CN106957923A

CN106957923A - 一种马铃薯疮痂病病原菌种类鉴定通用引物及检测方法

Info

Publication number: CN106957923A
Application number: CN201710380764.1A
Authority: CN
Inventors: 魏琪; 闵凡祥; 王晓丹; 高云飞; 杨帅; 董学志; 王文重; 张抒; 吕典秋; 宿飞飞; 张静华; 李辉
Original assignee: Institute Of Plant Detoxification And Seedling Research Heilongjiang Academy Of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute Of Plant Detoxification And Seedling Research Heilongjiang Academy Of Agricultural Sciences
Priority date: 2017-05-25
Filing date: 2017-05-25
Publication date: 2017-07-18
Anticipated expiration: 2037-05-25
Also published as: CN106957923B

Abstract

一种马铃薯疮痂病病原菌种类鉴定通用引物及检测方法，它涉及一种检测引物及其PCR扩增方法。本发明的目的是为了解决马铃薯疮痂病的病原菌种类鉴定分辨率低，鉴定效率低和准确性差的问题。该引物序列为：gyrBF2：5'‑TCTGCACGGYGTSGGYGTCTC‑3'；gyrBR2：5'‑TTGCGGGAGTTGAGGTAC‑3'。检测方法为：提取菌株基因组DNA，PCR扩增，对片段大小为400bp的产物测序，将测序结果与基因数据库进行序列比对，最终确认病原菌的种类。本发明具有更高的物种间鉴定分辨率、高鉴定效率、高重复性。检测样品可以是纯菌株DNA、单一致病菌侵染后的马铃薯块茎组织DNA作为模板进行PCR扩增和测序。

Description

一种马铃薯疮痂病病原菌种类鉴定通用引物及检测方法

技术领域

本发明涉及一种检测引物及其PCR扩增方法。

背景技术

马铃薯疮痂病(Potato common scab)，一种土传病害，对马铃薯的外观、等级和品质有影响，分布范围广，是一种严重的世界级病害。马铃薯疮痂病主要危害块茎，病原菌从皮孔侵入，初期在块茎表皮产生褐色斑点，以后逐渐扩大，侵染点周围的组织坏死，块茎表面变粗糙，组织木栓化。发病的严重程度因品种、地块、年份的不同而不同，病斑的大小和深度也因致病菌种类、品种的感病程度，环境条件的不同而不同。严重时病斑连片，严重降低块茎的外观品质，影响其商品价值和加工价值。在加拿大每公顷因疮痂病造成的经济损失在90-102美元之间，全国范围内因疮痂病造成的经济损失高达1.53-1.72亿美元。此病是由植物病原链霉菌(Streptomyces spp.)引起，至今已鉴定和报道了20多种疮痂病原菌，并不断有一些新的链霉菌致病种被发现，呈现出较大的多样性和复杂性。其中，S.scabies、S.acidiscabies和S.turgidiscabies被世界公认为引起马铃薯疮痂病的最普遍的病原菌，发病比例可达90％以上。此外，这些马铃薯疮痂病病原菌除可以侵染马铃薯外，还可以侵染甜菜、芜菁、红薯、胡萝卜、萝卜等块茎作物。

由于该病的病原菌种类比较复杂，明确各个发病地区病原菌的组成是了解该病害的首要环节。因此，对疮痂病致病性链霉菌进行种类鉴定与分类是十分必要的。该病原菌属于细菌，目前细菌种属鉴定和分类的标准方法是利用16S rRNA序列分析。然而，这种基于核苷酸序列的细菌分析方法存在一定的局限性：(1)16S rRNA具有高度保守性，且分子小，包含的信息量较少，对于亲缘关系较近的细菌，其分辨率不高；16S rRNA序列分析只能在属的水平上区分细菌，而在种的水平上仍然需要借助其他手段加以辅助分析，如DNA-DNA杂交，且结果也不稳定，鉴定准确性一般在90％左右。而引起马铃薯疮痂病的不同致病性链霉菌同属于Streptomyces，利用16S rRNA序列分析鉴定种类时，由于菌株亲缘关系很近导致种类鉴定分辨率低。利用各种致病菌内特异性基因扩增法进行致病菌种类鉴定，要根据不同的特异性基因进行多次扩增，工作量繁重；而且单独依靠PCR扩增片段的有无进行结果判断还存在着假阳性的结果，准确性有所降低。

发明内容

本发明的目的是为了解决马铃薯疮痂病的病原菌种类鉴定分辨率低，鉴定效率低和准确性差的问题。而提供了一种鉴定马铃薯疮痂病菌种类的通用引物及其鉴定方法。

本发明的一种马铃薯疮痂病病原菌种类鉴定通用引物，该引物对如下：

gyrBF2：5'-TCTGCACGGYGTSGGYGTCTC-3'

gyrBR2：5'-TTGCGGGAGTTGAGGTAC-3'。

本发明的一种鉴定马铃薯疮痂病菌种类的检测方法，它是按照以下步骤进行的：

一、提取待检测样本的基因组DNA；

二、以上述引物作为鉴定引物，步骤一提取的DNA作为模板，进行PCR扩增反应；

三、PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳；

四、对扩增片进行分析：在400bp位置有扩增条带，表示样品的PCR产物可以进行测序，随后进行测序；

五、将测序后的序列与基因数据库内的数据进行比对，比对成功后，即完成所述的鉴定马铃薯疮痂病菌种类的检测。

本发明是基于蛋白编码基因的促旋酶gyrase的B亚单位基因(即gyrB基因)设计的鉴定通用引物。gyrB基因与非蛋白编码基因的16S rRNA相比，在鉴定亲缘关系较近的细菌方面更具高分辨率的优越性。gyrB基因存在于大多数细菌中，并且不会发生频繁的水平转移，在不同的蛋白及蛋白的不同位点，其氨基酸替代率也不相同。因此，gyrB基因在细菌的系统发育学，特别是在近缘种间菌株的区分及鉴定方面有良好的广泛应用。本发明设计的gyrB基因鉴定通用引物可对3种常见马铃薯疮痂病致病菌(S.scabies、S.acidiscabies和S.turgidiscabies)扩增和测序后获得种间鉴定结果，既减少了不同特异性基因的重复扩增，又通过序列测定大大提高了鉴定结果的准确性。

本发明包含以下有益效果：

本发明的马铃薯疮痂病病原菌种类鉴定通用引物，该引物可以对引起马铃薯疮痂病病原菌Streptomyces属内三种最常见的致病菌(S.scabies、S.acidiscabies和S.turgidiscabies)的菌株进行鉴定。种类鉴定分辨率高、准确性好、鉴定效率高。同时，该引物还具有一定的特异性，与其它马铃薯细菌病害的病原物或不能产生任何产物或产生非特异性的长度不同且扩增量低无法达到测序的要求，从而达到一定的马铃薯疮痂病定性检测的效果。鉴定时对模板DNA浓度无特定要求，只要其PCR产物量达到测序所需的量即可。致病菌种间鉴定效率高，不需要利用多对特异性引物对同一样品进行多次扩增，仅需要扩增一次；鉴定准确性高，利用测序方法获得PCR产物的真实序列，避免了PCR扩增假阳性的弊端，大大提高鉴定准确性。鉴定检测样品可以是纯菌株DNA和块茎组织DNA。

本发明的马铃薯疮痂病病原菌种类鉴定通用引物，鉴定分辨率高、准确性好、鉴定效率高、还具备一定的定性检测功能。在3种常见马铃薯疮痂病致病菌(S.scabies、S.acidiscabies和S.turgidiscabies)的鉴定中，通过一次PCR扩增，其鉴定准确性即可到达100％，而且比现有的特异性引物鉴定方法至少节省三分之一的工作量。同时，该通用引物除了可以鉴定上述3种致病菌外，还可以为新致病菌的种类提供鉴定依据。

附图说明

图1为实施例1gyrB基因PCR扩增结果电泳图；其中，M：marker DL2000；1：空白对照；2～4：标准菌株S.scabies、S.acidiscabies、S.turgidiscabies；5：马铃薯健康块茎；6：菌株28-2；7：菌株B14；

图2为菌株28-2和菌株B14gyrB基因序列构建的系统发育树图；

图3为CS4和CS5在引物ScabI/ScabII下的扩增电泳图；其中，M：marker DL2000；1：空白对照；2：CS5(菌株B14)；3：CS4(菌株28-2)；4：CS1(标准菌株S.scabies CGMCC4.1765)；

图4为CS4和CS5在引物TurgI/TurgII下的扩增电泳图；其中，M：marker DL2000；1：空白对照；2：CS3(标准菌株S.turgidiscabies ATCC 700248)；3：CS5(菌株B14)；4：CS4(菌株28-2)；

图5为7类马铃薯病害19个供试菌株在gyrB基因通用引物下的扩增电泳图；其中，M：marker DL2000；1～2：马铃薯黑痣病菌；3～4：2种马铃薯干腐病菌；5～7：马铃薯晚疫病菌(A1和A2交配型)；8～9：马铃薯青枯病菌；10～12：3种马铃薯黑胫病菌；13～15：马铃薯环腐病菌；16～19：CS1～4；20：空白对照；

图6为菌株F1-16S rRNA基因系统发育树图；

图7为菌株F1-gyrB基因系统发育树图。

具体实施方式

具体实施方式一：本实施方式的一种马铃薯疮痂病病原菌种类鉴定通用引物，该引物对如下：

gyrBF2：5'-TCTGCACGGYGTSGGYGTCTC-3'

gyrBR2：5'-TTGCGGGAGTTGAGGTAC-3'。

本实施方式的引物序列，如序列表Seq ID No：8所示，序列表Seq ID No：9所示。

具体实施方式二：本实施方式的一种鉴定马铃薯疮痂病菌种类的检测方法，它是按照以下步骤进行的：

一、提取待检测样本的基因组DNA；

二、以具体实施方式一的引物作为鉴定引物，步骤一提取的DNA作为模板，进行PCR扩增反应；

三、PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳；

具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式二不同的是：PCR扩增的PCR体系如下：

PCR扩增条件：95℃预变性5min；95℃变性45s，50～65℃退火45s，72℃延伸90s，35个循环，72℃延伸10min，4℃保存。

其它与具体实施方式二相同。

具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式二不同的是：步骤一中提取基因组DNA，是从纯菌株或马铃薯块茎中提取。其它与具体实施方式二相同。

具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式二不同的是：步骤一种基因组DNA提取方法，具体操作步骤如下：

一、取菌体0.1g放入研砵中，加入液氮研磨后，再加入1mL提取缓冲液，所述的缓冲液加入RNase和巯基乙醇；在65℃水浴中1h；

二、将上一步的处理的样本从水浴锅中取出后，加入等体积饱和酚，在20min内混匀；

三、在10000rpm转速下离心10min，取上清液，放另一离心管中，弃下层有机相；

四、向步骤三取的上清中加入等体积的饱和酚/氯仿/异戊醇后，来回颠倒离心管混合10min后，在10000rpm转速下离心10min；重复此步骤直至取出的水相加入有机溶剂时无白色云雾状物；

五、取步骤四离心后的上清，加入等体积的氯仿/异戊醇，混合10min，在10000rpm转速下离心10min；

六、取上一步离心后的上清，加入2倍体积冻存后的无水乙醇，水平旋转50～100转后，在-20℃冰箱中放置30min以上，沉淀DNA；

七、将上一步放置于-20℃的离心管取出，在10000rpm转速下离心10min后，收集沉淀，得DNA；

八、向上一步得到的DNA中加入1mL体积百分含量为75％的乙醇，来回颠倒离心管，在8000rpm转速下离心4～5min，倒掉乙醇，将管倒置在干净的吸水纸上，干燥DNA沉淀；

九、向上一步干燥后的DNA中加入100～200μL灭菌的去离子水，在55℃水浴中溶解DNA；

十、然后用0.1％的凝胶进行电泳检测，-20℃冰箱中保存。

其它与具体实施方式二相同。

具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式二不同的是：步骤一种基因组DNA提取方法，具体操作步骤如下：

一、在无菌条件下刮取菌丝于1.5mL无菌离心管中，加入500μL含有溶菌酶的细胞悬浮液，使用移液器或涡旋振荡器悬浮细菌细胞沉淀，在37℃温浴30～60min，每隔5～10min颠倒混匀数次，然后在12000rpm离心2min，吸净上清；

二、向菌体沉淀中加入225μL缓冲液A，振荡至菌体彻底悬浮后，加入10μL蛋白酶K溶液，颠倒混匀；向管中加入25μL裂解缓冲液S，颠倒混匀；

三、加入250μL缓冲液B，振荡10s，70℃放置10～30min，12000rpm离心30s～1min，取上清液放入另一新离心管中，弃去沉淀；

四、加入250μL无水乙醇，充分振荡混匀15s，加入吸附柱中，12000rpm离心30s，倒掉废液；

五、向吸附柱中加入500μL缓冲液C，12000rpm离心30s，倒掉废液；

六、向吸附柱中加入700μL漂洗液，12000rpm离心30s，倒掉废液；

七、向吸附柱中加入500μL漂洗液，12000rpm离心30s，倒掉废液，然后12000rpm离心2min；

八、将上述吸附柱置于新的1.5mL离心管中，室温放置数分钟后，向吸附膜的中间滴加100μL的洗脱缓冲液，室温放置数分钟，12000rpm离心2min，将溶液收集到离心管中，-20℃冰箱中保存。

其它与具体实施方式二相同。

具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式二不同的是：PCR扩增产物进行序列测定时采用PCR产物直接测序或PCR产物回收后测序及克隆到载体后重组质粒测序。其它与具体实施方式二相同。

本发明内容不仅限于上述各实施方式的内容，其中一个或几个具体实施方式的组合同样也可以实现发明的目的。

通过以下实施例验证本发明有益效果：

实施例1

本实施例为验证本发明采用的通用引物和鉴定方法在马铃薯疮痂病菌种类鉴定中的准确性而设定的。

1、试验材料

本实施例所采用的马铃薯疮痂病菌株S.scabies(样品号CS1，CGMCC 4.1765)和S.acidiscabies(样品号CS2，CGMCC 4.1789)购置于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，菌株S.turgidiscabies(样品号CS3，ATCC 700248)购置于美国模式培养物集存库(ATCC)，菌株28-2(样品号CS4)为本课题组通过分离培养基对来自黑龙江省克山县的马铃薯疮痂病感病块茎进行分离纯化后获得，菌株B14(样品号CS5)为本课题组通过分离培养基对来自黑龙江省牡丹江市的马铃薯疮痂病感病块茎进行分离纯化后获得，置于-20℃冰箱保存备用。

2、试验方法

2.1 试验所用细菌的基因组DNA提取

菌株DNA提取方法参见具体实施方式五中基因组DNA提取方法的描述。

2.2 PCR通用引物的设计

根据Genebank中公布的Streptomyces scabiei strain NRRL F-3729、Streptomyces turgidiscabies strain NRRL B-24078和Streptomyces acidiscabiesstrain NRRL B-16524的部分gyrB基因序列，使用DNAMAN软件设计马铃薯疮痂病菌种类鉴定的通用扩增引物，引物由博仕生物公司合成，引物序列如下：

gyrBF2：5'-TCTGCACGGYGTSGGYGTCTC-3'

gyrBR2：5'-TTGCGGGAGTTGAGGTAC-3'。

目的片段长度为400bp。

2.3 PCR扩增

PCR的反应体系均为50μL。PCR反应条件确定主要是对扩增程序的最适退火温度。

2.3.1 PCR反应体系

2.3.2 PCR反应条件的优化

对PCR反应条件中退火温度进行优化：

2.3.3 PCR扩增产物测序与比对

取5μL扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，剩余PCR扩增产物送测序公司(华大基因公司等)进行测序。获得测序结果后，进行序列的Blast比对。最终确定病原菌种类。

2.4 gyrB基因鉴定与特异性引物鉴定结果一致性比较

以3种标准菌株(S.scabies、S.acidiscabies、S.turgidiscabies)、28-2和B14进行特异性引物鉴定，所使用的引物序列见表1。

表1 马铃薯疮痂病菌特异性鉴定引物

3、试验结果

3.1 gyrB基因PCR扩增

对马铃薯疮痂病菌种类鉴定通用引物的PCR反应条件进行优化，优化的条件为退火温度。结果表明：在50、55、57、60℃下，该通用引物均能够对供试菌株进行有效的PCR扩增，并获得目的片段，其中以57℃时扩增产物量最高，测序效果最佳。5个供试菌株S.scabies、S.acidiscabies、S.turgidiscabies、28-2和B14在57℃扩增效果见图1。

3.2 PCR扩增产物测序及序列比对

3.2.1 PCR扩增产物测序

将上述5个供试菌株的gyrB-PCR扩增产物直接送至华大基因有限公司进行测序，序列如序列表Seq ID No：1所示，Seq ID No：2所示，Seq ID No：3所示，Seq ID No：4所示，Seq ID No：5所示；

3.2.2 PCR扩增产物序列比对

将5个供试菌株的gyrB基因扩增产物经测序后获得的序列在NCBI的网站上进行Blast比对。比对结果见表2，结果显示3个标准菌株菌的鉴定结果准确率为100％。而CS4(菌株28-2)唯一与S.scabies的比对相似度达到100％；CS5(菌株B14)唯一与S.turgidiscabies的比对相似度达到100％。进而将CS4和CS5的扩增序列应用DNAMAN软件与NCBI公布的3个标准菌株的gyrB基因序列，利用最大似然法构建系统发育树(见图2)，其结果最终表明：CS4(菌株28-2)和CS5(菌株B14)在种类鉴定中分别是S.scabies和S.turgidiscabies。

表2 5个样品的gyrB基因序列比对结果

3.3 gyrB基因鉴定与特异性引物鉴定结果一致性比较

将CS4和CS5进行Streptomyces属内部分种类特异性引物PCR扩增鉴定，引物见表1，结果发现：CS4仅在引物ScabI/ScabII的扩增下有目的片段产生(见图3)，CS5仅在TurgI/TurgII的扩增下有目的片段产生(见图4)。

gyrB基因鉴定与特异性引物鉴定结果一致。然而，gyrB基因通用引物鉴定马铃薯疮痂病菌种类的方法，在实际操作中，可以避免特异性引物鉴定方法中的需要更换多对引物重复扩增的复杂性，减少了鉴定工作量，提高了鉴定的效率。同时，利用测序获得真实的序列，也可避免常规PCR扩增中出现的假阳性结果。

因此，本通用引物及鉴定方法与特异性引物鉴定法相比，具有鉴定效率高、工作量小、鉴定准确性高的优势。

实施例2

本实施例为验证专利权1中通用引物的在马铃薯常见的真菌病害(包括晚疫病、干腐病和黑痣病)和细菌病害(包括疮痂病、环腐病、黑胫病和青枯病)中的特异性。

1、试验材料

本实施例所采用的马铃薯疮痂病菌株如表3所示，菌株CS1～2、ECC、ECH和RS1购置于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，菌株CS3和ECA购置于美国模式培养物集存库(ATCC)，其余菌株均为本专利通过分离培养基对马铃薯感病植株或块茎进行分离纯化后，置于-20℃冰箱保存备用。

表3 样品来源

2、试验方法

2.1 试验所用细菌的基因组DNA提取

菌株DNA提取方法参见采用具体实施方式六中基因组DNA提取方法的描述。

2.2 PCR通用引物

马铃薯疮痂病菌种类鉴定的通用扩增引物，引物由博仕生物公司合成，引物序列如下：

gyrBF2：5'-TCTGCACGGYGTSGGYGTCTC-3'

gyrBR2：5'-TTGCGGGAGTTGAGGTAC-3'。

目的片段长度为400bp。

2.3 PCR扩增

PCR的反应体系均为50μL。

2.3.1 PCR反应体系

2.3.2 PCR反应条件

PCR反应条件中退火温度采用57℃。

2.3.3 PCR扩增产物电泳

3、试验结果

3.1 gyrB基因PCR扩增

以7类马铃薯病害19个供试的菌株DNA为模板，利用gyrB基因-通用引物进行常规PCR的扩增，电泳结果见图5。从图中可知，4个马铃薯疮痂病菌扩增出目的片段，扩增效果良好；而其余15个菌株或无扩增片段出现，或扩增出的非特异性片段，扩增量低。

3.2 PCR扩增产物测序

排除掉上述菌株中没有扩增片段出现的PCR产物后，剩余的送样进行测序。仅CS1～4的产物合格，能够进行正常测序。而其余供试菌株的PCR产物均因为扩增量太低，而未获得测序结果。

因此，本发明中的马铃薯疮痂病菌种类鉴定gyrB基因-通用引物在马铃薯常见的真菌和细菌病害中具有一定的特异性。

实施例3

本实施例为验证专利权1中gyrB基因通用引物与细菌鉴定常用的16s rRNA基因通用引物相比，具有分辨率高的优势，并可以用于鉴定马铃薯疮痂病的新致病菌种类。

1、试验材料

本实施例所采用的马铃薯疮痂病菌株(F1)为本专利通过分离培养基对来自黑龙江省绥化市的马铃薯疮痂病感病块茎进行分离纯化后获得，置于-20℃冰箱保存备用。

2、试验方法

2.1 试验所用细菌的基因组DNA提取

菌株DNA提取方法参见具体实施方式六中基因组DNA提取方法的描述。

2.2 种类鉴定通用引物

根据gyrB基因序列，使用DNAMAN软件设计马铃薯疮痂病菌种类鉴定的通用扩增引物，引物由博仕生物公司合成，引物序列如下：

gyrBF2：5'-TCTGCACGGYGTSGGYGTCTC-3'

gyrBR2：5'-TTGCGGGAGTTGAGGTAC-3'。目的片段长度为400bp。

根据已发表文献中，合成一对常用的马铃薯疮痂病菌16s rRNA基因通用引物，引物序列见表4。

表4 马铃薯疮痂病菌16s rRNA基因通用引物

2.3 PCR扩增

PCR的反应体系均为50μL。

2.3.1 gyrB基因-PCR反应体系及反应条件

反应体系如下：

反应条件如下：

2.3.2 16s rRNA基因-PCR反应体系及反应条件

反应体系如下：

反应条件如下：

2.3.3 PCR扩增产物测序与比对

3、试验结果

3.1 PCR扩增及测序

以菌株F1的DNA为模板，分别以gyrB基因通用引物和16s rRNA基因通用引物进行PCR扩增。扩增后的PCR产物直接送样进行测序。测序结果如序列表Seq ID No：6所示，序列表Seq ID No：7所示。

3.2 PCR扩增产物序列比对

以菌株F1的DNA为模板，分别以gyrB基因通用引物和16s rRNA基因通用引物进行PCR扩增后，将PCR产物进行测序。所获得的序列结果在NCBI网站上进行Blast比对，并利用网站内的系统发育树构建功能分别构建系统发育树(见图6和图7)，从图中可见16s rRNA基因通用引物鉴定亲缘关系近的物种时，分辨效果较差，分辨率低；而gyrB基因通用引物在鉴定近缘物种时，与16s rRNA基因相比分辨效果良好，分辨率较高。

序列表

<110> 黑龙江省农业科学院植物脱毒苗木研究所

<120>一种马铃薯疮痂病病原菌种类鉴定通用引物及检测方法

<160> 9

<210> 1

<211> 378

<212> DNA

<213>链霉菌属（S. acidiscabies）。

ggtacttcac gaagtcgacg atgccgccct cgtagtggta cgtgacggtc ttgacctcgt 60

ccttctcgtc cgcacccgcc tcgtccgccc cggccgtcgc cttcgccgac tcgcgctcgt 120

cggtgagctt gatggtcagg cccttgttga ggaacgccat ctcctggaag cgccgcgaga 180

gcgtctcgaa ggagtagacg gtcgtctcga agatgtccgg gtccgcccag aacgtcaccg 240

aggtgcccgt ctccgtgacg gcctcgtgct gtgccagcgg ggccgtcgga gcgccgagct 300

tgtagtcctg cgtccagcgg tggccgtcgg tgcggatctc gacggcgacc ttcgacgaca 360

gggcgttcac gaccgaga 378

<210> 2

<211> 378

<212> DNA

<213>链霉菌属（S. scabies）。

ggtacttcac gaagtcgacg atgccgccct cgtagtggta cgagacgctc ttgacctcgt 60

gcttctcgtc ctcgcccgcc tcgtccgccc cggccgtggc cttcgccgac tcgcgctcgt 120

cggcgaggtt gatccgcaga cccttgttga ggaacgccat ctcctggaaa cgccgcgaga 180

gcgtctcgaa ggagtactcc gtggtctcga agatgtccgg gtcggcccag aaggtgaccg 240

tggtgccgtg ctcgtccgtg gcctcgtgct gggcaagcgg ggccgtcggg acgcccaact 300

tgtagtcctg ggtccagcgg tggccgtcgg tcttgatctc gacggagacc ctggtcgaca 360

gggcgttcac gacggaga 378

<210> 3

<211> 376

<212> DNA

<213>链霉菌属（S. turgidiscabies）。

gtacgtcacg tagtcgacga tgccgccctc gtagtggtac gagacggtcc tgacctcgtc 60

cttctcgtcg gcgcccgcct cgtccgcgcc gatcgtggcc ttggccacct cacgctcgtc 120

cgtgaggttg atcgtcagac ccttgttgag gaacgccatc tcctggaagc gccgcgacag 180

cgtctcgaag gagtactcgg tggtctcgaa gatgtcaccg tcggcccaga aggtgaccga 240

cgtgccgtgc tccgtcgtcg cctcgtgctg ggccagcgga gccgtcggga cgcccagctt 300

gtagtcctgc gtccagcggt agccgtcggt cctgacctcc accgcgaccc tgctggacag 360

ggcgttcacg acggag 376

<210> 4

<211> 333

<212> DNA

<213>链霉菌属（菌株28-2）。

tctccgtcgt gaacgccctg tcgaccaggg tctccgtcga gatcaagacc gacggccacc 60

gctggaccca ggactacaag ttgggcgtcc cgacggcccc gcttgcccag cacgaggcca 120

cggacgagca cggcaccacg gtcaccttct gggccgaccc ggacatcttc gagaccacgg 180

agtactcctt cgagacgctc tcgcggcgtt tccaggagat ggcgttcctc aacaagggtc 240

tgcggatcaa cctcgccgac gagcgcgagt cggcgaaggc cacggccggg gcggacgagg 300

cgggcgagga cgagaagcac gaggtcaaga gcg 333

<210> 5

<211> 391

<212> DNA

<213>链霉菌属（菌株B14）。

tctccgtcgt gaacgccctg tccagcaggg tcgcggtgga ggtcaggacc gacggctacc 60

gctggacgca ggactacaag ctgggcgtcc cgacggctcc gctggcccag cacgaggcga 120

cgacggagca cggcacgtcg gtcaccttct gggccgacgg tgacatcttc gagaccaccg 180

agtactcctt cgagacgctg tcgcggcgct tccaggagat ggcgttcctc aacaagggtc 240

tgacgatcaa cctcacggac gagcgtgagg tggccaaggc cacgatcggc gcggacgagg 300

cgggcgccga cgagaaggac gaggtcagga ccgtctcgta ccactacgag ggcggcatcg 360

tcgactacgt gacgtacctc aactcccgca a 391

<210> 6

<211> 400

<212> DNA

<213>链霉菌属（菌株F1-gyrB基因）。

tctccgtcgt caacgccctg tccacgcgcg tctccgtcga ggtcaagacg gacggctacc 60

gctggaccca ggactacaag ctcggcgtcc cgaccgcccc gctggcccgt cacgaggcca 120

cggaggagac ggggaccagc gtcaccttct gggcggacgg cgacgtcttc gagaccaccg 180

actactcctt cgagacgctc tcgcggcgct tccaggagat ggcgttcctc aacaagggac 240

tcaccctcaa gctcaccgac gagcgtgagg aggcgaaggc cacggcgggc gccgacagcg 300

ccgaggtggt cgacgtcccc gacgaggagt cgacccgcac ggtcacgtac cactacgaga 360

acggcatcgt cgacttcgtc aagtacctca actcccgcaa 400

<210>7

<211> 1424

<212> DNA

<213>链霉菌属（菌株F1 16s rRNA基因）。

cgccagtccc accttcgaca gctccctccc acaaggggtt gggccaccgg cttcgggtgt 60

taccgacttt cgtgacgtga cgggcggtgt gtacaaggcc cgggaacgta ttcaccgcag 120

caatgctgat ctgcgattac tagcaactcc gacttcatgg ggtcgagttg cagaccccaa 180

tccgaactga gaccggcttt ttgagattcg ctccgcctcg cggcatcgca gctcattgta 240

ccggccattg tagcacgtgt gcagcccaag acataagggg catgatgact tgacgtcgtc 300

cccaccttcc tccgagttga ccccggcagt ctcctgtgag tccccatcac cccgaagggc 360

atgctggcaa cacagaacaa gggttgcgct cgttgcggga cttaacccaa catctcacga 420

cacgagctga cgacagccat gcaccacctg tataccgacc acaagggggg caccatctct 480

gatgctttcc ggtatatgtc aagccttggt aaggttcttc gcgttgcgtc gaattaagcc 540

acatgctccg ctgcttgtgc gggcccccgt caattccttt gagttttagc cttgcggccg 600

tactccccag gcggggaact taatgcgtta gctgcggcac cgacgacgtg gaatgtcgcc 660

aacacctagt tcccaacgtt tacggcgtgg actaccaggg tatctaatcc tgttcgctcc 720

ccacgctttc gctcctcagc gtcagtaatg gcccagagat ccgccttcgc caccggtgtt 780

cctcctgata tctgcgcatt tcaccgctac accaggaatt ccgatctccc ctaccacact 840

ctagctagcc cgtatcgaat gcagacccgg ggttaagccc cgggctttca catccgacgt 900

gacaagccgc ctacgagctc tttacgccca ataattccgg acaacgcttg cgccctacgt 960

attaccgcgg ctgctggcac gtagttagcc ggcgcttctt ctgcaggtac cgtcactttc 1020

gcttcttccc tgctgaaaga ggtttacaac ccgaaggccg tcatccctca cgcggcgtcg 1080

ctgcatcagg ctttcgccca ttgtgcaata ttccccactg ctgcctcccg taggagtctg 1120

ggccgtgtct cagtcccagt gtggccggtc gccctctcag gccggctacc cgtcgtcgcc 1180

ttggtaggcc attaccccac caacaagctg ataggccgcg ggctcatcct tcaccgccgg 1240

agcttttaac cccgtcccat gcgggacaga gtgttatccg gtattagacc ccgtttccag 1300

ggcttgtccc agagtgaagg gcagattgcc cacgtgttac tcacccgttc gccactaatc 1360

caccccgaag ggcttcatcg ttcgacttgc atgtgttaag cacgccgcca gcgttcgtcc 1420

tgag 1424

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223> 引物gyrBF2。

<400> 4

TCTGCACGGYGTSGGYGTCTC 21

<210> 9

<211> 18

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223> 引物gyrBR2。

<400> 4

TTGCGGGAGTTGAGGTAC 18

Claims

1.一种马铃薯疮痂病病原菌种类鉴定通用引物，其特征在于该引物对如下：

gyrBF2：5'-TCTGCACGGYGTSGGYGTCTC-3'

gyrBR2：5'-TTGCGGGAGTTGAGGTAC-3'。

2.一种鉴定马铃薯疮痂病菌种类的检测方法，其特征在于它是按照以下步骤进行的：

一、提取待检测样本的基因组DNA；

二、以权利要求1的引物作为鉴定引物，步骤一提取的DNA作为模板，进行PCR扩增反应；

三、PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳；

3.根据权利要求2所述的一种鉴定马铃薯疮痂病菌种类的检测方法，其特征在于PCR扩增的PCR体系如下：

4.根据权利要求2所述的一种鉴定马铃薯疮痂病菌种类的检测方法，其特征在于步骤一中提取基因组DNA，是从纯菌株或马铃薯块茎中提取。

5.根据权利要求2所述的一种鉴定马铃薯疮痂病菌种类的检测方法，其特征在于步骤一种基因组DNA提取方法，具体操作步骤如下：

十、然后用0.1％的凝胶进行电泳检测，-20℃冰箱中保存。

6.根据权利要求2所述的一种鉴定马铃薯疮痂病菌种类的检测方法，其特征在于PCR扩增产物进行序列测定时采用PCR产物直接测序或PCR产物回收后测序及克隆到载体后重组质粒测序。