CN108866219B

CN108866219B - 魔芋软腐病菌特异性序列及其检测引物和应用

Info

Publication number: CN108866219B
Application number: CN201810914854.9A
Authority: CN
Inventors: 郑露; 孙苗苗; 黄俊斌; 刘浩
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2018-08-13
Filing date: 2018-08-13
Publication date: 2021-08-03
Anticipated expiration: 2038-08-13
Also published as: CN108866219A

Abstract

本发明属于植物保护技术领域，公开了魔芋软腐病菌特异性序列及其检测引物和应用，所述的特异性序列的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示，本发明提供的魔芋软腐菌的特异性检测靶标，较之申请日前的鉴定靶标，具备特异性好、稳定性强和灵敏度高的特点，对于有着较高的同源性魔芋软腐菌近缘种或亚种都能很好的区分，避免了假阳性的产生。可以精确检测到魔芋软腐菌的存在，为魔芋软腐病的田间检测，以及该病害的早期诊断等提供了很好的工具。

Description

魔芋软腐病菌特异性序列及其检测引物和应用

技术领域

本发明属于植物保护技术领域，具体涉及魔芋软腐病菌特异性序列及其检测引物和应用。

背景技术

魔芋(Amorphophallus konjac)是一种多年生草本植物，其球茎中含有丰富的葡甘聚糖，广泛用于食品、化学工程、医药、农业和石油等领域(Li et al.,2010)。中国是魔芋的主要生产国，种植面积约1.13×10⁵公顷(吴金平等，2014)。随着我国魔芋种植和连作面积的增加，魔芋细菌性软腐病发生逐年加重，导致魔芋生产的巨大损失(Wu et al.,2010,2012)。据统计，一般魔芋软腐病可导致减产30％-50％，在一些种植区域产量减少80％以上，有时甚至绝收(张鑫等，2010；Wu et al.,2015)。因此，软腐病严重制约了魔芋产业的发展，成为产业规模化的重要瓶颈和限制因素。

魔芋软腐病是一种细菌性病害，主要是由胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种(Pectobacte rium carotovorum subsp.carotovorum，Pcc)侵染引起(王国馨等，1989)。Pcc除可侵染魔芋外，还可侵染马铃薯、香蕉、菠萝等多种作物，具有广泛的寄主范围(Yasuhara-Bell et al.,2016)。魔芋软腐病菌广泛存在于土壤中，可通过根系的富集作用，使致病菌数量增加从而通过伤口达到致病效果(Wu et al.,2010)。目前，对于魔芋软腐病的防治，除选育健康的魔芋球茎之外，还没有其他有效的防治方法(Wu et al.,2011)，因此加强魔芋软腐病的早期诊断显得尤为重要。

目前，常规PCR和实时定量PCR虽然已经应用到魔芋软腐病的检测上(马改转等，2009；Wu et al.,2011)，但是PCR检测技术需要特殊的仪器设备且检测成本较高，不适合在田间快速应用，且先前报道的检测魔芋软腐菌的特异性引物多是基于16S rDNA及UPR特异性引物(马改转等，2009；Kang et al.,2003；Wu et al.,2011)，但申请人发现，针对16SrDNA设计的引物，对于一些近缘种或亚种之间有着较高的同源性病菌，很难区分，尤其很难区分亚种；而UPR特异性引物扩增出来的目的序列，与其近缘种存在较高的同源性，如：与Pectobacterium carotovorum subsp.odoriferum的同源性高达95％，与Pectobacteriumcarotovorum的同源性达到94％，会在检测过程中造成非特异性扩增，造成假阳性问题。因此，开发魔芋软腐病菌Pcc的特异性检测靶标并建立一种魔芋软腐病的快速检测技术显得尤为重要。

生物信息学及测序技术的快速发展为魔芋软腐病菌的特异性检测提供了新思路。BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)是一种比较DNA序列之间的差异的程序(McGinnis and Madden,2004)。通过BLAST比对，进行基因组间的比较，可筛选出魔芋软腐病菌Pcc特异性基因作为检测靶标。环介导等温扩增技术(LAMP)是一种新型的检测技术，它需要具有链置换活性的Bst DNA聚合酶和一组四到六个特别设计的引物，这些引物特异性识别靶DNA上的六个区域，在60-65℃等温条件下，在1小时内，以高特异性、高灵敏度、高效率扩增DNA(Notomi et al.,2000；Nagamine et al.,2001,2002；Tomotada et al.,2003)；并且可以通过肉眼直接观察LAMP的扩增结果，阳性扩增将产生大量副产物焦磷酸根离子，其可以与溶液中的镁离子结合以形成焦磷酸镁的白色沉淀，阴性对照没有白色沉淀(Moriet al.,2001)。此外，当SYBR Green I添加到扩增产物中时，阳性扩增的颜色变为荧光绿色，阴性对照保持橙色(Tomotada et al.,2003)。因此，LAMP作为一种成本低廉、操作简便、灵敏度高、特异性强、结果判断快速的检测方法，适用于魔芋软腐病的田间快速检测。

本发明通过比较基因组学方法筛选魔芋软腐菌Pcc的特异性靶标，设计开发了具有较好特异性和高灵敏度的LAMP特异性检测引物；同时建立一种适用于田间的LAMP快速检测技术。

发明内容

本发明的目的在于提供了魔芋软腐病菌特异性序列在制备魔芋软腐病菌检测试剂中的应用，所述的魔芋软腐病菌特异性序列为SEQ ID NO.1所示。

本发明的另一个目的在于提供了针对魔芋软腐病菌特异性序列设计的引物在制备魔芋软腐病菌检测试剂中的应用，所述的魔芋软腐病菌特异性序列为SEQ ID NO.1所示。

本发明还有一个目的在于提供了针对魔芋软腐病菌特异性序列设计的LAMP引物，所述的引物为：F3:GCACAAGCTTGACTGCATAC、B3:TGGCGAGTTGTCCCCATAG、FIP:CGCCGTATCGGCACAGAAGAAAGCTTGGCGTTTCTCTCTCA、BIP:GCCCTCATCTCGCTGGCAATCATGTGCTTCCGGCAACAC、LF:AGAAACGGGATGGGGTGG和LB:GCCATCGAGCGTAGCGAA。

为了达到以上目的，本发明采取以下技术措施：

魔芋软腐病菌特异性序列在制备魔芋软腐病菌检测试剂中的应用，所述的魔芋软腐病菌特异性序列为SEQ ID NO.1所示，只要该序列应用于魔芋软腐病菌的检测，都属于本发明的保护内容。

针对魔芋软腐病菌特异性序列设计的引物在制备魔芋软腐病菌检测试剂中的应用，所述的魔芋软腐病菌特异性序列为SEQ ID NO.1所示。只要针对该序列设计的引物用于魔芋软腐病菌的检测，都属于本发明的保护内容。

以上所述的应用中，优选的，针对该特异性序列设计的LAMP引物，所述的引物为：F3:GCACAAGCTTGACTGCATAC、B3:TGGCGAGTTGTCCCCATAG、FIP:CGCCGTATCGGCACAGAAGAAAGCTTGGCGTTTCTCTCTCA、BIP:GCCCTCATCTCGCTGGCAATCATGTGCTTCCGGCAACAC、LF:AGAAACGGGATGGGGTGG和LB:GCCATCGAGCGTAGCGAA。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

1.本发明提供了魔芋软腐菌的特异性检测靶标，较之申请日前的鉴定靶标，该靶标具备特异好、稳定性强和灵敏度高的特点，对于有着较高的同源性魔芋软腐菌近缘种或亚种都能很好的区分，避免了假阳性的产生。

2.针对魔芋软腐菌的特异性检测靶标设计了LAMP检测引物，由于LAMP引物的设计需要结合靶序列上的六个区域，可以精确检测到魔芋软腐菌的存在，可以检测到50fg/μl的Pcc基因组DNA，这为魔芋软腐病的田间检测，以及该病害的早期诊断等提供了很好的工具。

3.提供了一种方便、高效的病原菌特异性检测靶标筛选的方案，只需要获得目标病原菌的全基因组或部分基因组序列就能完成靶标筛选，有效地解决了检测靶标单一、设计检测引物特异性不强的问题。

附图说明：

图1魔芋软腐菌LAMP检测引物特异性检测可视化图；

其中泳道1-14：采自湖北宜昌的Pcc菌株，15-24：采自湖北恩施的Pcc菌株，25-56：Dickeya dadantii,P.carotovorum subsp.actinidiae,P.carotovorumsubsp.Brasiliense,D.Chrysanthemi,D.zeae,Erwinia amylovora,E.Pyrifoliae,Ralstonia solanacearum,Acidovorax citrulli,Xanthomonas oryzae pv.Oryzae,Kosakonia pseudosacchari,Acinetobacter calcoaceticus,Bacillus aryabhattai,B.Firmus,B.Simplex,Citrobacter farmeri,C.Freundii,Enterobacter aerogenes,E.Asburiae,Enterobacter sp.,Klebsiella oxytoca,K.pneumoniae,Morganellamorganii,Paenibacillus polymyxa,Pantoea agglomerans,Providencia rettgeri,Pseudomonas plecoglossicida,P.Putida,Raoultella ornithinolytica,R.Planticola,R.Terrigena,CK。

图2魔芋软腐菌特异性LAMP检测引物灵敏度检测可视化及胶图；

其中泳道M:100bp DNA Ladder,1-8：50ng/μl,5ng/μl,500pg/μl,50pg/μl,5pg/μl,500fg/μl,50fg/μl,5fg/μl的魔芋软腐菌Pcc的基因组DNA，9:CK。

图3魔芋软腐菌特异性LAMP检测引物检测田间魔芋块茎可视化及胶图；

其中泳道M:100bp DNA Ladder,1-5:田间采集具有明显症状的魔芋块茎DNA，6-10:未显症魔芋块茎DNA。

具体实施方式

本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案，所用试剂或材料，如未特别说明均为公众可获得的。

实施例1：

魔芋软腐病菌特异性序列(SEQ ID NO.1所示)或针对该序列设计的引物在制备魔芋软腐病菌检测试剂中的应用：

针对SEQ ID NO.1所示序列，设计了LAMP引物，如下：

F3:GCACAAGCTTGACTGCATAC

B3:TGGCGAGTTGTCCCCATAG

FIP:CGCCGTATCGGCACAGAAGAAAGCTTGGCGTTTCTCTCTCA

BIP:GCCCTCATCTCGCTGGCAATCATGTGCTTCCGGCAACAC

LF:AGAAACGGGATGGGGTGG

LB:GCCATCGAGCGTAGCGAA

LAMP扩增体系如下：

Bst 2.0WarmStart DNA Polymerase购买自New England Biolabs公司。

LAMP扩增程序如下：

65℃反应40min，80℃进行5min使反应停止。

在反应产物中加入1000×SYBR Green I，阳性反应显示绿色，表明有魔芋软腐病菌的存在；阴性对照保持橙色。

实施例2：

魔芋软腐菌LAMP引物特异性检测及灵敏度检测：

魔芋软腐菌LAMP引物特异性检测：

利用实施例1所述的方法，申请人对50株菌株(表1)进行了LAMP检测，50株菌株中包括与Pcc亲缘关系较近的种或亚种的基因序列(如：Pectobacterium carotovorumsubsp.brasiliense和Pectobacterium atrosepticum)，Dickeya spp.(如：Dickeyadadantii和Dickeya zeae)，Erwinia spp.(如：E.amylovora和E.tracheiphila)，还有其他的一些病原细菌(如：Ralstonia solanacearum和Pantoea ananatis)，以及土壤中的常见细菌(如：Agrobac terium tumefaciens和Bacillus subtilis)，结果如表1所示，结果表明，只有Pcc能够特异性检测出来，其他菌株均不能检测出来，并能够准确将Pcc与其近缘亚种区分开，说明该组引物能够特异性检测魔芋软腐菌。

表1 57株菌株的特异性检测

注：+：阳性扩增，-：阴性扩增

魔芋软腐菌LAMP引物灵敏度检测：

将魔芋软腐菌(Pcc菌株PC1，GenBank accession CP001657.1)的基因组DNA进行10倍浓度梯度稀释，用实施例1的LAMP引物检测灵敏度。结果表明，该组引物可以检测到最低浓度为50fg/μl的魔芋软腐菌DNA，灵敏度较高(图2)。

实施例3：

魔芋软腐菌LAMP引物的田间检测：

利用实施例1所述的方法，将田间采集的24株魔芋软腐菌及其他31株阴性对照菌株利用本发明的LAMP引物进行扩增，结果显示，采集到的24株魔芋软腐菌菌株全部检出，31株阴性对照菌株的LAMP扩增结果全部为阴性(图1)。

实施例4：

魔芋软腐菌LAMP特异性检测引物的田间应用：

在湖北省宜昌市五峰县魔芋田块中分别随机采取5株魔芋软腐病明显发病块茎样品和5株未显症魔芋块茎，提取其DNA用LAMP检测，结果显示在5株发病的魔芋块茎上可以检测到魔芋软腐菌的存在，在5株未显症的魔芋块茎上可以检测到4株魔芋块茎也有魔芋软腐菌的存在，只有1株未检测到魔芋软腐菌(图3)，将4株未显症且检测为阳性的魔芋块茎保湿培养于28℃，48小时之后观察到有软腐症状出现，表明此LAMP引物组能在田间应用。

序列表

<110> 华中农业大学

<120> 魔芋软腐病菌特异性序列及其检测引物和应用

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1809

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgcctaaac aagatcggaa cttagtactt tcaaaccata caccgcagcc agagagacaa 60

tcaatggtgg cagcatcttc tcttgccaat agcacactgc gtggcgatat tcatgctgag 120

atattcaaaa cacttctcaa ccagcatgat actgacgagg tgatgtttgc actacagcaa 180

caaatgccgc tttcatcagg tattctggct acccgctatg tggaaatctg cctgcagtat 240

ggtgctgaca gtggggtagc caggcttttt cagcgcacac ccgtcgccta ctcctccagt 300

cactactaca gccttgtcgg caccacaaac cgcctgctcg atgccggaca attagaagaa 360

gctaatgcca tcatttcaca tttatcagag tttgctggcc agcatccaaa tacccgcatg 420

cttcacttaa agtacctact taaaggccgg cgttttgagg aacttcgcca gcagctcgag 480

agcattcccg ctcgagatta taagatgtcg gaagcactcg tagcgcttcg tacccgctat 540

gagtgcacta taggcaatcc agaagcaggg ctggcatggt tggccgacct tggcccactt 600

gaaacgctat cggctaacct tattcattgc gccatccagt gcttgatcag tttagcgcgt 660

tacaacgatg ttataccttt gctcgaagca tggtttaacc tcgatttttc ttatcaggag 720

gccgctaagc gtattttgct ggttgcgacc cagactggag aaaccatcag gctaatacgc 780

gctatagagc agctgcacgg ctggtttacc tcacctgatc tgatccgctt acgcaccgcg 840

ctaataacgt tagatgctac acaacgacgc attcagcgtg aagacgacaa gggggatgaa 900

accgaaagca caagcttgac tgcatactat ccgcttggcg tttctctctc accaccccat 960

cccgtttctg aaaatgccat tttcttctgt gccgatacgg cgtacacggc tccggctatc 1020

gtcgccctca tctcgctggc aatcgccatc gagcgtagcg aaaatttacc tgacatctat 1080

attttcgtgt tgccggaagc acatggtcta tggggacaac tcgccagcag cttcaacaga 1140

gaatttccgt ctttgacgct acgggtagtc tcaacgttgc aaatgcaact tgatcagagc 1200

cgggcacact acgggtttaa ttccatggga gatatgctga gcaccatggc atacgctcga 1260

ctttatgcca gccgttatct atcccaatgt ggtgtagcac gggccctata tcttgattcc 1320

gatgtagtta tccaatcttc accgctgcca ctgttgtata tggatatgga agaatttccg 1380

ttggctgcgt gccatgacca ggtgggtcct ctggttgacc atgcagtcac actgcatggt 1440

atccctaatg gccgctattt taactctggc gtgatgctat tggatttcca tcacccagct 1500

acattacccg caatagaagc tgcgattacc tacagtgaag acacagatag cgtccttatt 1560

tttcaagatc agtgcgcatt gaacaaagcg attcgtggtc tctatctgac gctggatgga 1620

aaatataact gctatatgcc tccaggtcga ccaatgagcg ctatgtatga aaacgcagct 1680

atcgtccatt ttgtcagcac gcccaagccg tggcacctgg cctatttagg tcaagggacg 1740

gcactttggt ctcgttttta tgaccatgcc gtgcgaattg tcggaaaaga tatttttctc 1800

tccctctag 1809

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gcacaagctt gactgcatac 20

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tggcgagttg tccccatag 19

<210> 4

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cgccgtatcg gcacagaaga aagcttggcg tttctctctc a 41

<210> 5

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gccctcatct cgctggcaat catgtgcttc cggcaacac 39

<210> 6

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

agaaacggga tggggtgg 18

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gccatcgagc gtagcgaa 18

Claims

1.检测SEQ ID NO.1所示核苷酸的引物在制备魔芋软腐病菌P. carotovorum subsp.carotovorum检测试剂中的应用。

2.针对SEQ ID NO.1所示核苷酸设计的引物在制备魔芋软腐病菌P. carotovorumsubsp. carotovorum检测试剂中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，所述的引物为：

F3: GCACAAGCTTGACTGCATAC、B3: TGGCGAGTTGTCCCCATAG、FIP:CGCCGTATCGGCACAGAAGAAA-GCTTGGCGTTTCTCTCTCA、BIP: GCCCTCATCTCGCTGGCAATC-ATGTGCTTCCGGCAACAC、LF: AGAAACGGGATGGGGTGG和LB: GCCATCGAGCGTAGCGAA。