CN104561358B - 一种铁皮石斛烟草疫霉菌lamp检测试剂盒及检测方法 - Google Patents

一种铁皮石斛烟草疫霉菌lamp检测试剂盒及检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种铁皮石斛烟草疫霉菌(Phytophthora？nicotianae)LAMP检测试剂盒，其包括引物、反应缓冲液、Bst？DNA聚合酶和核酸染料。本发明还涉及铁皮石斛烟草疫霉菌LAMP检测方法。使用本发明的试剂盒进行LAMP检测能够实现对铁皮石斛烟草疫霉菌的高特异性、快速、高效、高灵敏度、简便的分子检测。<pb pnum="1" />

Description

一种铁皮石斛烟草疫霉菌LAMP检测试剂盒及检测方法
技术领域
本发明涉及微生物检测领域，具体地说，本发明涉及一种铁皮石斛烟草疫霉菌LAMP检测试剂盒及检测方法。
背景技术
铁皮石斛又称黑节草，是石斛属药用植物中最为珍稀名贵的一种。其茎入药，具有益胃生津、滋阴清热、调节免疫力等功效，近年来在疾病的治疗和预防、营养保健、美容养颜等领域应用广泛，有巨大的市场需求和重要的经济价值。野生铁皮石斛主要在我国南方分布，因生长缓慢、自身繁殖能力低、数量少、过度采挖等原因导致濒临灭绝。为了满足不断增加的社会需求，人工栽培铁皮石斛已越来越受到重视。但是随之而来的铁皮石斛各种病害的发生逐年严重，且这些疫病常常是毁灭性的，对铁皮石斛的产量和药材质量造成恶劣影响，从而造成较大损失，严重制约石斛产业进一步发展。
黑腐病是铁皮石斛在生长期间容易发生的病害之一，可危害铁皮石斛的心叶、茎、根等，引起死亡。其病原菌为烟草疫霉菌(Phytophthora nicotianae)。病发时在叶面上出现细小的、有黄色边缘的紫褐色湿斑，并逐渐变为水渍状扩大，较大和较老的病斑中央变成黑褐色和黑色，用力挤压时会渗出水分，随后叶片变软，不久腐烂脱落。此外，烟草疫霉菌也能侵入根部和根状茎，然后向上扩散至茎及叶片基部，从而造成全株死亡。在栽培早期对烟草疫霉菌进行检测或鉴定，能够有效地观察并预防黑腐病的发生和蔓延，为防治此病害打下坚实的基础。
传统的检测和鉴定方法是基于烟草疫霉菌的形态特征和培养性状的观察，例如观察菌落的形状、色泽以及菌丝形态、孢子形态等。然而这些方法耗时较长，容易错过最佳防治时期，且分离培养过程中易受其他细菌的感染，准确性较差。因此，有必要开发一种快速、准确的烟草疫霉菌检测方法，以满足栽培产业的需求。
环介导恒温核酸扩增技术(loop-mediated isothermal amplificationof DNA,LAMP)是近些年发展起来的一种新型的核酸扩增方法(见文献Notomi T,Okayama H,Masubuchi H,Yonekawa T,Watanabe K,Amino N,Hase T.Loop-mediated isothermal amplification of DNA.Nucleic Acids Res.2000Jun 15；28(12):E63.)，其特点是针对靶基因的6个区域设计4种特异性引物，在链置换DNA聚合酶的作用下，于63～65℃恒温扩增，30-60分钟即可实现大量拷贝数的核酸扩增，且无需高端的仪器设备以及繁锁的电泳和紫外观察等步骤，具有操作简单、特异性强、易于检测等优势，应用前景广阔。目前该技术已成功用于多种病毒、细菌、寄生虫等引起的疾病检测、安全检查和进出口快速诊断中。
发明内容
本发明的目的在于提供一种铁皮石斛烟草疫霉菌LAMP检测试剂盒及检测方法。
为了实现本发明的目的，在一个方面中，本发明提供一种铁皮石斛烟草疫霉菌LAMP检测试剂盒，其包括引物、反应缓冲液、Bst DNA聚合酶和核酸染料，其中所述引物的核苷酸序列如下所示:
外引物F3：TAGGTGAACCTTGCGGAT(SEQ ID NO:1)
外引物B3：AAGCAGAGACTTTCGTCC(SEQ ID NO:2)
内引物FIP：ATAGGGCTCACTCAGCAGCA-TTAACCAAGTAGTTGGGGGT(SEQ ID NO:3)
内引物BIP：CAAAAAAAAGGCGAACGTTTGGG-GTATATTCAGTATTAAGGAATGGGT(SEQ ID NO:4)
优选地，所述外引物F3和所述外引物B3的浓度均为5pmol/μl，所述内引物FIP和所述内引物BIP的浓度均为40pmol/μl。
优选地，所述反应缓冲液由10mM dNTP、10×ThermoPol反应缓冲液、50mM MgSO4和5mM甜菜碱组成。
优选地，所述Bst DNA聚合酶的浓度为8U/μl。
优选地，所述核酸染料为1000×SYBR Green I。
优选地，本发明的试剂盒进一步包括DNA提取试剂以及阳性对照和阴性对照。
优选地，所述DNA提取试剂是CTAB抽提缓冲液，其由100mMTris-HCl pH 8.0、50mM EDTA、1M NaCl、1％(v/v)β-巯基乙醇、2％CTAB组成，pH 7.0-7.5。
在另一个方面中，本发明还提供一种铁皮石斛烟草疫霉菌LAMP检测方法，其包括以下步骤：
(1)提取待测样品DNA：向待测样品中加入CTAB抽提缓冲液，按照常规CTAB法提取DNA；
(2)建立LAMP反应体系：在PCR管中制备25μl反应体系，其包括5pmol/μl的外引物F31μl、5pmol/μl的外引物B31μl、40pmol/μl的内引物FIP 1μl、40pmol/μl的内引物BIP 1μl、反应缓冲液2.5μl、8U/μl的Bst DNA聚合酶1μl、模板DNA 2μl，加水补充至25μl，并以烟草疫霉菌基因组DNA作为阳性对照，以100mM Tris-HCl pH 8.0和50mMEDTA作为阴性对照；
(3)LAMP反应：将步骤(2)中PCR管于63℃恒温反应60min；
(4)分析判断反应产物结果：在(3)中所得反应产物中加入1μl核酸染料，如反应液颜色为橙色，表示结果为阴性，如反应液颜色为绿色，表示结果为阳性。
其中所述引物的核苷酸序列如下所示:
外引物F3：TAGGTGAACCTTGCGGAT(SEQ ID NO:1)
外引物B3：AAGCAGAGACTTTCGTCC(SEQ ID NO:2)
内引物FIP：ATAGGGCTCACTCAGCAGCA-TTAACCAAGTAGTTGGGGGT(SEQ ID NO:3)
内引物BIP：CAAAAAAAAGGCGAACGTTTGGG-GTATATTCAGTATTAAGGAATGGGT(SEQ ID NO:4)
优选地，所述反应缓冲液由10mM dNTP、10×ThermoPol反应缓冲液、50mM MgSO4和5mM甜菜碱组成。
优选地，所述CTAB抽提缓冲液由100mM Tris-HCl pH 8.0、50mMEDTA、1M NaCl、1％(v/v)β-巯基乙醇、2％CTAB组成，pH 7.0-7.5。
优选地，所述核酸染料为1000×SYBR Green I。
本发明的铁皮石斛烟草疫霉菌LAMP检测试剂盒和检测方法具有以下有益效果：
1、高特异性：本发明根据烟草疫霉菌基因的保守区设计了四条特异性引物，通过环介导恒温扩增反应判断靶标物质的存在与否，假阳性率低；
2、耗时短：扩增1小时内即可完成，快速、高效且产率高；
3、灵敏度高：在复杂体系中可检测到单个细胞的靶目标，最低检测极限达到1pg DNA，标本的检出率达到98％以上；
4、鉴定简便：通过肉眼观察颜色变化即可判定结果，无需电泳和紫外观察等步骤。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1本发明的铁皮石斛烟草疫霉菌LAMP检测试剂盒的制备1.1试剂
引物由天根生化科技(北京)有限公司合成；Bst DNA聚合酶和10×ThermoPol反应缓冲液购自NEB；SYBR Green I购自Invitrogen；其余PCR试剂和配制CTAB抽提缓冲液所需的试剂购自Sigma。
1.2试剂盒的制备：
获得以下试剂，以制备本发明的铁皮石斛烟草疫霉菌LAMP检测试剂盒：
CTAB抽提缓冲液：按照以下配方配制：100mM Tris-HCl pH 8.0、50mM EDTA、1M NaCl、1％(v/v)β-巯基乙醇、2％CTAB，最后将pH调整至7.0-7.5；
反应缓冲液：按照以下配方配制：10mM dNTP、10×ThermoPol反应缓冲液、50mM MgSO4、5mM甜菜碱；
引物：外引物F3，其核苷酸序列如SEQ ID NO:l所示；外引物B3，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；内引物FIP，其核苷酸序列如SEQID NO:3所示，内引物BIP，其核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。其中外引物F3和外引物B3的浓度为5pmol/μl，内引物FIP和内引物BIP的浓度为40pmol/μl。
浓度为8U/μl的Bst DNA聚合酶；
核酸染料：1000×SYBR Green I；
阳性对照：烟草疫霉菌基因组DNA；
阴性对照：100mM Tris-HCl(pH 8.0)和50mM EDTA。
实施例2烟草疫霉菌特异性检测
2.1LAMP特异性检测
待测菌株包括从浙江义乌的铁皮石斛栽培基地获得的6株烟草疫霉菌以及黄瓜疫霉菌、辣椒疫霉菌和恶疫霉菌各1株。
使用实施例1制备的试剂盒按照以下步骤对烟草疫霉菌进行检测：
(1)提取待测样品DNA：将待测菌株接种于PDA平板上，划线培养后，收集并离心，加入50μl CTAB抽提缓冲液，按照常规CTAB法提取DNA；
(2)建立LAMP反应体系：在PCR管中制备25μl反应体系，其中四种引物各1μl、反应缓冲液2.5μl、8U/μl的Bst DNA聚合酶1μl、步骤(1)所得模板DNA 2μl，加水补充至25μl，并以烟草疫霉菌基因组DNA作为阳性对照，以100mM Tris-HCl pH 8.0和50mM EDTA作为阴性对照；
(3)LAMP反应：将步骤(2)中PCR管于63℃恒温反应60min；
(4)分析判断反应产物结果：在(3)中所得反应产物中加入1μl1000×SYBR Green I，如反应液颜色为橙色，表示结果为阴性，如反应液颜色为绿色，表示结果为阳性。
2.2检测结果
6株烟草疫霉菌的PCR管中均呈现绿色，而黄瓜疫霉菌、辣椒疫霉菌和恶疫霉菌的显色结果均为橙色，表明引物具有很强的特异性。实施例3烟草疫霉菌灵敏度检测
3.1LAMP灵敏度检测
按照实施例2的步骤(1)提取烟草疫霉菌DNA，并以10倍浓度系列稀释法稀释成100ng、10ng、1ng、100pg、10pg、1pg、100fg共7个梯度。
LAMP反应体系和反应条件以及结果分析同实施例2的步骤(2)-(4)
3.2检测结果
除了DNA浓度为100fg的PCR管显示橙色之外，其余浓度的PCR管中均呈现绿色，表明本发明的检测方法的最低检测极限达到1pgDNA，灵敏度很高。

Claims (9)

1.一种铁皮石斛烟草疫霉菌LAMP检测试剂盒，其特征在于其包括引物、反应缓冲液、Bst DNA聚合酶和核酸染料，其中所述引物的核苷酸序列如下所示:
外引物F3：TAGGTGAACCTTGCGGAT(SEQ ID NO:1) 
外引物B3：AAGCAGAGACTTTCGTCC(SEQ ID NO:2) 
内引物FIP：ATAGGGCTCACTCAGCAGCA-TTAACCAAGTA               GTTGGGGGT(SEQ ID NO:3) 
内引物BIP：CAAAAAAAAGGCGAACGTTTGGG-GTATATT               CAGTATTAAGGAATGGGT(SEQ ID NO:4)。
2.根据权利要求1所述的铁皮石斛烟草疫霉菌LAMP检测试剂盒，其中所述反应缓冲液由10mM dNTP、10×ThermoPol反应缓冲液、50mM MgSO4和5mM甜菜碱组成。
3.根据权利要求1所述的铁皮石斛烟草疫霉菌LAMP检测试剂盒，其中所述核酸染料为1000×SYBR Green I。
4.根据权利要求1-3任一项所述的铁皮石斛烟草疫霉菌LAMP检测试剂盒，其进一步包括DNA提取试剂以及阳性对照和阴性对照。
5.根据权利要求4所述的铁皮石斛烟草疫霉菌LAMP检测试剂盒，其中所述DNA提取试剂是CTAB抽提缓冲液，其由100mM Tris-HCl pH 8.0、50mM EDTA、1M NaCl、1％(v/v)β-巯基乙醇、2％CTAB组成，pH 7.0-7.5。
6.一种铁皮石斛烟草疫霉菌LAMP检测方法，其包括以下步骤：
(1)提取待测样品DNA：向待测样品中加入CTAB抽提缓冲液，按照常规CTAB法提取DNA；
(2)建立LAMP反应体系：在PCR管中制备25μl反应体系，其包括5pmol/μl的外引物F3 1μl、5pmol/μl的外引物B3 1μl、40pmol/μl的内  引物FIP 1μl、40pmol/μl的内引物BIP 1μl、反应缓冲液2.5μl、8U/μl的Bst DNA聚合酶1μl、模板DNA 2μl，加水补充至25μl，并以烟草疫霉菌基因组DNA作为阳性对照，以100mM Tris-HCl pH 8.0和50mM EDTA作为阴性对照；
(3)LAMP反应：将步骤(2)中PCR管于63℃恒温反应60min；
(4)分析判断反应产物结果：在(3)中所得反应产物中加入1μl核酸染料，如反应液颜色为橙色，表示结果为阴性，如反应液颜色为绿色，表示结果为阳性；
其中所述引物的核苷酸序列如下所示:
外引物F3：TAGGTGAACCTTGCGGAT(SEQ ID NO:1) 
外引物B3：AAGCAGAGACTTTCGTCC(SEQ ID NO:2) 
内引物FIP：ATAGGGCTCACTCAGCAGCA-TTAACCAAGTA               GTTGGGGGT(SEQ ID NO:3) 
内引物BIP：CAAAAAAAAGGCGAACGTTTGGG-GTATATT               CAGTATTAAGGAATGGGT(SEQ ID NO:4) 。
7.根据权利要求6所述的铁皮石斛烟草疫霉菌LAMP检测方法，其中所述反应缓冲液由10mM dNTP、10×ThermoPol反应缓冲液、50mM MgSO4和5mM甜菜碱组成。
8.根据权利要求6所述的铁皮石斛烟草疫霉菌LAMP检测方法，其中所述CTAB抽提缓冲液由100mM Tris-HCl pH 8.0、50mM EDTA、1M NaCl、1％(v/v)β-巯基乙醇、2％CTAB组成，pH 7.0-7.5。
9.根据权利要求6所述的铁皮石斛烟草疫霉菌LAMP检测方法，其中所述核酸染料为1000×SYBR Green I。
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