CN100588716C - 香蕉枯萎病菌4号生理小种的检测引物及其检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物技术领域，公开了一个植物病原真菌的检测引物及其检测方法。本发明采用特异引物RF4并优化反应条件，建立了香蕉枯萎病菌4号生理小种的PCR检测方法，该方法能够特异、灵敏、有效的检测香蕉枯萎病菌4号生理小种。利用该方法能够检测到相当于0.1μg的菌丝，并且从香蕉的根和茎中均能够检测到病原物。

Description

香蕉枯萎病菌4号生理小种的检测引物及其检测方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一个植物病原真菌的检测引物及其检测方法。

背景技术

香蕉镰刀菌枯萎病又称香蕉巴拿马病、黄叶病，是由镰刀菌侵染引起维管束坏死的土传性病害，病原菌为尖镰孢霉古巴专化型[Fusarium oxysporum f.sp.cubense(E.F.Smith)Snyder etHansen](FOC)。病原菌从受伤的根茎侵入，通过寄主维管束向茎上发展，并进一步向假叶部蔓延。当植株枯死后，病原菌随残体遗留在土壤中，随着水流或带菌的农具在蕉园内再进行自然传播，其厚垣孢子可在土壤中存活8-10年。由于该菌存活期长，传播迅速，尚未有防止该病的特效药物，因此一旦在香蕉产地发病，很可能大面积爆发将造成重大损失。

尖镰刀菌古巴专化型有4个生理小种，1号小种(race1)感染香蕉的栽培种“大蜜哈”[Grosmichel(AAA)]及龙牙蕉(MusaAAB)，矮蕉[Dwarfcavendish(AAA)]较抗病，该小种呈世界分布，在中国大陆已有记录；2号小种(race2)在中美洲，仅感染三倍体杂种梭香蕉[Bluggoe(AAB)]，不侵染“大蜜哈”；3号小种(race3)感染野生的羯尾蕉属(Heliconia)；4号小种(race4)能感染几乎所有的香蕉种类，如Cevendish、“大蜜哈”、矮香蕉、野蕉(BB)和梭指蕉，毁灭性最大，在全世界范围内尚末找到有效的抵抗4号小种的香蕉品种。

香蕉枯萎病对目前世界香蕉生产已造成重大威胁，因而，如何控制该病原菌的进一步蔓延成为目前防控香蕉枯萎病的关键。

发明内容

本发明的目的是针对现有防控香蕉枯萎病的不足，提供一种香蕉枯萎病菌4号生理小种快速检测引物。

本发明的另一个目的是提供利用上述引物检测香蕉枯萎病菌4号生理小种的方法。

本发明的香蕉枯萎病菌4号生理小种的检测引物RF4，其核苷酸序列如下所示：

RF4-1：5’-TGCGGGTCCTATTAGTAC-3’

RF4-2：5’-GGTCCTCACACTCCAATC-3’。

利用上述检测引物RF4检测香蕉枯萎病菌4号生理小种的方法，包括如下步骤：设计引物RF4浓度、模板DNA、dNTPs、TaqDNA聚合酶及PCR退火温度梯度，然后进行PCR反应，反应结束后，取PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。

上述检测方法所述PCR反应各组分和最佳用量为：

模板DNA           1体积

10×PCR缓冲液     2.5体积

Mg²⁺  25mmol/l    2.5体积

dNTPs 25mM           2体积

引物RF4-1            1体积

引物RF4-2            1体积

TaqDNA聚合酶5U/μL   0.2体积

灭菌ddH₂O            14.8体积；

所述PCR反应程序为：94℃4min；94℃30s，52℃30s，72℃45s，重复35个循环；72℃10min。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：本发明采用特异引物RF4并优化反应条件，建立了香蕉枯萎病菌4号生理小种的PCR检测方法，该方法能够特异、灵敏、有效的检测香蕉枯萎病菌4号生理小种。利用该方法能够检测到相当于0.1μg的菌丝，并且从香蕉的根和茎中均能够检测到病原物。

附图说明

图1为引物RF4扩增的FOC4的核酸序列(R1-F4)图；

图2为PCR检测的灵敏度结果图；

图3为PCR检测纯病菌结果图；

图4为PCR检测香蕉不同组织结果图；

图5为PCR检测采集于番禺的样品结果图；

图6为PCR检测采集于中山的样品结果图；

图7为PCR检测采集于江门、高州的样品结果图；

图8为PCR检测采集于番禺、中山和江门的吸芽结果图；

其中，图1中划线部分为引物RF4的序列。图2中，M：DL2000；1-7：香蕉枯萎病菌4号小种FOC4总DNA稀释梯度(10⁰-10^-6)；8：清水对照。图3中，M：DL2000；1-15：香蕉枯萎病菌4号小种FOC4；16：香蕉枯萎病菌1号小种FOC1；17.番茄枯萎病菌FOL；18.西瓜枯萎病菌FOM；19.苦瓜枯萎病菌；20.菜豆枯萎病菌；21.棉花枯萎病菌；22.小麦赤霉病菌；23.胶孢炭疽病菌；24.清水对照。图4中，

M：DL2000；1-2：病根；3-4：病茎；5-6：病叶；7：清水对照；8：健康植株对照。图5中，M：DL2000；1-30：样品扩增效果；31：清水对照；32：健康植株对照。图6中，M：DL2000；1-16：样品扩增效果；17：清水对照；18：健康植株对照。图7中，M：DL2000；1-4：江门的样；5-6：高州的样；31：清水对照；32：健康植株对照。图8中，M：DL2000；1-15：番禺的样；16-23：中山的样；24-25：江门的样；26：清水对照；27：健康植株对照。

具体实施方式

实施例1

1、PCR体系的建立

设计引物浓度、模板、dNTPs、TaqDNA聚合酶及PCR退火温度梯度，用以检测各反应条件对扩增效果的影响，具体如下：

模板DNA                1ul

10×PCR缓冲液          2.5ul

Mg²⁺(25mmol/l)         2.5ul

dNTPs(25mM)            2ul

引物RF4-1                1ul

引物RF4-2                1ul

TaqDNA聚合酶(5U/μL)     0.2ul

灭菌ddH₂O                14.8ul

总体积                   25ul

在冰上配制好反应体系，混合均匀后，按如下PCR程序进行扩增：94℃4min；94℃30s，52℃30s，72℃45s，重复35个循环；72℃10min。4℃保存。

PCR反应结束后，取5μlPCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，再将特异性片段回收、克隆、测序，得到香蕉枯萎病菌4号生理小种的特异性片段的核酸序列如图1。图1中划线部分为引物RF4的序列。

利用DNAStar分析软件(Demonstration system DNASTAR，V5.0)进行序列处理、分析，然后在NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)上用BLAST程序进行核酸序列同源性比较。结果未找到与此序列有同源性的片段。

2、PCR检测的灵敏度

取50mg新鲜菌丝抽提总DNA溶于50μl TE中，抽提液用双蒸水以10倍梯度稀释后进行PCR扩增，电泳结果(图2)表明：DNA抽提液在稀释10⁴倍后仍能扩增出903bp的特异条带，即引物RF4能够检测出相当于0.1μg的菌丝。

3、引物的特异性

利用引物FR4对香蕉枯萎病菌4号和1号小种及其近似菌株进行扩增后电泳检测结果(图3)表明引物RF4能扩增FOC4得到903bp的特异性目的片段，而其它菌株及清水对照未出现条带，由此说明引物具有较高的特异性。

4、PCR检测香蕉组织

用引物RF4对带菌的香蕉的不同组织进行扩增时，发现引物RF4能有效的对香蕉的根和茎进行检测，得到特异的扩增产物。而叶片、清水对照和健康的香蕉组织未得到目的片段。(图4)

5、PCR检测方法的应用

用所建立的PCR鉴定体系，对采自广东省番禺、中山、江门和高州的具枯萎病典型症状的香蕉的根、茎及吸芽进行检测，电泳结果表明：在番禺采集的30个样中，有26个样扩增出目的片段(图5)；中山的16个样中，有14个样扩增出目的片段(图6)；江门的4个样中有3个扩增出目的片段以及高州的2个样检测都为阳性(图7)；从这几个地方采集的25个芽中，有11个扩增出目的片段(图8)。这说明所建立的PCR检测方法可以有效的检测出FOC4，同时也说明在这些地区存在该病害的危害。

SEQUENCE LISTING

<110>华南农业大学

<120>香蕉枯萎病菌4号生理小种的检测引物及其检测方法

<130>

<160>2

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>

<212>DNA

<213>人工引物

<400>1

RF4-1：5’-TGCGGGTCCTATTAGTAC-3’

RF4-2：5’-GGTCCTCACACTCCAATC-3’

<210>2

<211>903

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

tgcgggtcct attagtacag aatcaagagg agctcacccc ttgacaacaa ctgagaagcc    60

tgaaagcaat gggccaagtg ccgggccaca gtacatagcg cctgaccatg ccgctagact    120

gtatgggacg tagatgacgg aaaactgttg ggcaggcagt tagtggctag acaatatggt    180

gaaactagag aaaaccttgt attaccatgt cagtaaggct cgcagcgcca gtggcgaggc    240

atgggcttcc gaagaagcct tgcaggaaac gaatgatgag gaatccagca aagctctctg    300

tcaatgccgc tccgacgcag aggagattga agatggcgaa ggtaataatg tagatcgggt    360

tacgtccgat gtagggaatt tcgctgagcg gagagaaaag tagcggccca aatccatctg    420

tagattctca tcagcctcta tcgaaagtcg tgaccgtaat tgagaaagcc cacatccgag    480

aacgtaaagg gcgagaccta acgatgctgc tgtttctgtg acgctgaact cttgcatgac    540

ctgtctatac actgatttag tgtgcatcgt cctcatgtct aagaaagctt tgacgtaccc    600

gacgcttgga acgtaaatcg acgacccgca atagatggta aaagtgtaca agctgtttaa    660

aaagaggttt ggtttcagca aggttcaggc ggtgatgggg atgcgtcaaa cgagttacca    720

gattagggcg gccacggcgg tcttcctcat cgtagaccaa ttgtgaggat tttcagcatc    780

atcgtgcgat ttcctgcgct tgccgtgaga aaaaagaaac aaagactaat agcgtaacac    840

ttgtcactca ccatccaaca agtatgcaat catcctctag ctgaagattg gagtgtgagg    900

acc                                                                  903

Claims (3)

1、香蕉枯萎病菌4号生理小种的检测引物RF4，其核苷酸序列如下所示：

RF4-1：5’-TGCGGGTCCTATTAGTAC-3’

RF4-2：5’-GGTCCTCACACTCCAATC-3’。

2、利用权利要求1所述检测引物RF4检测香蕉枯萎病菌4号生理小种的方法，包括如下步骤：设计引物RF4浓度、模板DNA、dNTPs、TaqDNA聚合酶及PCR退火温度梯度，然后进行PCR反应，反应结束后，取PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。

3、如权利要求2所述的方法，其特征在于PCR反应各组分和用量为：

模板DNA               1体积

10×PCR缓冲液         2.5体积

Mg²⁺25mmol/l          2.5体积

dNTPs 25mM            2体积

引物RF4-1             1体积

引物RF4-2             1体积

TaqDNA聚合酶5U/μL    0.2体积

灭菌ddH₂O             14.8体积；

所述PCR反应程序为：94℃4min；94℃30s，52℃30s，72℃45s，重复35个循环；72℃10min。

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