CN105861745B - 一种病毒检测试剂盒及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种柑橘裂皮类病毒RT‑LAMP检测试剂盒，其包括4条特异性引物、反应缓冲液、AMV逆转录酶、Bst DNA聚合酶和核酸染料。本发明还涉及柑橘裂皮类病毒RT‑LAMP检测方法。使用本发明的试剂盒及检测方法能够准确对柑橘裂皮类病毒进行检测或鉴定，具有特异性强、灵敏度高、重复性好等优点，适合于直接对田间甜橙类品种的带毒情况进行检测。
Description
技术领域
本发明涉及微生物检测领域，具体地说，本发明涉及一种柑橘裂皮类病毒RT-LAMP检测试剂盒及检测方法。
背景技术
柑橘是世界第一大水果，其国际年贸易额仅次于小麦和玉米，为第三大国际贸易农产品，在各国的国民经济中占有举足轻重的位置。但是，柑橘在生长过程中易受各种病毒、类病毒及一些原核生物如寄生细菌的感染而致病，从而引起产量变低、品质变劣，严重的导致植株衰弱，甚至死亡。目前世界上已报道的柑橘病毒病和类似病毒病有80多种，给柑橘生产带来很大影响。
柑橘裂皮病是由柑橘裂皮类病毒(Citrus exocortis viroid,CEVd)引起的一种世界范围的重要柑橘病害，在我国分布广泛，可以通过嫁接或修剪用的工具机械传播，主要危害以枳、枳橙和兰普来檬作砧木的柑橘，能够引起砧木部树皮纵裂或翘起，最后呈鳞片状剥落，导致树势衰弱、植株矮化和严重减产。CEVd是马铃薯纺缍形块茎类病毒属成员，其分子结构具有高度碱基配对的共扼环状RNA。目前，无毒化生产是防治柑橘裂皮病的主要措施，而无毒化生产要求一种准确、灵敏、简便、快速的检测方法。柑橘裂皮类病毒的传统指示植物检测法虽然稳定可靠,但检测周期长,且需要温、网室等配套设施；聚丙烯酰胺凝胶电泳和分子杂交等方法,能稳定地检测已经嫁接传播到指示植物上的CEVd,然而由于春季和冬季类病毒在田间寄主植株内含量低,直接采样检测时稳定性不高；虽然已有应用RT-PCR方法检测CEVd的分子生物学检测报道，但是仍然存在操作繁琐、取样大、灵敏度不高等问题。
环介导恒温核酸扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是近些年发展起来的一种新型的核酸扩增方法(见Notomi T等，Nucleic Acids Res.2000Jun15；28(12):E63)，而逆转录-环介导等温扩增技术(RT-LAMP)基于LAMP建立，其在反应体系中增加了逆转录酶，使RNA的逆转录和cDNA的LAMP扩增在同一试管中一步完成。此外，RT-LAMP还具有检测速度快、操作简单和灵敏度高等优点：该技术依赖于能够识别靶序列上6个特异性区域的引物和具有解旋功能且呈瀑布式扩增的Bst DNA聚合酶，在等温条件下可以高效、快速和特异性地扩增靶序列。与RT-PCR相比，RT-LAMP的灵敏度显著较高，优势明显，可用于准确鉴定田间植株病害，及时监控发病情况，符合产业需求。
发明内容
本发明的目的在于提供一种柑橘裂皮类病毒RT-LAMP检测试剂盒及检测方法。
为了实现本发明的目的，在一个方面中，本发明提供了一种柑橘裂皮类病毒RT-LAMP检测试剂盒，其包括4条特异性引物，所述引物的核苷酸序列如下所示:
外引物F3：TGCCCAGCAATGGTCTA(SEQ ID NO:1)
外引物B3：GCGCATGCTCATAGTACGAA(SEQ ID NO:2)
内引物FIP：CGGCTAACCGTGGTCATGAACC-GGCTCTCGAAAAGCTCTGG(SEQ ID NO:3)
内引物BIP：TAGAAGTCGTGATGGCCGTCGA-CCCGATCAGCTAGACGTTAC(SEQ ID NO:4)。
进一步地，本发明的试剂盒还包括反应缓冲液、AMV逆转录酶、Bst DNA聚合酶和核酸染料，其中所述反应缓冲液由2mM dNTP、10×ThermoPol反应缓冲液、0.6mM甜菜碱和6mMMg2+组成。
在本发明的试剂盒中，优选外引物F3和外引物B3的浓度均为0.2μmol/μl，内引物FIP和内引物BIP的浓度均为1.2μmol/μl。
在本发明的试剂盒中，优选核酸染料为SYBR Green I。
进一步地，本发明的试剂盒还可以包括RNA提取试剂以及阳性对照和阴性对照。
在另一个方面中，本发明还提供了使用本发明的试剂盒对柑橘裂皮类病毒进行检测的方法。
本发明的柑橘裂皮类病毒RT-LAMP检测试剂盒和检测方法针对CEVd的包膜蛋白编码基因的6个区域设计特异性和灵敏度高的4条引物，且一步完成逆转录和扩增步骤，假阳性率低、快速、高效，且通过肉眼观察颜色变化即可判定结果，无需电泳和紫外观察等步骤，无需使用热循环仪等仪器，成本低、操作简单、鉴定简便，适于CEVd的基础实验室和田间检测。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1柑橘裂皮类病毒RT-LAMP检测试剂盒的制备
1.1试剂
引物由天根生化科技(北京)有限公司合成；Bst DNA聚合酶和10×ThermoPol反应缓冲液购自NEB；AMV逆转录酶购自Promega公司；SYBR Green I和TRIZOL Reagent购自Invitrogen；其余PCR所需试剂购自Sigma。
1.2试剂盒的制备：
反应缓冲液：包括2mM dNTP、10×ThermoPol反应缓冲液、0.6mM甜菜碱和6mM Mg2+；
引物：外引物F3，其核苷酸序列如SEQ ID NO:l所示；外引物B3，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；内引物FIP，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，内引物BIP，其核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。其中两条外引物的浓度为0.2μmol/μl，两条内引物的浓度为1.2μmol/μl。
2U的AMV逆转录酶；
8U的Bst DNA聚合酶；
核酸染料：1000×SYBR Green I；
阳性对照：柑橘裂皮类病毒基因组DNA；
阴性对照：100mM Tris-HCl(pH 8.0)和50mM EDTA。
实施例2柑橘裂皮类病毒特异性检测
2.1 RT-LAMP特异性检测
感染CEVd的脐橙和柑橘植株以及感染马铃薯纺缍形块茎类病毒的柑橘植株各1株，不含病毒的甜橙1株由中国农业科学院柑橘研究所提供。将感染CEVd的植株上的单芽和无芽枝段嫁接于锦橙砧木主干下部，后在砧木较上方接暗柳橙芽，形成砧穗组合，以繁殖病毒。每株感染植株繁育4株保存苗，以不接种的健康甜橙作为阴性对照。
将保存苗嫁接到指示植物Etrog香橼上，观察指标植物的生长症状，通过指标植物法证实保存苗已感染CEVd。
使用实施例1制备的试剂盒按照以下步骤对上述样品进行检测：
1.利用TRIZOL Reagent提取待测样品RNA，具体方法如下：
(1)剪下适量叶片，充分研磨，再加1ml Trizol Reagent充分研磨，室温放置5min；
(2)加入氯仿200μl，充分振荡30sec，室温放置5min后，12000×g，4℃离心10min；
(3)取上层水相至新管中，加入等体积异丙醇，室温放置30min，12000×g，4℃离心10min，弃上清液；
(4)用DEPC水配置的75％乙醇洗涤沉淀，7000×g，4℃离心5min，弃上清液；
(5)真空干燥RNA沉淀，加入DEPC水50μl溶解RNA。
2.在PCR管中制备25μl的RT-LAMP反应体系，其包括4条引物各1μl、反应缓冲液2.5μl、AMV逆转录酶1μl、Bst DNA聚合酶1μl、模板2μl，加水补充至25μl，并以柑橘裂皮类病毒基因组DNA作为阳性对照，以100mM Tris-HCl pH 8.0和50mM EDTA作为阴性对照；
3.LAMP反应：将步骤2的PCR管于63℃恒温反应80min，随后80℃5min失活；
4.结果判读：在步骤3的所得反应产物中加入1μl SYBR Green I，如反应液颜色为橙色，表示结果为阴性，样品中不含CEVd；如反应液颜色为绿色，表示结果为阳性，样品中含有CEVd。
2.2检测结果
待测染毒保存苗共8株，与其相对应的8份样品的PCR管中均呈现绿色，而感染马铃薯纺缍形块茎类病毒的植株样品、健康甜橙以及试剂盒中所含阴性对照的PCR显色结果均为阴性，表明所设计的4条特异性引物能够准确地鉴定出CEVd，并能将其与马铃薯纺缍形块茎类病毒属的其他成员区分开来，具有很强的特异性。
实施例3柑橘裂皮类病毒灵敏度检测
3.1 RT-LAMP灵敏度检测
取实施例2中鉴定结果为阳性的保存苗RNA样品，并以10倍浓度系列稀释法稀释成100fg-100ng共7个梯度。
RT-LAMP反应及结果判读步骤同实施例2的步骤2-4。
3.2检测结果
除了DNA浓度为100fg的PCR管显示橙色之外，其余浓度的PCR管中均呈现绿色，表明本发明的检测方法的最低检测极限达到1pg DNA，灵敏度很高。
Claims (2)
1.一种柑橘裂皮类病毒RT-LAMP检测试剂盒，包括4条特异性引物，所述引物的核苷酸序列为：
外引物F3：TGCCCAGCAATGGTCTA(SEQ ID NO:1)
外引物B3：GCGCATGCTCATAGTACGAA(SEQ ID NO:2)
内引物FIP：CGGCTAACCGTGGTCATGAACC-GGCTCTCGAAAAGCTCTGG(SEQ ID NO:3)
内引物BIP：TAGAAGTCGTGATGGCCGTCGA-CCCGATCAGCTAGACGTTAC(SEQ ID NO:4)；
所述试剂盒进一步包括反应缓冲液、AMV逆转录酶、Bst DNA聚合酶、核酸染料、RNA提取试剂以及阳性对照和阴性对照；
所述反应缓冲液由2mM dNTP、10×ThermoPol反应缓冲液、0.6mM甜菜碱和6mM Mg2+组成；
所述核酸染料为SYBR Green I。
2.使用权利要求1所述的试剂盒对柑橘裂皮类病毒进行检测的方法。
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Inventor after: Zhu Qiang Inventor after: Cao Yong Inventor after: Xu Wenlong Inventor after: Sun Yongcheng Inventor after: Wang Quan Inventor before: Li Yong |
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Effective date of registration: 20170829 Address after: 236800 Bozhou Industrial Park, Anhui Applicant after: Anhui Jiren Pharmaceutical Co., Ltd. Address before: 214016 Jiangsu province Wuxi Guangrui Liangxi District Road 1906, 1908-257 Applicant before: Wuxi Beidouxing Communication Information Science and Technology Co., Ltd. |
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