CN103710440B - 大豆南方茎溃疡病菌的检测靶标及其lamp引物组合物和应用 - Google Patents

大豆南方茎溃疡病菌的检测靶标及其lamp引物组合物和应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于基因工程领域，公开了大豆南方茎溃疡病菌的检测靶标及其特异性LAMP引物组合物和应用。大豆南方茎溃疡病菌的检测靶标序列Tef-α，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，该靶标序列特异性的LAMP引物组合物，正向内引物FIP如SEQ ID NO.2所示，反向内引物BIP如SEQ ID NO.3所示，正向外引物F3如SEQ ID NO.4所示，反向外引物B3如SEQ ID NO.5所示。本发明的检测体系在LAMP扩增条件下，能快速、高效、高特异、高灵敏地检测到大豆南方茎溃疡病菌，用于田间检疫、进出口检疫等的现场检测，易于大范围推广应用。

Description

大豆南方茎溃疡病菌的检测靶标及其LAMP引物组合物和应用
技术领域
本发明属于基因工程领域，涉及大豆拟茎点种腐病菌的检测靶标及其PCR引物组合物和应用。
背景技术
大豆南方茎溃疡[Diaporthephaseolorum(Cke.&Ell.)Sacc.var.meridionalis Morgan-Jones(简称DPM)]是我国重点关注的大豆上13种检疫性病原菌之一[1]。该病害于1973年在美国首次报道，20世纪80年代在美国广泛传播，已遍及美国南部各省，某地区损失高达100%，目前分布在巴西、玻利维亚、巴拉圭、美国和阿根廷，并且疫区还在不断扩大，是国外大豆生产上重要病害，经济影响很大[2,3]。
目前，我国尚没有DPM发生危害的报道。该病菌可通过种子和病残体远距离传播，并且抗逆性很强，病残体在-15℃～-18℃下可存活14个月。中国大豆产区具有和疫区类似的气候条件，一旦传入我国大豆产区，将对我国的大豆生产产生严重影响。
因其近年来在国外发生普遍、经济影响大、传入风险高且在我国尚未有发生的报道。为了阻止大豆南方茎溃疡病菌传播范围的不断扩大，使大豆南方茎溃疡得到控制，需要对其进行快速、准确地检测。
环介导等温扩增法（loop-mediated isothermal amplification，LAMP），是有日本的荣研株式会社的Notomi等人于2000年开发的一种新型的核酸扩增方法[4]，其特点是针对靶基因的6个区域设计4条特异性引物，在链置换DNA酶（Bst DNA polymerase）的作用下，60～65℃恒温扩增，15～60min即可观察结果，效率可达109～1010个数量级，具有操作简单、特异性强、产物易检测等特点。在DNA合成时，从脱氧核酸三磷酸基质（dNTPs）中析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的镁离子反应，产生大量焦磷酸镁沉淀，呈现白色。因此，可以把浑浊度作为反应的指标，只用肉眼观察白色浑浊沉淀，就能鉴定扩增与否，而不需要繁琐的电泳和紫外观察。由于LAMP反应不需要PCR仪和昂贵的试剂，反应产物可通过是否形成白色沉淀（浑浊）或SYBR GREEN Ⅰ染色后的颜色变化来判断是否反应。随着技术的不断完善和发展，会在食品检测临床疾病诊断等领域有着广泛的应用前景[5,6]。
发明内容
本发明的目的在于提供一种大豆南方茎溃疡病菌的检测靶标序列Tef1-α。
本发明的另一目的是提供该大豆南方茎溃疡病菌的检测靶标序列Tef1-α的其特异性LAMP引物组合物。
本发明的又一目的是提供该大豆南方茎溃疡病菌的检测靶标序列Tef1-α及其特异性LAMP引物组合物的应用。
本发明的目的可通过如下技术方案实现：
大豆南方茎溃疡病菌的检测靶标序列Tef1-α，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
所述的大豆南方茎溃疡病菌的检测靶标序列Tef1在检测或鉴定大豆南方茎溃疡病菌中的应用。
针对所述的大豆南方茎溃疡病菌的检测靶标序列Tef设计的特异性LAMP引物组合物，其特征在于包括正向内引物FIP如SEQ ID NO.2所示，反向内引物BIP如SEQ ID NO.3所示，正向外引物F3如SEQ ID NO.4所示，反向外引物B3如SEQ ID NO.5所示。
所述的针对所述的大豆南方茎溃疡病菌的检测靶标序列Tef1-α设计的特异性LAMP引物组合物在检测或鉴定大豆南方茎溃疡病菌中的应用。
一种用于检测大大豆南方茎溃疡病菌的LAMP检测试剂盒，包含所述的特异性的LAMP引物组合物。
所述的用于检测大豆南方茎溃疡病菌的LAMP检测试剂盒，包含：由20mM正向内引物FIP、20mM反向内引物BIP，10mM正向外引物F3、10mM反向外引物B3，10%10xThermoPolReaction Buffer、50mM MgSO4、10mMdNTP Mixture、5M甜菜碱、8000U/mLBst DNA PolymeraseLarge fragment及超纯水组成的检测溶液。
一种检测大豆南方茎溃疡病菌的方法，提取待检微生物的DNA，以提取的DNA为模板，利用所述的特异性的LAMP引物组合物进行LAMP反应；扩增产物加入SYBR GREENⅠ染料，在常光和/或紫外光下检测结果，如果反应产物在常光下变显黄色、在紫外光下产生强烈荧光，则表示存在大豆南方茎溃疡病菌，在常光下显橙色、紫外光下无荧光产生则表示不含该病菌。
所述的检测大豆南方茎溃疡病菌的方法优选提取待检微生物的DNA，取3μlDNA溶液，加入19.5μl所述的检测溶液和2.5μl灭菌去离子水进行LAMP反应，LAMP反应程序为：64℃70min。
有益效果：
本发明提供了一个新的大豆南方茎溃疡病菌的检测靶标序列Tef1-α，并分析该靶标序列Tef1-α和其他近似种病菌在序列上的差异，设计了4条特异性的LAMP引物，在此基础上建立了检测大豆南方茎溃疡病菌的LAMP反应体系。本发明的检测体系在LAMP扩增条件下，能快速、高效、高特异、高灵敏地检测到大豆南方茎溃疡病菌，具有优异的种间特异性、种内通用性以及灵敏度，能很好满足目前对大大豆南方茎溃疡病菌的现场检测的迫切需要，用于田间检疫、进出口检疫等的现场检测，易于大范围推广应用。
附图说明
图1实施例2大豆南方茎溃疡病菌种间特异性试验常光照射图
其中，1号、2号为大豆南方茎溃疡病菌不同菌株，3号、4号为大豆北方茎溃疡病菌不同菌株，5～7号为拟茎点种腐病菌不同菌株，8号为阴性对照。
图2实施例2大豆南方茎溃疡病菌种间特异性试验紫外光照射图
其中，1号、2号为大豆南方茎溃疡病菌不同菌株，3号、4号为大豆北方茎溃疡病菌不同菌株，5～7号为拟茎点种腐病菌不同菌株，8号为阴性对照。
图3实施例3大豆南方茎溃疡病菌属间特异性试验常光光照射图
其中，1号、2号为大豆南方茎溃疡病菌不同菌株，3号为大豆锈菌，4号为胶胞炭疽菌，5号为平头炭疽菌，6号为稻瘟菌，7号为链格孢菌，8号为球黑孢菌，9号为大豆疫霉菌，10号为菜豆壳球孢菌，11号为米曲霉菌，12号为菊池尾孢菌，13号为油瓶霉菌，14号为丁香疫霉菌，15号为苎麻疫霉，16号为阴性对照。
图4实施例3大豆南方茎溃疡病菌属间特异性试验紫外光照射图
其中，1号、2号为大豆南方茎溃疡病菌不同菌株，3号为大豆锈菌，4号为胶胞炭疽菌，5号为平头炭疽菌，6号为稻瘟菌，7号为链格孢菌，8号为球黑孢菌，9号为大豆疫霉菌，10号为菜豆壳球孢菌，11号为米曲霉菌，12号为菊池尾孢菌，13号为油瓶霉菌，14号为丁香疫霉菌，15号为苎麻疫霉，16号为阴性对照。
图5实施例4大豆南方茎溃疡病菌灵敏度试验常光照射图
LAMP扩增不同浓度大豆南方茎溃疡病菌基因组DNA；从左到右分别为25μL的反应体系中分别含有100ng、10ng、1ng、100pg、10pg、1pg、100fg、10fg大豆南方茎溃疡病菌DNA的LAMP扩增结果。LAMP扩增反应能特异性地识别大豆南方茎溃疡病菌，图片表示灵敏度能够达到1ng/μL。
图6实施例4大豆南方茎溃疡病菌灵敏度试验紫外光照射图
LAMP扩增不同浓度大豆南方茎溃疡病菌基因组DNA；从左到右分别为25μL的反应体系中分别含有100ng、10ng、1ng、100pg、10pg、1pg、100fg、10fg大豆拟茎点种腐病菌DNA的LAMP扩增结果。LAMP扩增反应能特异性地识别大豆南方茎溃疡病菌，图片表示灵敏度能够达到100pg/μL。
图7感病大豆植株LAMP检测试验常光、紫外光照射图
其中1为大豆南方茎溃疡病菌标准菌株基因组，2-7为接种大豆南方茎溃疡病菌菌株6天后的大豆植株基因组，8为接种空白PDA培养基6天后的大豆植株基因组，9为健康大豆植株基因组，10为阴性对照。上一排为常光照射图，下一排为紫外光照射图。
具体实施方式
实施例1
一种用于检测大豆南方茎溃疡病菌的LAMP检测试剂盒，包含：由20mM正向内引物FIP、20mM反向内引物BIP，10mM正向外引物F3、10mM反向外引物B3，10%10xThermoPolReaction Buffer、50mM MgSO4、10mMdNTP Mixture、5M甜菜碱、8000U/mLBst DNA PolymeraseLarge fragment，加入超纯水制备成检测溶液。各组分的浓度表示其在检测溶液中的终浓度。
实施例2大豆南方茎溃疡病菌种间特异性试验
为了验证LAMP方法的特异性，选择大豆南方茎溃疡病菌标准菌株(200236TM)与大豆南方茎溃疡病菌同种的大豆北方茎溃疡病菌以及同属不同种的大豆拟茎点种腐病菌的DNA作为模板，取3μlDNA溶液，加入19.5μl实施例1所述的检测溶液和2.5μl灭菌去离子水进行LAMP反应，反应程序为：64℃70min；扩增产物加入SYBR GREEN Ⅰ染料，在常光和紫外光下检测，结果如图1和图2所示。图1显示特异性引物特异性地识别大豆南方茎溃疡病菌，含有大豆南方茎溃疡病菌的样品（1号和2号管）会在常光下变成黄色，而其他种（3～7号管）和阴性对照（8号管）在常光下变成橙色；图2显示含有大豆南方茎溃疡病菌的样品（1号和2号管）在紫外光下产生强烈荧光，而其他种（3～7号管）和阴性对照（8号管）在紫外光下不产生荧光，这表明本发明建立的LAMP检测方法具有很高的种间特异性。
实施例3大豆南方茎溃疡病菌属间特异性试验
为了验证LAMP方法的特异性，选择大豆南方茎溃疡病菌标准菌株与大豆南方茎溃疡病菌不同属的菌（大豆锈菌；胶胞炭疽菌；平头炭疽菌；稻瘟菌；链格孢菌；球黑孢菌；大豆疫霉菌；菜豆壳球孢菌；米曲霉菌；菊池尾孢菌）的DNA作为模板，取3μlDNA溶液，加入19.5μl实施例1所述的检测溶液和2.5μl灭菌去离子水进行LAMP反应，反应程序为：64℃70min；扩增产物加入SYBR GREEN Ⅰ染料，在常光、紫外光下检测，结果如图3和4所示。结果显示特异性引物特异性地识别大豆南方茎溃疡病菌，含有大豆南方茎溃疡病菌的样品（1号和2号管）在常光下变成黄色，紫外光下产生强烈荧光；而其他种（3～15号管）在常光下变成橙色，紫外光下也不产生荧光，阴性对照（16号）在常光下变成橙色，紫外光下也不产生荧光，这表明本发明建立的LAMP检测方法具有很高的属间特异性。
实施例4大豆南方茎溃疡病菌灵敏度试验
为了确定LAMP检测方法的灵敏度，将提取的标准大豆南方茎溃疡病菌菌株DNA用分光光度计测定浓度（1μg/μl）后用DEPC水进行10倍比稀释，-70℃保存作为模板。分别取10倍比稀释后的各浓度DNA稀释液3μl作为模板，加入19.5μl实施例1所述的检测溶液和2.5μl灭菌去离子水进行LAMP反应，反应程序为：64℃70min；扩增产物加入SYBR GREENⅠ染料，在常光和紫外光下检测，结果如图5和图6所示，1～3管在常光下变成黄色，紫外光下产生强烈荧光，表明本发明方法的灵敏度为1ng/μL。
实施例5感病大豆植株LAMP检测试验
用NaOH碱裂解法提取6株接种大豆南方茎溃疡病菌6天后的大豆植株的DNA，将其作为模板用于LAMP扩增，将大豆南方茎溃疡病菌标准菌株DNA作为阳性对照，健康植株DNA和灭菌水取代DNA扩增作为阴性对照。取3uLDNA溶液，加入19.5μl实施例1所述的检测溶液和2.5μl灭菌去离子水进行LAMP反应，反应程序为：64℃70min。扩增产物加入SYBRGREEN Ⅰ染料，在常光和紫外光下检测，结果如图7所示，显示本方法能够从接种大豆南方茎溃疡病菌的大豆植株（2～7号管）在常光下变成黄色，紫外光下产生强烈荧光，能够特异性地检测出大豆南方茎溃疡病菌，效果和直接检测大豆南方茎溃疡病菌（1号管）DNA没有差别，而接种空白PDA培养基6天后的大豆植株（8号管）、健康植株（9号管）和阴性对照灭菌水（10号管）则在常光下变成橙色，紫外光下也不产生荧光，可见本方法可以用于田间检测（图7）。
参考文献
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6.肖斌,朱永红,邹全明(2005)简便敏感的环介导等温扩增基因诊断新技术.中华检验医学杂志28:761‐763.

Claims (6)

1.针对SEQ ID NO.1所示的大豆南方茎溃疡病菌的检测靶标序列Tef1-α设计的特异性的LAMP引物组合物，其特征在于包括正向内引物FIP如SEQ ID NO.2所示，反向内引物BIP如SEQ ID NO.3所示，正向外引物F3如SEQ ID NO.4所示，反向外引物B3如SEQ ID NO.5所示。
2.权利要求1所述的特异性的LAMP引物组合物在制备检测或鉴定大豆南方茎溃疡病菌的试剂中的应用。
3.一种用于检测大豆南方茎溃疡病菌的LAMP检测试剂盒，其特征在于包含权利要求1所述的特异性的LAMP引物组合物。
4.根据权利要求3所述的用于检测大豆南方茎溃疡病菌的LAMP检测试剂盒，其特征在于所述的试剂盒包含：由20 mM正向内引物FIP、20 mM反向内引物BIP，10mM正向外引物F3、10mM反向外引物B3，10%10xThermoPol Reaction Buffer、50mM MgSO4、10mMdNTP Mixture、5M甜菜碱、8000U/mLBst DNA Polymerase Large fragment及超纯水组成的检测溶液。
5.一种检测大豆南方茎溃疡病菌的方法，其特征在于提取待检微生物的DNA，以提取的 DNA 为模板，利用权利要求1所述的特异性的LAMP引物组合物进行LAMP扩增反应； 扩增产物加入SYBR GREEN Ⅰ染料，在常光和/或紫外光下检测结果，如果反应产物在常光下变显黄色、在紫外光下产生强烈荧光，则表示存在大豆南方茎溃疡病菌，在常光下显橙色、紫外光下无荧光产生则表示不含该病菌。
6.根据权利要求5所述的检测大豆南方茎溃疡病菌的方法，其特征在于提取待检微生物的DNA，取3μ l DNA溶液，加入19.5μ l 权利要求4 中的检测溶液和2.5μl灭菌去离子水进行LAMP反应，反应程序为：64 ℃ 70min；扩增产物加入SYBR GREEN Ⅰ染料，在紫外光下检测结果，如果反应产物产生强烈荧光，则表示存在大豆南方茎溃疡病菌，无荧光产生则表示不含该病菌。
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