CN103388026B - 大豆拟茎点种腐病菌的检测靶标及其pcr引物组合物和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于基因工程领域，公开了大豆拟茎点种腐病菌的检测靶标及其PCR引物组合物和应用。大豆拟茎点种腐病菌的检测靶标序列Tef，核苷酸序列如SEQ？ID？NO.1所示，该靶标序列特异性的普通PCR引物组合物，上游引物FP如SEQ？ID？NO.2所示，下游引物RP如SEQ？ID？NO.3所示。本发明的检测体系在普通PCR扩增条件下，能快速、高效、高特异、高灵敏地检测到大豆拟茎点种腐病菌，能较好满足对大豆拟茎点种腐病菌的检测，为大豆拟茎点种腐病菌的检测提供了新的技术平台，能较好满足目前对大豆拟茎点种腐病菌的检测的迫切需要，用于田间检疫、进出口检疫等的现场检测，易于大范围推广应用。
Description
技术领域
本发明属于基因工程领域，涉及大豆拟茎点种腐病菌的检测靶标及其PCR引物组合物和应用。
背景技术
大豆拟茎点种腐病菌（PhomopsislongicollaHobbs）侵染大豆，引起大豆根腐以及苗期病害，并且可以导致大豆种子品质降低[1,2]，。大豆拟茎点种腐病菌最早在1976年在美国发现，此后，加拿大、阿根廷、韩国、意大利、南斯拉夫都有报道过[3,4]。据统计，在1994年，全世界因为该病害导致大豆产量损失高达18.6万吨[5,6,7]。因其近年来在国外发生普遍、经济影响大、传入风险高且在我国尚未有发生的报道,被有关专家列为大豆上包括大豆疫霉在内的7种危险性真菌病害之一[8]。为了阻止大豆拟茎点种腐病菌传播范围的不断扩大，使大豆拟茎点种腐病菌病得到控制，需要对其进行快速、准确地检测。
基于PCR的方法检测病原菌的方法已经成功用于我国的各个进出口口岸，但是以往的靶标选择都是基于核糖体基因序列，但由于核糖体序列没有足够多的位点来区分所有的病原菌，因此开发出新的检测靶标成为检测的热点。
发明内容
本发明的目的在于提供一种大豆拟茎点种腐病菌的检测靶标序列Tef1-α。
本发明的另一目的是提供该大豆拟茎点种腐病菌的检测靶标序列Tef1-α的其特异性普通PCR引物组合物。
本发明的又一目的是提供该大豆拟茎点种腐病菌的检测靶标序列Tef1-α及其普通PCR引物组合物的应用。
本发明的目的可通过如下技术方案实现：
大豆拟茎点种腐病菌的检测靶标序列Tef，核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。
所述的大豆拟茎点种腐病菌的检测靶标序列Tef1在检测或鉴定大豆拟茎点种腐病菌中的应用。
针对所述的大豆拟茎点种腐的检测靶标序列Tef设计的特异性的普通PCR引物组合物，上游引物FP如SEQIDNO.2所示，下游引物RP如SEQIDNO.3所示。
所述的针对所述的大豆拟茎点种腐病菌的检测靶标序列Tef1-α设计的特异性的普通PCR引物组合物在检测或鉴定大豆拟茎点种腐病菌中的应用。
一种用于检测大豆拟茎点种腐病菌的普通PCR检测试剂盒，包含所述的特异性的普通PCR引物组合物。
所述的用于检测大豆拟茎点种腐病菌的普通PCR检测试剂盒，包含：由20mM上游引物FP、20mM下游引物RP、10xPCR反应缓冲液(TAKARA)、25mMMgCl2(TAKARA)、2.5mMdNTPMixture(TAKARA)，1.25单位Taq酶(TAKARA)，加入超纯水制成的检测溶液。
一种检测大豆拟茎点种腐病菌的方法，提取待检微生物的DNA，以提取的DNA为模板，利用所述的特异性的普通PCR引物组合物进行普通PCR反应；扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，在紫外光下检测结果，如果存在226bp左右的特异性条带，则证明所检测的病原为大豆拟茎点种腐病菌，无特异性条带则证明不含大豆拟茎点种腐病菌。
所述的检测大豆拟茎点种腐病菌的方法优选提取待检微生物的DNA，取1μlDNA溶液，加入23μl所述的检测溶液和1μl灭菌去离子水进行普通PCR反应，普通PCR反应程序为：94℃预变性5min；然后进入循环，94℃变性30sec，60℃退火30sec，72℃延伸45sec，共35个循环；最后72℃延伸10min。
扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，在紫外光下检测结果，如果存在大小为226bp左右的特异性条带，则证明存在大豆拟茎点种腐病菌，无条带则表示不含该病菌。
有益效果：
本发明提供了一个新的大豆拟茎点种腐病菌的检测靶标序列Tef1-α，并分析该靶标序列Tef1-α和其他拟茎点霉属病菌菌在序列上的差异，设计了两条特异性的普通PCR引物，在此基础上建立了检测大豆拟茎点种腐病菌的普通PCR反应体系。本发明的检测体系在普通PCR扩增条件下，能快速、高效、高特异、高灵敏地检测到大豆拟茎点种腐病菌，具有优异的种间特异性、种内通用性以及灵敏度，能很好满足目前对大豆拟茎点种腐的现场检测的迫切需要，用于田间检疫、进出口检疫等的现场检测，易于大范围推广应用。
附图说明
图1实施例2大豆拟茎点种腐病菌特异性实验凝胶电泳结果图
其中，M为DL5000DNAmarker；1为拟茎点种腐菌标准菌株，2为北方茎溃疡菌菌株，3为南方茎溃疡菌菌株，4为大豆锈菌菌株，5为胶胞炭疽菌菌株，6为平头炭疽菌菌株，7为稻瘟菌菌株，8为链格孢菌菌株，9为球黑孢菌菌株，10为大豆疫霉菌菌株，11为菜豆壳球孢菌菌株，12为米曲霉菌菌株，13为菊池尾孢菌菌株，14为阴性对照。
图2实施例3大豆拟茎点种腐病菌种内通用性试验凝胶电泳结果图
其中，M为DL5000DNAmarker；1为拟茎点种腐菌标准菌株，2-15为待测拟茎点种腐病菌菌株，16为阴性对照。
图3实施例4大豆拟茎点种腐病菌灵敏度试验凝胶电泳结果图
普通PCR扩增不同浓度基因组DNA；从左到右分别为25μL的反应体系中分别含有100ng、10ng、1ng、100pg、10pg、1pg、100fg、10fg大豆拟茎点种腐病菌DNA的扩增结果。普通PCR反应能从PhomopsislongicollaHobbs菌株中特异性地扩增出一条226bp的条带。电泳表示该反应的灵敏度达到了100pg。M为DL5000DNAmarker
图4感病大豆植株PCR检测试验凝胶电泳结果图
其中，，M为DL5000DNAmarker；1为拟茎点种腐菌标准菌株，2-7为接种大豆拟茎点种腐病菌菌株6天后的大豆菌株，8为健康大豆植株，9为阴性对照。
具体实施方式
实施例1
一种用于检测大豆拟茎点种腐病菌的普通PCR检测试剂盒，包含：20mM上游引物FP、20mM下游引物RP、10xPCR反应缓冲液(TAKARA)、25mMMgCl2(TAKARA)、2.5mMdNTPMixture(TAKARA)，1.25单位Taq酶(TAKARA)、加入超纯水制备成检测溶液。
实施例2大豆拟茎点种腐病菌特异性试验
为了验证普通PCR方法的特异性，选择大豆拟茎点种腐病菌标准菌株（CBS100.87）与大豆拟茎点种腐病菌不同种（大豆南方茎溃疡病菌；大豆北方茎溃疡病菌）和不同属的菌（大豆锈菌；胶胞炭疽菌；平头炭疽菌；稻瘟菌；链格孢菌；球黑孢菌；大豆疫霉菌；菜豆壳球孢菌；米曲霉菌；菊池尾孢菌）的DNA作为模板，取1μlDNA溶液，加入23μl实施例1所述的检测溶液和1μl灭菌去离子水进行普通PCR反应，反应程序为：94℃预变性5min；然后进入循环，94℃变性30sec，60℃退火30sec，72℃延伸45sec，共35个循环；最后72℃延伸10min。扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，在紫外光下检测结果。结果显示特异性引物特异性地识别大豆拟茎点种腐病菌，含有大豆拟茎点种腐病菌的样品会出一条226bp左右的条带，而其他种或属的病菌则无任何条带，阴性对照也无条带，这表明本发明建立的普通PCR检测方法具有很高的特异性（图1）。
实施例3大豆拟茎点种腐病菌种内通用性试验
为了确定本方法是否对不同的大豆拟茎点种腐病菌菌株都能够特异性识别，选择大豆拟茎点种腐病菌标准菌株DNA以及待检测大豆拟茎点种腐病菌菌株14株DNA做模板，取1μlDNA溶液，加入23μl实施例1所述的检测溶液和1μl灭菌去离子水进行普通PCR反应，反应程序为：94℃预变性5min；然后进入循环，94℃变性30sec，60℃退火30sec，72℃延伸45sec，共35个循环；最后72℃延伸10min。扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，在紫外光下检测结果（图2）。
实施例4大豆拟茎点种腐病菌灵敏度试验
为了确定普通PCR检测方法的灵敏度，将提取的标准大豆拟茎点种腐病菌菌株DNA用分光光度计测定浓度（1μg/μl）后用DEPC水进行10倍比稀释，-70℃保存作为模板。分别取10倍比稀释后的各浓度DNA稀释液1μl作为模板，加入23μl实施例1所述的检测溶液和1μl灭菌去离子水进行普通PCR反应，反应程序为：94℃预变性5min；然后进入循环，94℃变性30sec，60℃退火30sec，72℃延伸45sec，共35个循环；最后72℃延伸10min。扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，在紫外光下检测结果。结果显示，方法可以检测到浓度为100pg的大豆拟茎点种腐病菌DNA（图3）。
实施例5感病大豆植株PCR检测试验
用NaOH碱裂解法提取6株接种大豆拟茎点种腐病菌6天后的大豆植株的DNA，将其作为模板用于普通PCR扩增，将大豆拟茎点种腐病菌标准菌株DNA作为阳性对照，健康植株DNA和灭菌水取代DNA扩增作为阴性对照。取1uLDNA溶液，取1μlDNA溶液，加入23μl实施例1所述的检测溶液和1μl灭菌去离子水进行普通PCR反应，反应程序为：94℃预变性5min；然后进入循环，94℃变性30sec，60℃退火30sec，72℃延伸45sec，共35个循环；最后72℃延伸10min。扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，在紫外光下检测结果。结果显示，本方法能够从接种大豆拟茎点种腐病菌的大豆植株特异性地检测出拟茎点种腐病菌，效果和直接检测大豆拟茎点种腐病菌DNA没有差别，可见本方法可以用于田间检测（图4）。
参考文献
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Claims (6)
1.针对大豆拟茎点种腐病菌的检测靶标基因Tef设计的特异性的普通PCR引物组合物，Tef基因序列如SEQIDNO.1所示，其特征在于上游引物FP如SEQIDNO.2所示，下游引物RP如SEQIDNO.3所示。
2.权利要求1所述的PCR引物组合物在制备检测或鉴定大豆拟茎点种腐病菌的试剂中的应用。
3.一种用于检测大豆拟茎点种腐病菌的普通PCR检测试剂盒，其特征在于包含权利要求1所述的特异性的普通PCR引物组合物。
4.根据权利要求3所述的用于检测大豆拟茎点种腐病菌的普通PCR检测试剂盒，其特征在于所述的试剂盒包含：由20mM上游引物FP、20mM下游引物RP、10xPCR反应缓冲液、25mMMgCl2、2.5mMdNTPMixture，1.25单位Taq酶及超纯水组成的检测溶液。
5.一种检测大豆拟茎点种腐病菌的方法，其特征在于提取待检微生物的DNA，以提取的DNA为模板，利用权利要求1所述的特异性的普通PCR引物组合物进行聚合酶链式扩增反应；扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，在紫外光下检测结果，如果存在大小为226bp的特异性条带，则证明存在大豆拟茎点种腐病菌，无条带则表示不含该病菌。
6.根据权利要求5所述的检测大豆拟茎点种腐病菌的方法，其特征在于提取待检微生物的DNA，取1μlDNA溶液，加入23μl权利要求4所述的检测溶液和1μl灭菌去离子水进行普通PCR反应，反应程序为：94℃预变性5min；然后进入循环，94℃变性30sec，60℃退火30sec，72℃延伸45sec，共35个循环；最后72℃延伸10min；扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，在紫外光下检测结果，如果存在大小为226bp的特异性条带，则证明存在大豆拟茎点种腐病菌，无条带则表示不含该病菌。
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