CN116004863A - 一种用于检测鉴定水稻白叶枯病菌的引物对及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于检测鉴定水稻白叶枯病菌(Xanthomonasoryzae pv.oryzae，Xoo)的靶标，所述的靶标为如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。本发明还公开了一种用于检测鉴定水稻白叶枯病菌的引物对，包括正向引物5’‑CCTTCTGCAATCTATGGCACC‑3’和反向引物5’‑TAAATAACACGGTGAAGCCGAC‑3’。所述引物对用于PCR能且只能从包含Xoo DNA的样品中扩增出138bp的核酸片段，具有检测鉴定Xoo的特异性和通用性，实现准确检测鉴定Xoo。所述引物对适用于实时荧光定量PCR，检测灵敏度达到2.7×102fg/μL。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种用于检测鉴定水稻白叶枯病菌的引物对及其应用。
背景技术
白叶枯病和条斑病是水稻最重要的细菌性病害。水稻白叶枯病菌(Xanthomonasoryzae pv.oryzae,Xoo)和水稻条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola,Xoc)属于同种下的两个致病变种。Xoo和Xoc可通过种子传播，是我国进境植物检疫性有害生物。用可靠的方法鉴别Xoo和Xoc，对于准确检疫两种病原菌和预警防控两种病害至关重要。
系统发育分析已揭示稻黄单胞菌(Xanthomonas oryzae，Xo)分成5个系统发育群：Xoo亚洲系(XooAsia)、Xoo非洲系(XooAfrica)、Xo美国系(XoUS)、Xoc和李氏禾变种(Xanthomonas oryzae pv.leersiae,Xol)。即Xo并非只有Xoo和Xoc两个致病变种，还有XoUS和Xol，而XoUS和Xol对水稻的致病力较弱；而且，Xoo致病变种包含两个系统发育群XooAsia和XooAfrica，其间基因组相似度的差异接近于细菌亚种间的差异。
检测Xoo和Xoc最常用的方法是PCR方法，已有常规PCR、双重PCR、多重PCR、实时荧光定量PCR(qPCR)和数字PCR(dPCR)等多种PCR方法用于检测鉴别Xoo和Xoc。用PCR方法专一检测鉴别Xoo和Xoc的关键是使用针对Xoo或Xoc专一特异的引物。
基于对Xo菌株分化成5个系统发育群的认识，利用目前在NCBI数据库中存储的丰富的Xanthomonas属细菌的全基因组序列，经BLAST检索，发现现有技术中鉴别Xoo和Xoc的特异引物存在两类问题。一是引物特异性不够强，引物序列和被扩增的目标序列在非目标菌株的全基因组序列中有高度一致的目标序列，能导致非特异扩增。如常用的检测鉴定Xoo的引物对Xoo80F/Xoo80R(Lang等.Genomics-Based Diagnostic Marker Development forXanthomonas oryzae pv.oryzae and X.oryzae pv.oryzicola[J].Plant Disease,2010,94(3).311-319)，不仅匹配XooAsia、XooAfrica和XoUS菌株基因组中的目标序列，还能与一些Xanthomonas citri菌株，甚至Pseudomonas syringae菌株基因组中的序列高度匹配，能导致PCR非特异扩增，出现假阳性。又如用于检测鉴定Xoc的引物对Xoc2071F/Xoc2071R，不仅与Xoc菌株基因组中的目标序列匹配，还与Xol菌株基因组中的序列高度匹配。二是引物通用性不足，如检测鉴定Xoo的引物对Xoo-Hpa1F/Xoo-Hpa1R(冯雯杰等,水稻白叶枯病菌和细菌性条斑病菌的分子标记筛选及检测[J].植物病理学报,2013,43(6):581-589)与XooAsia菌株基因组中目标序列完全匹配，但其中Xoo-Hpa1F与XooAfrica菌株基因组中目标序列差5个碱基。检测发现，用引物对Xoo-Hpa1F/Xoo-Hpa1R只能扩增出XooAsia菌株的目标序列，不能扩增出XooAfrica菌株的目标序列，出现假阴性。
发明内容
本发明针对现有技术中用于PCR检测鉴定Xoo引物的特异性不强或通用性不高，检测会出现假阳性或假阴性的问题，提供了一种特异性的、能够准确检测鉴定Xoo的引物对及其应用。
具体采用的技术方案如下：
本发明利用NCBI数据库中存储的丰富的Xanthomonas属细菌的全基因组序列，挖掘现有技术中没有被关注的Xo的假基因，发现Xoo特有的假基因，针对Xoo假基因的特异保守区序列设计引物，在NCBI数据库中BLAST检索，评估引物的通用性和特异性。选择通用性和特异性强的引物，对Xoo和近缘变种Xoc及Xanthomonas其他种菌株进行PCR，检验引物的通用性和特异性，确定Xoo特异的通用引物。
本发明提供了一种用于检测鉴定水稻白叶枯病菌的靶标，所述的靶标为如SEQ IDNo.1所示的核苷酸序列。
本发明还提供了所述的靶标在检测鉴定水稻白叶枯病菌中的应用。
本发明提供了一种用于检测鉴定水稻白叶枯病菌的引物对，引物所针对的靶标是Xoo全基因组序列中的一个假基因，对于XooAfrica菌株BAI3是全基因组序列(GenBank登录号：CP025610.1)中的C0L90_22090位点，对应真基因编码的是双组分传感器组氨酸激酶(two-component sensor histidine kinase,SHK)。其中，所述的引物对包括正向引物XooSHK2F和反向引物XooSHK2R，正向引物XooSHK2F(5’-CCTTCTGCAATCTATGGCACC-3’)，有21个核苷酸，对应Xoo SHK假基因序列的107-127位；反向引物XooSHK2R(5’-TAAATAACACGGTGAAGCCGAC-3’)，有22个核苷酸，对应Xoo SHK假基因序列的223-244位。PCR扩增出核酸片段的长度为138bp，且仅能从Xoo扩增出138bp的核酸片段。
本发明还提供了所述的引物对在检测鉴定水稻白叶枯病菌中的应用。
本发明还提供了所述的引物对在制备检测鉴定水稻白叶枯病菌的试剂盒中的应用。
本发明提供了一种检测鉴定水稻白叶枯病菌的方法，包括以下步骤：以待测样品的DNA作为扩增模板，利用所述的引物对进行PCR扩增；若能够扩增得到138bp的基因片段，说明待测样品中含有水稻白叶枯病菌，否则，待测样品中不含有水稻白叶枯病菌。
具体的，以每25μL计，上述常规PCR扩增反应体系为：10～50ng/μL的DNA模板1μL，10μM的正向引物1μL，10μM的反向引物1μL，2×Taq PCR Mix 12.5μL，无菌超纯水补足；扩增反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸15s，35个循环；72℃延伸5min。
本发明还提供了一种检测鉴定水稻白叶枯病菌的方法，包括以下步骤：以待测样品的DNA作为扩增模板，利用所述的引物对进行实时荧光定量PCR；若扩增阳性，说明待测样品中含有水稻白叶枯病菌，否则，待测样品中不含有水稻白叶枯病菌。
具体的，以每20μL计，实时荧光定量PCR扩增反应体系为：10～50ng/μL的DNA模板1μL，10μM的正向引物0.5μL，10μM的反向引物0.5μL，2×SYBR Green Mix 10μL，无菌超纯水补足；扩增反应条件为：95℃预变性30s；95℃变性10s，60℃退火30s，40个循环。
上述两种检测鉴定水稻白叶枯病菌的方法中，扩增模板采用细菌、提取的细菌DNA或含有细菌/细菌DNA的粗提液。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
(1)本发明提供了用于检测鉴定水稻白叶枯病菌的靶标，所述靶标为如SEQ IDNo.1所示的核苷酸序列。
(2)本发明优选正向引物XooSHK2F和反向引物XooSHK2R进行PCR扩增，能且只能从包含Xoo DNA的样品中扩增出138bp的核酸片段，具有检测鉴定Xoo的特异性和通用性，该引物对能够实现准确检测鉴定Xoo；此外，PCR扩增出核酸片段的长度为138bp，扩增过程中不产生引物二聚体，适用于qPCR检测，比用常规PCR检测更灵敏，检出限可达2.7×102fg/μL。
(3)本发明方法特异性强、通用性好，检测灵敏度高，对于预警Xoo引发的水稻白叶枯病有重要价值。
附图说明
图1为以多种菌体DNA为模板进行PCR检测的电泳结果图。
图2为以10倍梯度稀释的Xoo PXO99A基因组DNA为模板，进行PCR检测的电泳结果图。
图3为以10倍梯度稀释的Xoo PXO99A基因组DNA为模板进行实时荧光定量PCR的扩增曲线图和溶解峰图，其中，A为扩增曲线图，B为溶解峰图；标记1-6指示DNA浓度分别为2.7×106fg/μL、2.7×105fg/μL、2.7×104fg/μL、2.7×103fg/μL、2.7×102fg/μL和2.7×10fg/μL，7指示无菌超纯水。
具体实施方式
下面结合附图与实施例，进一步阐明本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不用于限制本发明的范围。
在NCBI数据库中细菌全基因组序列中被注释的假基因在全基因组序列的gbk文件中有“/pseudo”标志。将XooAfrica菌株BAI3完整全基因组序列(GenBank登录号：CP025610.1)中所有假基因及其核酸序列整理成表，用假基因对应真基因编码产物作为假基因的名称。将所有假基因序列逐一在NCBI数据库中进行BLASTN检索，选出Xoo特有的假基因，确定候选靶标。
实施例1
设计针对Xoo假基因的通用特异引物
用NCBI中的primer-BLAST设计Xoo的特异引物，扩增产物大小设计为100～300bp，可同时用于常规PCR、qPCR和dPCR检测，并通过BLASTN评估引物对Xoo的特异性。以引物扩增的目标序列为Query在NCBI数据库中进行BLASTN检索，将检索出的同源序列和引物序列用MEGA5软件中的MUSCLE程序整列，用BioEdit软件查看比较引物序列与目标序列的一致性。
评估引物对Xoo的通用性和特异性的方法为：将设计出的引物在NCBI核酸序列数据库中BLAST，针对Xoo的通用特异引物显示与Xoo SHK假基因序列的coverage为100％，identity为100％，而E value与Xoc、Xanthomonas属其他种菌株序列的E value比，至少低一个量级。
按照上述方法，筛选得到最优正向引物XooSHK2F(5’-CCTTCTGCAATCTATGGCACC-3’)和反向引物XooSHK2R(5’-TAAATAACACGGTGAAGCCGAC-3’)，针对的靶标核苷酸序列如SEQID No.1所示。
实施例2
建立水稻白叶枯病菌分子检测方法
(1)制备引物：用全自动DNA合成仪合成引物核苷酸序列，用ULTRAPAGE方法纯化得到白色结晶，用Tris-EDTA缓冲液(pH 8.0)或超纯水稀释到10μM，分装到0.5-mL离心管内，在-20℃保存。
(2)制备模板：选择8个XooAsia菌株和1个XooAfrica菌株BAI3、11个Xoc菌株、7个Xanthomonas属其他种菌株和4个其他属的水稻病原细菌菌株(表1)在固体丰富培养基上培养细菌，挑取测试菌株长成的单菌落，用10μL无菌纯水悬浮菌体，取1μL菌悬液作为PCR反应的模板。或在液体丰富培养基中培养细菌，从菌体中提取细菌基因组DNA，用紫外分光光度计检测DNA在260nm和280nm处的吸收值，评价所提取DNA的质量，计算DNA的浓度，储存在-20℃备用。
表1用于PCR检测的细菌菌株
| 菌株 | 分离地所在国家 |
| Xanthomonas oryzae pv.oryzae PXO99A | 菲律宾 |
| Xanthomonas oryzae pv.oryzae PXO86 | 菲律宾 |
| Xanthomonas oryzae pv.oryzae ScYc-b | 中国 |
| Xanthomonas oryzae pv.oryzae YN11 | 中国 |
| Xanthomonas oryzae pv.oryzae FuJ | 中国 |
| Xanthomonas oryzae pv.oryzae OS198 | 中国 |
| Xanthomonas oryzae pv.oryzae GD414 | 中国 |
| Xanthomonas oryzae pv.oryzae HEN11 | 中国 |
| Xanthomonas oryzae pv.oryzae BAI3 | 布基纳法索 |
| Xanthomonas oryzae pv.oryzicola BLS256 | 菲律宾 |
| Xanthomonas oryzae pv.oryzicola RS105 | 中国 |
| Xanthomonas oryzae pv.oryzicola FZ05 | 中国 |
| Xanthomonas oryzae pv.oryzicola ACCC 05509 | 中国 |
| Xanthomonas oryzae pv.oryzicola oxy02 | 中国 |
| Xanthomonas oryzae pv.oryzicola oxy04 | 中国 |
| Xanthomonas oryzae pv.oryzicola oxy05 | 中国 |
| Xanthomonas oryzae pv.oryzicola JS | 中国 |
| Xanthomonas oryzae pv.oryzicola AH | 中国 |
| Xanthomonas oryzae pv.oryzicola GX | 中国 |
| Xanthomonas oryzae pv.oryzicola YN | 中国 |
| Xanthomonas campestris CGMCC 1.3408 | 英国 |
| Xanthomonas citri Xac29-1 | 中国 |
| Xanthomonas hortorum ATCC 19865 | 前南斯拉夫 |
| Xanthomonas albilineans FJ1 | 中国 |
| Xanthomonas axonopodis CCTCC AB 2018263 | 中国 |
| Xanthomonas sacchari ACCC 10416 | 中国 |
| Xanthomonas sontii XQ1 | 中国 |
| Burkholderia glumae Os48 | 中国 |
| Acidovorax oryzae CGMCC 1.1728 | 日本 |
| Dickeya oryzae ACCC 61554 | 中国 |
| Pantoea ananatis F163 | 中国 |
(3)常规PCR扩增：以25μL反应液总体积为例，扩增反应体系组成为1μL DNA模板(10～50ng/μL)、1μL正向引物(10μM)、1μL反向引物(10μM)、12.5μL 2×Taq PCR Mix、9.5μL无菌超纯水。扩增程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸15s，35个循环；72℃延伸5min。取5μL扩增后反应液，在1.5％(w/v)的琼脂糖凝胶中和0.5×TBE缓冲液(pH 8.3)中电泳，用凝胶成像仪观察PCR产物。
(4)qPCR扩增：以20μL反应液总体积为例，扩增反应体系组成为1μL DNA模板(10～50ng/μL)、0.5μL正向引物(10μM)、0.5μL反向引物(10μM)、10μL 2×SYBR Green Mix、8.0μL无菌超纯水。扩增程序为：95℃预变性30s；95℃变性10s，60℃退火30s，进行40个循环。
实施例3
引物对用于PCR检测水稻白叶枯病菌的特异性
提取上述9个Xoo菌株、11个Xoc菌株、7个Xanthomonas属其他种菌株以及4个其他属的水稻病原细菌菌株的基因组DNA，各取1μLDNA溶液为模板，用引物XooSHK2F和XooSHK2R，在25μL反应体系中，以实施例2中常规PCR的扩增体系及程序进行PCR，用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，结果如图1所示。
显示从所有XooAsia和XooAfrica菌株基因组DNA中扩增出了138bp的目标片段，而从其他细菌基因组DNA中没有扩增出138bp核酸片段，说明引物XooSHK2F和XooSHK2R具有检测鉴定Xoo的特异性。
实施例4
引物对用于PCR检测水稻白叶枯病菌的灵敏度
将浓度为27ng/μL的Xoo PXO99A基因组DNA以10倍系列稀释8个稀释度，各取1μLDNA溶液为模板，用引物XooSHK2F和XooSHK2R，用上海翊圣生物科技有限公司生产的2×Hieff PCR Master Mix，在25μL反应体系中，以实施例2中常规PCR的扩增体系及程序进行PCR，用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，结果如图2所示，显示可检测DNA的最低浓度为2.7×104fg/μL。
实施例5
引物对用于qPCR检测水稻白叶枯病菌的灵敏度
将浓度为27ng/μL的Xoo PXO99A基因组DNA以10倍系列稀释8个稀释度，各取1μLDNA溶液为模板，用引物XooSHK2F和XooSHK2R，用南京诺唯赞生物科技股份有限公司生产的2×ChamQ SYBR Master Mix，在20μL反应体系中，以实施例2中qPCR的扩增体系及程序，用Bio-Rad CFX-96实时荧光定量PCR仪进行PCR，结果如图3中的A所示，显示扩增阳性的最低DNA浓度为2.7×102fg/μL，比常规PCR检测DNA的灵敏度(2.7×104fg/μL)高100倍。且扩增结果的溶解曲线有且只有一个峰(图3中的B)，表明扩增产物单一，没有非特异性产物出现，表明qPCR扩增的特异性高。
以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述的仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种用于检测鉴定水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.
oryzae)的靶标，其特征在于，所述的靶标为如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。
2.如权利要求1所述的靶标在检测鉴定水稻白叶枯病菌中的应用。
3.一种用于检测鉴定水稻白叶枯病菌的引物对，用于扩增权利要求1所述的靶标，其特征在于，所述的引物对包括正向引物XooSHK2F和反向引物XooSHK2R，其核苷酸序列分别为：
正向引物XooSHK2F：5’-CCTTCTGCAATCTATGGCACC-3’；
反向引物XooSHK2R：5’-TAAATAACACGGTGAAGCCGAC-3’。
4.如权利要求3所述的引物对在检测鉴定水稻白叶枯病菌中的应用。
5.如权利要求3所述的引物对在制备检测鉴定水稻白叶枯病菌的试剂盒中的应用。
6.一种检测鉴定水稻白叶枯病菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：以待测样品的DNA作为扩增模板，利用权利要求3所述的引物对进行PCR扩增；若能够扩增得到138bp的基因片段，说明待测样品中含有水稻白叶枯病菌，否则，待测样品中不含有水稻白叶枯病菌。
7.如权利要求6所述的检测鉴定水稻白叶枯病菌的方法，其特征在于，以每25μL计，PCR扩增反应体系为：10～50ng/μL的DNA模板1μL，10μM的正向引物1μL，10μM的反向引物1μL，2×Taq PCR Mix 12.5μL，无菌超纯水补足；扩增反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸15s，35个循环；72℃延伸5min。
8.一种检测鉴定水稻白叶枯病菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：以待测样品的DNA作为扩增模板，利用权利要求3所述的引物对进行实时荧光定量PCR；若扩增阳性，说明待测样品中含有水稻白叶枯病菌，否则，待测样品中不含有水稻白叶枯病菌。
9.如权利要求8所述的检测鉴定水稻白叶枯病菌的方法，其特征在于，以每20μL计，实时荧光定量PCR扩增反应体系为：10～50ng/μL的DNA模板1μL，10μM的正向引物0.5μL，10μM的反向引物0.5μL，2×SYBR Green Mix 10μL，无菌超纯水补足；扩增反应条件为：95℃预变性30s；95℃变性10s，60℃退火30s，40个循环。
10.如权利要求6或8所述的检测鉴定水稻白叶枯病菌的方法，其特征在于，扩增模板采用细菌、提取的细菌DNA或含有细菌/细菌DNA的粗提液。
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|---|---|---|---|---|
| CN116656850A (zh) * | 2023-07-27 | 2023-08-29 | 中国热带农业科学院三亚研究院 | 基于CRISPR/Cas12a-RPA快速检测水稻白叶枯病菌的序列组合及其应用 |
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