KR20230111124A

KR20230111124A - 펙토박테리움 카로토보룸의 검출을 위한 선택배지 조성물 및 이를 이용한 검출방법

Info

Publication number: KR20230111124A
Application number: KR1020220038487A
Authority: KR
Inventors: 오세욱; 김은지; 백지혜; 이소영
Original assignee: 국민대학교산학협력단
Priority date: 2022-01-17
Filing date: 2022-03-29
Publication date: 2023-07-25

Abstract

펙틴 (Pectin), 셀로비오스 (cellobiose) 및 이노시톨 (inositol)을 유효성분으로 포함하는 펙토박테리움 카로토보룸 (P. carotovorum) 검출용 배지조성물에 관한 것으로, 펙토박테리움 카로토보룸 (P. carotovorum)은 재배뿐만 아니라 저장 및 운송중에서도 무름병을 일으키는 가능성이 높기 때문에 지속적인 모니터링이 필요한 바, 이러한 문제를 해결하기 위해 상기 배지조성물은 펙토박테리움 카로토보룸 (P. carotovorum)에 대한 선택성이 현저하게 우수한 효과가 있다.

Description

펙토박테리움 카로토보룸의 검출을 위한 선택배지 조성물 및 이를 이용한 검출방법{Composition for selective medium of detecting P. carotovorum and detecting method using the same}

본 발명은 펙토박테리움 카로토보룸 (Pectobacterium carotovorum subsp .; P. carotovorum)의 검출을 위한 선택배지 조성물 및 이를 이용한 검출방법을 제공한다.

무름병은 식물 성장 중에 펙틴질이 녹아 독특한 냄새가 나면서 흐물해지며, 블랙레그 (blackleg) 및 부패 현상이 나타난다. 특히, 펙토박테리움 카로토보룸 (Pectobacterium carotovorum subsp .; P. carotovorum)은 강력한 효소 매커니즘을 통해 식물 세포벽을 파괴하여 재배뿐만 아니라 저장 및 운송 중에서도 무름병을 유발하기 때문에 작물 수확량과 품질을 제한하는 농업에서 가장 중요한 10대 세균 병원체로 보고되었다. 또한, 최근 배추에서 무름병의 피해가 전국적으로 확산되어 많은 농가에서 경제적인 피해를 입은 사례가 다수 발생하여 무름병을 제어하기 위한 방법이 필요한 실정이다. 그러나 화학적 및 물리적인 방법 같은 경우에는 무름병균을 제어하기에는 효과적이나, 살균 과정에서 인체에 부정적인 영향을 미칠 수 있으며, 괴경출현 및 독성물질이 잔류 할 수 있는 문제점 등이 많아 권고되고 있지는 않다. 따라서 초기에 무름병을 분리 및 검출하여 적제적시에 무름병을 통제하여야 한다.

식품 내 펙토박테리움 카로토보룸 검출 시, 국내외 연구된 바로는 균수를 늘린 후, 선택배지를 사용하는 검출방법을 사용하고 있다. 일반적으로 펙토박테리움 카로토보룸 검출에 사용되는 선택배지는 CVP (Crystal Violet Pectate Agar) 배지가 있다.

그러나 상기와 같은 종래 선택배지는 펙토박테리움 카로토보룸만을 선택적으로 분리하지 못하기 때문에 식품 내에서 검출하기에는 한계점이 있는 것으로 알려져 있다. 따라서 펙토박테리움 카로토보룸의 경쟁 집락에 대하여 적합한 조성물에 대한 연구가 계속 진행되고 있는 실정이다.

1. 대한민국 공개특허 10-2011-0058596호.

본 발명의 목적은 펙틴 (pectin), 셀로비오스 (cellobiose) 및 이노시톨 (inositol)을 유효성분으로 포함하는 펙토박테리움 카로토보룸 (P. carotovorum) 선택적 검출용 배지조성물 및 이의 제조방법을 제공하는 데에 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 i) 상기 펙토박테리움 카로토보룸 (P. carotovorum) 선택적 검출용 배지조성물에 펙토박테리움 카로토보룸 (P. carotovorum) 균주 접종 후 배양하는 단계; 및 ii) 상기 i) 단계에서 접종 또는 배양 후, 선택배지 조성물에 형성된 군집체의 발색 형태 또는 환을 확인하는 단계;를 포함하는 펙토박테리움 카로토보룸 (P. carotovorum) 선택적 검출방법을 제공하는 데에 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 펙틴 (pectin), 셀로비오스 (cellobiose) 및 이노시톨 (inositol)을 유효성분으로 포함하는 펙토박테리움 카로토보룸 (P. carotovorum) 선택적 검출용 배지조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 a) 펙틴 (pectin), 셀로비오스 (cellobiose), 이노시톨 (inositol), 담즙염 (bile salt) 및 브로모크레졸 그린 (bromocresol green)을 물에 용해시키고 혼합하는 단계; 및 b) 상기 a) 단계의 혼합물을 110 내지 130 ℃에서 12 내지 18분간 멸균하는 단계;를 포함하는 펙토박테리움 카로토보룸 (P. carotovorum) 선택적 검출용 배지조성물 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 i) 상기 펙토박테리움 카로토보룸 (P. carotovorum) 선택적 검출용 배지조성물에 펙토박테리움 카로토보룸 (P. carotovorum) 균주 접종 후 배양하는 단계; 및 ii) 상기 i) 단계에서 접종 또는 배양 후, 선택배지 조성물에 형성된 군집체의 발색 형태 또는 환을 확인하는 단계;를 포함하는 펙토박테리움 카로토보룸 (P. carotovorum) 선택적 검출방법을 제공한다.

본 발명은 펙틴 (pectin), 셀로비오스 (cellobiose) 및 이노시톨 (inositol)을 유효성분으로 포함하는 펙토박테리움 카로토보룸 (P. carotovorum) 검출용 배지조성물에 관한 것으로, 균수를 늘린 후 선택배지를 사용하여 검출하지 않으면서, 펙토박테리움 카로토보룸 (P. carotovorum)의 경쟁 집락을 검출 할 수 있어, 초기 무름병 통제에 용이할 수 있다.

도 1은 다양한 대장균 (이하, E. coli라함) 선택배지에 배양 된 펙토박테리움 카로토보룸 (이하, P. carotovorum이라함)을 나타낸다.
도 2는 P. carotovorum의 이노시톨 (inositol) 저하 경로를 나타낸다.
도 3은 P. carotovorum 검출용 배지 제조방법 모식도를 나타낸다.
도 4는 P. carotovorum 검출용 배지의 P. carotovorum 집락을 확인한 결과를 나타낸다.
도 5는 P. carotovorum 검출용 배지의 다른 균주들과 P. carotovorum 집락을 비교 확인한 결과를 나타낸다.
도 6은 상용화 된 CVP 배지의 경쟁 집락에 대한 P . carotovorum의 특이성을 나타낸다.
도 7은 P. carotovorum 검출용 배지의 경쟁 집락에 대한 P . carotovorum의 특이성을 나타낸다.
도 8은 배추에 P. carotovorum 접종 후 TSA 배지에 배양한 결과를 나타낸다.
도 9는 배추에 P. carotovorum 접종 후 P. carotovorum 검출용 배지에 배양한 결과를 나타낸다.
도 10은 자연적으로 무름병이 발생한 배추를 나타낸다.
도 11은 자연적으로 무름병이 발생한 배추를 TSA 배지에 배양한 결과를 나타낸다.
도 12는 자연적으로 무름병이 발생한 배추를 P. carotovorum 검출용 배지에 배양한 결과를 나타낸다.

이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

식물 무름병을 제어하기 위한 방법 모색이 필요한 실정으로, 화학적 물리적 방법은 무름 병균 제어에는 효과적이나, 인체에 부정적인 영향을 미칠 수 있어 초기의 무름병을 분리 및 검출하여 무름병을 통제할 필요성이 있었고, P. carotovorum을 균수를 늘리지 않으면서 선택적으로 검출할 수 있는 본 발명을 완성 하였다.

본 발명은 펙틴 (pectin), 셀로비오스 (cellobiose) 및 이노시톨 (inositol)을 유효성분으로 포함하는 펙토박테리움 카로토보룸 (P. carotovorum) 선택적 검출용 배지조성물을 제공하며, 상기 배지조성물은 담즙염 (bile salt) 및 브로모크레졸 그린 (bromocresol green)을 더 포함될 수 있다.

상기 배지조성물은 한천 (agar), 효모추출물 (yeast extract) 및 염화나트륨 (NaCl)을 더 포함될 수 있다.

상기 펙틴의 배지조성물 내 농도는 0.01 g/L 내지 5 g/L일 수 있다.

상기 펙틴은 P. carotovorum이 분해하는 성분 중 하나로, 탄소원으로 첨가되고, P. carotovorum 및 E. coli 둘 다 장내 세균과에 속하며, 서열 유사성도 높아, 70 % 이상의 높은 대사적 유사성을 보이는데, 도 1에 따를 때, E . coli 선택배지인 EMB, SMAC배지 및 MAC배지에 P. carotovorum 을 배양했을 때, E. coli 와 같은 배양특징이 나타나는 것을 확인했다.

상기 셀로비오스의 배지조성물 내 농도는 1 g/L 내지 50 g/L일 수 있고, D-셀로비오스 (D-cellobiose) 일 수 있다.

상기 D-셀로비오스는 셀룰로오스 (cellulose)에 엔도글루카나아제 (endoglucanases) 및 엑소글루카나아제 (exoglucanases)가 함께 작용하면서 생성되며, 탄수화물 발효 능력에 따라 박테리아를 구별하는 데 사용될 수 있다. 또한, BGLU의 기질로 사용되어, 포도당으로 가수분해될 수 있는 것으로, BGLU는 탄수화물 부분의 글리코사이드 결합을 가수분해하는 효소로 셀로비오스를 포도당으로 분해시키는 역할을 한다.

상기 이노시톨의 배지조성물 내 농도는 0.01 g/L 내지 1 g/L일 수 있다.

상기 이노시톨은 도 2에 따를 때, P. carotovorum의 오페론들이 관여하여 열화 (degradation)하는 것을 확인할 수 있었다.

상기 담즙염은 P. carotovorum이 그람음성의 세균이여서, 그람 양성균의 성장 억제를 위해 첨가될 수 있다.

상기 브로모크레졸 그린의 배지조성물 내 농도는 0.01 g/L 내지 0.1 g/L일 수 있다.

상기 브로모크레졸 그린은 pH 3.8 내지 5.4에서 반응이 나타나는 것을 특징으로 하는 것으로, 상기 배지조성물에 P. carotovorum을 배양하고 24 내지 48시간 뒤, 평균 pH는 5.03 내지 5.07이고, E. coli 및 다른 그람 음성균들 (Salmonella Typhimurium 및 Dickeya chrysanthemi 등)을 배양하였을 때의 평균 pH는 6.5 내지 7.09으로 나타나는 점을 볼 때, P. carotovorum 선택배지의 pH 지시약으로 첨가할 수 있다.

상기 i) 단계에서 균주 배양은 27 내지 31 ℃에서 24 내지 48시간 배양하는 것일 수 있다.

상기 ii) 단계에서 군집체는 중심부가 연노랑이고, 주변이 청록색일 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예 등을 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예 등은 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예 등에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예 등은 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

[준비예 1] P. carotovorum 검출용 배지의 기본 구성 및 제조방법

도 3에 따를 때, 우선 펙틴 5 g/L, D-셀로비오스 15 g/L, 이노시톨 0.1 g/L, 담즙염 1.5 g/L, 브로모크레졸 그린 0.04 g/L, 한천 15 g/L, 효모추출물 10 g/L 및 염화나트륨 5 g/L을 물에 용해시키고 혼합하고, 121 ℃에서 15분간 멸균하여, P. carotovorum 검출용 배지를 완성했다.

[실험예 1] 집락관찰

상기 준비예 1의 P. carotovorum 검출용 배지에 30 ℃에서 36시간 동안 P. carotovorum 균주 배양 후, P. carotovorum이 발생한 집락을 확인했다.

그 결과, 도 4에 따를 때, 집락의 중심부가 연노랑이고, 주변이 진한 청록색인 집락을 형성하는 것을 확인했다.

[ 실험예 2] 10종의 균주에 대한 P. carotovorum 검출용 배지의 P. carotovorum 에 대한 특이성 확인

상기 준비예 1의 P. carotovorum 검출용 배지의 다양한 균주에 대한 선택성을 확인하기 위해, 그람 양성균 4종 (Listeria monocytogenes, Bacillus subtilis, Bacillus cereus 및 Staphylococcus aureus) 및 그람 음성균 5종 (Escherichia coli, Shigella sonnei, Salmonella Typhimurium, Pectobacterium carotovorum 및 Dickeya chrysanthemi)에 대해 선택배지에 배양하였다.

그 결과, 도 5에 따를 때, 그람 양성균에 대해서는 담즙염 (bile salt)에 의해 성장이 억제되어 집락이 생성되지 않았으며, 그람 음성균을 배양하였을 때는, P. carotovorum을 배양하였을 때만 중심부가 연노랑이고 주변이 진한 청록색인 집락을 형성하는 것을 확인 할 수 있었다.

[ 실험예 3] 상용화 된 배지와 개발된 선택배지의 P. carotovorum 에 대한 특이성 확인

상용화 된 배지와 상기 준비예 1의 P. carotovorum 검출용 배지의 P. carotovorum에 대한 특이성 확인을 위해 P. carotovorum과 여러 경쟁집락을 혼합한 후, 획선도말 하였다.

그 결과, 도 6에 따를 때, P. carotovorum을 분리하는데 상용화된 CVP 배지는 경쟁 집락에 대한 P. carotovorum의 특이성이 없어 분리하기가 힘들었으나, 도 7에 따를 때, 상기 준비예 1의 P. carotovorum 검출용 배지는 경쟁 집락에 대해 P. carotovorum의 특이성이 나타나는 것을 확인했다.

[ 실험예 4] 인위적으로 P. carotovorum 을 식품에 접종 후, 집락 계수 및 분리 확인

25 g 의 배추에 107 CFU/g 수준의 P. carotovorum을 접종 한 후, 225 ml의 0.85 % (w/v) 염화나트륨 용액 (NaCl solution)을 넣고 0.85 % (w/v) 염화나트륨 용액 (NaCl solution)으로 단계희석 (serial dilutions) 후 영양배지인 TSA (Tryptic Soy Agar)와 상기 준비예 1의 P. carotovorum 검출용 배지에 배양하였다.

그 결과, 도 8에 따를 때, 식품에 존재하는 잡균들도 같이 자라기 때문에, P. carotovorum 집락만을 계수하지 못했지만, 도 9에 따를 때, 상기 준비예 1의 P. carotovorum 검출용 배지에는 접종한 P. carotovorum만 성장이 가능했기 때문에 집락 계수 및 분리가 가능함을 확인했다.

[ 실험예 5] 자연적으로 무름병이 발생한 식품에서의 P. carotovorum 분리 후 16s RNA sequencing 분석

자연적으로 무름병이 발생한 배추(도 10)를 TSA 배지 및 상기 준비예 1의 P. carotovorum 검출용 배지에 배양하였다. 그 결과, 도 11 및 12에 의할 때, TSA 배지에서는 모든 균들이 다 자랐지만, 상기 준비예 1의 P. carotovorum 검출용 배지에서는 P. carotovorum에 대해 선택성이 나타나 분리가 가능하였다.

따라서, 상기 준비예 1의 P. carotovorum 검출용 배지를 이용하여 P. carotovorum 단일 집락 9개를 분리 한 뒤에 16s RNA sequencing 분석을 추가로 실시하였다.

그 결과, 표 1에 따를 때, 9개의 샘플 중에서 8개 샘플에서 양성이 검출되었으며, 이는 개발된 선택배지가 자연적으로 발생한 무름병에서 P. carotovorum을 분리 및 검출 할 수 있는 선택배지로 적합하다고 판단 할 수 있었다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

본 발명의 범위는 후술하는 청구범위에 의하여 나타내어지며, 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims

펙틴 (pectin), 셀로비오스 (cellobiose) 및 이노시톨 (inositol)을 유효성분으로 포함하는 펙토박테리움 카로토보룸 (P. carotovorum) 선택적 검출용 배지조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 배지조성물은 담즙염 (bile salt) 및 브로모크레졸 그린 (bromocresol green)을 더 포함 하는 것을 특징으로 하는, 배지조성물.
청구항 1 또는 청구항 2에 있어서, 상기 배지조성물은 한천 (agar), 효모추출물 (yeast extract) 및 염화나트륨 (NaCl)을 더 포함 하는 것을 특징으로 하는, 배지조성물.
청구항 1 또는 청구항 2에 있어서, 상기 셀로비오스는 D-셀로비오스 (D-cellobiose)인 것을 특징으로 하는, 배지조성물.
청구항 1 또는 청구항 2에 있어서, 상기 펙틴의 배지조성물 내 농도는 0.01 g/L 내지 5 g/L인 것을 특징으로 하는, 배지조성물.
청구항 1 또는 청구항 2에 있어서, 상기 셀로비오스의 배지조성물 내 농도는 1 g/L 내지 50 g/L인 것을 특징으로 하는, 배지조성물.
청구항 1 또는 청구항 2에 있어서, 상기 이노시톨의 배지조성물 내 농도는 0.01 g/L 내지 1 g/L인 것을 특징으로 하는, 배지조성물.
청구항 2에 있어서, 상기 브로모크레졸 그린의 배지조성물 내 농도는 0.01 g/L 내지 0.1 g/L인 것을 특징으로 하는, 배지조성물.
a) 펙틴 (pectin), 셀로비오스 (cellobiose), 이노시톨 (inositol), 담즙염 (bile salt) 및 브로모크레졸 그린 (bromocresol green)을 물에 용해시키고 혼합하는 단계; 및
b) 상기 a) 단계의 혼합물을 110 내지 130 ℃에서 12 내지 18분간 멸균하는 단계;를 포함하는 펙토박테리움 카로토보룸 (P. carotovorum) 선택적 검출용 배지조성물 제조방법.
i) 청구항 1 또는 청구항 2의 펙토박테리움 카로토보룸 (P. carotovorum) 선택적 검출용 배지조성물에 펙토박테리움 카로토보룸 (P. carotovorum) 균주 접종 후 배양하는 단계; 및
ii) 상기 i) 단계에서 접종 또는 배양 후, 선택배지 조성물에 형성된 군집체의 발색 형태 또는 환을 확인하는 단계;를 포함하는 펙토박테리움 카로토보룸 (P. carotovorum) 선택적 검출방법.
청구항 10에 있어서, 상기 i) 단계에서 균주 배양은 27 내지 31 ℃에서 24 내지 72시간 배양하는 것을 특징으로 하는, 검출방법.
청구항 10에 있어서, 상기 ii) 단계에서 군집체는 중심부가 연노랑이고, 주변이 청록색인 것을 특징으로 하는, 검출방법.