CN118146360A - 针对SARS-CoV-2 S蛋白的抗体1A01及其用途 - Google Patents

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Abstract

针对SARS‑CoV‑2S蛋白的抗体1A01及其用途，涉及免疫学领域和分子病毒学领域。提供一种针对SARS‑CoV‑2的人源抗体1A01，其重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。还提供编码所述抗体的核酸分子，制备所述抗体的方法以及包含所述抗体的药物组合物。还涉及所述抗体在制备药物中的用途，所述药物用于中和样品中SARS‑CoV‑2的毒力，或用于预防和/或治疗受试者的SARS‑CoV‑2感染或与SARS‑CoV‑2感染相关的疾病。

Description

针对SARS-CoV-2 S蛋白的抗体1A01及其用途
技术领域
本发明涉及免疫学领域和分子病毒学领域。具体而言，本发明涉及一种抗SARS-CoV-2的人源抗体，编码它们的核酸分子，制备它们的方法，以及包含所述抗体的药物组合物。本发明还涉及所述抗体的用途。
背景技术
严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severe acute respiratory syndromecoronavirus 2，SARS-CoV-2)是一种新近出现的人类病原体，引起新型冠状病毒(COVID-19)，并已广泛传播和演变。根据世界卫生组织显示自2019年12月以来，在全球共造成超过7.6亿例病例和690万人死亡，其实际数字可能更高(WHO，Coronavirus disease(COVID-19)，Fact sheet，2023年8月9日)。感染SARS-CoV-2病毒的人最常见的症状包括发烧、发冷和喉咙痛。但是60岁及以上老年人以及患有高血压、癌症、糖尿病、肥胖、心血管疾病等基础疾病的人群危害较大，感染后容易发展为重症或危重症，甚至死亡(Wu Z et al,Jama,2020Apr 7；323(13):1239-1242；Hu B et al,Nature Reviews Microbiology,2021Mar；19(3):141-154)。
SARS-CoV-2是一种包膜的正义RNA病毒，属于β冠状病毒属。SARS-CoV-2编码4种结构蛋白，即核衣壳蛋白(nucleocapsidprotein，N)、刺突蛋白(spike protein，S)、膜蛋白(membrane protein，M)和囊膜蛋白(envelope protein，E)。研究结果显示S蛋白是SARS-CoV-2病毒的主要抗原成分，S蛋白在病毒感染宿主细胞的过程中发挥关键的作用(Wrapp Det al,Science,2020Mar 13；367(6483):1260-1263；Letko M et al，Nat Microbiol,2020Apr；5(4):562-569；Jiang RD et al,Cell,2020,182(1):50-58e58)。S蛋白介导SARS-CoV-2病毒进入宿主细胞，并显著暴露在病毒表面，是宿主产生抗体应答的主要靶向区域，也是中和抗体的主要靶点(Shi R et al,Nature,2020,584(7819):120-124)。S蛋白包含两个功能亚基，S1和S2。其中S1识别宿主细胞受体，而S2促进病毒和细胞膜的融合。S1亚基由N端结构域(N-terminal domain，NTD)和受体结合结构域(receptor binding domain，RBD)组成。RBD通过识别宿主细胞上的受体分子血管紧张素转化酶Ⅱ(angiotensin convertingenzyme II，ACE2)，并与之结合以启动病毒的感染(Wrapp D et al,Science,2020 Mar 13；367(6483):1260-1263；Letko M et al，Nat Microbiol,2020Apr；5(4):562-569；Jiang RDet al,Cell,2020,182(1):50-58e58)。RBD是中和抗体的主要靶点之一(Brouwer et al,2020,Science,369,643-650；Cao,et al,Cell,2020,182,73-84；Seydoux et al,Immunity,2020,53,98-105(2020))。
中和抗体通过阻断病毒入侵宿主细胞而防止病毒传播，达到预防、治疗疾病的目的。由清华大学、深圳市第三人民医院等合作研发安巴韦单抗注射液及罗米司韦单抗注射液是中国首个自主知识产权新冠病毒中和抗体联合治疗药物，用于新冠病毒感染患者的治疗，该药已于2023年3月26日停产。替沙格韦单抗和西加韦单抗(Evusheld)在美国FDA紧急获批用于预防新冠病毒感染，该药在尚未在我国正式上市，但已通过海南博鳌乐城先行区特殊进口审批。
研发出更多针对SARS-CoV-2病毒S蛋白的抗体，将为诊断、预防和/或治疗SARS-CoV-2感染以及所导致的疾病提供更多的工具。本发明获得能够特异性结合SARS-CoV-2病毒S蛋白的全人源抗体。
发明内容
本发明的目的在于提供针对SARS-CoV-2 S蛋白的抗体1A01及其用途。
本发明提供一种针对SARS-CoV-2 S蛋白的抗体1A01，抗体1A01的重链可变区(VH)的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，轻链可变区(VL)的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；抗体1A01的重链可变区(VH)的互补决定区VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.3、4、5所示，轻链可变区(VL)的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.6、7、8所示。
本发明提供一种针对SARS-CoV-2 S蛋白的抗体或其抗原结合片段，其重链可变区(VH)的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示或与如SEQ ID NO.1所示序列具有至少95％的序列同一性，轻链可变区(VL)的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示或与如SEQ ID NO.2所示序列具有至少95％的序列同一性。
在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含来源于人免疫球蛋白的恒定区或其变体。
在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：
(a)人免疫球蛋白的重链恒定区(CH)或其变体，所述变体与其所源自的序列相比具有一个或多个氨基酸的置换、缺失或添加或其任意组合(例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加或其任意组合)；和/或
(b)人免疫球蛋白的轻链恒定区(CL)或其变体，所述变体与其所源自的序列相比具有一个或多个氨基酸的置换、缺失或添加或其任意组合(例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加或其任意组合)。
在某些实施方案中，所述重链恒定区是IgG重链恒定区，例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4重链恒定区。
在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO.9所示的重链恒定区(CH)。
在某些实施方案中，所述轻链恒定区是κ轻链恒定区。
在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO.10所示的轻链恒定区(CL)。
在某些实施方案中所述抗体或抗原结合片段选自Fab、Fab’、(Fab’)2、Fv、scFv、双抗体(diabody)、单域抗体(sdAb)、双特异性抗体、多特异性抗体或人源抗体。
在另一方面，本发明提供一种缀合物，其包含如前所述抗体或其抗原结合片段，以及与所述抗体或其抗原结合片段连接的可检测的标记。
在某些实施方案中，所述可检测的标记选自酶(例如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)、化学发光试剂(例如吖啶酯类化合物、鲁米诺及其衍生物、或钌衍生物)、荧光染料(例如荧光素或荧光蛋白)、有色物质、放射性核素或生物素。
在另一方面，本发明提供一种核酸分子，其包含编码如前所述抗体或其抗原结合片段，或其重链可变区和/或轻链可变区。
在另一方面，本发明提供一种载体，其包含如前所述核酸分子。在某些实施方案中，所述载体为克隆载体或表达载体。
在另一方面，本发明提供一种宿主细胞，其包含如前所述核酸分子或如前所述载体。
在另一方面，本发明提供一种制备如前所述抗体或其抗原结合片段的方法，其包括，在允许所述抗体或其抗原结合片段表达的条件下，培养如前所述宿主细胞，和从培养的宿主细胞培养物中回收所述抗体或其抗原结合片段。
在另一方面，本发明提供一种药物组合物，其包含如前所述抗体或其抗原结合片段或如前所述缀合物，以及药学上可接受的载体和/或赋形剂。
在另一方面，本发明提供一种如前所述抗体或其抗原结合片段或如前所述缀合物用于制备药物的用途，所述药物用于中和样品中SARS-CoV-2的毒力，和/或用于预防和/或治疗受试者的SARS-CoV-2感染或与SARS-CoV-2感染相关的疾病。
优选地，所述受试者是哺乳动物，例如人。
在另一方面，本发明提供一种试剂盒或检测试剂，其包括如前所述抗体或其抗原结合片段或如前所述缀合物。
在某些实施方案中，所述试剂盒包含如前所述抗体或其抗原结合片段，以及特异性识别所述抗体或其抗原结合片段的第二抗体；任选地，所述第二抗体还包括可检测的标记。此类可检测的标记是本领域技术人员熟知的，例如酶(例如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)、化学发光试剂(例如吖啶酯类化合物、鲁米诺及其衍生物、或钌衍生物)、荧光染料(例如荧光素或荧光蛋白)、有色物质、放射性核素或生物素。
在另一方面，本发明提供一种如前所述抗体或其抗原结合片段或如前所述缀合物在制备试剂盒以及检测试剂中的用途，所述试剂盒或检测试剂用于检测SARS-CoV-2在样品中的存在或其水平，和/或用于诊断受试者是否感染了SARS-CoV-2。
在某些实施方案中，所述样品为来自受试者(例如哺乳动物，优选人)的血液样品(例如，全血、血浆或血清)、排泄物、口腔或鼻腔分泌物、或肺泡灌洗液。
本发明的有益效果：
本发明提供一种能够特异性结合SARS-CoV-2病毒的单克隆抗体，该抗体特异性结合SARS-CoV-2病毒S蛋白，与S蛋白结合具有很高的亲和力(KD值为1.66×10-3nM)，该抗体对SARS-CoV-2D614G、B.1.1.7、B.1.351、P.1、B.1.617.2突变株具备较强的中和能力。本发明提供的抗体为全人源抗体，与异源抗体相比具有更低的免疫原性；另外所述全人源的抗体也可以用于检测试剂的开发。
附图说明
图1为单克隆抗体1A01与SARS-CoV-2 STFK蛋白和SARS-CoV-2 RBD蛋白的结合活性的ELISA检测结果以及EC50的值。其中，横坐标表示抗体浓度(ng/mL)，纵坐标表示OD450/630值。
图2为单克隆抗体1A01对SARS-CoV-2 S6P蛋白以及SARS-CoV-2 RBD蛋白的亲和力测定结果。其中，a为SARS-CoV-2 S6P蛋白，b为SARS-CoV-2 RBD蛋白；横坐标表示时间(s)，纵坐标表示响应值(RU)。
图3为单克隆抗体1A01对SARS-CoV-2突变株(D614G、B.1.1.7、B.1.351、P.1、B.1.617.2)中和能力的测定结果以及IC50的值。横坐标表示抗体浓度(ng/mL)，纵坐标表示抑制率(％)。
具体实施方式
现参照下列意在举例说明本发明(而非限定本发明)的实施例来描述本发明。
除非特别指明，否则基本上按照本领域内熟知的以及在各种参考文献中描述的常规方法进行实施例中描述的实验和方法。例如，本发明中所使用的免疫学、生物化学、分子生物学、微生物学、细胞生物学、基因组学等常规技术，可参见萨姆布鲁克(Sambrook)、弗里奇(Fritsch)和马尼亚蒂斯(Maniatis)，《分子克隆：实验室手册》(MOLECULAR CLONING:ALABORATORY MANUAL)，第2次编辑(1989)；《当代分子生物学实验手册》(CURRENT PROTOCOLSIN MOLECULAR BIOLOGY)(F.M.奥苏贝尔(F.M.Ausubel)等人编辑，(1987))；《酶学方法》(METHODS IN ENZYMOLOGY)系列(学术出版公司)：《PCR 2：实用方法》(PCR 2:A PRACTICALAPPROACH)(M.J.麦克弗森(M.J.MacPherson)、B.D.黑姆斯(B.D.Hames)和G.R.泰勒(G.R.Taylor)编辑(1995))，以及《动物细胞培养》(ANIMAL CELL CULTURE)(R.I.弗雷谢尼(R.I.Freshney)编辑(1987))。
另外，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。本领域技术人员知晓，实施例以举例方式描述本发明，且不意欲限制本发明所要求保护的范围。本发明中提及的全部公开案和其他参考资料以其全文通过引用合并入本发明。
在本发明的第一方面，提供一种特异性结合SARS-CoV-2病毒的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含：
(a)包含下述3个互补决定区(CDR)的重链可变区(VH)：
(i)VH CDR1，其由下述序列组成：SEQ ID NO.3，和
(ii)VH CDR2，其由下述序列组成：SEQ ID NO.4，和
(iii)VH CDR3，其由下述序列组成：SEQ ID NO.5；
(b)包含下述3个互补决定区(CDR)的轻链可变区(VL)：
(iv)VL CDR1，其由下述序列组成：SEQ ID NO.6，和
(v)VL CDR2，其由下述序列组成：SEQ ID NO.7，和
(vi)VL CDR3，其由下述序列组成：SEQ ID NO.8。
在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：
(a)重链可变区(VH)，其包含选自下列的氨基酸序列：
(i)SEQ ID NO.1所示的序列；或
(ii)与SEQ ID NO.1所示的序列具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列；
(b)轻链可变区(VL)，其包含选自下列的氨基酸序列：
(iii)SEQ ID NO.2所示的序列；或
(iv)与SEQ ID NO.2所示的序列具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列。
在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：具有如SEQ ID NO.1所示的序列的重链可变区(VH)和具有如SEQ ID NO.2所示的序列的轻链可变区(VL)。
在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含来源于人免疫球蛋白的恒定区或其变体。
在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：
(a)人免疫球蛋白的重链恒定区(CH)或其变体，所述变体与其所源自的序列相比具有一个或多个氨基酸的置换、缺失或添加或其任意组合(例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加或其任意组合)；和/或
(b)人免疫球蛋白的轻链恒定区(CL)或其变体，所述变体与其所源自的序列相比具有一个或多个氨基酸的置换、缺失或添加或其任意组合(例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加或其任意组合)。
在某些实施方案中，所述重链恒定区是IgG重链恒定区，例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4重链恒定区。
在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO.9所示的重链恒定区(CH)。
在某些实施方案中，所述轻链恒定区是κ轻链恒定区。
在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO.10所示的轻链恒定区(CL)。
在某些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段选自Fab、Fab’、(Fab’)2、Fv、scFv、双抗体(diabody)、单域抗体(sdAb)、双特异性抗体、多特异性抗体或人源抗体。(1A01是人源抗体，已进行相应修改)
在另一方面，本发明提供一种缀合物，其包含如前所述抗体或其抗原结合片段，以及与所述抗体或其抗原结合片段连接的可检测的标记。
在某些实施方案中，所述可检测的标记选自酶(例如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)、化学发光试剂(例如吖啶酯类化合物、鲁米诺及其衍生物、或钌衍生物)、荧光染料(例如荧光素或荧光蛋白)、有色物质、放射性核素或生物素。
在另一方面，本发明提供一种核酸分子，其包含编码如前所述抗体或其抗原结合片段，或其重链可变区和/或轻链可变区。
在另一方面，本发明提供一种载体，其包含如前所述核酸分子。在某些实施方案中，所述载体为克隆载体或表达载体。
在另一方面，本发明提供一种宿主细胞，其包含如前所述核酸分子或如前所述载体。
在另一方面，本发明提供一种制备如前所述抗体或其抗原结合片段的方法，其包括，在允许所述抗体或其抗原结合片段表达的条件下，培养如前所述宿主细胞，和从培养的宿主细胞培养物中回收所述抗体或其抗原结合片段。
在另一方面，本发明提供一种药物组合物，其包含如前所述抗体或其抗原结合片段或如前所述缀合物，以及药学上可接受的载体和/或赋形剂。
在另一方面，本发明提供一种如前所述抗体或其抗原结合片段或如前所述缀合物用于制备药物的用途，所述药物用于中和样品中SARS-CoV-2的毒力，和/或用于预防和/或治疗受试者的SARS-CoV-2感染或与SARS-CoV-2感染相关的疾病。
在另一方面，本发明提供一种试剂盒或检测试剂，其包括如前所述抗体或其抗原结合片段或如前所述缀合物。
在某些实施方案中，所述试剂盒包含如前所述抗体或其抗原结合片段，以及特异性识别所述抗体或其抗原结合片段的第二抗体；任选地，所述第二抗体还包括可检测的标记。此类可检测的标记是本领域技术人员熟知的，例如酶(例如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)、化学发光试剂(例如吖啶酯类化合物、鲁米诺及其衍生物、或钌衍生物)、荧光染料(例如荧光素或荧光蛋白)、有色物质、放射性核素或生物素。
在另一方面，本发明提供一种如前所述抗体或其抗原结合片段或如前所述缀合物在制备试剂盒以及检测试剂中的用途，所述试剂盒或检测试剂用于检测SARS-CoV-2在样品中的存在或其水平，和/或用于诊断受试者是否感染了SARS-CoV-2。
在某些实施方案中，所述样品为来自受试者(例如哺乳动物，优选人)的血液样品(例如，全血、血浆或血清)、排泄物、口腔或鼻腔分泌物、或肺泡灌洗液。
序列信息
本发明涉及的部分序列的信息提供于下面的表1中。
表1：序列的描述
实施例1.单克隆抗体序列的获得
1.1外周血单核细胞(PBMC)的制备
采集健康的新冠疫苗接种志愿者的外周静脉血，采用Ficoll-paque密度梯度离心法分离人PBMC。将淋巴细胞分离液Ficoll-paque、RPMI 1640培养基和PBS缓冲液预先平衡至室温。在离心管中加入与外周静脉血等体积的淋巴细胞分离液Ficoll-paque，将等体积的RPMI 1640培养基与静脉血混匀，随后将混匀的混合物沿离心管壁缓慢加入到Ficoll-paque液面上方。在室温、离心速度为400g条件下，水平离心40min。离心结束后收集血浆与Ficoll-paque分离液中间的乳白色细胞层，即为PBMC。使用10倍体积的PBS清洗PBMC并丢弃细胞上清。用胎牛血清配制10％DMSO细胞冻存液，用细胞冻存液重悬细胞，并将其分装冻存至液氮。
1.2 SARS-CoV-2 STFK蛋白的制备与标记
参考SARS-CoV-2 S蛋白基因序列(GenBank:MN908947)，选取第1-1192位氨基酸的核苷酸序列。在此基础上，将其第682-685位氨基酸(即RRAR)用“GSAS“替代，并且，将其第1192位氨基酸突变为蛋氨酸。将其基因片段克隆至pGS01b表达载体上，构建SARS-CoV-2STFK表达质粒，使用CHO细胞进行重组表达。利用Q-FF琼脂糖离子交换层析纯化获得SARS-CoV-2 STFK蛋白。STFK蛋白分别标记FITC荧光和生物素(Biotin)，并使用流式细胞术、ELISA验证标记效率。
1.3抗SARS-CoV-2 S蛋白的特异性B细胞筛选：
将冻存在液氮的PBMC复苏进行流式染色。每1mL全血对应PBMC的第一次染色体系如表2所示，染色条件为4℃避光孵育30min。
表2.第一次染色体系
染料 加入量
live/dead aqua 1μL
CD3-PE-CY7 1μL
CD19-BV786 1.5μL
CD27-BV650 0.5μL
Anti-human IgG-BV421 1.5μL
Anti-human IgM-PERCP-CY5.5 2μL
S-FITC 1μg
S-Biotin 1μg
PBS 补充至100μL
第一次孵育结束后，用PBS清洗细胞，将细胞离心后用第二次染色体系重悬。每1mL全血对应外周血单个核细胞的第二次染色体系如表3所示，染色条件为4℃避光孵育30min。
表3.第二次染色体系
染料 加入量
Streptavidin-APC 1μL
PBS 补充至100μL
预先在96孔U底板中每孔分装23μL裂解液，裂解液的配制如表4所示。使用流式细胞仪将S蛋白双阳性的记忆B细胞分选到分装了裂解液的96孔U底板中，每孔1个细胞。分选结束后进行单细胞RT-PCR调取抗体轻、重链可变区基因序列。随后通过琼脂糖凝胶电泳分析扩增产物，并用DNA纯化回收试剂盒回收扩增产物，测序得到抗体轻链和重链可变区基因序列。使用IMGT数据库对获得的抗体基因序列进行注释。
表4.裂解液体系
裂解液体系 加入量
RNase Out 0.5μL
5×First strand Buffer 5μL
Water 13.25μL
0.1M DTT 1.25μL
Igepal 0.0625μL
1.4单克隆抗体的重组表达质粒的构建以及抗体的小量表达鉴定
利用Age I酶切位点和Sal I酶切位点将扩增的VH基因序列构建到含有人抗体的重链恒定区序列的表达载体pTT5上，构建抗体重链表达质粒。利用AgeI酶切位点和Bsiw I酶切位点将扩增的VL基因序列构建到含有人抗体的轻链恒定区序列的表达载体pTT5上，构建抗体轻链表达质粒。利用PEI(聚乙烯亚胺)将抗体轻重链表达质粒共转染至HEK293T细胞中，进行单克隆抗体的重组表达。转染前12h，在6孔细胞培养板中每孔接种1.2×106细胞。分别制备质粒稀释液和转染试剂稀释液，制备方法如下所述：在125μL Opti-MEM中加入1μg抗体重链质粒和1μg抗体轻链质粒，轻轻混匀制备成质粒稀释液；在125μL Opti-MEM中加入8μL PEI转染试剂，充分混匀制备成转染试剂稀释液。随后将PEI转染试剂稀释液滴加至质粒稀释液中，轻柔混匀，室温避光孵育15min。将质粒-转染试剂复合物滴加至HEK293T细胞中，置于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养。转染6h后更换为生长培养基，培养4天后，离心，收集细胞上清。
1.5细胞培养上清的检测
利用间接ELISA检测细胞上清，筛选SARS-CoV-2 S特异性抗体。用50mM CB缓冲液(NaHCO3/Na2CO3缓冲液，pH值为9.6)将SARS-CoV-2 STFK蛋白稀释至浓度为1μg/mL。向96孔ELISA板中加入稀释好的SARS-CoV-2 STFK蛋白(每孔100μL)，在4℃包被过夜，随后在37℃包被2h。用PBST洗涤液(20mM PB7.4，150mM NaCl，0.05％Tween-20)洗板1次，甩干。然后每孔加入200μL的封闭液(20mM PB7.4，20％小牛血清，1％酪蛋白)，放入37℃温箱封闭2h，弃去封闭液，甩干。
在包被了SARS-CoV-2 STFK蛋白的ELISA板中，每孔加入100μL待检测的细胞上清，在37℃孵育30min。随后，用PBST洗板5次，然后每孔加入100μL以1∶5000稀释的HRP标记的羊抗人(GAH-HRP)酶标二抗，并在37℃孵育30min。待反应结束后，用PBST洗涤板5次，甩干。每孔加入100μL TMB显示液(现配现用)，显色15min。用H2SO4终止显色反应，并用酶标仪检测OD450/630读值。细胞培养上清检测为阳性的孔为SARS-CoV-2特异性抗体。
1.6单克隆抗体序列的获得
经过上述实验，获得SARS-CoV-2特异性单克隆抗体1A01。人源单克隆抗体1A01重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
利用IMGT(http://www.imgt.org/IMGT_vquest/input)数据库注释1A01的CDR序列，其重链CDR1-3如SEQ ID NO:3-5所示，其轻链CDR1-3如SEQ ID NO:6-8所示。
实施例2.单克隆抗体的制备与纯化
采用ExpiCHO-S真核表达系统(Thermo Scientific)对抗体进行大量表达。采用1mL OptiPRO培养基稀释12.5μg重链质粒和12.5μg轻链质粒，轻柔混匀制备成质粒稀释液，采用1mL OptiPRO培养基稀释80μL ExpiFectamine CHO Transfection Kit转染试剂，混匀制备成转染试剂稀释液。将转染试剂稀释液加入质粒稀释液中，轻柔混匀，室温静置1-5min。随后将其加入体积为25mL的ExpiCHO-S细胞中(细胞密度为6×106/mL、细胞活率大于98％)，将ExpiCHO-S细胞置于125rpm，37℃，8％CO2的细胞摇床中培养。转染18-22h后，在ExpiCHO-S细胞中加入150μL增强剂和4mL辅料，并将其转移至125rpm、32℃、5％CO2的细胞摇床中培养12-14天。表达完成后，离心，收集细胞上清。使用protein A亲和层析纯化细胞上清中的抗体，获得纯化的单克隆抗体1A01。
实施例3.单克隆抗体1A01与SARS-CoV-2 STFK蛋白和SARS-CoV-2 RBD蛋白的ELISA结合活性
3.1 SARS-CoV-2 STFK蛋白和SARS-CoV-2 RBD蛋白的获得
SARS-CoV-2 STFK蛋白的获得如实施例1.2所述。
为了构建SARS-CoV-2 RBD表达质粒，参考其基因序列(GenBank:MN908947,aminoacids 331-531)，然后在其C端添加His标签。将其基因片段克隆至表达载体进行重组表达，利用亲和层析纯化获得SARS-CoV-2 RBD蛋白。
3.2间接ELISA检测单克隆抗体1A01的结合活性
分别将SARS-CoV-2 STFK蛋白和将SARS-CoV-2 RBD蛋白用50mM CB缓冲液稀释至浓度为1μg/mL。向96孔ELISA板中加入稀释好的SARS-CoV-2 RBD蛋白(每孔100μL)，在4℃包被过夜，随后在37℃包被2h。用PBST洗板1次，甩干。然后每孔加入200μL的封闭液，放入37℃温箱封闭2h，弃去封闭液，甩干。获得SARS-CoV-2 STFK蛋白和SARS-CoV-2 STFK蛋白包被的ELISA板。
取实施例2获得的单克隆抗体1A01，用PBS稀释至首孔为100μg/mL，5倍梯度稀释，共稀释12个浓度梯度。随后，在分别包被了SARS-CoV-2 STFK蛋白和SARS-CoV-2 RBD蛋白的ELISA板中加入稀释好的抗体(每孔100μL)，置于37℃温箱孵育30min。用PBST洗板5遍，甩干。每孔加入100μL GAH-HRP酶标二抗，置于37℃孵育30min。随后用PBST洗板5遍，甩干。每孔加入100μL TMB显色液(现配现用)，置于37℃温箱显色15min。显色结束后用H2SO4终止显色反应，并用酶标仪检测OD450/630值。
结果如图1所示，单克隆抗体1A01对SARS-CoV-2 STFK蛋白和SARS-CoV-2 RBD蛋白具有良好的结合活性。。
实施例4.单克隆抗体1A01与SARS-CoV-2 S6P蛋白和SARS-CoV-2 RBD蛋白的亲和力测定
为了构建SARS-CoV-2 S6P表达质粒，参考SARS-CoV-2 S蛋白基因序列(GenBank：MN908947)，选取第1-1208位氨基酸的核苷酸序列。在此基础上，将其第682-685位氨基酸(即RRAR)用“GSAS”替代，并且，将其第817、892、899、942、986和987位氨基酸分别突变为脯氨酸。然后，在其C端添加T4纤维蛋白三聚体结构域、HRV3C蛋白酶切割位点以及His标签。将基因片段克隆至真核表达载体进行重组表达，利用亲和层析纯化获得SARS-CoV-2 S6P三聚体蛋白。
在Biacore 8K(Cytiva)上检测单克隆抗体1A01对SARS-CoV-2 S6P和SARS-CoV-2RBD蛋白的亲和力。首先分别将SARS-CoV-2 S6P蛋白和SARS-CoV-2 RBD蛋白包被在CM5芯片(Cytiva)上。然后使用杜氏磷酸盐缓冲液(DPBS)将单克隆抗体1A01稀释至400nM、100nM、50nM和25nM，最后执行亲和力(affinity)程序。其中运行缓冲液为DPBS，结合时间为120s，解离时间为300s，流速为30μL/min。使用Biacore Insight分析软件进行数据分析，并用1︰1结合模型进行拟合。
结果如图2所示，1A01对SARS-CoV-2 S6P蛋白(图2中的图a)以及SARS-CoV-2 RBD蛋白(图2中的图b)具有良好的亲和力，其解离平衡常数分别为1.66×10-3nM以及3.64×10-1nM。
实施例5.单克隆抗体1A01对SARS-CoV-2突变株假病毒中和能力的检测
将SARS-CoV-2突变株的S蛋白基因，包括D614G(GenBank：MN908947)、B.1.1.7(GISAID:EPI_ISL_601443)、B.1.351(GISAID:EPI_ISL_700428)、P.1(GISAID:EPI_ISL_792680)以及B.1.617.2(GISAID:EPI_ISL_1662451)分别克隆到慢病毒载体上。然后将其转染到293T细胞，使其生产相应的假病毒，制备SARS-CoV-2假病毒。
提前24h，在96孔板中每孔加入6×103H1299-hACE2细胞。对于除D614G以外的病毒株，将单克隆抗体1A01稀释到50000ng/mL作为首孔浓度，3倍梯度稀释，共稀释11个梯度；对于D614G的中和，将单克隆抗体1A01稀释到16666.67ng/mL作为首孔浓度，3倍梯度稀释，共10个梯度。然后将稀释好的抗体和SARS-CoV-2假病毒等体积混匀，37℃孵育1h。孵育结束后，弃H1299-hACE2原始细胞上清，取100μL已孵育完成的抗体以及假病毒的混合物加入至细胞中。37℃孵育48h后，使用高内涵成像系统(Opera phenix或Operetta CLS，购自Perkinelmer公司)对感染后细胞进行荧光成像，最后采用Columbus图像管理分析软件(Perkinelmer)对所获荧光图像进行定量，分析绿色荧光阳性细胞数量。计算与未处理的对照孔相比，抗体处理组的绿色荧光阳性细胞数量减少百分数(即抑制率)，利用非线性回归分析计算抗体的IC50值。
检测结果如图3所示，单克隆抗体1A01对SARS-CoV-2突变株D614G、B.1.1.7、B.1.351、P.1、B.1.617.2具有较强的中和能力。
术语定义
在本发明中，除非另有说明，否则本发明中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本发明中所用的分子遗传学、核酸化学、分子生物学、生物化学、微生物学、细胞生物学、免疫学等操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。
如本发明中所使用的，术语“抗体”是指，通常由两对多肽链(每对具有一条轻链(LC)和一条重链(HC))组成的免疫球蛋白分子。抗体轻链可分类为κ(kappa)和λ(lambda)轻链。抗体重链可分类为μ、δ、γ、α或ε，并且分别将抗体的同种型定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在轻链和重链内，可变区和恒定区通过大约12或更多个氨基酸的“J”区连接，重链还包含大约3个或更多个氨基酸的“D”区。各重链由重链可变区(VH)和重链恒定区(CH)组成。重链恒定区由3个结构域(CH1、CH2和CH3)组成。各轻链由一个轻链可变区(VL)和一个轻链恒定区(CL)组成。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子，包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(C1q)的结合。VH和VL区还可被细分为具有高变性的区域(称为互补决定区(CDR)，其间散布有较保守的称为构架区(FR)的区域。各VH和VL由按下列顺序：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4从氨基末端至羧基末端排列的3个CDR和4个FR组成。各重链/轻链对的可变区(VH和VL)分别形成抗原结合部位。氨基酸在各区域或结构域的分配可遵循Kabat等人,Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest(National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1987and 1991))，或Chothia&Lesk(1987),J.Mol.Biol.196:901-917；Chothia等人(1989)Nature 342:878-883的定义。
如本发明中所使用的，术语“互补决定区”或“CDR”是指抗体可变区中负责抗原结合的氨基酸残基。在重链和轻链的可变区中各含有三个CDR，命名为CDR1、CDR2和CDR3。这些CDR的精确边界可根据本领域已知的各种编号系统进行定义，例如可按照Kabat编号系统(Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.PublicHealth Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.,1991)、Chothia编号系统(Chothia&Lesk(1987)J.Mol.Biol.196:901-917；Chothia等人(1989)Nature 342:878-883)或IMGT编号系统(Lefranc et al.,Dev.Comparat.Immunol.27:55-77,2003)中的定义。对于给定的抗体，本领域技术人员将容易地鉴别各编号系统所定义的CDR。并且，不同编号系统之间的对应关系是本领域技术人员熟知的(例如，可参见Lefranc et al.,Dev.Comparat.Immunol.27:55-77,2003)。
如本发明中所使用的，术语抗体的“抗原结合片段”是指包含全长抗体的片段的多肽，其保持特异性结合全长抗体所结合的相同抗原的能力，和/或与全长抗体竞争对抗原的特异性结合，其也被称为“抗原结合部分”。通常参见，Fundamental Immunology,Ch.7(Paul,W.,ed.,第2版，Raven Press,N.Y.(1989)，其以其全文通过引用合并入本发明，用于所有目的。可通过重组DNA技术或通过完整抗体的酶促或化学断裂产生抗体的抗原结合片段。抗原结合片段的非限制性实例包括Fab、Fab’、F(ab’)2、Fd、Fv、dAb、互补决定区(CDR)片段、二硫键稳定性蛋白(dsFv)、scFv、双抗体(diabody)、单域抗体(singledomainantibody)、嵌合抗体、线性抗体(linear antibody)、纳米抗体(技术来自Domantis)、probody和这样的多肽，其包含足以赋予多肽特异性抗原结合能力的抗体的至少一部分。工程改造的抗体变体综述于Holliger et al.,Nat Biotechnol,200523(9):1126-1136中。如本发明中所使用的，术语“全长抗体”意指，由两条“全长重链”和两条“全长轻链”组成的抗体。其中，“全长重链”是指这样的多肽链，其在N端到C端的方向上由重链可变区(VH)、重链恒定区CH1结构域、铰链区(HR)、重链恒定区CH2结构域、重链恒定区CH3结构域组成；并且，当所述全长抗体为IgE同种型时，任选地还包括重链恒定区CH4结构域。优选地，“全长重链”是在N端到C端方向上由VH、CH1、HR、CH2和CH3组成的多肽。“全长轻链”是在N端到C端方向上由轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)组成的多肽。两对全长抗体链通过在CL和CH1之间的二硫键和两条全长重链的HR之间的二硫键连接在一起。本发明的全长抗体可以来自单一物种，例如人；也可以是嵌合抗体或人源化抗体。本发明的全长抗体包含分别由VH和VL对形成的两个抗原结合部位，这两个抗原结合部位特异性识别/结合相同的抗原。
可使用本领域技术人员已知的常规技术(例如，重组DNA技术或酶促或化学断裂法)从给定的抗体(例如本发明提供的抗体)获得抗体的抗原结合片段，并且以与用于完整抗体的方式相同的方式就特异性筛选抗体的抗原结合片段。
在本发明中，除非上下文明确指出，否则当提及术语“抗体”时，其不仅包括完整抗体，而且包括抗体的抗原结合片段。
如本发明所使用的，术语“单抗”和“单克隆抗体”是来自一群高度同源的抗体分子中的一个抗体或抗体的一个片段，即除可能自发出现的自然突变外，一群完全相同的抗体分子。单抗对抗原上的单一表位具有高特异性。多克隆抗体是相对于单克隆抗体而言的，其通常包含至少2种或更多种的不同抗体，这些不同的抗体通常识别抗原上的不同表位。修饰语“单克隆”表示了抗体的特性，是从基本均一的抗体群中获得的，这不应被解释成需要用任何特殊方法来生产抗体。单克隆抗体通常采用Kohler等首次报道的杂交瘤技术(Nature,1975,256:495-497)，重组DNA技术(如参见U.S.P 4,816,567)，或噬菌体抗体库技术获得(参见，例如Clackson等.Nature 352:624-628,1991，或Marks等.J.Mol.Biol.222:581-597,1991)。
如本发明中所使用的，术语“人抗体”或“人源抗体”指可变区和恒定区(如果有的话)均衍生自人生殖系免疫球蛋白序列的抗体。人抗体可通过多种技术获得，包括噬菌体抗体库技术、单个B细胞克隆技术、转基因小鼠技术(例如，使用引入了人生殖系免疫球蛋白基因并去除了小鼠自身生殖系免疫球蛋白基因的转基因小鼠)等。相对于动物源抗体(例如鼠源抗体)，人源抗体在用于人患者时具有免疫原性小、安全性高的优势。
在本发明中，术语“KD”是指特定抗体-抗原相互作用的平衡解离常数，其用于描述抗体与抗原之间的结合亲和力。平衡解离常数越小，抗体-抗原结合越紧密，抗体与抗原之间的亲和力越高。两分子间的特异性结合性质可使用本领域公知的方法进行测定，例如使用表面等离子体共振术(Surface Plasmon Resonance，SPR)在Biacore仪中测定。
如本发明中所使用的，术语“受试者”是指哺乳动物，例如人。在某些实施方案中，所述受试者(例如人)患有SARS-CoV-2感染或与SARS-CoV-2感染相关的疾病(例如COVID-19)，或者，具有患有上述疾病的风险。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，但本领域技术人员将理解：根据已经公布的所有教导，可以对细节进行各种修改和变动，并且这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部分为由所附权利要求及其任何等同物给出。

Claims (10)

1.能够特异性结合SARS-CoV-2病毒的抗体，其特征在于所述抗体命名为1A01，其重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；抗体1A01的重链可变区的互补决定区VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3的氨基酸序列分别如SEQID NO.3、4、5所示，轻链可变区的互补决定区VL CDR1、VL CDR2、VL CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.6、7、8所示。
2.能够特异性结合SARS-CoV-2病毒的抗体或其抗原结合片段，其特征在于所述抗体或其抗原结合片段的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示或与如SEQ ID NO.1所示序列具有至少95％的序列同一性，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示或与如SEQID NO.2所示序列具有至少95％的序列同一性；
优选的，所述抗体或其抗原结合片段的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；
所述抗体或抗原结合片段可选自Fab、Fab’、(Fab’)2、Fv、scFv、双抗体diabody、单域抗体sdAb、双特异性抗体、多特异性抗体或人源抗体。
3.核酸分子，其特征在于所述核酸分子编码权利要求1～2中任一项所述抗体或其抗原结合片段，或其重链可变区和/或轻链可变区。
4.载体，其特征在于所述载体包含如权利要求3所述核酸分子；优选地，所述载体为克隆载体或表达载体。
5.宿主细胞，其特征在于所述宿主细胞包含权利要求3所述核酸分子或权利要求4所述载体。
6.如权利要求1～2中任一项所述抗体或其抗原结合片段的制备方法，其特征在于其具体步骤包括，在允许所述抗体或其抗原结合片段表达的条件下，培养如权利要求5所述宿主细胞，和从培养的宿主细胞培养物中回收所述抗体或其抗原结合片段。
7.药物组合物，其特征在于其包含如权利要求1～2中任一项所述抗体或其抗原结合片段，以及药学上可接受的载体和/或赋形剂。
8.如权利要求1～2中任一项所述抗体或其抗原结合片段或如权利要求7所述药物组合物在制备用于中和样品中SARS-CoV-2的毒力药物的用途，或制备用于预防和/或治疗受试者的SARS-CoV-2感染或与SARS-CoV-2感染相关的疾病药物中的用途。
9.试剂盒或检测试剂，其特征在于包括权利要求1～2任一项所述抗体或其抗原结合片段；
所述试剂盒包含权利要求1～2任一项所述抗体或其抗原结合片段，以及特异性识别所述抗体或其抗原结合片段的第二抗体；任选地，所述第二抗体还包括可检测的标记；酶：辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶；化学发光试剂：吖啶酯类化合物、鲁米诺及其衍生物、或钌衍生物；荧光染料：荧光素或荧光蛋白；有色物质；放射性核素；或生物素。
10.权利要求1～4任一项所述抗体或其抗原结合片段在制备试剂盒或检测试剂中的用途，所述试剂盒或检测试剂用于检测SARS-CoV-2在样品中的存在或其水平，和/或用于诊断受试者是否感染SARS-CoV-2。
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