CN103773865B

CN103773865B - 一种烟草疫霉菌lamp引物及其快速检测方法

Info

Publication number: CN103773865B
Application number: CN201410017199.9A
Authority: CN
Inventors: 陈庆河; 李本金; 刘裴清; 谢世勇; 翁启勇
Original assignee: Institute of Plant Protection of FAAS
Current assignee: Institute of Plant Protection of FAAS
Priority date: 2014-01-15
Filing date: 2014-01-15
Publication date: 2015-05-20
Anticipated expiration: 2034-01-15
Also published as: CN103773865A

Abstract

本发明公开了一种烟草疫霉菌LAMP引物及其快速检测方法，专用于烟草疫霉菌特异检测。主要采用设计了一种烟草疫霉菌的LAMP引物：F3、B3、FIP、BIP，序列如SEQ ID NO.1-4所示，经过恒温扩增和加入SYBR greenⅠ显色剂显色或琼脂糖凝胶电泳检测，可观察到绿色荧光或出现LAMP特征性的梯形带。所发明的LAMP引物及其用法可被用于生产实践中烟草疫霉菌感染的植株和土壤中烟草疫霉菌的快速、灵敏、准确的检测，同时可用于田间病害的早期诊断和病菌的监测和鉴定，为烟草疫霉菌引起的病害防治提供可靠的技术和理论依据。

Description

一种烟草疫霉菌LAMP引物及其快速检测方法

技术领域

本发明涉及一种烟草疫霉菌LAMP引物及其快速检测方法，专用于烟草疫霉菌高灵敏度快速分子检测，同时可用于田间烟草疫病的早期诊断和病菌的监测和鉴定，属于农作物病害检测、鉴定及防治技术领域。

背景技术

由烟草疫霉菌(Phytophthora nicotianae Breda de Haan)引起的烟草黑胫病是一种毁灭性世界病害。1896年van Breda de Haan在印度尼西亚的爪哇首次发现，此后该病流行蔓延迅速，1922年便成为美国的佛罗里达、堪萨斯州烟区的严重病害。1924年后，该病己遍布于全世界温带、亚热带和热带地区烟田。中国于1950年首次报道，当时该病发生在黄淮烟区，目前各主要产烟区均有不同程度的发生，其中安徽、山东、河南为历史上的重病区；云南、贵州、四川、湖南、广东、广西、福建等南方烟区发生亦相当普遍，平均发病率为5％-12％，严重田块发病率高达75％，甚至造成绝收。烟草疫霉的寄主范围很广，可以侵害数百种植物，病害通常在潮湿、多雨条件下发病重，潜育期短，可多次再侵染，传播与蔓延迅速，常造成寄主植物成片死亡。近年来，由于我国连作烟田面积不断扩大，连作年限不断增加，加重了该病害的流行，我国平均每年因烟草黑胫病造成的经济损失达1亿元以上，仅次于烟草病毒病。该病属于维管束系统性病害，一旦发生就很难控制，对烟草威胁极大，并常与其他烟草根茎部病害混合发生，给病害的诊断造成困难，而生产上则常因不明发病原因，难以有针对性的防治措施，故造成更为严重危害。因此建立烟草疫霉菌快速检测体系，早期对发病植株及土壤进行疫霉菌快速准确检测，对预测病害发生情况、及时采取有效的防治措施控制病原菌的传播和流行、减少经济损失都具有重要的理论和实际意义。

传统烟草疫霉菌的分类鉴定主要是基于形态学特征、致病性测定、生理生化特性等，程序繁琐，所需时间较长，鉴定时还易受人为及环境等诸多因素的干扰，而且不能直接从植物组织中检测出病原菌，难以满足病害控制中快速、灵敏、稳定的检测要求，很容易错过病害防治的最佳时期，而免疫血清学鉴定方法虽已建立，但是特异性较差，常常受到抗血清质量的影响，容易造成假阳性，因此这些方法的应用均受到一定的限制。因此，建立一套快速、灵敏、准确的烟草疫霉菌检测诊断技术不仅非常必要，而且十分迫切。

PCR技术为植物病原诊断提供了快速、灵敏、准确的优势，然而目前PCR特异性检测技术仍然需要PCR仪、电泳和凝胶成像系统等昂贵的专业仪器和分子生物学试剂，且需要分子生物学专业实验人员操作，限制了PCR检测方法的推广应用。循环恒温扩增技术（Ioop-mediated isothermal amplification，简称LAMP）是2000年由日本荣研株式会社Notomi等人开发的一种新型循环恒温核酸扩增技术。LAMP反应针对靶基因的6个位点设计出4条引物，利用一种链式置换活性的DNA聚合酶（Bst DNA polymerase），在恒温条件下（60–65℃）保温30–90分钟，即可完成扩增反应。由于LAMP反应的高效性和等温快速扩增的特点，在90分钟内可扩增10⁹–10¹⁰倍产物。LAMP扩增产物的检测一般采用荧光染料目测观察、琼脂糖凝胶电泳和浊度观察等方法。由于LAMP反应简单、快速、高效、经济等特征，因而具有极为广泛的应用前景。目前LAMP检测主要应用于人畜病原物、食品安全和环境卫生的检测，在植物病原菌检测中报道极少，烟草疫霉菌的检测国内外均未见报道。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术中烟草疫霉菌的生物学检测方法所需周期长、检测方法特异性差，灵敏度低的问题，提供一种烟草疫霉菌的LAMP检测引物以及结果可靠、易于操作、特异性强、灵敏度高的烟草疫霉菌的快速检测方法。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

1．LAMP引物的设计

我们从GenBank中下载烟草疫霉Ypt（登录号：JN678924.1）基因序列，根据烟草疫霉Ypt基因序列，采用PrimerExplorer V4软件设计一种LAMP检测引物，包括2条外引物(F3 和 B3) 和 2条内引物 (FIP 和 BIP)，引物序列分别为：

F3: AAATCACGTGTGTGTCTGTAGT；

B3: ACAGGCGTATCTGTAAATCAGTG ；

FIP: CCGTCACGTCGTACACCACAATA-CGTTTCCGCACGATCACTAG ；

BIP: TGTGAAACAGTGGCTGCATGAGA-CACTCAGCTCTTTTCCTTGGA。

2．烟草疫霉菌快速检测体系的建立

一种烟草疫霉菌的LAMP引物的检测方法是利用所述的LAMP引物进行LAMP反应， 25μl反应体系中F3与B3各0.2-0.25μM，FIP与BIP各1.5-1.7μM，20mM Tris-HCl，10mM (NH₄)₂SO₄，10mM KCl，8mM MgSO₄，0.1wt.% 吐温-20，0.8M 甜菜碱，1.4 mM dNTPs，8U Bst DNA 聚合酶大片段，10-50ng DNA模板，不足部分用无菌双蒸水补足。

所述LAMP反应条件为在60-65℃温育30-90 min，80℃保温5-10min。

所述的检测方法为荧光染料目测观察法和琼脂糖凝胶电泳法。所述荧光染料目测观察法：在LAMP反应的扩增产物中加入1μl显色剂，所述显色剂为SYBR greenⅠ，显色结果观察到绿色荧光判断为阳性，橙色判断为阴性；或取2μl扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测，如出现梯形条带判断为阳性，没有出现则判断为阴性。

该方法可用于带菌的植株和土壤的高灵敏度快速检测。建立烟草疫霉菌快速、简便、特异性强、灵敏度高的监测技术体系，对于烟草疫霉菌引起病害显症之前的早期监测，确定病害防治最佳时期具有十分重要的意义。

本发明的关键性技术是烟草疫霉菌的高效特异扩增的引物序列及其扩增方法。为了验证烟草疫霉菌的特异引物序列，本发明以我国福建、云南、山东、广西、河北和台湾等省的39株烟草疫霉菌和12种其它卵菌以及28种病原真菌为供试材料，采用CTAB法提取组织中烟草疫霉菌的DNA。具体方法如下：取50mg 冷冻干燥后的菌丝粉于1.5ml离心管中，加入900μl 2% CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)提取液（提取液的配方为：2% CTAB；100 m mol/L Tris-HCl（三羟甲基氨基甲烷盐酸盐），pH 8.0；20mmol/L EDTA（乙二胺四乙酸二钠），pH8.0；1.4 mol/L NaCl）和90μl 10% SDS（十二烷基苯磺酸钠）后混匀，于55～60℃水浴1.5 h，每10 min振荡混匀一次，水浴1.5h后离心（12,000rpm）15min，取上清液加入与上清液等体积的酚/氯仿/异戊醇（酚、氯仿和异戊醇的体积比为25:24:1），离心(12,000rpm)5 min，取上清液（水相），加入与上清液等体积的氯仿抽提一次（12,000rpm）离心5min，吸上清(350μl），加0.1体积(35μl)的3mol/L NaAC溶液和2体积（700μl）的冰无水乙醇，-20℃下沉淀30min后12,000rpm离心5 min，轻轻地倒去上清液，加入700μl冰70%乙醇进行洗涤（稍离心，倾掉上清），在超净工作台上自然晾干无酒精味后用1×TE（10mmol/L Tris-HCl,0.1mmol/L EDTA, pH8.0）溶液进行溶解，得到DNA溶液，用紫外分光光度计检测DNA浓度并稀释至25ng/μl待用。

经对供试菌株和39株烟草疫霉菌的特异性进行LAMP验证。

除了来自我国福建、云南、山东、广西、河北和台湾等省的39株烟草疫霉菌显色结果可观察到绿色荧光或琼脂糖凝胶电泳检测出现LAMP特征性的梯形带外，检测了28种真菌菌株和12种其他卵菌显色结果为橙色或琼脂糖凝胶电泳没有出现扩增条带。这说明该引物可被用于生产实践中发病组织及土壤中烟草疫霉菌快速可靠的检测和鉴定。

①当在用于烟草组织中存在烟草疫霉菌时，采用NaOH快速裂解法提取烟草疫霉菌的DNA，具体过程如下：(1)将烟草病叶或病茎洗净、晾干，剪取发病部位；(2)按1mg病叶加入10μl（0.5mol/L NaOH，0.5%PVP）计量，将组织充分磨碎成糊，在12,000g离心机中离心5min；(3)取上清20μl与等体积的0.1 mol/L的Tris-HCl（pH8.0）混合；(4)稀释10倍、100倍、1000倍液，分别取1μl原液、 10倍、100倍、1000倍液作为PCR模板进行扩增。

②当在用于烟草土壤中存在烟草疫霉菌时，采用土壤DNA提取法提取土壤中烟草疫霉菌的DNA。具体方法如下：取过筛的土壤冷冻抽干24-48 h后加少量石英砂，倒入液氮充分研磨，将研磨后的土壤细粉分装至1.5 ml 离心管中，每管加入500 μl 0.4% 脱脂奶粉溶液，涡旋混匀。12000 rpm离心15 min。取上清加入等体积蛋白酶K 缓冲液，加终浓度为10 μg/ml蛋白酶K，55℃水浴1-3 h。水浴结束后，加入1/2体积的7.5 M NH₄AC溶液，上下颠倒混匀。12000 rpm离心15 min。吸上清加2倍体积无水乙醇-20℃沉淀（沉淀时间1.5 h）。沉淀结束后，12000 rpm离心15 min。用70%乙醇洗涤沉淀后倾去，室温晾干。每份样品所提DNA用10 μl TE（或无菌超纯水）溶解，-20℃保存备用。

按如下LAMP反应体系和反应条件用所设计的引物进行检测：

①LAMP反应体系25μl：包含F3与B3各0.2μM， FIP与BIP各1.6μM，20mM Tris-HCl，10mM (NH₄)₂SO₄，10mM KCl，8mM MgSO₄，0.1% Tween-20，0.8M Betaine，1.4 mM dNTPs，8U Bst DNA 聚合酶大片段，25ng DNA模板，不足部分用无菌双蒸水补足；LAMP反应条件为在63℃温育65 min，82℃保温10min。

②在LAMP反应的最终扩增产物中加入1μl显色剂，所述显色剂为SYBR greenⅠ，显色结果观察到绿色荧光，或取2μl扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测，结果出现LAMP特征性的梯形带，即可判断所述的烟草组织或土壤中存在烟草疫霉菌；否则所述的烟草组织或土壤中未存在烟草疫霉菌。

本发明有益效果：本发明方法适用于发病组织或土壤中烟草疫霉菌的快速可靠的检测和鉴定，对于农业生产中烟草疫霉菌引起的病害防治具有重要的实用价值。本发明与现有技术相比，具有以下的技术优势和积极效果：

1、结果可靠：本发明所设计出的LAMP检测引物，已经对源于中国福建、云南、山东、广西、河北和台湾等地的烟草疫霉菌和带烟草疫霉菌的土样、植物组织进行了测试验证，因此结果可靠性具有充分的保证；

2、特异性强：本发明所采用的LAMP引物是针对烟草疫霉菌Ypt基因序列中6个不同区域设计出4条特异性引物，6个区域中任何区域与引物不匹配均不能进行核酸扩增，故特异性高。

3、灵敏度高： LAMP对烟草疫霉菌的检测灵敏度在DNA水平上可达到10fg，比常规PCR检测高1000倍。

4、实用性好：本发明所设计出的LAMP引物，可用于带烟草疫霉菌的组织和土壤的高灵敏度快速检测，因此本方法的实用性强，可满足对带菌组织和土壤中存在的烟草疫霉菌进行快速可靠的检测和鉴定的需要。

5、操作简便快速：应用本发明方法，对带烟草疫霉菌的组织和土壤进行检测可在1小时内完成，且LAMP核酸扩增是在等温条件下进行，只需一个水浴锅即可，不需要复杂的仪器设备和昂贵的分子试剂，结果肉眼直接可见。

附图说明

图1为本发明烟草疫病菌的特异LAMP检测结果图。图1中A表示琼脂糖凝胶电泳检测结果，其中：泳道M为DL 2000 DNA marker，泳道1为阴性对照，泳道2为阳性对照，泳道3-11为其他卵菌和真菌菌株；图1中B表示显色结果，其中：第1管为阴性对照，第2管为阳性对照，第3–11管为其他卵菌和真菌菌株（见实施例1）。

图2 为本发明烟草疫病菌的LAMP灵敏性检测结果图。图2中A表示琼脂糖凝胶电泳检测结果，其中：泳道M为DL 2000 DNA marker，泳道1–10模板浓度分别为100 pg，10 pg，1 pg，100 fg，10 fg，1 fg，100 ag 10ag and 1ag；图2中B表示显色结果，其中：第1–10管模板浓度分别为100 pg，10 pg，1 pg，100 fg，10 fg，1 fg，100 ag 10ag and 1ag（见实施例2）。

图3为本发明对发病植株和土壤的检测结果图。图3中A表示琼脂糖凝胶电泳检测结果，其中：泳道1为阳性对照; 泳道2为阴性对照，泳道3、4为发病土壤，泳道6、9、10、11、13、14、17、18为发病组织，泳道5、7、8、12、15、16为健康组织；泳道M为DL 2000 DNA marker；图3中B表示显色结果，其中：第1管为阳性对照，第2管为阴性对照，第3、4管为发病土壤，第6、9、10、11、13、14、17、18管为发病组织，第5、7、8、12、15、16管为健康组织（见实施例3）。

具体实施方式

本发明的技术内容包括烟草疫霉菌的LAMP检测引物，LAMP引物及其序列分别为：

F3: AAATCACGTGTGTGTCTGTAGT

B3: ACAGGCGTATCTGTAAATCAGTG

FIP: CCGTCACGTCGTACACCACAATA-CGTTTCCGCACGATCACTAG

BIP: TGTGAAACAGTGGCTGCATGAGA-CACTCAGCTCTTTTCCTTGGA

利用LAMP引物检测烟草疫霉菌显色结果可观察到绿色荧光或琼脂糖凝胶电泳出现LAMP特征性的梯形带。

主要试剂：Bst DNA 聚合酶大片段购自英国NEB公司；DNA marker 购自宝生物工程大连有限公司；其余试剂均购自生工生物（上海）技术有限公司。引物由生工生物（上海）技术有限公司合成。

实施例1：LAMP引物对烟草疫霉菌的特异性扩增

1．烟草疫霉菌的LAMP特异检测

①LAMP反应体系25 μl：包含F3与B3各0.2μM，FIP与BIP各1.6μM，20mM Tris-HCl，10mM (NH₄)₂SO₄，10mM KCl，8mM MgSO₄，0.1% Tween-20，0.8M Betaine，1.4 mM dNTPs，8U Bst DNA 聚合酶大片段，25ng DNA模板，不足部分用无菌双蒸水补足；LAMP反应条件为在65℃温育60 min，82℃保温10min。

②在LAMP反应的最终扩增产物中加入1μl显色剂，所述显色剂为SYBR greenⅠ，显色结果观察到绿色荧光判断为阳性，橙色判断为阴性。或取2μl扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测，如果出现LAMP特征性的梯形带判断为阳性，没有出现扩增条带判断为阴性。

2．检测结果

检测的特异性：除了来自我国福建、云南、山东、广西、河北和台湾等省的39株烟草疫霉菌显色结果可观察到绿色荧光或琼脂糖凝胶电泳出现LAMP特征性的梯形带外，检测了12种其他卵菌和28种真菌菌株显色结果为橙色或琼脂糖凝胶电泳没有出现扩增条带（部分结果见图1），说明此引物具有很强的特异性。

实施例2：LAMP引物对烟草疫霉菌的灵敏性检测

1．烟草疫霉菌的LAMP灵敏性检测

采用10倍浓度系列稀释法将提取的烟草疫霉菌DNA稀释成100 pg，10 pg，1 pg，100 fg，10 fg，1 fg，100 ag 10ag and 1ag共9个不同浓度梯度。

①LAMP反应体系25μl：包含F3与B3各0.2μM， FIP与BIP各1.6μM，20mM Tris-HCl，10mM (NH₄)₂SO₄，10mM KCl，8mM MgSO₄，0.1% Tween-20，0.8M Betaine，1.4 mM dNTPs，8U Bst DNA 聚合酶大片段，25ng DNA模板，不足部分用无菌双蒸水补足；LAMP反应条件为在65℃温育60 min，82℃保温10min。

2．检测结果：烟草疫霉菌LAMP灵敏性检测，显色结果可观察到绿色荧光或琼脂糖凝胶电泳出现LAMP特征性的梯形带，检测灵敏度可达10fg（见图2）。

实施例3：发病组织或土壤中烟草疫霉菌的检测。

1．样品采集：植物组织及土壤样品采自福建南平市烟草生产基地。

2．DNA提取及检测

发病植物组织采用NaOH快速裂解法提取烟草疫霉菌DNA，发病土壤采用土壤DNA提取法提取烟草疫霉菌的DNA。

按下述方法进行LAMP检测：

①LAMP反应体系25 μl：包含F3与B3各0.2μM， FIP与BIP各1.6μM，20mM Tris-HCl，10mM (NH₄)₂SO₄，10mM KCl，8mM MgSO₄，0.1% Tween-20，0.8M Betaine，1.4 mM dNTPs，8U Bst DNA 聚合酶大片段，25ng DNA模板，不足部分用无菌双蒸水补足；LAMP反应条件为在65℃温育60 min，82℃保温10min。

3．检测结果

如图3所示，发病组织或土壤中感染烟草疫霉菌，显色结果可观察到绿色荧光或琼脂糖凝胶电泳出现LAMP特征性的梯形带，健康组织显色结果则观察到橙色荧光或琼脂糖凝胶电泳未出现LAMP特征性的梯形带。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建省农业科学院植物保护研究所

<120> 一种烟草疫霉菌LAMP引物及其快速检测方法

<130> 4

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> F3

<400> 1

aaatcacgtg tgtgtctgta gt 22

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> B3

<400> 2

acaggcgtat ctgtaaatca gtg 23

<210> 3

<211> 43

<212> DNA

<213> FIP

<400> 3

ccgtcacgtc gtacaccaca atacgtttcc gcacgatcac tag 43

<210> 4

<211> 44

<212> DNA

<213> BIP

<400> 4

tgtgaaacag tggctgcatg agacactcag ctcttttcct tgga 44

Claims

1.一种烟草疫霉菌的LAMP引物，其特征在于：所述LAMP引物为：

F3: AAATCACGTGTGTGTCTGTAGT；

B3: ACAGGCGTATCTGTAAATCAGTG ；

FIP: CCGTCACGTCGTACACCACAATA-CGTTTCCGCACGATCACTAG ；

BIP: TGTGAAACAGTGGCTGCATGAGA-CACTCAGCTCTTTTCCTTGGA。

2.一种利用权利要求1所述的烟草疫霉菌LAMP引物检测烟草疫霉菌的检测方法，其特征在于：利用所述的LAMP引物进行LAMP反应， 25μl反应体系中F3与B3各0.2-0.25μM，FIP与BIP各1.5-1.7μM，20mM Tris-HCl，10mM (NH₄)₂SO₄，10mM KCl，8mM MgSO₄，0.1wt.% 吐温-20，0.8M 甜菜碱，1.4 mM dNTPs，8U BstDNA 聚合酶大片段，10-50ng DNA模板，不足部分用无菌双蒸水补足。

3.根据权利要求2所述的烟草疫霉菌LAMP引物检测烟草疫霉菌的检测方法，其特征在于：所述LAMP反应条件为在60-65℃温育30-90 min，80℃保温5-10min。

4.根据权利要求2所述的烟草疫霉菌LAMP引物检测烟草疫霉菌的检测方法，其特征在于：在LAMP反应的扩增产物中加入1μl显色剂，所述显色剂为SYBR greenⅠ，显色结果观察到绿色荧光判断为阳性，橙色判断为阴性；或取2μl扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测，如出现梯形条带判断为阳性，没有出现则判断为阴性。