方法。
根据第一方面，一种实施例中提供一种用于病原核酸扩增的引物组，该引物组包括至少一对多重扩增引物，上述多重扩增引物包括正向引物和反向引物，每条正向引物和反向引物的结构包括通用引物扩增结构序列、样本标签序列和病原核酸特异性结合序列，上述通用引物扩增结构序列用于通用引物扩增，上述样本标签序列用于识别样本来源，上述病原核酸特异性结合序列用于特异性结合病原核酸目标区域。
在优选实施例中，上述正向引物和反向引物的结构从5’端至3’端依次包括上述通用引物扩增结构序列、上述样本标签序列和上述病原核酸特异性结合序列。
在优选实施例中，上述引物组还包括至少一对通用扩增引物，上述通用扩增引物包括正向引物和反向引物，上述正向引物包括与上述多重扩增引物的通用引物扩增结构序列至少部分互补或相同的序列，上述反向引物包括与上述多重扩增引物的通用引物扩增结构序列至少部分互补或相同的序列、文库标签序列以及任选存在的用于环化反应和/或测序所需的结构序列，其中，上述文库标签序列用于识别文库样本来源，上述文库样本是上述多重扩增引物的扩增产物。
在优选实施例中，上述通用扩增引物中的反向引物的结构从3’端至5’端依次包括与上述多重扩增引物的通用引物扩增结构序列至少部分互补或相同的序列、上述文库标签序列以及任选存在的用于环化反应和/或测序所需的结构序列。
在优选实施例中，上述通用引物扩增结构序列选自LP-F或LP-R所示的任一序列：
LP-F：GACCGCTTGGCCTCCGACTT；
LP-R：ACATGGCTACGATCCGACTT。
在优选实施例中，上述通用扩增引物的反向引物中与上述通用引物扩增结构序列至少部分互补或相同的序列是如下序列：
TTGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCC。
在优选实施例中，上述通用扩增引物的反向引物中任选存在的用于环化反应和/或测序所需的结构序列是如下序列：
AGCCAAGGAGTT。
在优选实施例中，上述通用扩增引物的正向引物是如下序列：
CACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTT。
根据第二方面，一种实施例中提供一种病原核酸检测文库构建方法，该方法包括：
采用第一方面的引物组中的多重扩增引物对病原核酸样本进行多重扩增，其中每个病原核酸样本对应一组具有样本标签序列的多重扩增引物，不同的病原核酸样本所对应的样本标签序列彼此不同；
将不同的病原核酸样本的多重扩增产物混合形成多个不同的文库样本；和
采用上述通用扩增引物对上述文库样本进行通用扩增，其中每个文库样本对应一对通用扩增引物，每对通用扩增引物中的反向引物具有文库标签序列，不同的文库样本所对应的文库标签序列彼此不同。
在优选实施例中，上述方法还包括：
对上述通用扩增得到的产物进行环化得到可上机测序的病原核酸检测文库。
根据第三方面，一种实施例中提供一种病原高通量检测方法，该方法包括：
通过第二方面的方法构建病原核酸检测文库；
对上述病原核酸检测文库进行高通量测序；
依据上述样本标签序列和文库标签序列对高通量测序数据进行拆分，得到对应于每个病原样本的测序读长数据；和
将每个病原样本的测序读长数据与参考序列比对，得到每个病原样本的检测结果。
在优选实施例中，上述病原样本的检测结果选自病原分型检测结果、病原鉴定检测结果和病原耐药性检测结果中的至少一种。
需要说明的是，本发明的病原高通量检测方法是一种非诊断目的检测方法，因为根据病原检测结果并不能直接得到相关疾病的发生情况，例如检测到乙肝病毒的个体可能是完全健康的病毒携带者。
本发明建立了一种病原微生物的高通量检测技术。主要带来以下方面的改进：
本发明采用多重扩增技术富集病原核酸目标基因序列，通过将样本标签序列与样本相连，可明确样本来源，同时实现多个样本混合一起进行文库制备，提高检测通量；通过将通用引物扩增结构序列、样本标签序列与样本相连，可实现PCR技术进行文库制备，简化技术流程；通过将文库标签序列与多重扩增产物相连，可明确文库样本来源，同时实现多个文库样本一起测序检测，进一步提高检测通量；基于样本标签序列和文库标签序列的双重标签的识别，能够实现多数样本同时测序，大幅提高检测通量，降低检测成本。
附图说明
图1为本发明实施例中多重扩增引物结构示意图；
图2为本发明实施例中多重扩增引物变型的结构示意图；
图3为本发明实施例中HPV多重PCR扩增原理示意图；
图4为本发明实施例中HPV通用PCR扩增原理示意图；
图5为本发明实施例中HCV多重PCR扩增原理示意图；
图6为本发明实施例中HCV通用PCR扩增原理示意图；
图7为本发明实施例中大肠杆菌耐药基因多重PCR扩增原理示意图；
图8为本发明实施例中大肠杆菌耐药基因通用PCR扩增原理示意图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。在以下的实施方式中，很多细节描述是为了使得本发明能被更好的理解。然而，本领域技术人员可以毫不费力的认识到，其中部分特征在不同情况下是可以省略的，或者可以由其他材料、方法所替代。
另外，说明书中所描述的特点、操作或者特征可以以任意适当的方式结合形成各种实施方式。同时，方法描述中的各步骤或者动作也可以按照本领域技术人员所能显而易见的方式进行顺序调换或调整。因此，说明书和附图中的各种顺序只是为了清楚描述某一个实施例，并不意味着是必须的顺序，除非另有说明其中某个顺序是必须遵循的。
本发明提供一种用于病原核酸扩增的引物组，该引物组包括至少一对多重扩增引物，该多重扩增引物包括正向引物和反向引物，每条正向引物和反向引物的结构包括通用引物扩增结构序列、样本标签序列和病原核酸特异性结合序列，上述通用引物扩增结构序列用于通用引物扩增，上述样本标签序列用于识别样本来源，上述病原核酸特异性结合序列用于特异性结合病原核酸目标区域。
需要说明的是，本发明中，多重扩增引物是指可用于多重扩增的引物，当然这样的多重扩增引物也可用于只含有一对扩增引物的扩增体系中。本发明中，多重扩增引物包括三部分：通用引物扩增结构序列、样本标签序列和病原核酸特异性结合序列，其中通用引物扩增结构序列一般用于与通用引物结合进行通用扩增，通用引物扩增结构序列在不同组的多重扩增引物之间可以相同；样本标签序列(Index)用于识别样本来源，即扩增不同样本使用的多重扩增引物的样本标签序列彼此不同；病原核酸特异性结合序列用于特异性结合病原核酸目标区域，即引物的特异性结合部分，对于一种特定的病原而言，每组多重扩增引物的病原核酸特异性结合序列可以是一种特定的序列(用于结合病原核酸的一个目标区域)，也可以是多种特定的序列(用于结合病原核酸的多个目标区域)，当病原核酸特异性结合序列是多种特定的序列的情况下，每组多重扩增引物包括多对引物，这多对引物之间的差别就在于病原核酸特异性结合序列彼此不同，而通用引物扩增结构序列和样本标签序列可以彼此相同。每组多重扩增引物都含有相同的样本标签序列，用于扩增一个样本，不同的样本采用含有不同的样本标签序列的多重扩增引物进行扩增。
多重扩增引物的正向引物和反向引物均包括上述三部分序列，这三部分序列之间的连接关系，如图1所示，一般是从5’端至3’端依次包括通用引物扩增结构序列、样本标签序列和病原核酸特异性结合序列。
当然，在其他实施例中，多重扩增引物的正向引物和反向引物的上述三部分序列也可能有其他连接方式，例如，如图2所示，病原核酸特异性结合序列可以被分成两部分序列，一部分位于样本标签序列的下游(3’端)，一部分位于通用引物扩增结构序列的上游(5’端)。
上述多重扩增引物用于对不同的样本进行多重扩增，所得到的产物可以混合在一起得到多重扩增混合文库，这种多重扩增混合文库可以使用通用扩增引物进一步扩增，一方面使文库容量放大，另一方面将标识不同文库的文库标签序列引入扩增产物中，在混合上机测序后能够根据不同的文库标签序列区分不同的文库样本来源。
在一个实施例中，通用扩增引物包括正向引物和反向引物，正向引物包括与多重扩增引物的通用引物扩增结构序列至少部分互补或相同的序列。反向引物包括与多重扩增引物的通用引物扩增结构序列至少部分互补或相同的序列、文库标签序列以及任选存在的用于环化反应和/或测序所需的结构序列，其中，文库标签序列用于识别文库样本来源，文库样本是多重扩增引物的扩增产物。
需要说明的是，本发明实施例中，通用扩增引物的正向引物和反向引物并没有特别限定，即并不特别限定正向引物和反向引物一定是某一个方向上的引物，这种命名只是为了区分一对彼此配对使用、扩增方向相反、扩增链彼此互补的引物。在其它实施例中，正向引物也可以被称为反向引物，而反向引物也可以被称为正向引物。
正向引物包括与多重扩增引物的通用引物扩增结构序列至少部分互补或相同的序列，保证正向引物能够与通用引物扩增结构序列或其互补链配对结合实现引物扩增。正向引物中与通用引物扩增结构序列至少部分互补或相同的序列一般是指正向引物延伸方向(即3’端)部分的序列。
反向引物也包括与多重扩增引物的通用引物扩增结构序列至少部分互补或相同的序列，需要说明的是，由于多重扩增引物也包括正向引物和反向引物两条引物，并且每条引物也均包括通用引物扩增结构序列，因此，通用扩增引物的正向引物和反向引物中与多重扩增引物的通用引物扩增结构序列至少部分互补或相同的序列，是分别与多重扩增引物中正向引物和反向引物的通用引物扩增结构序列对应的。需要说明，通用扩增引物的正向引物中与多重扩增引物的通用引物扩增结构序列至少部分互补或相同的序列，可以是对应于多重扩增引物中正向引物的通用引物扩增结构序列，也可以是对应于多重扩增引物中反向引物的通用引物扩增结构序列。类似地，通用扩增引物的反向引物中与多重扩增引物的通用引物扩增结构序列至少部分互补或相同的序列，可以是对应于多重扩增引物中反向引物的通用引物扩增结构序列，也可以是对应于多重扩增引物中正向引物的通用引物扩增结构序列。
通用扩增引物的反向引物中的文库标签序列用于区分不同的文库样本来源，文库样本是多重扩增引物的扩增产物，这些扩增产物可以以任意方式混合形成不同的文库样本。在一种实施例中，这些不同的文库样本是指多重扩增产物混合物在不同纯化程序中得到的样本。
通用扩增引物的反向引物中用于环化反应和/或测序所需的结构序列，是可以存在也可以不存在的序列，即“任选存在的”序列，其是否存在取决于下游用途和测序方法等，在基于环化文库的测序中，可以存在用于环化反应的结构序列，能够将通用扩增后的产物环化形成可上机测序的文库，在其他测序策略中，可以存在对应的测序所需的结构序列。
通用扩增引物中的反向引物的结构一般是从3’端至5’端依次包括与多重扩增引物的通用引物扩增结构序列至少部分互补或相同的序列、文库标签序列以及任选存在的用于环化反应和/或测序所需的结构序列。
在本发明一个实施例中，提供一种病原微生物核酸高通量测序检测技术，根据病原微生物核酸设计一系列引物，引物5’端引入用于样本识别的样本标签序列(Index)和用于通用引物(Universal Primer，UP)扩增的结构序列，统称线性引物(Linear Prime，LP)，如图1所示。利用线性引物进行多重LP-PCR技术富集目标基因序列，并将多个(例如96个)扩增产物混合成一个文库样本，文库样本通过通用引物扩增(UP-PCR)引入用于文库识别的文库标签序列(Barcode)及用于单链环化和测序反应的结构序列，最后将适量文库样本按等物质的量比例混合为一个测序样本，使用基因测序仪对测序样本核酸进行序列信息读取，每一条测序读长的测序结果经过文库标签序列及样本标签序列比对拆分后将被精确定位到每一个样本中，将每个样本的测序结果与标准数据库中的病原微生物序列进行比对分析，统计每个样本比对到病原微生物的序列数量，若某样本的某一病原微生物的序列数高于该病原微生物的阈值，判断该样本为该病原微生物阳性，若低于阈值判断为该病原微生物阴性。
本发明一个实施实例中，提出了用于样本识别的样本标签序列，这些样本标签序列分别命名为样本标签N，其中N＝1-96的任意整数，其序列如下表1所示核苷酸所示。利用本发明原理，通过将样本标签序列与样本核酸相连，可以精确确定样本的来源。
表1用于样本识别的样本标签序列(5’-3’方向)
本发明一个实施实例中，提供用于通用引物(UP)扩增的结构序列，其用于与正向引物相连的命名为LP-F，用于与反向引物相连的命名为LP-R，其序列如下表2中核苷酸所示。利用该序列与样本标签序列以及样本核酸相连，可将多个(例如96个)不同来源的样本混合成一个文库样本，采用PCR扩增进行文库制备，与“接头连接”法文库制备相比，简化了技术流程，提高了检测通量，同时避免了连接反应效率导致检测失败的问题。
表2通用引物扩增结构序列(5’-3’方向)
| 名称 | 序列 |
| LP-F | GACCGCTTGGCCTCCGACTT |
| LP-R | ACATGGCTACGATCCGACTT |
本发明一个实施实例中，提出了用于文库样本识别的文库标签序列，这些文库标签序列分别命名为文库标签N，其中N＝1-50的任意整数，其序列如下表3所示核苷酸所示。利用本发明原理，通过将文库标签序列与多重扩增产物相连，可以精确确定文库样本的来源。基于样本标签序列和文库标签序列的双重标签的识别，可以实现多数样本同时进行测序，大幅度提高了检测通量，降低检测成本。
表3用于文库样本识别的文库标签序列(5’-3’方向)
在本发明的优选实施例中，样本标签序列和文库标签序列的长度分别是7bp和10bp，然而，在其它实施例中，可以通过增加样本标签序列或减少文库标签序列的碱基数来形成替代方案，即样本标签序列的碱基数可以是7bp以上，例如8bp、9bp或10bp等；而文库标签序列的碱基数可以是10bp以下，例如7bp、8bp或9bp等。
以下通过实施例详细说明本发明的技术方案，应当理解，实施例仅是示例性的，不能理解为对本发明保护范围的限制。
实施例1：病原微生物的分型检测(HPV核酸分型检测)
1.样本准备
分别准备1000、100、10拷贝/微升的人乳头瘤病毒核酸L1区国家标准品，型别包括HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68、6、11、26、53、73、82，同时准备30例已知HPV分型检测结果的HPV临床DNA样本。不同梯度浓度的国家标准品和HPV临床DNA样本共90例。
2.多重PCR扩增
将已准备的90例样本和6个空白对照依次编号，以96组分别带有样本标签序列的正向引物和反向引物分别扩增得到96份多重PCR扩增产物，如图3所示。
需要说明的是，针对不同的DNA样本采用不同的样本标签序列，这里使用的样本标签序列均选自表1中的96组样本标签序列。另外，这96组带有样本标签序列的引物中的每一组中，均包含13条带有样本标签序列的正向引物和20条带有样本标签序列的反向引物，其中正向引物由表4中所列的第1核酸序列和表1中样本标签序列以及表2中所列的LP-F组成，反向引物由表4中所列的第2核酸序列和表1中的样本标签序列以及表2中所列的LP-R组成。
表4第一核酸序列和第二核酸序列(5’-3’方向)
多重PCR的反应体系为25微升，其组成如下表5所示：
表5
反应体系在ABI公司的9700PCR仪上运行。PCR程序如下表6所示：
表6
3.多重PCR产物混合和纯化
取96个多重PCR反应产物各10微升至1.5毫升的离心管中，振荡混匀。取100微升混合后的多重PCR产物，使用130微升的Agencourt AMPure XP磁珠进行纯化，3次纯化分别所得的22微升DNA文库样本，分别标志为HPV-L1、HPV-L2、HPV-L3。留待通用PCR扩增使用。
4.通用PCR扩增进行文库制备
将文库样本HPV-L1、HPV-L2、HPV-L3使用3组通用正向引物和分别带有不同文库标签序列的反向引物进行扩增，如图4所示。
需要说明的是，这里使用的不同文库标签序列是选自表3中的50组文库标签序列中随机3组序列。另外，这3组带有文库标签序列的引物中的每一组中，均包含1条正向引物和1条带有文库标签序列的反向引物，其中正向引物由表7中第3核酸序列组成，引物5’端带有磷酸化基团(Phos)；反向引物由表7中所列的第4核酸序列和表3中文库标签序列以及表7中所列的第5核酸序列组成。
表7第三、第四、第五核酸序列(5’-3’方向)
| 名称 | 序列 |
| 第3核酸序列 | phos/CACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTT |
| 第4核酸序列 | AGCCAAGGAGTT |
| 第5核酸序列 | TTGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCC |
通用PCR的反应体系为50微升，其组成如下表8所示：
表8
反应体系在ABI公司的9700PCR仪上运行。PCR程序如下表9所示：
表9
5.通用PCR产物纯化和混合
将文库样本HPV-L1、HPV-L2、HPV-L3扩增所得的50微升通用PCR扩增产物，用50微升的Agencourt AMPure XP磁珠进行纯化，纯化所得的30微升DNA分别使用Life公司的Qubit3.0测定DNA的浓度，同时按照等物质的量将3个文库样本混合成测序文库，震荡混匀。
6.单链环化及测序反应
单链环化及测序反应操作流程按照深圳华大智造科技有限公司的联合探针锚定测序法试剂盒的操作说明书进行，本实施例采用的是BGISEQ-50测序平台，测序时间约1天，得到可靠的序列碱基信息。
7.数据结果分析
通过对测序结果中文库标签序列和样本标签序列拆分筛选，可获得每个样本的DNA序列信息，将所获得的DNA序列信息与HPV数据库中参考序列比对分析，最终可实现一个样本的HPV分型检测，得到的结果与原已知结果完全一致。具体结果如下表10所示：
表10
如上表结果所示，本实施例对人乳头瘤病毒L1国家标准品及已知测序分型结果的样本进行分型检测，结果发现：所得结果与已知分型结果一致，从而证明了本发明能够有效地应用于病原微生物尤其是HPV的分型检测。同时相对于现有的检测技术，本发明检测流程简单，可实现双重标签测序检测，大幅度提高了检测通量，降低了检测成本。
实施例2：病原微生物的鉴定(HCV检测)
1.样本准备
使用中山大学达安基因股份有限公司的丙型肝炎病毒核酸测定试剂盒(PCR-荧光探针法)的提取试剂进行提取，按照制造商所提供的说明书，从48例已知HCV检测结果的血清样本提取模板RNA，HCV临床血清样本由天津华大临检中心有限公司提供。
2.反转录反应
将已准备的48例样本依次编号，使用宝生物工程(大连)有限公司的MMLV反转录酶，加入随机引物(N8，见表13)进行反转录反应，从而获得样本cDNA。
反转录反应体系为20微升，其组成如下表11所示：
表11
| 试剂 | 体积/微升 |
| 水(无RNA) | 7.6微升 |
| 5×M-MLV缓冲液 | 4微升 |
| dNTP(10μM) | 2微升 |
| 随机引物N8(20μM) | 1微升 |
| RNA抑制剂 | 0.3微升 |
| MMLV反转录酶 | 0.1微升 |
| 模板RNA | 5微升 |
| 总体积 | 20微升 |
反应体系在ABI公司的9700PCR仪上运行。PCR程序如下表12所示：
表12
3.PCR扩增
以cDNA为模板，不同的cDNA分别使用48组带有样本标签序列的正向引物和反向引物进行PCR扩增，如图5所示。需要说明的是，针对不同的cDNA样本采用不同的样本标签序列，这里使用的样本标签序列均选自表1中的96组样本标签序列。另外，这48组带有样本标签序列的引物中的每一组中，均包含1条带有样本标签序列的正向引物和1条带有样本标签序列的反向引物，其中正向引物由表13中所列的第6核酸序列和表1中样本标签序列以及表2中所列的LP-F组成，反向引物由表13中所列的第7核酸序列和表1中的样本标签序列以及表2中所列的LP-R组成。
表13随机引物N8、第6核酸序列和第7核酸序列(5’-3’方向)
| 名称 | 序列 |
| 随机引物N8 | NNNNNNNN |
| 第6核酸序列 | GAGAGCCATAGTGGTCTGCGGAAC |
| 第7核酸序列 | GCACTCGCAAGCRCCCTATCAG |
PCR的反应体系为50微升，其组成如下表14所示：
表14
| 试剂 | 体积/微升 |
| 水(无RNA) | 1微升 |
| 2×KAPA2G Fast Multiplex | 25微升 |
| 正向引物(各10pmol) | 2微升 |
| 反向引物(各10pmol) | 2微升 |
| 模板cDNA | 20微升 |
| 总体积 | 50微升 |
反应体系在ABI公司的9700PCR仪上运行。PCR程序如下表15所示：
表15
4.多重PCR产物混合和纯化
取48个多重PCR反应产物各10微升至1.5毫升的离心管中，振荡混匀。取100微升混合后的多重PCR产物，使用130微升的Agencourt AMPure XP磁珠进行纯化，3次纯化分别所得的22微升DNA文库样本，分别标志为HCV-L1、HCV-L2、HCV-L3。留待通用PCR扩增使用。
5.通用PCR扩增进行文库制备
将文库样本HCV-L1、HCV-L2、HCV-L3使用3组通用正向引物和分别带有不同文库标签序列的反向引物进行扩增，如图6所示。
需要说明的是，这里使用的不同文库标签序列是选自表3中的50组文库标签序列中随机3组序列。另外，这3组带有文库标签序列的引物中的每一组中，均包含1条正向引物和1条带有文库标签序列的反向引物，其中正向引物由表7中第3核酸序列组成，引物5’端带有磷酸化基团(Phos)；反向引物由表7中所列的第4核酸序列和表3中文库标签序列以及表7中所列的第5核酸序列组成。
通用PCR的反应体系为50微升，其组成如下表16所示：
表16
| 试剂 | 体积/微升 |
| 水(HPLC级) | 2微升 |
| 2×KAPA2G Fast Multiplex | 25微升 |
| 正向引物(各10pmol) | 1.5微升 |
| 反向引物(各10pmol) | 1.5微升 |
| 模板DNA | 20微升 |
| 总体积 | 50微升 |
反应体系在ABI公司的9700PCR仪上运行。PCR程序如下表17所示：
表17
6.通用PCR产物纯化和混合
将文库样本HCV-L1、HCV-L2、HCV-L3扩增所得的50微升通用PCR扩增产物，使用50微升的Agencourt AMPure XP磁珠进行纯化，纯化所得的30微升DNA分别使用Life公司的Qubit3.0测定DNA的浓度，同时按照等物质的量将3个文库样本混合成测序文库，震荡混匀。
7.单链环化及测序反应
单链环化及测序反应操作流程按照深圳华大智造科技有限公司的联合探针锚定测序法试剂盒的操作说明书进行，本实施例采用的是BGISEQ-500测序平台，测序时间约3天，得到可靠的序列碱基信息。
8.数据结果分析
通过对测序结果中文库标签序列和样本标签序列拆分筛选，可获得每个样本的DNA序列信息，将所获得的DNA序列信息与HCV数据库中参考序列比对分析，最终可实现一个样本的HCV的鉴定检测，得到的结果与原已知结果完全一致。具体结果如下表18所示：
表18
如上表结果显示，对已知鉴定结果的HCV临床样本进行检测，结果发现：对HCV进行鉴定，3个文库检测的结果与已知鉴定结果均一致，从而证明本发明能够有效地应用于病原微生物尤其是HCV的鉴定。相对于现有的检测技术，本发明检测流程简单，可实现双重标签测序检测，大幅度提高了检测通量，降低了检测成本。
实施例3：细菌耐药基因监测(大肠杆菌耐药基因检测)
1.样本准备
本实施案例使用来自中国食品药品检定研究院的突变型大肠杆菌菌株(ATCC43888)和野生型大肠杆菌菌株(ATCC8739)，其中突变型大肠杆菌菌株包含caiC807、flhA1281、hybA612、valS528、valS1317、valS1356、valS1368、valS1389、yafE227、yedK1323共10个突变位点，使用华大生物科技(武汉)有限公司生产的核酸纯化试剂盒进行DNA提取，严格按照生产厂商提供说明书操作。使用Qubit3.0对DNA样本进行浓度测定，再使用TE缓冲液分别稀释成7000、5000拷贝/微升。然后将相同浓度的突变型大肠杆菌菌株(ATCC43888)与野生型大肠杆菌菌株(ATCC8739)分别按照1：0、3：1、1：1、1：3、1：9、1：20、1：99、0：1的比例混合，分别配置7000、5000拷贝/微升浓度的突变比例为100％、75％、50％、25％、10％、5％、1％、0％的样本。
2.多重PCR扩增
本实施例检测涉及大肠杆菌38个耐抗菌药物基因共68个突变位点，由于引物之间的兼容性问题，本实施例多重PCR反应引物分为引物1和引物2。引物1包含27对引物，共覆盖36个突变；引物2包含26对引物，由表19的第10核酸序列和第11核酸序列组成，共覆盖32个突变位点。将7000、5000拷贝/微升的不同突变比例的样本依次编号，以8组分别带有样本标签序列的引物1和引物2分别扩增16例浓度为7000、5000拷贝/微升的不同突变比例的样本，如图7所示。
需要说明的是，这里使用的8组样本标签序列均选自表1中的96组样本标签序列。另外，引物1包含27条带有样本标签序列的正向引物和27条带有样本标签序列的反向引物，其中正向引物由表19的第8核酸序列和表1中样本标签序列以及表2中所列的LP-F组成，反向引物由表19的第9核酸序列和表1中的样本标签序列以及表2中所列的LP-R组成。引物2包含26条带有样本标签序列的正向引物和26条带有样本标签序列的反向引物，其中正向引物由表19的第10核酸序列和表1中样本标签序列以及表2中所列的LP-F组成，反向引物由由表19的第11核酸序列和表1中的样本标签序列以及表2中所列的LP-R组成。
表19第8、9、10、11核酸序列(5’-3’方向)
多重PCR的反应体系为25微升，其组成如下表20所示：
表20
| 试剂 | 体积/微升 |
| 水(HPLC级) | 5.5微升 |
| 2×KAPA2G Fast Multiplex | 12.5微升 |
| 正向引物(各1pmol) | 1微升 |
| 反向引物(各1pmol) | 1微升 |
| 模板DNA | 5微升 |
| 总体积 | 25微升 |
反应体系在ABI公司的9700PCR仪上运行。PCR程序如下表21所示：
表21
3.多重PCR产物混合和纯化
将带有8组不同样本标签序列的引物1和引物2扩增的PCR产物混合，震荡混匀，16例样本PCR扩增产物分别混合成2个文库样本。取100微升混合后的多重PCR产物，使用130微升的Agencourt AMPure XP磁珠进行纯化，2个文库样本纯化分别所得的22微升DNA文库样本，分别标志为E.coli-L1、E.coli-L2。留待通用PCR扩增使用。
4.通用PCR扩增进行文库制备
将文库样本E.coli-L1、E.coli-L2使用2组通用正向引物和分别带有不同文库标签序列的反向引物进行扩增，如图8所示。
需要说明的是，这里使用的不同文库标签序列是选自表3中的50组文库标签序列中随机2组序列。另外，这2组带有文库标签序列的引物中的每一组中，均包含1条正向引物和1条带有文库标签序列的反向引物，其中正向引物由表7中第3核酸序列组成，引物5’端带有磷酸化基团(Phos)；反向引物由表7中所列的第4核酸序列和表3中文库标签序列以及表7中所列的第5核酸序列组成。
通用PCR的反应体系为50微升，其组成如下表22所示：
表22
反应体系在ABI公司的9700PCR仪上运行。PCR程序如下表23所示：
表23
5.通用PCR产物纯化和混合
将文库样本E.coli-L1、E.coli-L2扩增所得的50微升通用PCR扩增产物，使用50微升的Agencourt AMPure XP磁珠进行纯化，纯化所得的30微升DNA分别使用Life公司的Qubit3.0测定DNA的浓度，同时按照等物质的量将2个文库样本混合成测序文库，震荡混匀。
6.单链环化及测序反应
单链环化及测序反应操作流程按照深圳华大智造科技有限公司的联合探针锚定测序法试剂盒的操作说明书进行，本实施例采用的是BGISEQ-500测序平台，测序时间约3天，得到可靠的序列碱基信息。
7.数据结果分析
通过对测序结果中文库标签序列和样本标签序列拆分筛选，可获得每个样本的DNA序列信息，将所获得的DNA序列信息与耐药数据库中参考序列比对分析，最终可实现大肠杆菌样本的耐药分析检测，得到的结果与原已知结果完全一致。具体结果如下表24所示：
表24
如上表结果所示，对不同浓度不同突变比率的突变型大肠杆菌菌株进行耐药分析检测，结果发现：16例不同浓度不同突变比率的突变型大肠杆菌菌株的检测结果与原结果均一致，而且可以检测1％的突变频率，从而证明了本发明能够有效地应用于细菌耐药尤其是大肠杆菌的耐药基因的检测。相对于现有的检测技术，本发明检测流程简单，可实现双重标签测序检测，大幅度提高了检测通量，降低了检测成本。
以上应用了具体个例对本发明进行阐述，只是用于帮助理解本发明，并不用以限制本发明。对于本发明所属技术领域的技术人员，依据本发明的思想，还可以做出若干简单推演、变形或替换。
SEQUENCE LISTING
<110> 深圳华大智造科技有限公司
<120> 用于病原核酸扩增的引物组、病原核酸检测文库构建方法和病原检测方法
<130> 18I27504
<160> 293
<170> PatentIn version 3.3
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<213> 人工序列
<400> 114
atccagcatc 10
<210> 115
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 115
catcactcac 10
<210> 116
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 116
cagctgactc 10
<210> 117
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 117
ttcgcagaca 10
<210> 118
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 118
ttgtaccaat 10
<210> 119
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 119
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<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 120
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<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 121
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<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 122
gcttgtggtg 10
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 123
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<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 124
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<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 125
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<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 126
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<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 127
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<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 128
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<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 129
cgcaagatct 10
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<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 130
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<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
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ccatcgttgc 10
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<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 132
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<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 133
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<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 134
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 135
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<211> 10
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<213> 人工序列
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<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 138
gctcaacgct 10
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<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 139
atgcatctaa 10
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<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 140
agctctggac 10
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<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
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<213> 人工序列
<400> 142
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 143
gccaagtcca 10
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<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 144
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<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 145
tagaggtctt 10
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 146
tatggcaact 10
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 147
ctgcgtacat 10
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 148
atctcattaa 10
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 149
tttgttactg tggtggatac tac 23
<210> 150
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 150
tttgttaccg ttgttgatac tac 23
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<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 151
tttgttacta aggtagatac cactc 25
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 152
tttgttactg ttgtggatac aac 23
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<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 153
tttgttacta tggtagatac cacac 25
<210> 154
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 154
tttgtcacag ttgtggatac cactc 25
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<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 155
tttgttactg tagttgatac cactc 25
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 156
tttgttactg tggtagatac tac 23
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 157
tttgttacct gtgttgatac cac 23
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 158
tttattactt gtgttgacac tac 23
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<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 159
tttttaactg ttgtagatac tactag 26
<210> 160
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 160
tttgtaactg ttgtggatac cac 23
<210> 161
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 161
tttattaggc agaatccaga tg 22
<210> 162
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 162
tgtcgtaggt actccttaaa g 21
<210> 163
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 163
catgtctgct atactgctta aat 23
<210> 164
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 164
ccatgtctta aatactcttt aaaattac 28
<210> 165
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 165
tcatttttat atgtactgtc actag 25
<210> 166
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 166
tgcctggtat attccttaaa c 21
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<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 167
acatgtctac tatagtgctt aaac 24
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<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 168
cccatgccta atatattgct taaag 25
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<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 169
gaaaaataaa ttgtaaatca aattcctcg 29
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<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 170
tgtctaaggt actgattaat ttttcg 26
<210> 171
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 171
catttttata tgtaccttcc ttagt 25
<210> 172
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 172
tccttaaaac tggtaggtgt g 21
<210> 173
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 173
gcgaaagtat tgattgattt cacg 24
<210> 174
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 174
ctcaacatgc ctaatatatt ccttaaat 28
<210> 175
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 175
catgtactct ttataatcag aattgg 26
<210> 176
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 176
gcatgtattc cttataatct gaattag 27
<210> 177
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 177
gaaatataaa ttgtaattca tattcttcg 29
<210> 178
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 178
cctaacatac tgtttaattt gctttga 27
<210> 179
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 179
gtcttaaata ttccttaaaa ttagagttgg 30
<210> 180
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 180
catgcctaat gtactgctta aag 23
<210> 181
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 181
cacaagtatc actaagctcg 20
<210> 182
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 182
cacagaacga catggctacg atccgactt 29
<210> 183
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 183
agccaaggag tt 12
<210> 184
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 184
ttgtcttcct aagaccgctt ggcc 24
<210> 185
<211> 8
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(8)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 185
nnnnnnnn 8
<210> 186
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 186
gagagccata gtggtctgcg gaac 24
<210> 187
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 187
gcactcgcaa gcrccctatc ag 22
<210> 188
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 188
acctttgtgc tggtcgagaa 20
<210> 189
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 189
tctggttaca gacggtagaa gca 23
<210> 190
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 190
cggccatttt tagcgcattg 20
<210> 191
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 191
gtaaacgtga aagccgctac at 22
<210> 192
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 192
cctttggctg ggtttctgat attagc 26
<210> 193
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 193
gggcatgaat ggtttcagga 20
<210> 194
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 194
aatggatatc agtaatgagg ggcttg 26
<210> 195
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 195
agcgatggtg ataaccaata cagc 24
<210> 196
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 196
tggtgcacat tcgcgacaat a 21
<210> 197
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 197
atgagtaaac aacgcatttt tattgctg 28
<210> 198
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 198
cgaacaggtc aatcagcaac tg 22
<210> 199
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 199
ggcaatgact ggaacaaagc ct 22
<210> 200
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 200
gccgtaagcc cactgtcaa 19
<210> 201
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 201
cttgctccac catctgtcct tt 22
<210> 202
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 202
gagtaacggc attgtgatca tcg 23
<210> 203
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 203
agctgtgcaa ccagaaaggt 20
<210> 204
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 204
gcgttttcga tgctggagaa tc 22
<210> 205
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 205
acaagtaagt tccagaatgt agtgattgt 29
<210> 206
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 206
gtacgcaaac tttgcccaca tt 22
<210> 207
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 207
ggtaacagcg aatgccgttt tg 22
<210> 208
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 208
ggaagagata atatcgatgc gttcact 27
<210> 209
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 209
ctgtattgct gtttgcactg cta 23
<210> 210
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 210
ggcgaaataa agggatacga ttacg 25
<210> 211
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 211
cttaagtaat ctggagccga atattcagat 30
<210> 212
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 212
cctgtccaat gcggtgaaag aa 22
<210> 213
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 213
aaaaccgcag acggtaaaga ttatct 26
<210> 214
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 214
aggactggtg tatctctcgt cagtt 25
<210> 215
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 215
tgttgctgat cgttcgctga a 21
<210> 216
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 216
agaaaattcc agcggtaact tatctgtaat 30
<210> 217
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 217
gttttcaact ttcgccacca gtt 23
<210> 218
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 218
tcagttctgc cacttcgatt tcc 23
<210> 219
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 219
gtggttggca acattaataa ccagg 25
<210> 220
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 220
acacccatca ttgtggataa agttactg 28
<210> 221
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 221
gccatcgcta atattgaggt ttccg 25
<210> 222
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 222
cccactttta cctgctgatg ca 22
<210> 223
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 223
gcagcggttc cagggttaat 20
<210> 224
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 224
ctgtccagca ggttcagttc at 22
<210> 225
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 225
gtggaggaat ttcatacagc tcgaa 25
<210> 226
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 226
gaccgtctac cagcatgtaa cg 22
<210> 227
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 227
ttacttcact ttctatccag ccgtc 25
<210> 228
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 228
atatcaagac tggcaatatc atcatccac 29
<210> 229
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 229
ggctgaggtc aggtttgttg ta 22
<210> 230
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 230
cttcagcgcc agacgttttt 20
<210> 231
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 231
ccctgatcgg ccataataaa cgg 23
<210> 232
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 232
agcgtaaaga ccattttgac gaaac 25
<210> 233
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 233
gccgtacgac cataaaaacc gt 22
<210> 234
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 234
ttacgtaaaa tggaatccag tccgtttat 29
<210> 235
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 235
catggcgcat cgttacttac gtaa 24
<210> 236
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 236
gagatactca catgtacttt ctgacctttt 30
<210> 237
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 237
ctggataaat caacagaatc atcgattcct 30
<210> 238
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 238
gttttgctgt tcgagcatca ca 22
<210> 239
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 239
ctttcgattc gcggttttcg actt 24
<210> 240
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 240
cggttaacct gcggcagaat 20
<210> 241
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 241
agaagagaac caggtatcga gaacgt 26
<210> 242
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 242
caagtgcggg gagaaaccat cg 22
<210> 243
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 243
gcgaaaaacc tgctgatcgg ta 22
<210> 244
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 244
cgcatctgac cgtagcaaat tc 22
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 245
agaacaacgt tgagtcggtg tt 22
<210> 246
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 246
acacatcctc gatgtggctc ta 22
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 247
gctcaactga atggtcagga tgt 23
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 248
gttcaccagg ttgttgttgc ttatg 25
<210> 249
<211> 22
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<213> 人工序列
<400> 249
gctgaatgat tttctcggtg cc 22
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 250
ctgcttcaac agccacaacg aa 22
<210> 251
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 251
cgttagcggt agatcgcgtt at 22
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<212> DNA
<213> 人工序列
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gtcaaccggg tacggacgat 20
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<212> DNA
<213> 人工序列
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gcctgctgac tcgtgaatct tt 22
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cggcattatt cgcgaccttt ta 22
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<213> 人工序列
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ccagccagct gtctcagttt at 22
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<212> DNA
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agcgcactgg tagaaatcta cc 22
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<212> DNA
<213> 人工序列
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acagataagg atggacgaat taaggc 26
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<212> DNA
<213> 人工序列
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aaaacgtaat ttgccactga tgatcac 27
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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cttaagtaat ctggagccga atattcagat 30
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<212> DNA
<213> 人工序列
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gcgacattca gttcgtaccg aa 22
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 263
gcgacattca gttcgtaccg aa 22
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 264
agtgcgtaaa gaaaataacc tcggtg 26
<210> 265
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 265
aacttttgac cattgaccaa tttgaaatc 29
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 266
atgacctcgc tggcgtttat 20
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<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 267
tgatacaatg tatcatgcct ctttgc 26
<210> 268
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 268
tattccacgc ccgcaacatc 20
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 269
tagatagcgg tcataaaacc gcc 23
<210> 270
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 270
aatcgcttcc agcgtcatgc 20
<210> 271
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 271
gcacgcatgg taatcgcttc aa 22
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 272
cactgaacaa atccgacttg tctttaaaat 30
<210> 273
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 273
attttttacg cagcgtacca cgg 23
<210> 274
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 274
gccagatcgg gctcttgata ga 22
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<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 275
catcgccggc tgacttctt 19
<210> 276
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 276
gatgcggcag ccgtttttga 20
<210> 277
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 277
gtatggcggc ccataatcac g 21
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 278
cagtttttgc gcttttggca ag 22
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 279
ccagaatggt agaaatgata gaagcca 27
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 280
cctttcgccg tcaccataat gat 23
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<212> DNA
<213> 人工序列
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caatagcatg gccagtgaca tct 23
<210> 282
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 282
ggtgtacgtc tcgaacttcg aag 23
<210> 283
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 283
taccggaacc ttcgatttct tcg 23
<210> 284
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 284
gcacatgata atgctcgttc actttattaa 30
<210> 285
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 285
gtcaggatat tgcagatcac tcttgt 26
<210> 286
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 286
caccaggcca ttgttaatat ggaaaaa 27
<210> 287
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 287
gttttgctgt tcgagcatca ca 22
<210> 288
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 288
taccatgccg ggatacggtg a 21
<210> 289
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 289
tcttcgttgc ggccaacata aac 23
<210> 290
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 290
tattttccgg ccagccaagg gta 23
<210> 291
<211> 19
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<213> 人工序列
<400> 291
tgttagggct aagctgcct 19
<210> 292
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 292
ggaacgaaga agattgccag tac 23
<210> 293
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 293
aaagcagaat ggtagctgga ttgta 25
Claims (10)
1.一种用于病原核酸扩增的引物组，其特征在于，所述引物组包括至少一对多重扩增引物，所述多重扩增引物包括正向引物和反向引物，每条正向引物和反向引物的结构包括通用引物扩增结构序列、样本标签序列和病原核酸特异性结合序列，所述通用引物扩增结构序列用于通用引物扩增，所述样本标签序列用于识别样本来源，所述病原核酸特异性结合序列用于特异性结合病原核酸目标区域。
2.根据权利要求1所述的引物组，其特征在于，所述正向引物和反向引物的结构从5’端至3’端依次包括所述通用引物扩增结构序列、所述样本标签序列和所述病原核酸特异性结合序列。
3.根据权利要求1所述的引物组，其特征在于，所述引物组还包括至少一对通用扩增引物，所述通用扩增引物包括正向引物和反向引物，所述正向引物包括与所述多重扩增引物的通用引物扩增结构序列至少部分互补或相同的序列，所述反向引物包括与所述多重扩增引物的通用引物扩增结构序列至少部分互补或相同的序列、文库标签序列以及任选存在的用于环化反应和/或测序所需的结构序列，其中，所述文库标签序列用于识别文库样本来源，所述文库样本是所述多重扩增引物的扩增产物。
4.根据权利要求3所述的引物组，其特征在于，所述通用扩增引物中的反向引物的结构从3’端至5’端依次包括与所述多重扩增引物的通用引物扩增结构序列至少部分互补或相同的序列、所述文库标签序列以及任选存在的用于环化反应和/或测序所需的结构序列。
5.根据权利要求1所述的引物组，其特征在于，所述通用引物扩增结构序列选自LP-F或LP-R所示的任一序列：
LP-F：GACCGCTTGGCCTCCGACTT；
LP-R：ACATGGCTACGATCCGACTT。
6.根据权利要求3所述的引物组，其特征在于，所述通用扩增引物的反向引物中与所述通用引物扩增结构序列至少部分互补或相同的序列是如下序列：
TTGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCC；
任选地，所述通用扩增引物的反向引物中任选存在的用于环化反应和/或测序所需的结构序列是如下序列：
AGCCAAGGAGTT；
任选地，所述通用扩增引物的正向引物是如下序列：
CACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTT。
7.一种病原核酸检测文库构建方法，其特征在于，所述方法包括：
采用权利要求3至6任一项所述的引物组中的多重扩增引物对病原核酸样本进行多重扩增，其中每个病原核酸样本对应一组具有样本标签序列的多重扩增引物，不同的病原核酸样本所对应的样本标签序列彼此不同；
将不同的病原核酸样本的多重扩增产物混合形成多个不同的文库样本；和
采用所述通用扩增引物对所述文库样本进行通用扩增，其中每个文库样本对应一对通用扩增引物，每对通用扩增引物中的反向引物具有文库标签序列，不同的文库样本所对应的文库标签序列彼此不同。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：
对所述通用扩增得到的产物进行环化得到可上机测序的病原核酸检测文库。
9.一种病原高通量检测方法，其特征在于，所述方法包括：
通过权利要求7或8所述的方法构建病原核酸检测文库；
对所述病原核酸检测文库进行高通量测序；
依据所述样本标签序列和文库标签序列对高通量测序数据进行拆分，得到对应于每个病原样本的测序读长数据；和
将每个病原样本的测序读长数据与参考序列比对，得到每个病原样本的检测结果。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述病原样本的检测结果选自病原分型检测结果、病原鉴定检测结果和病原耐药性检测结果中的至少一种。
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|---|---|---|---|
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- 2018-12-21 CN CN201811575203.8A patent/CN111349718A/zh active Pending
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