KR101166702B1 - 배추무름병균 검출용 ｄｎａ 올리고뉴클레오티드 및 그 검출방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 PCR에 의하여 배추무름병균 Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum을 신속, 정확하게 검출할 수 있는 올리고뉴클레오티드 및 그 방법에 대한 것이다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드를 이용하면 현장에서 채취된 시료에 대해서도 배추무름병균을 신속 정확하게 고감도로 검출할 수 있다.

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Description

배추무름병균 검출용 ＤＮＡ 올리고뉴클레오티드 및 그 검출방법 {Method and DNA oligonucleotide for detecting Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum}

본 발명은 PCR에 의하여 배추무름병균 Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum을 신속, 정확하게 검출할 수 있는 올리고뉴클레오티드 및 그 방법에 대한 것이다.

배추는 국내 재배면적 2위 채소 작물로서, 그 재배 면적은 연평균 약 4만ha이다. 배추무름병의 증상은 감염된 배추의 잎이나 잎자루는 처음에 수침상 병반이 생기며 차츰 무르게 되고 심한 악취를 발생시킨다. 이 병으로 인해 연간 100억원 내외의 큰 피해가 발생하고 있다.

결구가 되기 전에 배추에 이 병이 발병되면 포기 전체가 부패하여 결구가 되지 않는다. 결구된 배추의 경우는 표면이 담갈색으로 되지만 속잎은 변색되지 않고 물러썩는다. 배추무름병을 일으키는 병원균은 감마프로테오박테리아(gammaproteobacteria)의 일종인 Pectobacterium carotovorum subsp . carotovorum(또는, Erwinia carotovora subsp. carotovora)이며 그람음성의 짧은 간균으로 한천배지에서 회백색 원형 또는 아메바성 콜로니를 형성한다. 기회적 혐기성이며 혐기조건에서도 증식이 가능하다. 이 균은 펙틴분해효소를 분비하여 식물조직을 분해하여 부패시킨다. 건조에 약하여 식물체상에서 월동하는 일은 거의 없으며 감수성 식물조직이 섞여 있는 토양에서는 오랫동안 생존할 수 있다.

이 병원균의 검출에 관하여는 1998년에 서던(Southern) 하이브리드에 의한 검출방법이 보고된 바 있으나, 아종(subspecies)내의 균주간 변이가 매우 다양하여 PCR에 의하여 검출하는 방법은 보고된 바가 없다. 따라서, PCR에 의한 보다 신속하고 정확한 검출법에 대한 연구가 필요한 실정이다.

이와 같은 기술적 배경 하에서, 본 발명자들은 배추무름병원균을 검출하는 방법을 개발하기 위하여 예의 노력한 결과 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

결국, 본 발명의 목적은 배추무름병균을 특이적으로 검출하는 올리고뉴클레오티드 및 이를 이용한 검출방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명에서는,

서열번호 1 및 2로 표시되는 염기서열 및 이에 상보적인 염기서열을 포함하는 배추무름병균 검출용 올리고뉴클레오티드가 제공될 수 있다.

일 실시예에 따르면, 상기 배추무름병균은 Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum 인 것을 특징으로 하는 배추무름병균 검출용 올리고뉴클레오티드가 제공될 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 상기 올리고뉴클레오티드와 PCR반응 혼합물을 포함하는 것을 특징으로 하는 배추무름병균 검출용 키트가 제공될 수 있다.

본 발명의 일 측면에 따르면, 상기 올리고뉴클레오티드를 어닐링 온도 52~60℃에서 PCR을 수행하여 PCR 산물이 437bp일 때 배추무름병균이 검출된 것으로 판정하는 것을 특징으로 하는 배추무름병균의 검출 방법이 제공될 수 있다.

일 실시예에 따르면, 상기 PCR산물을 AvaI, BmeT110I, BsiEI, BslI, BsrI, BssSI, BstNI, Hin4I', Hpy8I, Hpy99I, HpyCH4IV, HpyCH4V, MaeIII, MseI, PspGI, PvuI, ScrFI, StyD4I, TscI, TsoI 및 TspDTI로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 제한효소를 이용하여 RFLP(Restriction Fragment Length polymorphism)기법을 통해 배추무름병균을 검출하는 방법이 제공될 수 있다.

본 발명의 다른 측면에 따르면, 상기 올리고뉴클레오티드를 이용하여 배추무름병균을 검출하는 방법이 제공될 수 있다.

본 발명의 올리고뉴클레오티드를 이용하면 현장에서 채취된 시료에 대해서도 배추무름병균을 신속 정확하게 고감도로 검출할 수 있다.

이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

본 발명은 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 포함하는 배추무름병균 검출용 올리고뉴클레오티드를 제공한다.

PCR을 이용하여 Pectobacterium carotovorum 을 높은 정확성과 민감도로 검출할 수 있는 진단법을 개발하고자 하였다. 먼저 P. carotovorum에 특이적인 유전자 후보군(tail protein, holin, lytic murein transglycolase, core and tail fiber gene, carocin S1, puative Rz lysis protein, DNA invertase)으로부터 올리고뉴클레오티드 세트를 제작하였다. NCBI(미국 국립생물정보센터 http://www.ncbi.nlm.nih.gov) 데이터 베이스 검색을 통해 다른 종에서 유사한 염기서열이 발견되지 않으며 P. carotovorum에 가장 특이성이 높은 것으로 나타나는 서열을 중심으로 PCR 프라이머 용도의 올리고뉴클레오티드 세트를 제작하였다. 이들 올리고뉴클레오티드 세트를 이용하여 P. carotovorum 를 포함한 여러 종에 대하여 PCR을 수행하여 산물의 양상을 관찰하였다. 이를 통해 Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum에만 증폭되고 기타의 생물종에 대해서는 증폭되지 않는 특이성이 높은 올리고뉴클레오티드 세트를 선별하였다.

그 중 특이성이 가장 높은 것으로는 lytic murein transglycolase 유전자의 염기서열(서열목록 3에 첨부)로부터 제조된 올리고뉴클레오티드인 것으로 나타났으며, 그 염기서열은 하기와 같이 명명하였다.(서열목록 1 및 2에 첨부)

ERB3-F :　TgC gAC ACC TCC TCA TCA Cg

ERB3-R :　CTT ATC ACg CTg TAA CCA gC

상기 ERB3-F 및 ERB3-R로 이루어진 올리고뉴클레오티드 세트는 PCR을 수행하였을 때 배추무름병균인 Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum 에 있어 서만 특정크기(437bp)의 반응물을 생성하며, 그 신뢰도는 하기 실시예 2에 나타나있는 바와 같이 94.5% 정도인 것으로 나타났다.

일 실시예에 따르면, 올리고뉴클레오티드와 PCR반응 혼합물을 포함하는 것을 특징으로 하는 배추무름병균 검출용 키트가 제공될 수 있는데, 이러한 본 발명의 올리고뉴클레오티드가 포함된 프리믹스(pre-mix) 검출키트를 이용하면, 손쉽게 PCR을 수행하고 그 산물의 크기를 P. carotovorum 에서 증폭된 것과 비교하여 배추무름병균의 존재여부를 알 수 있다. 상기 키트에는 P. carotovorum로 부터 증폭된 유전자산물이 양성 대조군으로 포함될 수 있다.

일 실시예에 따르면, 상기 올리고뉴클레오티드를 어닐링 온도 52~60℃에서 PCR을 수행하여 배추무름병균을 검출할 수 있다. 상기 올리고뉴클레오티드를 이용하여 PCR을 수행해 본 결과, 염기서열의 예측되는 어닐링 최적온도는 52~60℃인 것으로 나타났다. 52이하에서는 특이성이 없는 산물의 증폭이 나타났으며, 60℃ 이상의 어닐링 온도에서는 주형 DNA와의 어닐링이 원활하지 않아 PCR 산물의 증폭이 잘 일어나지 않았다.

상기의 과정을 통해 제조된 올리고뉴클레오티드 세트인 ERB_3F (서열번호 1) 및 ERB_3R (서열번호 2)는 58℃의 어닐링(annealing) 온도와 15mM MgCl₂농도에서 최적화된 PCR 산물을 나타내었다. 이 조건의 진단법 내에서 10pg/μl, 즉 2X10³ copies 정도의 적은 주형 숫자에도 증폭반응을 나타내는 민감도를 보였다. 증폭된 PCR 산물은 437bp일 경우 배추무름병원균으로 진단할 수 있으며, 확인한 PCR 산물 의 염기서열을 분석하여 확인할 수도 있다.

이로 인해 실험실 환경에서 배양 또는 보존된 균주가 뿐만 아니라, 현장의 열악한 상황에서 채취되어 여러 잡균 및 기주생물인 배추의 유전자가 혼입된 시료를 PCR에 투입하더라도 P. carotovorum 만 특이적으로 증폭이 가능한 것으로 확인되었다. 따라서 본 연구를 통해 확립된 P. carotovorum 특이 PCR 진단법은 병원균의 신속하게 병원균을 조기 진단하는데 유용하게 적용될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 PCR산물에 대하여 RFLP를 수행하여 보다 정확하게 P. carotovorum을 검출하는 방법이 더 포함될 수 있다. 도 5에는 Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum 중 변이를 포함하고 있는 2가지 strain인 pPCC42 및 pPCC43의 유전자 염기서열을 비교하여 나타내었다. 도 5에서 밑줄친 염기서열 부분은 서열목록 1 및 2의 올리고뉴클레오티드 염기서열을 나타낸다. 이 유전자 염기서열에 대하여 제한효소 염기서열 분석프로그램(VectorNTI, 인포맥스사)을 이용하여 사용가능한 제한효소를 조사하였다. 그 결과는 하기 표 1과 같다.

효소명	제한부위갯수	제한부위	효소명	제한부위갯수	제한부위
AvaI	1	244	HpyCH4V	1	271
BmeT110I	1	245	MaeIII	1	12
BsiEI	1	105	MseI	1	141
BslI	1	191	PspGI	1	130
BsrI	1	185	PvuI	1	105
BssSI	1	361	ScrFI	1	132
BstNI	1	132	StyD4I	1	130
Hin4I'	1	416	TscI	1	62
Hpy8I	1	92	TsoI	1	30
Hpy99I	1	233	TspDTI	1	293
HpyCH4IV	1	59

표 1에 나타나있는 제한효소의 제한부위항목은 도 5에 나타나있는 염기서열 437bp 내에서의 위치를 나타낸다. 즉, 염기서열 미상의 샘플에서 437bp의 PCR산물이 나타난 경우, 이를 제한효소 AvaI(표 1 참조)으로 제한하였을 경우, 244bp 크기의 밴드가 나타나면 이는 Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum 의 lytic murein transglycolase 유전자로부터 증폭된 산물인 것으로 판정할 수 있다. 도 5의 별표모양(Asterisk, *)을 참고하면 두 strain에서 일치하지 않는 변이된 염기서열도 확인할 수 있는데, 이 때문에 제한효소를 한 가지 이상 적절히 조합하여 이용할 필요가 있으며, 이를 통해 보다 검증의 신뢰도를 높일 수 있다. 이와 같은 방법의 RFLP(Restriction Fragment Length polymorphism)기법을 이용하면 본 발명의 올리고뉴클레오티드로 증폭된 437bp의 산물을 염기서열 분석없이도 비교적 신속하게 진위여부를 판단할 수 있다.

일 실시예에 따르면, 본 발명의 올리고뉴클레오티드를 이용하여 배추무름병균을 검출하는 방법이 제공될 수 있다.

상기 올리고뉴클레오티드는 PCR뿐만 아니라, 서던(Southern) 하이브리드, 노던(northern) 하이브리드, 마이크로 어레이를 이용한 P. carotovorum 특정유전자의 검출의 프로브(pobe)로도 사용될 수 있다. 이를 위해, 상기 올리고뉴클레오티드의 말단 또는 염기서열의 특정부위에 형광물질, 방사성 동위원소 및 기타 생물학적 표지인자를 접합시키거나 삽입하여 이용할 수도 있다. 그 어떠한 방법이라도, 본 발명의 올리고뉴클레오티드가 갖는 특이성으로 인하여 P. carotovorum을 손쉽게 검출할 수 있다.

본 발명의 다른 측면에 따르면, 상기 올리고뉴클레오티드에 상보적인 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드가 제공될 수 있다. 서열목록 1 및 2에 나타나 있는 염기서열은 바로 PCR에 투입하여 프라이머로 사용할 수 있으며, 이에 대하여 상보적인 염기서열을 갖는 올리코뉴클레오티드 또한 본 발명의 서열목록 1 및 2에 나타나있는 올리고뉴클레오티드와 동일한 용도로 사용될 수 있다.

이하에서는 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 다만, 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다 할 것이다.

<실시 예 1> 증폭 실험과 산물

농업유전자원센터 미생물은행(KACC)이 보유하고 있는 표준 배추무름병균(Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum)을 배양하여 단일 콜로니의 genomic DNA를 genomic DNA 추출키트(Quiagen사)로 추출한 다음, 스펙트로포토미터(genequant사)로 시료 내의 DNA양을 측정하였다. 그런 다음, 1의 2.5mM dNTP, 2.5U Taq polymerase, 10X PCR reaction buffer (15mM MgCl2), 200ng의 배추무름병균 genomic DNA, 10 pmole의 ERB_3F(서열번호 1)및 10 pmole의 ERB_3R (서열번호 2)을 혼합하였다. PCR은 96℃ 4 분의 프리히팅을 거친 후, 96℃ 1분, 54℃ 1분, 72℃ 0.5분의 조건으로 35 사이클 동안 실시하였다. 그 결과 437bp의 증폭산물을 얻었으며, 전기영동 결과가 도 1에 나타나 있다. 도 1의 좌측에는 염기서열 100bp크기단위의 사이즈 마커가 로딩되어 있으며, 상기서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드에 따라 증폭된 산물들이 437bp크기를 반영하며 증폭되어 있는 것이 나타나있다.

<실시 예 2> 올리고뉴클레오티드의 신뢰도 검증

실시예 1과 동일한 방법으로 농업유전자원센터 미생물은행(KACC)이 보유하고 있는 배추무름병균(Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum ) 55개 균주에 대하여 PCR을 실시한 결과 52개 균주에서 437bp크기의 산물이 검출되었다. 이는 94.5%의 신뢰도를 나타내며, 전기영동을 통해 확인한 결과는 도 2에 나타나있다.

<실시 예 3> 올리고뉴클레오티드의 특이성 검증

실시예 1과 동일한 방법으로 배추무름병균 이외에 아래에 나타나 있는 6종의 미생물과 2종의 식물에 대하여 PCR을 실시하였다. 총 9종의 생물체 중 배추무름병균에 대하여만 특이적으로 검출됨을 확인하였다. 이를 도 3에 나타내었다. 도 3에 나타나 있는 바와 같이 일련번호 1에서만 PCR 증폭산물이 관찰되는 것을 알 수 있다. 각 일련번호의 생물종은 다른 세균, 감자, 특히 기주식물인 배추(일련번호 9 : Brassica pekinensis )를 포함하여 실험에 사용되었으며, 하기와 같다.

1. Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum (산물이 증폭됨)

2. Xanthomonas oryzae pv. oryzae

3. Shigella dysenteriae

4. Salmonella enterica subsp. enterica ,

5. Paenibacillus larvae subsp. larvae ,

6. Escherichia coli ,

7. Shigella sonnei

8. Solanum tuberosum

9. Brassica pekinensis

<실시 예 4> 올리고뉴클레오티드의 검출한계 측정

저농도의 주형에 대한 검출 한계를 측정하기 위하여 P. carotovorum genomic DNA를 1 ng/ (=2X10⁵ copies)를 상한으로 하여 10배씩 단계적으로 희석한 후, 이를 주형으로 이미 확립된 최적조건에서 각각의 PCR을 수행하였다. 전기영동으로 확인한 결과 10pg/, 즉 2X10³ copies 까지 동일한 PCR 산물이 생성된 것으로 확인되었으며, 이를 도 4에 나타내었다. 즉, 도 4의 일련번호 1은 주형의 농도가 2X10⁵ copies, 2는 2X10⁴ copies, 3은 2X10³ copies, 4는 2X10² copies이며 5는 2X10 copies를 나타낸다. 도 4에서는 일련번호 3까지만 PCR에 의한 증폭산물이 관찰되어 서열번호 1 및 서열번호 2의 올리고뉴클레오티드를 이용한 검출한계가 2X10³ copies라는 것을 알 수 있다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항 들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

도 1은 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드를 이용하여 PCR을 수행한 결과물의 크기를 나타내는 전기영동 결과이다.

도 2는 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드를 이용한 55개 샘플의 배추무름병균에 대한 PCR 결과이다.

도 3은 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드를 이용한 9가지의 다른 종에 대한 PCR결과이다.

도 4는 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드를 이용한 각기 다른 농도의 주형에 대한 PCR 결과이다.

도 5는 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드를 이용하여 증폭된 Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum 2개 strain에 대한 염기서열 분석 및 비교결과를 나타낸다.

<110> RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION <120> METHOD AND DNA OLIGONUCLEOTIDES FOR DETECTING PECTOBACTERIUM CAROTOVORUM SUBSP. CAROTOVORUM <160> 3 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ERB_3F <400> 1 tgcgacacct cctcatcacg 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ERB_3R <400> 2 cttatcacgc tgtaaccagc 20 <210> 3 <211> 437 <212> DNA <213> Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum <400> 3 tgcgacacct cctcatcacg ctgtttgtta gcccgctgct ttttagcgct acggtctgtg 60 ccgacacgat ccctcgtgcc gcgcaggcgt atcgcagtga tgtgatccgc agcgcacggt 120 tggattgggg catgaatgcc ccgattgctg actttgcggc gcagttgcat caggaaagcg 180 gctggaatcc tcgggccgtt tcacccgtcg gtgcgcaagg gctggctcag tttatgccga 240 ccaccgccga ctggtttagc ggtatcgttc ctgaacttcg cgctaatcac ccgtttaatc 300 ctgcctgggc tatccgtgct ctgacgggct acgatcgctg gctgtggaca cgaatcagcg 360 ccagcaacga ctgcgaacgt atggcgatga ccttgtcgtc ctacaacggc gggcttggct 420 ggttacagcg tgataag 437

Claims (6)

1. 서열번호 1 및 2로 표시되는, 증폭가능한 검출한계 2X10³ copies의 민감도, 기주생물인 배추는 검출하지 않는 특이성 및 94~95% 수준의 신뢰도를 갖는 배추무름병균(Pectobacterium carotovorum subsp. Carotovorum) 검출용 프라이머쌍.
2. 삭제
3. 제1항의 프라이머쌍과, 이의 PCR반응 혼합물을 포함하는 것을 특징으로 하는 배추무름병균 검출용 키트.
4. 제1항의 프라이머쌍을 어닐링 온도 52~60℃에서 PCR을 수행하여 PCR 산물이 437bp일 때 배추무름병균이 검출된 것으로 판정하는 것을 특징으로 하는 배추무름병균의 검출 방법.
5. 제4항에 있어서, 상기 PCR산물을 AvaI, BmeT110I, BsiEI, BslI, BsrI, BssSI, BstNI, Hin4I', Hpy8I, Hpy99I, HpyCH4IV, HpyCH4V, MaeIII, MseI, PspGI, PvuI, ScrFI, StyD4I, TscI, TsoI 및 TspDTI로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 제한효소를 이용하여 제한함으로써 RFLP(Restriction Fragment Length polymorphism)분석하는 것을 특징으로 하는 배추무름병균의 검출 방법.
6. 삭제

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