CN108531639B - 一种用于检测可可球二孢的特异性引物及快速检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种快速检测引起多种植物病害的病原菌可可球二孢(Lasiodiplodia theobromae)的特异性引物，以及用于设计特异性引物的变异区间。根据GenBank中包括Lasiodiplodia theobromae在内的葡萄座腔菌科真菌和其它种类真菌的翻译延长因子基因(Transcription elongation factor,TEF)序列，发现了可用于设计L.theobromae特异性引物的变异区间，并基于该区间序列设计了特异性强的引物对ZYLTF1/ZYLTR1，该引物对仅可以从L.theobromae中特异扩增出一条216bp的条带，而不能从其它物种中扩增出任何条带。本发明还提供了所述引物对用于Lasiodiplodia theobromae的快速检测方法，具有特异性好、灵敏度高且经济快速等优点，此方法可快速、准确的检测出L.theobromae是否存在，能在植物病害早期防控中起到关键作用。

Description

一种用于检测可可球二孢的特异性引物及快速检测方法

技术领域

本发明涉及微生物检测技术领域，具体涉及一种用于检测可可球二孢的特异性引物及快速检测方法。

背景技术

可可球二孢(Lasiodiplodia theobromae)生长速度快，传播能力强，对环境适应性强，其在pH 4-9、温度10-37℃范围内均可生长。该病原菌寄主范围广，能造成龙眼、猕猴桃、芒果和板栗等果实腐烂，也能引起桉树枝干溃疡病、葡萄溃疡病、橡胶木蓝变、桃树流胶病和凤梨叶斑病等多种植物病害。

植物病害的快速识别是早期防治的关键。传统的植物病害诊断方法只能在植物显现病害症状后，分离纯化病原菌并对病原菌进行鉴定才能确定病原，无法做到病害未显症时得知病原菌的侵染并及时进行防治。同时，分离病原菌后需要对病原菌进行形态或者分子鉴定，以便明确病原菌的分类地位。缺点在于，病原菌形态学鉴定易受到人为因素和培养条件的干扰导致鉴定错误。虽然近年来，基于核糖体转录间隔区序列(ITS)、翻译延长因子序列(TEF)、微管蛋白序列(BT)和甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(GAPDH)等真核生物通用基因序列已被广泛应用于植物病原真菌的鉴定。然而，利用通用引物鉴定病原菌需要分离纯化病原菌，且PCR扩增结果需送样测序及序列比对，才可确定病原菌分类地位。以上两种病原菌分类方法耗时长，程序繁琐，且常导致病害的误诊和防治延误。所以，以病害症状为基础的病害常规诊断技术不能做到病害发生前检测，难以实施提前防治，不适合快速检测的要求。因此迫切需要构建一套灵敏度高，操作简便的快速检测技术，实现植物病害的早期诊断。

利用特异性引物检测病原菌仅通过PCR扩增是否产生目标条带即可判断是否有病原菌存在，具有简便快捷和准确的优点，已经广泛的应用于病害早期诊断。

发明内容

本发明目的在于提供一种用于检测可可球二孢的特异性引物及快速检测方法。该检测方法不需要巢式PCR反应体系，可直接用总DNA为模板进行一次PCR扩增就能判定有无Lasiodiplodia theobromae，方便性得以提高。是一种很有应用前景的病原菌早期快速检测和监测技术，可为L.theobromae引起的植物病害诊断提供有力的技术保障。

本发明采取的技术方案如下：

一种用于检测可可球二孢的特异性引物对，包括上游引物ZYLTF1和下游引物ZYLTR1，所述ZYLTF1和ZYLTR1的核苷酸序列分别为：

ZYLTF1：5'-acgcatgtcgttttttaa-3'，

ZYLTR1：5'-tacatgagtggtcagagcat-3'，

所述可可球二孢的拉丁名为Lasiodiplodia theobromae。

优选的，所述引物通过以下方式得到：利用一段翻译延长因子变异区间序列设计上游引物ZYLTF1，所述变异区间序列为：acgcatgtcgttttttaacccctctcga，并根据翻译延长因子其它碱基序列设计下游引物ZYLTR1。

优选的，所述引物ZYLTF1和ZYLTR1对可可球二孢特异性扩增出216bp的产物。

本发明还提供了一种可可球二孢快速检测方法，具体步骤为：以待测样品的DNA为模板，利用权利要求1所述的引物对进行PCR扩增，反应结束后对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，根据扩增产物的大小判定结果，如果能特异性地扩增出216bp的产物，即判定样品中存在可可球二孢。

优选的，所述待测样品为可可球二孢或者疑似感染了可可球二孢的植物组织。

优选的，引物扩增的反应体系为：10μmol/L上游引物和下游引物各1μL，2×TaqPCR Master Mix 12.5μL，模板DNA 1μL，无菌超纯水9.5μL；所述2×Taq PCR Master Mix包括0.05U/μL的Taq DNA聚合酶、10×Buffer、4mmol/L的Mg²⁺和0.4mmol/L的dNTPs。

优选的，扩增的反应程序为：

94℃预变性3min；94℃变性45s，58℃退火45s，72℃延伸1min；循环35次；72℃终延伸10min。

本发明所述的引物检测的靶序列为翻译延长因子基因(Transcriptionelongation factor，TEF)，其基因表达调控十分保守，基因的序列具有高度的进化保守性，可以作为物种间点的DNA条形码。通过本发明所述引物对进行检测，具有特异性好、灵敏度高、经济且耗时短等优点，可为由Lasiodiplodia theobromae引起的植物病害病害早期诊断起到重要的作用。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明所述的引物检测的靶序列为翻译延长因子基因(Transcriptionelongation factor,TEF)，其基因表达调控十分保守，基因的序列具有高度的进化保守性，可以作为物种间点的DNA条形码。

通过本发明所述引物对进行检测，具有特异性好、灵敏度高、经济且耗时短等优点，可为由Lasiodiplodia theobromae引起的植物病害病害早期诊断起到重要的作用。

附图说明

图1：特异性引物对ZYLTF1/ZYLTR1 PCR扩增不同来源的Lasiodiplodiatheobromae菌株DNA的电泳图；

图1中，泳道M：2000bp DNAmarker；泳道1-10分别为：来自芒果、芒果、龙眼、龙眼、猕猴桃、葡萄、樱桃、杨梅、番石榴、香蕉的Lasiodiplodia theobromae；

图2：特异性引物ZYLTF1/ZYLTR1 PCR扩增Lasiodiplodia theobromae和其它菌株DNA的电泳图；

图2中，泳道M：2000bp DNAmarker；泳道1：来自芒果的Lasiodiplodiatheobromae；泳道2：来自龙眼的L.theobromae；泳道3：来自番石榴的L.theobromae；泳道4：L.pseudotheobromae；泳道5：L.crassispora；泳道6：Neofusicoccum mangiferae；泳道7：N.parvum；泳道8：Botryosphaeria dothidea；泳道9：Colletotrichum scovillei；泳道10：Mortierella minutissima；泳道11：Penicillium urticae；泳道12：Acremoniumfurcatum；泳道13：Truncatella angustata；泳道14：Aspergillus sydowii；泳道15：Alternaria alternata；泳道16：Phyllosticta capitalensis；泳道17：Stemphyliumlycopersici；泳道18：Pestalotiopsis mangiferae；泳道19：Neurospora intermedia；泳道20：Daldinia eschscholtzii；泳道21：Trichoderma harzianum；泳道22：T.atrobrunneum；泳道23：Rhizopus stolonifer；泳道24：Fusarium oxysporum；

图3特异性引物对ZYLTF1/ZYLTR1PCR扩增Lasiodiplodia theobromae、被L.theobromae侵染和健康的植物组织DNA的电泳图；

图3中，泳道M：2000bp DNAmarker；泳道1：来自芒果的Lasiodiplodia theobromae菌株；泳道2：来自番石榴的L.theobromae菌株；泳道3：被L.theobromae侵染的芒果果实；泳道4：被L.theobromae侵染的番石榴果实；泳道5：被L.theobromae的芒果叶片；泳道6：被L.theobromae侵染的番石榴叶片；泳道7：健康芒果果实；泳道8：健康番石榴果实；泳道9：健康芒果叶片；泳道10：健康番石榴叶片。

具体实施方式

下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。

本发明实施例所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

本发明实施例所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、特异性引物设计

根据GenBank中包括Lasiodiplodia theobromae在内的葡萄座腔菌科真菌和其它种类真菌的翻译延长因子基因(Transcription elongation factor,TEF)序列，发现了可用于设计L.theobromae特异性引物的变异区间，该区间序列为acgcatgtcgttttttaacccctctcga(即SEQ ID NO:1)，利用该区间序列设计用于L.theobromae检测的上游引物ZYLTF1，并根据翻译延长因子其它碱基序列设计用于L.theobromae检测的下游引物ZYLTR1，其核苷酸序列为：

(SEQ ID NO:2)ZYLTF1：5'-acgcatgtcgttttttaa-3'；

(SEQ ID NO:3)ZYLTR1：5'-tacatgagtggtcagagcat-3'。

实施例2、一种快速检测植物病原真菌可可球二孢的分子检测方法

2.1参试菌株

分离自芒果的Lasiodiplodia theobromae(菌株LTMG1)、分离自芒果L.theobromae(菌株LTMG9)、分离自龙眼L.theobromae(菌株LTLY13)、分离自龙眼L.theobromae(菌株LTLY25)、分离自猕猴桃L.theobromae(菌株MHT5)、分离自葡萄L.theobromae(菌株LTPT2)、分离自樱桃L.theobromae(菌株LTYT42)、分离自杨梅L.theobromae(菌株LTYM6)、分离自番石榴L.theobromae(菌株LTFSL9)、分离自香蕉的L.theobromae(菌株LTXJ57)。

L.pseudotheobromae、L.crassispora、Neofusicoccum mangiferae、N.parvum、Botryosphaeria dothidea、Colletotrichum scovillei、Mortierella minutissima、Penicillium urticae、Acremonium furcatum、Truncatella angustata、Aspergillussydowii、Alternaria alternata、Phyllosticta capitalensis、Stemphyliumlycopersici、Pestalotiopsis mangiferae、Neurospora intermedia、Daldiniaeschscholtzii、Trichoderma harzianum、T.atrobrunneum、Rhizopus stolonifer、Fusarium oxysporum。

2.2样品制备及DNA的提取

2.2.1菌丝体的收集及其DNA的提取

用马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)活化参试菌株，在27℃恒温培养箱中暗培养9天，用灭菌刀片在菌落表面刮取菌丝体放入灭菌研钵，液氮冷冻研磨成菌丝粉，加到2mL离心管中，加入700μL 65℃预热的2×CTAB裂解缓冲液和3μLβ-巯基乙醇，轻柔混匀，65℃水浴30至45min，水浴时每15min混匀一次；将完成水浴的离心管取出放至室温后加入700μL的三氯甲烷和异戊醇混合液(24:1，V/V)，混匀10min；10000rpm离心10min，取500μL上清液移至另一无菌的2mL离心管中，加入500μL的三氯甲烷和异戊醇混合液(24:1，V/V)重复抽提一次，取300μL上清液移至无菌的1.5mL离心管中，加入600μL提前预冷的异丙醇，颠倒混匀10min；10000rpm离心15min，弃上清液，加入95％的乙醇浸洗沉淀3min；10000rpm离心5min，弃上清液，加入75％的乙醇浸洗沉淀5min；10000rpm离心5min，弃上清液，将离心管置于超净工作台中吹干去除乙醇后，加入80μL无菌双蒸水，溶解DNA，待DNA完全溶解后，检测DNA浓度并于-20℃保存备用。

2.2.2感病和健康植物样品的制备及DNA的提取

称取1g被Lasiodiplodia theobromae侵染的植物组织(叶片、果实)，以及未被L.theobromae侵染的健康植物组织(叶片、果实)分别放入灭菌研钵，液氮冷冻研磨成粉。将粉末放入5mL离心管中，加入1.5mL 65℃预热的2×CTAB裂解缓冲液和6μL β-巯基乙醇，混匀，65℃水浴45min，水浴时每15min混匀一次；将完成水浴的离心管取出放至室温后加入1.5mL的三氯甲烷和异戊醇混合液(24:1，V/V)，混匀10min；10000rpm离心10min，取1mL上清液移至另一无菌的2mL离心管中，加入1mL的三氯甲烷和异戊醇混合液(24:1，V/V)，混匀10min；10000rpm离心10min，取700μL上清液移至无菌的1.5mL离心管中，加入700μL提前预冷的异丙醇，上下颠倒混匀10min；10000rpm离心10min，弃上清液，加入95％的乙醇浸洗沉淀3min；10000rpm离心5min，弃上清液，加入75％的乙醇浸洗沉淀5min；10000rpm离心5min，弃上清液，加入75％的乙醇浸洗沉淀5min；10000rpm离心5min，弃上清液，将离心管置于超净工作台中吹干去除乙醇后，加入80μL无菌双蒸水，溶解DNA，待DNA完全溶解后，检测DNA浓度并于-20℃保存备用。

2.3引物设计与PCR扩增

分别以步骤2.2提取的DNA为模板，利用实施例1的特异性引物进行PCR扩增，PCR反应总体积为25μL，包括：1μL正向引物(ZYLTF1 10μmol/L)，1μL反向引物(ZYLTR1 10μmol/L)，2×Taq PCR Master Mix 12.5μL(包括0.05U/μL的Taq DNA聚合酶、10×Buffer、4mmol/L的Mg²⁺、0.4mmol/L的dNTPs)，1μL模板DNA，无菌超纯水9.5μL。PCR扩增程序为：94℃预变性3min；94℃变性45s，58℃退火45s，72℃延伸1min，共35个循环；最后72℃延伸10min。

2.4分析方法

PCR反应结束后取5μL扩增产物于1.0％琼脂糖凝胶中电泳40min(100V)分析，在凝胶成像系统上观察并拍照。将可可球二孢(Lasiodiplodia theobromae)的DNA和被L.theobromae侵染的植物果实及叶片的DNA视为阳性模板，而其它种属真菌的DNA和健康植物果实及叶片的DNA视为阴性模板。

若阳性模板均出现条带而所有阴性模板均没有出现条带，则可判定引物特异性强；若阳性模板和阴性模板均出现条带，则判定引物没有特异性。

2.5结果

2.5.1引物对ZYLTF1/ZYLTR1的特异性PCR扩增

如图1、图2所示，特异性引物对ZYLTF1/ZYLTR1只能从供试的来源于8种植物的Lasiodiplodia theobromae菌株中特异地扩增出一条216bp的条带，而其它菌株及空白对照中均未扩增到任何条带，表明该引物具有极高的特异性。

2.5.2发病植株组织中病原物的快速检测

图3结果显示，Lasiodiplodia theobromae菌丝体DNA，以及被L.theobromae侵染的芒果和番石榴的果实及叶片的DNA均能扩增出216bp大小的条带，而健康芒果和番石榴的果实及叶片的DNA未能扩增出任何条带，表明该引物具有极高的特异性，并且能检测到在植物组织中的L.theobromae。

以上内容是结合具体的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换。

序列表

<110> 中国热带农业科学院环境与植物保护研究所

<120> 一种用于检测可可球二孢的特异性引物及快速检测方法

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 28

<212> DNA/RNA

<213> 可可球二孢(Lasiodiplodia theobromae)

<400> 1

acgcatgtcg ttttttaacc cctctcga 28

<210> 2

<211> 18

<212> DNA/RNA

<213> 可可球二孢(Lasiodiplodia theobromae)

<400> 2

acgcatgtcg ttttttaa 18

<210> 3

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> 可可球二孢(Lasiodiplodia theobromae)

<400> 3

tacatgagtg gtcagagcat 20

Claims (6)

1.一种用于检测可可球二孢的特异性引物对，其特征在于，包括上游引物ZYLTF1和下游引物ZYLTR1，所述ZYLTF1和ZYLTR1的核苷酸序列分别为：

ZYLTF1：5'-acgcatgtcgttttttaa-3'，

ZYLTR1：5'-tacatgagtggtcagagcat-3'，

所述可可球二孢的拉丁名为Lasiodiplodia theobromae；

所述引物通过以下方式得到：利用一段翻译延长因子序列的变异区间序列设计上游引物ZYLTF1，所述变异区间序列为：acgcatgtcgttttttaacccctctcga，并根据翻译延长因子其它碱基序列设计下游引物ZYLTR1。

2.根据权利要求1所述的一种用于检测可可球二孢的特异性引物对，其特征在于，所述引物ZYLTF1和ZYLTR1对可可球二孢特异性扩增出216bp的产物。

3.一种可可球二孢快速检测方法，其特征在于，以待测样品的DNA为模板，利用权利要求1所述的引物对进行PCR扩增，反应结束后对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，根据扩增产物的大小判定结果，如果能特异性地扩增出216bp的产物，即判定样品中存在可可球二孢。

4.根据权利要求3所述的一种可可球二孢快速检测方法，其特征在于，所述待测样品为可可球二孢或者疑似感染了可可球二孢的植物组织。

5.根据权利要求3所述的一种可可球二孢快速检测方法，其特征在于，引物扩增的反应体系为：10μmol/L上游引物和下游引物各1μL，2×Taq PCR Master Mix 12.5μL，模板DNA 1μL，无菌超纯水9.5μL；所述2×Taq PCR Master Mix包括0.05U/μL的Taq DNA聚合酶、10×Buffer、4mmol/L的Mg²⁺和0.4mmol/L的dNTPs。

6.根据权利要求3所述的一种可可球二孢快速检测方法，其特征在于，扩增的反应程序为：

94℃预变性3min；94℃变性45s，58℃退火45s，72℃延伸1min；循环35次；72℃终延伸10min。