CN104611451B - 鉴定或辅助鉴定香蕉枯萎病菌的成套引物及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了鉴定或辅助鉴定香蕉枯萎病菌的成套引物及应用。本发明所提供的鉴定或辅助鉴定香蕉枯萎病菌的成套引物，为成套引物1、成套引物2或成套引物3；所述成套引物1由名称为A的PCR引物对、名称为B的PCR引物对和名称为C的PCR引物对组成；所述A由序列表中SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的两条单链DNA组成；所述B由序列表中SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示的两条单链DNA组成；所述C由序列表中SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示的两条单链DNA组成。所述成套引物2由所述A和所述C组成。所述成套引物3由所述B和所述C组成。

Description

鉴定或辅助鉴定香蕉枯萎病菌的成套引物及应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域中鉴定或辅助鉴定香蕉枯萎病菌的成套引物及应用。
背景技术
尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)是一种世界性分布的土传病原真菌，寄主范围广泛，可引起瓜类、茄科、香蕉、棉、豆科及花卉等100多种植物枯萎病的发生。尽管尖孢镰刀菌在整体上具有广泛的寄主范围，但单个菌株仅能侵染一种或少数几种植物种类。在不同的寄主上又分为不同的生理专化型，目前已报道的生理专化型有150多种，有些专化型依据对不同品种的特异性被进一步划分为不同的生理小种，大多数专化型包含2个或更多的生理小种，而一小部分是单型。某生理专化型可能在特定的植物种类上引起病害，但是属于其他专化型的菌株对同样的这种特定植物种类可能无害甚至对其有利。
香蕉枯萎病，又称香蕉镰刀菌枯萎病、巴拿马病、黄叶病，是由尖孢镰刀菌古巴专化型(Fusarium oxyporum f.sp.Cubense，Foc)引起的破坏植株维管束而导致植株死亡的一种毁灭性病害，目前，除地中海、印度洋、南太平洋一些岛屿国家外，几乎所有香蕉种植区均有遭受该病害危害的报导。依据尖孢镰刀菌古巴专化型(Foc)对不同品种香蕉的侵染特异性将其划分为4个生理小种(race)：其中1号生理小种(Foc1)侵染“大蜜哈”[Gros michel(AAA)]、Silk(AAB)、Taiwan Latundan(AAB)、IC2(AAAA)和粉蕉(ABB)；2号生理小种(Foc2)只侵染杂种三倍体Bluggoe及ABB基因型的相关煮食蕉类；3号生理小种侵染野生揭尾蕉属(Heliconia spp.)而不是香蕉类，因而被划分出Foc；4号生理小种(Foc4)则侵染所有的Cavendish类香蕉(AAA)及其他对1号与2号生理小种敏感的蕉类。基于Foc4是否能在热带环境条件下对Cavendish类香蕉致病，又将Foc4进一步划分为“尖孢镰刀菌古巴专化型热带4号生理小种”(TR4)与“尖孢镰刀菌古巴专化型亚热带4号生理小种”(ST4)，尖孢镰刀菌古巴专化型亚热带4号生理小种仅在亚热带条件下侵染Cavendish类香蕉。我国广东、广西、福建、海南、云南和台湾地区等主要香蕉种植区也均已发现香蕉枯萎病，且香蕉枯萎病的发病加重趋势明显。目前急需一套快速鉴定香蕉是否感染香蕉枯萎病菌的方法，为生产安全健康香蕉种苗保驾护航。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何鉴定香蕉枯萎病菌中的尖孢镰刀菌古巴专化型、尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种和/或尖孢镰刀菌古巴专化型亚热带4号生理小种。
为解决上述技术问题，本发明提供了鉴定或辅助鉴定香蕉枯萎病菌的成套引物，其名称为成套引物1。
本发明所提供的成套引物1，由名称为A的PCR引物对、名称为B的PCR引物对和名称为C的 PCR引物对组成；
所述A由序列表中SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的两条单链DNA组成；所述B由序列表中SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示的两条单链DNA组成；所述C由序列表中SEQ IDNo.5和SEQ ID No.6所示的两条单链DNA组成。
本发明所要解决的另一个技术问题是如何鉴定香蕉枯萎病菌中的尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种和/或尖孢镰刀菌古巴专化型亚热带4号生理小种。
为解决上述技术问题，本发明提供了鉴定或辅助鉴定香蕉枯萎病菌的成套引物，其名称为成套引物2。
本发明所提供的成套引物2，由所述A和所述C组成。
本发明所要解决的再一个技术问题是如何鉴定香蕉枯萎病菌中的尖孢镰刀菌古巴专化型和/或尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种。
为解决上述技术问题，本发明提供了鉴定或辅助鉴定香蕉枯萎病菌的成套引物，其名称为成套引物3。
本发明所提供的成套引物3，由所述B和所述C组成。
本发明所要解决的又一个技术问题是如何鉴定香蕉枯萎病菌中的尖孢镰刀菌古巴专化型亚热带4号生理小种。
为解决上述技术问题，本发明提供了鉴定或辅助鉴定香蕉枯萎病菌的PCR引物对。
本发明所提供的鉴定或辅助鉴定香蕉枯萎病菌的PCR引物对，为所述C。
为解决上述技术问题，本发明还提供了鉴定或辅助鉴定香蕉枯萎病菌的系统。
本发明所提供的鉴定或辅助鉴定香蕉枯萎病菌的系统为下述Hh-Kk中的任一种：
Hh、含有所述成套引物1的系统；
Ii、含有所述成套引物2的系统；
Jj、含有所述成套引物3的系统；
Kk、含有所述C的系统。
上述鉴定或辅助鉴定香蕉枯萎病菌的系统，可包括通过PCR鉴定或辅助鉴定香蕉枯萎病菌所需的试剂和仪器。具体来说，鉴定或辅助鉴定香蕉枯萎病菌的系统可包括所述成套引物1、所述成套引物2、所述成套引物3或所述C以及PCR所需要的其它试剂和仪器。
上述鉴定或辅助鉴定香蕉枯萎病菌的系统还可仅包括所述成套引物1、所述成套引物2、所述成套引物3或所述C。
所述成套引物1、所述成套引物2和所述成套引物3中的各引物对以及PCR所需要的其它试剂均可独立包装。所述C以及PCR所需要的其它试剂均可独立包装。
PCR所需要的其它试剂可包括DNA聚合酶(DNA Polymerase)和/或10×PCR buffer和/或dNTPs。PCR所需要的仪器可为PCR仪。
为解决上述技术问题，本发明提供了鉴定或辅助鉴定香蕉枯萎病菌的方法。
本发明所提供的鉴定或辅助鉴定香蕉枯萎病菌的方法为下述H-K中的任一种：
H下述H1)或H2)：
H1)下述H11)和H12)：
H11)以待测生物样品的核酸(DNA或RNA或以RNA为模板转录得到的cDNA)为模板，用所述A进行PCR扩增得到PCR产物A1；以所述待测生物样品的RNA或以RNA为模板转录得到的cDNA为模板，用所述B进行PCR扩增得到PCR产物B1；以所述待测生物样品的核酸(DNA或RNA或以RNA为模板转录得到的cDNA)为模板，用所述C进行PCR扩增得到PCR产物C1；
H12)检测H11)所述PCR产物A1、所述PCR产物B1和所述PCR产物C1的大小，如果所述PCR产物B1中含有500bp-750bp的DNA片段(即699bp的DNA片段)，所述PCR产物A1中含有500bp-750bp的DNA片段(即699bp的DNA片段)，所述PCR产物C1中含有500bp-750bp的DNA片段(即663bp的DNA片段)，所述待测样品含有或候选含有尖孢镰刀菌古巴专化型亚热带4号生理小种；如果所述PCR产物B1中含有500bp-750bp的DNA片段(即699bp的DNA片段)，所述PCR产物A1中含有500bp-750bp的DNA片段(即699bp的DNA片段)，所述PCR产物C1中不含500bp-750bp的DNA片段(即不含663bp的DNA片段)，所述待测样品含有或候选含有尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种，所述尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种不为尖孢镰刀菌古巴专化型亚热带4号生理小种；如果所述PCR产物B1中含有500bp-750bp的DNA片段(即699bp的DNA片段)，所述PCR产物A1中不含500bp-750bp的DNA片段(即不含699bp的DNA片段)，所述待测样品含有或候选含有尖孢镰刀菌古巴专化型，所述尖孢镰刀菌古巴专化型不为尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种；如果所述PCR产物B1中不含500bp-750bp的DNA片段(即不含699bp的DNA片段)，所述待测样品不含或候选不含尖孢镰刀菌古巴专化型；
H2)下述H21)和H22)：
H21)以待测生物样品的核酸(DNA或RNA或以RNA为模板转录得到的cDNA)为模板，用所述A进行PCR扩增得到PCR产物A2；以所述待测生物样品的DNA为模板，用所述B进行PCR扩增得到PCR产物B2；以所述待测生物样品的核酸(DNA或RNA或以RNA为模板转录得到的cDNA)为模板，用所述C进行PCR扩增得到PCR产物C2；
H22)检测H21)所述PCR产物A2、所述PCR产物B2和所述PCR产物C2的大小，如果所述PCR产物B2中含有500bp-750bp的DNA片段(即730bp的DNA片段)，所述PCR产物A2中含有500bp-750bp的DNA片段(即699bp的DNA片段)，所述PCR产物C2中含有500bp-750bp的DNA片段(即663bp的DNA片段)，所述待测样品含有或候选含有尖孢镰刀菌古巴专化型亚热带4号生理小种；如果所述PCR产物B2中含有500bp-750bp的DNA片段(即730bp的DNA片段)，所述PCR产物A2中含有500bp-750bp的DNA片段(即699bp的DNA片段)，所述PCR 产物C2中不含500bp-750bp的DNA片段(即不含663bp的DNA片段)，所述待测样品含有或候选含有尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种，所述尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种不为尖孢镰刀菌古巴专化型亚热带4号生理小种；如果所述PCR产物B2中含有500bp-750bp的DNA片段(即730bp的DNA片段)，所述PCR产物A2中不含500bp-750bp的DNA片段(即不含699bp的DNA片段)，所述待测样品含有或候选含有尖孢镰刀菌古巴专化型，所述尖孢镰刀菌古巴专化型不为尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种；如果所述PCR产物B2中不含500bp-750bp的DNA片段(即不含730bp的DNA片段)，所述待测样品不含或候选不含尖孢镰刀菌古巴专化型；
I下述I1)和I2)：
I1)以待测生物样品的核酸(DNA或RNA或以RNA为模板转录得到的cDNA)为模板，用所述A进行PCR扩增得到PCR产物A1；以所述待测生物样品的核酸(DNA或RNA或以RNA为模板转录得到的cDNA)为模板，用所述C进行PCR扩增得到PCR产物C1；
I2)检测I1)所述PCR产物A1和所述PCR产物C1的大小，如果所述PCR产物A1中含有500bp-750bp的DNA片段(即699bp的DNA片段)，所述PCR产物C1中含有500bp-750bp的DNA片段(即663bp的DNA片段)，所述待测样品含有或候选含有尖孢镰刀菌古巴专化型亚热带4号生理小种；如果所述PCR产物A1中含有500bp-750bp的DNA片段(即699bp的DNA片段)，所述PCR产物C1中不含500bp-750bp的DNA片段(即不含663bp的DNA片段)，所述待测样品含有或候选含有尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种，所述尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种不为尖孢镰刀菌古巴专化型亚热带4号生理小种；如果所述PCR产物A1中不含500bp-750bp的DNA片段(即不含699bp的DNA片段)，所述待测样品不含或候选不含尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种；
J下述J1)或J2)或J3)或J4)：
J1)下述J11)和J12)：
J11)以待测生物样品的RNA或以RNA为模板转录得到的cDNA为模板，用所述B进行PCR扩增得到PCR产物B1；以所述待测生物样品的核酸(DNA或RNA或以RNA为模板转录得到的cDNA)为模板，用所述C进行PCR扩增得到PCR产物C1；
J12)检测J11)所述PCR产物B1和所述PCR产物C1的大小，如果所述PCR产物B1中含有500bp-750bp的DNA片段(即699bp的DNA片段)，所述PCR产物C1中含有500bp-750bp的DNA片段(即663bp的DNA片段)，所述待测样品含有或候选含有尖孢镰刀菌古巴专化型亚热带4号生理小种；如果所述PCR产物B1中含有500bp-750bp的DNA片段(即699bp的DNA片段)，所述PCR产物C1中不含500bp-750bp的DNA片段(即不含663bp的DNA片段)，所述待测样品含有或候选含有尖孢镰刀菌古巴专化型，所述尖孢镰刀菌古巴专化型不为尖孢镰刀菌古巴专化型亚热带4号生理小种；如果所述PCR产物B1中不含500bp-750bp的DNA片段 (即不含699bp的DNA片段)，所述待测样品不含或候选不含尖孢镰刀菌古巴专化型；
J2)下述J21)和J22)：
J21)以待测生物样品的DNA为模板，用所述B进行PCR扩增得到PCR产物B2；以所述待测生物样品的核酸(DNA或RNA或以RNA为模板转录得到的cDNA)为模板，用所述C进行PCR扩增得到PCR产物C2；
J22)检测J21)所述PCR产物B2和所述PCR产物C2的大小，如果所述PCR产物B2中含有500bp-750bp的DNA片段(即730bp的DNA片段)，所述PCR产物C2中含有500bp-750bp的DNA片段(即663bp的DNA片段)，所述待测样品含有或候选含有尖孢镰刀菌古巴专化型亚热带4号生理小种；如果所述PCR产物B2中含有500bp-750bp的DNA片段(即730bp的DNA片段)，所述PCR产物C2中不含500bp-750bp的DNA片段(即不含663bp的DNA片段)，所述待测样品含有或候选含有尖孢镰刀菌古巴专化型，所述尖孢镰刀菌古巴专化型不为尖孢镰刀菌古巴专化型亚热带4号生理小种；如果所述PCR产物B2中不含500bp-750bp的DNA片段(即不含730bp的DNA片段)，所述待测样品不含或候选不含尖孢镰刀菌古巴专化型；
J3)下述J31)和J32)：
J31)在同一个PCR反应体系中，以待测生物样品的RNA或以RNA为模板转录得到的cDNA为模板，用所述成套引物3进行PCR扩增得到PCR产物；
J32)检测J31)所述PCR产物的大小，如果所述PCR产物中含有两条500bp-750bp的DNA片段(即699bp和663bp的DNA片段)，所述待测样品含有或候选含有尖孢镰刀菌古巴专化型亚热带4号生理小种；如果所述PCR产物中仅含有一条500bp-750bp的DNA片段(即699bp的DNA片段)，所述待测样品含有或候选含有尖孢镰刀菌古巴专化型，所述尖孢镰刀菌古巴专化型不为尖孢镰刀菌古巴专化型亚热带4号生理小种；如果所述PCR产物中不含500bp-750bp的DNA片段(即不含699bp和663bp的DNA片段)，所述待测样品不含或候选不含尖孢镰刀菌古巴专化型；
J4)下述J41)和J42)：
J41)在同一个PCR反应体系中，以待测生物样品的DNA为模板，用所述成套引物3进行PCR扩增得到PCR产物；
J42)检测J41)所述PCR产物的大小，如果所述PCR产物中含有两条500bp-750bp的DNA片段(即730bp和663bp的DNA片段)，所述待测样品含有或候选含有尖孢镰刀菌古巴专化型亚热带4号生理小种；如果所述PCR产物中仅含有一条500bp-750bp的DNA片段(即730bp的DNA片段)，所述待测样品含有或候选含有尖孢镰刀菌古巴专化型，所述尖孢镰刀菌古巴专化型不为尖孢镰刀菌古巴专化型亚热带4号生理小种；如果所述PCR产物中不含500bp-750bp的DNA片段(即不含730bp和663bp的DNA片段)，所述待测样品不含或候选不含尖孢镰刀菌古巴专化型；
K下述K1)和K2)：
K1)以所述待测生物样品的核酸(DNA或RNA或以RNA为模板转录得到的cDNA)为模板，用所述C进行PCR扩增得到PCR产物C1；
K2)检测K1)所述PCR产物C1的大小，如果所述PCR产物C1中含有500bp-750bp的DNA片段(即663bp的DNA片段)，所述待测样品含有或候选含有尖孢镰刀菌古巴专化型亚热带4号生理小种；如果所述PCR产物C1中不含500bp-750bp的DNA片段(即不含663bp的DNA片段)，所述待测样品不含或候选不含尖孢镰刀菌古巴专化型亚热带4号生理小种。
上述方法中，所述香蕉枯萎病菌可为尖孢镰刀菌古巴专化型和/或尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种和/或尖孢镰刀菌古巴专化型亚热带4号生理小种。
上述方法中，用所述A进行PCR扩增时的退火温度可为56℃。用所述B进行PCR扩增时的退火温度可为54℃。用所述C进行PCR扩增时的退火温度可为54℃。
为解决上述技术问题，本发明还提供了所述成套引物1、成套引物2、成套引物3、或所述C、或所述系统、或所述方法在鉴定香蕉枯萎病菌中的应用；
所述香蕉枯萎病菌可为尖孢镰刀菌古巴专化型和/或尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种和/或尖孢镰刀菌古巴专化型亚热带4号生理小种。
为解决上述技术问题，本发明还提供了成套引物的制备方法。
本发明所提供的成套引物的制备方法，包括将所述成套引物1、成套引物2或成套引物3中各引物对的两条单链DNA分别单独包装的步骤。
为解决上述技术问题，本发明还提供了PCR引物对的制备方法。
本发明所提供的PCR引物对的制备方法，包括将所述C的两条单链DNA分别单独包装的步骤。
上文中，用所述A进行PCR扩增的反应体系可为：Taq DNA polymerase(5U/μL)0.2μL，10×PCR buffer 2.5μL，含有dATP、dTTP、dCTP和dGTP各2.5mM的dNTPs 2μL，DNA或RNA或以RNA为模板转录得到的cDNA 1μL，SEQ ID No.1所示的单链DNA，SEQ ID No.2所示的单链DNA，加水补足至25μL。所述反应体系中所述SEQ ID No.1所示的单链DNA和所述SEQ IDNo.2所示的单链DNA的浓度均为0.4μmol/L。所述PCR扩增的反应程序如下：94℃5min；94℃30s，56℃30s，72℃45s，35个循环；72℃10min。
上文中，用所述B进行PCR扩增的反应体系可为：Taq DNA polymerase(5U/μL)0.2μL，10×PCR buffer 2.5μL，含有dATP、dTTP、dCTP和dGTP各2.5mM的dNTPs 2μL，DNA或RNA或以RNA为模板转录得到的cDNA 1μL，SEQ ID No.3所示的单链DNA，SEQ ID No.4所示的单链DNA，加水补足至25μL。所述反应体系中所述SEQ ID No.3所示的单链DNA和所述SEQ IDNo.4所示的单链DNA的浓度均为0.4μmol/L。所述PCR扩增的反应程序如下：94℃5min；94℃30s，54℃30s，72℃45s，35个循环；72℃10min。
上文中，用所述C进行PCR扩增的反应体系可为：Taq DNA polymerase(5U/μL)0.2μL，10×PCR buffer 2.5μL，含有dATP、dTTP、dCTP和dGTP各2.5mM的dNTPs 2μL，DNA或RNA或以RNA为模板转录得到的cDNA 1μL，SEQ ID No.5所示的单链DNA，SEQ ID No.6所示的单链DNA，加水补足至25μL。所述反应体系中所述SEQ ID No.5所示的单链DNA和所述SEQ IDNo.6所示的单链DNA的浓度均为0.4μmol/L。所述PCR扩增的反应程序如下：94℃5min；94℃30s，54℃30s，72℃45s，35个循环；72℃10min。
上文中，用所述成套引物3进行PCR扩增的反应体系可为：Taq DNA polymerase(5U/μL)0.2μL，10×PCR buffer 2.5μL，含有dATP、dTTP、dCTP和dGTP各2.5mM的dNTPs 2μL，DNA或RNA或以RNA为模板转录得到的cDNA 1μL，SEQ ID No.3所示的单链DNA，SEQ ID No.4所示的单链DNA，SEQ ID No.5所示的单链DNA，SEQ ID No.6所示的单链DNA，加水补足至25μL。所述反应体系中所述SEQ ID No.3所示的单链DNA和所述SEQ ID No.4所示的单链DNA的浓度均为0.4μmol/L，所述SEQ ID No.5所示的单链DNA和所述SEQ ID No.6所示的单链DNA的浓度均为0.4μmol/L。所述PCR扩增的反应程序如下：94℃5min；94℃30s，54℃30s，72℃45s，35个循环；72℃10min。
本发明中，所述A、所述B和所述C的每种引物对中的两条单链DNA均可独立包装。
本发明中，所述成套引物1的所述A、所述B和所述C这三种PCR引物对可单独使用，也可任两种一起使用，也可三种一起使用。所述成套引物1中的任两种引物对一起使用时引物对的摩尔比可为1:1；所述A、所述B和所述C一起使用时，所述A、所述B和所述C的摩尔比可为1:1:1；所述成套引物2的所述A和所述B一起使用时，所述A和所述B的摩尔比可为1:1；所述成套引物3的所述A和所述C一起使用时，所述A和所述C的摩尔数摩尔比可为1:1。
本发明中，每种引物对中的两条单链DNA的摩尔比均可为1:1。
本发明中，所述DNA Polymerase可为Taq DNA Polymerase。所述Taq DNAPolymerase具体可为宝生物工程(大连)有限公司产品，货号为DR001A。所述10×PCRbuffer具体可为宝生物工程(大连)有限公司产品，货号为DR001A。所述dNTPs具体可为宝生物工程(大连)有限公司产品，货号为DR001A。
实验证明，本发明的鉴定或辅助鉴定香蕉枯萎病菌的成套引物中的A、B和C均可以特异地鉴定出目的菌株，灵敏度高：本发明的鉴定香蕉枯萎病菌中的尖孢镰刀菌古巴专化型的PCR引物对B可以特异地从香蕉枯萎病菌中的尖孢镰刀菌古巴专化型的核酸中扩增出目的条带，灵敏度可达5pg/25μL；本发明的鉴定香蕉枯萎病菌中的尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种的PCR引物对A可以特异地从香蕉枯萎病菌中的尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种的核酸中扩增出目的条带，灵敏度可达50fg/25μL；本发明的鉴定香蕉枯萎病菌中的尖孢镰刀菌古巴专化型亚热带4号生理小种的PCR引物对C可以特异地从香蕉枯萎病菌中的尖孢镰刀菌 古巴专化型亚热带4号生理小种的核酸中扩增出目的条带，灵敏度可达500fg/25μL。
实验证明，本发明的鉴定或辅助鉴定香蕉枯萎病菌的成套引物1可以特异地鉴定香蕉枯萎病菌中的尖孢镰刀菌古巴专化型、尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种和尖孢镰刀菌古巴专化型亚热带4号生理小种；本发明的鉴定或辅助鉴定香蕉枯萎病菌的成套引物2可以特异地鉴定香蕉枯萎病菌中的尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种和尖孢镰刀菌古巴专化型亚热带4号生理小种；本发明的鉴定或辅助鉴定香蕉枯萎病菌的成套引物3可以特异地鉴定香蕉枯萎病菌中的尖孢镰刀菌古巴专化型和尖孢镰刀菌古巴专化型亚热带4号生理小种；本发明的鉴定香蕉枯萎病菌中的尖孢镰刀菌古巴专化型亚热带4号生理小种的PCR引物对C可以特异地鉴定香蕉枯萎病菌中的尖孢镰刀菌古巴专化型亚热带4号生理小种。本发明的鉴定或辅助鉴定香蕉枯萎病菌的成套引物鉴定香蕉枯萎病菌时，模板不受来源的限制，所用模板可为待测菌株核酸也可为植物组织核酸。
附图说明
图1为利用引物对ITS1和ITS4对各菌株的总DNA的PCR检测结果。
图2为利用PCR引物对B对各菌株的总DNA的PCR检测结果。
图3为利用PCR引物对B对部分菌株的cDNA的PCR检测结果。其中，泳道M为DL2000marker；不同泳道的菌株名称如下：1为B2；2为TR4；3为STR4；4为N2；5为阴性对照。
图4为利用PCR引物对A对各菌株的总DNA的PCR检测结果。其中，A和B分别为利用PCR引物对A对部分菌株的总DNA的PCR检测结果。图A中，泳道M为DL2000 marker；不同泳道的菌株名称如下：1：BW4；2：TR4；3：STR4；4：3#①；5：3#②；6：5#①；7：5#②；8：6#①；9：6#②；10：7#①；11：7#②；12：9#①；13：9#②；14：34#①；15：34#②；16：36#①；17：36#②；18：37#①；19：37#②；20：QWXZ b-2；21：NXXZ；22：NBXZ a；23：DTXZ-1 a-1；24：DTXZ-2维a；25：DTXZ-3维；26：LDXZ a；27：LGXD-5维；28：LGXD-6维；29：ZJXD；30：ZJB1 b1；31：ZJB2 b2；32：XNB2 a；33：XNB5 a；34：XNB6 a；35：XSBN；36：HH；37：HZ；38：ZJ；39：NX-27；40：PB3-15；41：N2；42：11#②；43：40#①；44：40#②；45：42#①；46：BXFZ-1 b-1；47：BXFZ-2 a-2；48：FOC1；49：Foc1 e2；50：Race1；51：BW1；52：Race2；53：Race3；54：Fom；55：Fob；56：Fou；57：Foh；58：Foe；59：FOL；60：oxy-2；61：oxy-3；62：oxy-4；63：FGL-01；64：FGL-12-48；65：FGL-13-1；66：FGL-13-8；67：FCH-12-9；68：22；69：75；70：624；71：Fon1；72：H2O。图B中，泳道M为DL2000 marker；不同泳道的菌株名称如下：1：B2；2：N2；3：AB-2-8；4：AB-11-5-2；5：FJAT-9241；6：FJAT-9245；7：FJAT-3752；8：FJAT-3756；9：XJLJ4；10：FJAT-772；11：CH0001；12：CH0099；13：SX-02；14：XF-08；15：Pn006；16：CH001；17：b；18：HC-1；19：HC-2；20：HBHN01；21：1；22：尾1；23：MYD3；24：H2O。
图5为利用PCR引物对A对部分菌株的cDNA的PCR检测结果。其中，泳道M为DL2000marker；泳道1为B2；泳道2为B2 R1；泳道3为B2gfp；泳道4为N2；泳道5为阴性对照。
图6为利用PCR引物对C对各菌株的总DNA的PCR检测结果。
图7为利用PCR引物对C对部分菌株的cDNA的PCR检测结果。其中，泳道M为DL2000marker；不同泳道的菌株名称如下：1为B2；2为TR4；3为STR4；4为N2；5为阴性对照。
图8为利用PCR引物对B和C对植物组织总DNA的PCR检测结果。其中，泳道M为DL2000marker；不同泳道的菌株或植物组织的名称如下：1：STR4；2：B2；3：N2；4：感染STR4的巴西蕉球茎；5：感染B2的巴西蕉球茎；6：感染N2的粉蕉球茎；7：未感染任何菌株的健康巴西蕉球茎；8：未感染任何菌株的健康粉蕉球茎；9：阴性对照。
图1、图2和图6中，泳道M为DL2000 marker；不同泳道的菌株名称如下：1为B2；2为B2 R1；3为B2gfp；4为BW4；5为TR4；6为STR4；7为3#①；8为3#②；9为5#①；10为5#②；11为6#①；12为6#②；13为7#①；14为7#②；15为9#①；16为9#②；17为34#①；18为34#②；19为36#①；20为36#②；21为37#①；22为37#②；23为QWXZ b-2；24为NXXZ；25为NBXZ a；26为DTXZ-1a-1；27为DTXZ-2维a；28为DTXZ-3维；29为LDXZ a；30为LGXD-5维；31为LGXD-6维；32为ZJXD；33为ZJB1 b1；34为ZJB2 b2；35为XNB2 a；36为XNB5 a；37为XNB6 a；38为XSBN；39为HH；40为HZ；41为ZJ；42为NX-27；43为PB3-15；44为11#②；45为40#①；46为40#②；47为42#①；48为N2；49为BXFZ-1 b-1；50为BXFZ-2 a-2；51为FOC1；52为Foc1 e2；53为Race1；54为BW1；55为Race2；56为Race3；57为Fom；58为Fob；59为Fou；60为Foh；61为Foe；62为FOL；63为oxy-2；64为oxy-3；65为oxy-4；66为FGL-01；67为FGL-12-48；68为FGL-13-1；69为FGL-13-8；70为FCH-12-9；71为22；72为75；73为624；74为Fon1；75为AB-11-5-2；76为AB-2-8；77为FJAT-9241；78为FJAT-9245；79为FJAT-3752；80为FJAT-3756；81为XJLJ4；82为FJAT-772；83为CH0001；84为CH0099；85为SX-02；86为XF-08；87为Pn006；88为CH001；89为b；90为HC-1；91为HC-2；92为HBHN01；93为1；94为尾1；95为MYD3；96为阴性对照。
图9为鉴定香蕉枯萎病菌中的尖孢镰刀菌古巴专化型的PCR引物对B的灵敏度鉴定结果。
图10为鉴定香蕉枯萎病菌中的尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种的PCR引物对A的灵敏度鉴定结果。
图11为鉴定香蕉枯萎病菌中的尖孢镰刀菌古巴专化型亚热带4号生理小种的PCR引物对C的灵敏度鉴定结果。
图9-图11中，泳道M为DL2000 marker，泳道1为50ng/25μL反应体系，泳道2为5ng/25μL反应体系，泳道3为500pg/25μL反应体系，泳道4为50pg/25μL反应体系，泳道5为5pg/25μL反应体系，泳道6为500fg/25μL反应体系，泳道7为50fg/25μL反应体系，泳道8为5fg/25μL反应体系，泳道9为阴性对照。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的Taq DNA Polymerase为宝生物工程(大连)有限公司产品，货号为DR001A；10×PCR buffer为宝生物工程(大连)有限公司产品，货号为DR001A；dNTPs为宝生物工程(大连)有限公司产品，货号为DR001A。
下述实施例中的菌株如表1、表2和表3所示，公众可从中国热带农业科学院环境与植物保护研究所获得，这些生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
其中，B2、N2、3#②、5#①、6#②、11#②、36#①、40#①、ZJXD、STR4、TR4和Race1记载在文献(杨腊英,郭立佳,毛超,刘磊,王飞燕,谢玉萍,黄俊生.利用香蕉水培系统测定枯萎病病原菌致病力.2014，44(6):671-678.)中；
XSBN、HH、HZ、ZJ、FOC1与FOL记载在文献(唐琦,纪春艳,李云锋,王振中.不同地区香蕉枯萎病菌4号生理小种生物学特性及ITS序列分析.广东农业科学,2012,01:1-5.)中；
Fom、Fob、Fou、Foh和Foe记载在文献(李建湘，王振中.5种瓜类植物多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白的诱导表达及活性测定.广东农业科学,2013,1:143-146.)中；
BW1、BW4、Race2、Race3、AB-11-5-2和AB-2-8记载在文献(吕顺,曾莉莎,刘文清,王芳,赵志慧,周建坤,李洪波,杜彩娴,陈石,韩秀香,向欣叶.大蕉枯萎病病原菌鉴定及TEF-1α序列分析.植物病理学报,2014,04:337-348.)中；
1记载在文献(谢艺贤,张欣,范鸿雁,黄艳岚,杨腊英.海南香蕉褐缘灰斑病原菌的核酸分析鉴定.热带作物学报,2004,02:24-27.)中；
HC-1和HC-2记载在文献(蔡吉苗,陈瑶,潘羡心,黄贵修.海南橡胶树棒孢霉落叶病病情调查与病原鉴定.热带农业科学,2008,05:1-7+10.)中；
HBHN01记载在文献(刘先宝,高宏华,蔡吉苗,张新春,林春花,黄贵修.9种热区植物白粉病菌的rDNA-ITS序列及系统发育分析.热带作物学报,2013,01:98-104.)中；
b记载在文献(郑肖兰,梁艳琼,吴伟怀,李锐,林维雄,贺春萍.炭疽菌的遗传多样性初步分析.中国植物病理学会.中国植物病理学会2012年学术年会论文集.中国植物病理学会:2012:9.)中；
CH001记载在文献(史学群,宋海超,张欣,易克贤.海南和两广地区柱花草炭疽菌遗传多态性的RAPD分析.植物学通报,2007,2:173-180.)中；
SX-02和XF-08记载在文献(刘巧莲,朱军,郑金龙,陈河龙,高建明,张世清,易克贤.剑 麻茎腐病6个病原菌生物学特性的研究.中国麻业科学,2014,01:23-27+32.)中；
CH0001和CH0099记载在文献(郑金龙,刘巧莲,陈鸿,黄贵修,易克贤.剑麻斑马纹病病原菌生物学特性初步研究.热带农业科学,2008,06:15-18.)中；
Pn006记载在文献(贺春萍,李锐,吴伟怀,郑肖兰,吴川颖,梁艳琼.12种杀菌剂对橡胶树褐根病菌的毒力测定.热带作物学报,2013,10:1987-1990.)中；
FJAT-9241、FJAT-9245、FJAT-3752和FJAT-3756记载在文献(杨莹莹,刘波,肖荣凤,朱育菁.番茄、茄子和辣椒枯萎病原菌分子鉴定及其致病性测定.热带作物学报,2012,05:906-912.)中；
Fon1记载在文献(曾凡云,裴月令,彭军,龙海波,郭建荣.西瓜枯萎病菌T-DNA插入体库的构建及表型异常突变体的筛选.中国植物保护学会.“创新驱动与现代植保”——中国植物保护学会第十一次全国会员代表大会暨2013年学术年会论文集.中国植物保护学会,2013:1.)中；
FGL-01记载在文献(张吉祥.甘蓝枯萎病菌1、2号生理小种特异基因鉴定及应用.中国农业科学院,植物保护,2014,硕士毕业论文.)中。
表1、供试菌株详细情况表(1)
表2、供试菌株详细情况表(2)
表3、供试菌株详细情况表(3)
实施例1、鉴定或辅助鉴定香蕉枯萎病菌的引物的制备
鉴定香蕉枯萎病菌中的尖孢镰刀菌古巴专化型的PCR引物对，其名称为B，可从香蕉枯萎病菌中的尖孢镰刀菌古巴专化型的DNA中扩增出大小为730bp的DNA片段，可从香蕉枯萎病菌中的尖孢镰刀菌古巴专化型的RNA或以RNA为模板转录得到的cDNA中扩增出大小为699bp的DNA片段；所述B由序列表中SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示的两条单链DNA组成。
鉴定香蕉枯萎病菌中的尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种的PCR引物对，其名称为A，可从香蕉枯萎病菌中的尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种的DNA或RNA或以RNA为模板转录得到的cDNA中扩增出大小为699bp的DNA片段；所述A由序列表中SEQ ID No.1和SEQID No.2所示的两条单链DNA组成。
鉴定香蕉枯萎病菌中的尖孢镰刀菌古巴专化型亚热带4号生理小种的PCR引物对，其名称 为C，可从香蕉枯萎病菌中的尖孢镰刀菌古巴专化型亚热带4号生理小种的DNA或RNA或以RNA为模板转录得到的cDNA中扩增出大小为663bp的DNA片段；所述C由序列表中SEQID No.5和SEQ ID No.6所示的两条单链DNA组成。
鉴定或辅助鉴定香蕉枯萎病菌的成套引物1由A、B和C组成，成套引物1可用来鉴定香蕉枯萎病菌中的尖孢镰刀菌古巴专化型、尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种和尖孢镰刀菌古巴专化型亚热带4号生理小种；鉴定或辅助鉴定香蕉枯萎病菌的成套引物2由A和C组成，成套引物2可用来鉴定香蕉枯萎病菌中的尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种和尖孢镰刀菌古巴专化型亚热带4号生理小种；鉴定或辅助鉴定香蕉枯萎病菌的成套引物3由B和C组成，成套引物3可用来鉴定尖孢镰刀菌古巴专化型和尖孢镰刀菌古巴专化型亚热带4号生理小种；鉴定或辅助鉴定香蕉枯萎病菌的成套引物甲由A和B组成，成套引物甲可用来鉴定香蕉枯萎病菌中的尖孢镰刀菌古巴专化型和尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种。
实施例2、实施例1的鉴定香蕉枯萎病菌中的尖孢镰刀菌古巴专化型的PCR引物对B的特异性和灵敏度实验
一、模板的制备
按照文献(杨腊英，黄华平，唐复润，等.植物病理学报.2006，36(3)：219-225.)的方法抽提并得到下述各菌株的总DNA：
1：B2；2：B2R1；3：B2gfp；4：BW4；5：TR4；6：STR4；7：3#①；8：3#②；9：5#①；10：5#②；11：6#①；12：6#②；13：7#①；14：7#②；15：9#①；16：9#②；17：34#①；18：34#②；19：36#①；20：36#②；21：37#①；22：37#②；23：QWXZ b-2；24：NXXZ；25：NBXZ a；26：DTXZ-1 a-1；27：DTXZ-2维a；28：DTXZ-3维；29：LDXZ a；30：LGXD-5维；31：LGXD-6维；32：ZJXD；33：ZJB1 b1；34：ZJB2 b2；35：XNB2 a；36：XNB5 a；37：XNB6 a；38：XSBN；39：HH；40：HZ；41：ZJ；42：NX-27；43：PB3-15；44：11#②；45：40#①；46：40#②；47：42#①；48：N2；49：BXFZ-1 b-1；50：BXFZ-2a-2；51：FOC1；52：Foc1 e2；53：Race1；54：BW1；55：Race2；56：Race3；57：Fom；58：Fob；59：Fou；60：Foh；61：Foe；62：FOL；63：oxy-2；64：oxy-3；65：oxy-4；66：FGL-01；67：FGL-12-48；68：FGL-13-1；69：FGL-13-8；70：FCH-12-9；71：22；72：75；73：624；74：Fon1；75：AB-11-5-2；76：AB-2-8；77：FJAT-9241；78：FJAT-9245；79：FJAT-3752；80：FJAT-3756；81：XJLJ4；82：FJAT-772；83：CH0001；84：CH0099；85：SX-02；86：XF-08；87：Pn006；88：CH001；89：b；90：HC-1；91：HC-2；92：HBHN01；93：1；94：尾1；95：MYD3。
调整上述总DNA的浓度均至20ng/μL，置于-20℃冰箱中保存备用。采用引物对ITS1：TCCGTAGGTGAACCTGCGG(5’-3’)和ITS4：TCCTCCGCTTATTGATATGC(5’-3’)对上述总DNA进行PCR检测(以无菌水作为阴性对照)，结果显示以上述各菌株的总DNA为模板均能扩增出546bp的条带，表明上述各菌株的总DNA均可进行下一步实验(图1)。
采用异硫氰酸胍法提取并得到下述菌株的总RNA：B2；B2 R1；B2gfp；TR4；STR4；N2。采用TaKaRa RNA PCR Kit并按照试剂盒中的说明书中将上述总RNA进行反转录，分别得到B2 cDNA、B2 R1 cDNA、B2gfp cDNA、TR4 cDNA、STR4 cDNA和N2 cDNA。
二、鉴定香蕉枯萎病菌中的尖孢镰刀菌古巴专化型的PCR引物对B的特异性实验
分别以菌株的总DNA和菌株的cDNA为PCR扩增的模板分别对实施例1的鉴定香蕉枯萎病菌中的尖孢镰刀菌古巴专化型的PCR引物对B进行特异性鉴定，实验重复三次，每次重复实验的具体步骤如下：
1、以菌株的总DNA为PCR扩增的模板
用实施例1的鉴定香蕉枯萎病菌中的尖孢镰刀菌古巴专化型的PCR引物对B对步骤一的各菌株的总DNA进行PCR扩增，PCR扩增的反应体系均为：Taq DNA polymerase(5U/μL)0.2μL，10×PCR buffer 2.5μL，含有dATP、dTTP、dCTP和dGTP各2.5mM的dNTPs 2μL，总DNA(每个反应体系中一种DNA)1μL，SEQ ID No.3所示的单链DNA，SEQ ID No.4所示的单链DNA，加水补足至25μL。以无菌水作为阴性对照，反应体系中SEQ ID No.3所示的单链DNA和SEQID No.4所示的单链DNA的浓度均为0.4μmol/L。
PCR扩增的程序如下：94℃5min；94℃30s，54℃℃30s，72℃45s，35个循环；72℃10min。
对PCR扩增得到的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图2所示。结果显示，图2中的泳道1-55的模板均为尖孢镰刀菌古巴专化型的总DNA，各泳道菌株名称如下：1为B2；2为B2 R1；3为B2gfp；4为BW4；5为TR4；6为STR4；7为3#①；8为3#②；9为5#①；10为5#②；11为6#①；12为6#②；13为7#①；14为7#②；15为9#①；16为9#②；17为34#①；18为34#②；19为36#①；20为36#②；21为37#①；22为37#②；23为QWXZ b-2；24为NXXZ；25为NBXZ a；26为DTXZ-1a-1；27为DTXZ-2维a；28为DTXZ-3维；29为LDXZ a；30为LGXD-5维；31为LGXD-6维；32为ZJXD；33为ZJB1 b1；34为ZJB2 b2；35为XNB2 a；36为XNB5 a；37为XNB6 a；38为XSBN；39为HH；40为HZ；41为ZJ；42为NX-27；43为PB3-15；44为11#②；45为40#①；46为40#②；47为42#①；48为N2；49为BXFZ-1 b-1；50为BXFZ-2 a-2；51为FOC1；52为Foc1 e2；53为Race1；54为BW1；55为Race2，泳道1-55中均有到大小在500bp-750bp间的条带(测序结果表明，这些500bp-750bp的条带的大小均为730bp)；非尖孢镰刀菌古巴专化型的其他菌株(图2中泳道56-95)和阴性对照(图2中泳道96)均扩增不到任何条带。结果表明，实施例1的鉴定香蕉枯萎病菌中的尖孢镰刀菌古巴专化型的PCR引物对B特异性好，与其他菌株没有交叉反应，没有非特异的杂带产生，可以特异地从香蕉枯萎病菌中的尖孢镰刀菌古巴专化型的总DNA中扩增出大小为730bp的条带，该引物对可以用来鉴定香蕉枯萎病菌中的尖孢镰刀菌古巴专化型。
2、以菌株的cDNA为PCR扩增的模板
用实施例1的鉴定香蕉枯萎病菌中的尖孢镰刀菌古巴专化型的PCR引物对B对步骤一的B2 cDNA、TR4 cDNA、STR4 cDNA和N2 cDNA进行PCR扩增，PCR扩增的反应体系均为：TaqDNA polymerase(5U/μL)0.2μL，10×PCR buffer 2.5μL，含有dATP、dTTP、dCTP和dGTP各2.5mM的dNTPs 2μL，cDNA(每个反应体系中一种cDNA)1μL，SEQ ID No.3所示的单链DNA，SEQID No.4所示的单链DNA，加水补足至25μL。以无菌水作为阴性对照，反应体系中SEQ IDNo.3所示的单链DNA和SEQ ID No.4所示的单链DNA的浓度均为0.4μmol/L。
PCR扩增的程序如下：94℃5min；94℃30s，54℃30s，72℃45s，35个循环；72℃10min。
对PCR扩增得到的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图3所示。结果显示，B2(泳道1)、TR4(泳道2)、STR4(泳道3)和N2(泳道4)均可以扩增到大小在500bp-750bp间的条带(测序结果表明，这些500bp-750bp的条带的大小均为699bp)，阴性对照(泳道5)中无任何条带。结果表明，实施例1的鉴定香蕉枯萎病菌中的尖孢镰刀菌古巴专化型的PCR引物对B可以从香蕉枯萎病菌中的尖孢镰刀菌古巴专化型的cDNA中扩增出大小为699bp的条带。
三、鉴定香蕉枯萎病菌中的尖孢镰刀菌古巴专化型的PCR引物对B的敏感性实验
用无菌水对步骤一的BW4菌株的总DNA进行梯度稀释，得到浓度分别为50ng/μL、5ng/μL、500pg/μL、50pg/μL、5pg/μL、500fg/μL、50fg/μL和5fg/μL的BW4总DNA溶液。
分别以浓度为50ng/μL、5ng/μL、500pg/μL、50pg/μL、5pg/μL、500fg/μL、50fg/μL和5fg/μL的BW4总DNA溶液中的核酸为模板，用实施例1的鉴定香蕉枯萎病菌中的尖孢镰刀菌古巴专化型的PCR引物对B进行PCR扩增，PCR扩增均采用25μL的反应体系，将对浓度为50ng/μL、5ng/μL、500pg/μL、50pg/μL、5pg/μL、500fg/μL、50fg/μL和5fg/μL的BW4总DNA溶液中的核酸进行PCR扩增的反应体系分别命名为50ng/25μL反应体系、5ng/25μL反应体系、500pg/25μL反应体系、50pg/25μL反应体系、5pg/25μL反应体系、500fg/25μL反应体系、50fg/25μL反应体系和5fg/25μL反应体系。
50ng/25μL反应体系的配制方法为：Taq DNA polymerase(5U/μL)0.2μL，10×PCRbuffer 2.5μL，含有dATP、dTTP、dCTP和dGTP各2.5mM的dNTPs 2μL，浓度为50ng/μL的BW4总DNA溶液1μL，SEQ ID No.3所示的单链DNA，SEQ ID No.4所示的单链DNA，加水补足至25μL。反应体系中SEQ ID No.3所示的单链DNA和SEQ ID No.4所示的单链DNA的浓度均为0.4μmol/L。
按照上述方法，将浓度为50ng/μL的BW4总DNA溶液分别替换为上述浓度分别为5ng/μL、500pg/μL、50pg/μL、5pg/μL、500fg/μL、50fg/μL和5fg/μL的BW4总DNA溶液，其他步骤均不变，分别得到5ng/25μL反应体系、500pg/25μL反应体系、50pg/25μL反应 体系、5pg/25μL反应体系、500fg/25μL反应体系、50fg/25μL反应体系和5fg/25μL反应体系。
以无菌水作为阴性对照进行PCR扩增，PCR扩增的程序均为：94℃5min；94℃30s，54℃30s，72℃45s，35个循环；72℃10min。
对PCR扩增得到的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图9所示。结果显示，50ng/25μL的反应体系(泳道1)、5ng/25μL的反应体系(泳道2)、500pg/25μL的反应体系(泳道3)、50pg/25μL的反应体系(泳道4)、5pg/25μL的反应体系(泳道5)均可以扩增到大小在500bp-750bp间的条带(测序结果表明，这些500bp-750bp的条带的大小均为730bp)，500fg/25μL的反应体系(泳道6)、50fg/25μL的反应体系(泳道7)、5fg/25μL的反应体系(泳道8)和阴性对照(泳道9)均不能得到任何条带。结果表明，实施例1的鉴定香蕉枯萎病菌中的尖孢镰刀菌古巴专化型的PCR引物对B鉴定香蕉枯萎病菌中的尖孢镰刀菌古巴专化型的灵敏度可达5pg/25μL。
实施例3、实施例1的鉴定香蕉枯萎病菌中的尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种的PCR引物对A的特异性和灵敏度实验
一、实施例1的鉴定香蕉枯萎病菌中的尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种的PCR引物对A的特异性实验
分别以菌株的总DNA和菌株的cDNA为PCR扩增的模板分别对实施例1的鉴定香蕉枯萎病菌中的尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种的PCR引物对A进行特异性鉴定，实验重复三次，每次重复实验的具体步骤如下：
1、以菌株的总DNA为PCR扩增的模板
用实施例1的鉴定香蕉枯萎病菌中的尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种的PCR引物对A对实施例2步骤一的各菌株的总DNA进行PCR扩增，PCR扩增的反应体系均为：Taq DNApolymerase(5U/μL)0.2μL，10×PCR buffer 2.5μL，含有dATP、dTTP、dCTP和dGTP各2.5mM的dNTPs 2μL，菌株总DNA(每个反应体系中一种DNA)，SEQ ID No.1所示的单链DNA，SEQ IDNo.2所示的单链DNA，加水补足至25μL。以无菌水作为阴性对照，反应体系中SEQ ID No.1所示的单链DNA和SEQ ID No.2所示的单链DNA的浓度均为0.4μmol/L。
PCR扩增的程序如下：94℃5min；94℃30s，56℃30s，72℃45s，35个循环；72℃10min。
对PCR扩增得到的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图4所示。结果显示，图4的A中的泳道1-40的模板均为尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种的总DNA，泳道1-40的菌株名称如下：1：BW4；2：TR4；3：STR4；4：3#①；5：3#②；6：5#①；7：5#②；8：6#①；9：6#②；10：7#①；11：7#②；12：9#①；13：9#②；14：34#①；15：34#②；16：36#①；17：36#②；18：37#①；19：37#②；20：QWXZ b-2；21：NXXZ；22：NBXZ a；23：DTXZ-1 a-1； 24：DTXZ-2维a；25：DTXZ-3维；26：LDXZ a；27：LGXD-5维；28：LGXD-6维；29：ZJXD；30：ZJB1 b1；31：ZJB2 b2；32：XNB2 a；33：XNB5 a；34：XNB6 a；35：XSBN；36：HH；37：HZ；38：ZJ；39：NX-27；40：PB3-15，图4的B中的泳道1的模板为尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种的总DNA，菌株名称为B2。图4的A的泳道1-40和B的泳道1中均有到大小在500bp-750bp间的条带(测序结果表明，这些500bp-750bp的条带的大小均为699bp)。非尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种的其他菌株(图4的A的泳道41-71和B的泳道2-23)和阴性对照(图4的A的泳道72和B的泳道24)均扩增不到任何条带。结果表明，实施例1的鉴定香蕉枯萎病菌中的尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种的PCR引物对A特异性好，与其他菌株没有交叉反应，没有非特异的杂带产生，可以特异地从香蕉枯萎病菌中的尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种的总DNA中扩增出大小为699bp的条带，该引物对可以用来鉴定香蕉枯萎病菌中的尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种。
2、以菌株的cDNA为PCR扩增的模板
用实施例1的鉴定香蕉枯萎病菌中的尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种的PCR引物对A对实施例2步骤一的B2 cDNA、B2 R1 cDNA、B2gfp cDNA和N2 cDNA进行PCR扩增，PCR扩增的反应体系均为：Taq DNA polymerase(5U/μL)0.2μL，10×PCR buffer 2.5μL，含有dATP、dTTP、dCTP和dGTP各2.5mM的dNTPs 2μL，菌株cDNA(每个反应体系中一种cDNA)，SEQID No.1所示的单链DNA，SEQ ID No.2所示的单链DNA，加水补足至25μL。以无菌水作为阴性对照，反应体系中SEQ ID No.1所示的单链DNA和SEQ ID No.2所示的单链DNA的浓度均为0.4μmol/L。
PCR扩增的程序如下：94℃5min；94℃30s，56℃30s，72℃45s，35个循环；72℃10min。
对PCR扩增得到的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图5所示。结果显示，B2(泳道1)、B2R1(泳道2)和B2gfp(泳道3)均可以扩增到大小在500bp-750bp间的条带(测序结果表明，这些500bp-750bp的条带的大小均为699bp)，N2(泳道4)和阴性对照(泳道5)均不能得到任何条带。结果表明，实施例1的鉴定香蕉枯萎病菌中的尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种的PCR引物对A与其他菌株没有交叉反应，没有非特异的杂带产生，可以特异地从香蕉枯萎病菌中的尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种的cDNA中扩增出大小为699bp的条带。
二、实施例1的鉴定香蕉枯萎病菌中的尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种的PCR引物对A的灵敏度实验
用无菌水对实施例2步骤一的BW4菌株的总DNA进行梯度稀释，得到浓度分别为50ng/μL、5ng/μL、500pg/μL、50pg/μL、5pg/μL、500fg/μL、50fg/μL和5fg/μL的BW4总DNA溶液。
分别以浓度为50ng/μL、5ng/μL、500pg/μL、50pg/μL、5pg/μL、500fg/μL、50fg/μL和5fg/μL的BW4总DNA溶液中的核酸为模板，用实施例1的鉴定香蕉枯萎病菌中的尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种的PCR引物对A进行PCR扩增，PCR扩增均采用25μL的反应体系，将对浓度为50ng/μL、5ng/μL、500pg/μL、50pg/μL、5pg/μL、500fg/μL、50fg/μL和5fg/μL的BW4总DNA溶液中的核酸进行PCR扩增的反应体系分别命名为50ng/25μL反应体系、5ng/25μL反应体系、500pg/25μL反应体系、50pg/25μL反应体系、5pg/25μL反应体系、500fg/25μL反应体系、50fg/25μL反应体系和5fg/25μL反应体系。
50ng/25μL反应体系的配制方法为：Taq DNA polymerase(5U/μL)0.2μL，10×PCRbuffer 2.5μL，含有dATP、dTTP、dCTP和dGTP各2.5mM的dNTPs 2μL，浓度为50ng/μL的BW4总DNA溶液1μL，SEQ ID No.1所示的单链DNA，SEQ ID No.2所示的单链DNA，加水补足至25μL。反应体系中SEQ ID No.1所示的单链DNA和SEQ ID No.2所示的单链DNA的浓度均为0.4μmol/L。
按照上述方法，将浓度为50ng/μL的BW4总DNA溶液分别替换为上述浓度分别为5ng/μL、500pg/μL、50pg/μL、5pg/μL、500fg/μL、50fg/μL和5fg/μL的BW4总DNA溶液，其他步骤均不变，分别得到5ng/25μL反应体系、500pg/25μL反应体系、50pg/25μL反应体系、5pg/25μL反应体系、500fg/25μL反应体系、50fg/25μL反应体系和5fg/25μL反应体系。
以无菌水作为阴性对照进行PCR扩增，PCR扩增的程序均为：94℃5min；94℃30s，56℃30s，72℃45s，35个循环；72℃10min。
对PCR扩增得到的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图10所示。结果显示，50ng/25μL的反应体系(泳道1)、5ng/25μL的反应体系(泳道2)、500pg/25μL的反应体系(泳道3)、50pg/25μL的反应体系(泳道4)、5pg/25μL的反应体系(泳道5)、500fg/25μL的反应体系(泳道6)、50fg/25μL的反应体系(泳道7)均可以扩增到大小在500bp-750bp间的条带(测序结果表明，这些500bp-750bp的条带的大小均为699bp)，5fg/25μL的反应体系(泳道8)和阴性对照(泳道9)均不能得到任何条带。结果表明，实施例1的鉴定香蕉枯萎病菌中的尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种的PCR引物对A鉴定香蕉枯萎病菌中的尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种的灵敏度可达50fg/25μL。
实施例4、实施例1的鉴定香蕉枯萎病菌中的尖孢镰刀菌古巴专化型亚热带4号生理小种的PCR引物对C的特异性和灵敏度实验
一、实施例1的鉴定香蕉枯萎病菌中的尖孢镰刀菌古巴专化型亚热带4号生理小种的PCR引物对C的特异性实验
分别以菌株的总DNA和菌株的cDNA为PCR扩增的模板分别对实施例1的鉴定香蕉枯萎病菌中的尖孢镰刀菌古巴专化型亚热带4号生理小种的PCR引物对C进行特异性鉴定，实验重 复三次，每次重复实验的具体步骤如下：
1、以菌株的总DNA为PCR扩增的模板
用实施例1的鉴定香蕉枯萎病菌中的尖孢镰刀菌古巴专化型亚热带4号生理小种的PCR引物对C对实施例2步骤一的各菌株的总DNA进行PCR扩增，PCR扩增的反应体系均为：Taq DNA polymerase(5U/μL)0.2μL，10×PCR buffer 2.5μL，含有dATP、dTTP、dCTP和dGTP各2.5mM的dNTPs 2μL，菌株总DNA(每个反应体系中一种DNA)1μL，SEQ ID No.5所示的单链DNA，SEQ ID No.6所示的单链DNA，加水补足至25μL。以无菌水作为阴性对照，反应体系中SEQ ID No.5所示的单链DNA和SEQ ID No.6所示的单链DNA的浓度均为0.4μmol/L。
PCR扩增的程序如下：94℃5min；94℃30s，54℃30s，72℃45s，35个循环；72℃10min。
对PCR扩增得到的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图6所示。结果显示，图6中的泳道4和6的模板均为尖孢镰刀菌古巴专化型4号亚热带生理小种的总DNA，菌株名称分别为BW4和STR4。图6的泳道4和6中均有到大小在500bp-750bp间的条带(测序结果表明，这些500bp-750bp的条带的大小均为663bp)。非尖孢镰刀菌古巴专化型亚热带4号生理小种的其他菌株(图6的泳道1-3、5和7-95)和阴性对照(图6的泳道96)均扩增不到任何条带。结果表明，实施例1的鉴定香蕉枯萎病菌中的尖孢镰刀菌古巴专化型亚热带4号生理小种的PCR引物对C特异性好，与其他菌株没有交叉反应，没有非特异的杂带产生，可以特异地从香蕉枯萎病菌中的尖孢镰刀菌古巴专化型亚热带4号生理小种的总DNA中扩增出大小为663bp的条带，该引物对可以用来鉴定香蕉枯萎病菌中的尖孢镰刀菌古巴专化型亚热带4号生理小种。
2、以菌株的cDNA为PCR扩增的模板
用实施例1的鉴定香蕉枯萎病菌中的尖孢镰刀菌古巴专化型亚热带4号生理小种的PCR引物对C对实施例2步骤一的B2 cDNA、TR4 cDNA、STR4 cDNA和N2 cDNA进行PCR扩增，PCR扩增的反应体系均为：Taq DNA polymerase(5U/μL)0.2μL，10×PCR buffer 2.5μL，含有dATP、dTTP、dCTP和dGTP各2.5mM的dNTPs 2μL，菌株cDNA(每个反应体系中一种cDNA)1μL，SEQ ID No.5所示的单链DNA，SEQ ID No.6所示的单链DNA，加水补足至25μL。所述反应体系中所述SEQ ID No.5所示的单链DNA和所述SEQ ID No.6所示的单链DNA的浓度均为0.4μmol/L。以无菌水作为阴性对照，反应体系中SEQ ID No.5所示的单链DNA和SEQ ID No.6所示的单链DNA的浓度均为0.4μmol/L。
PCR扩增的程序如下：94℃5min；94℃30s，54℃30s，72℃45s，35个循环；72℃10min。
对PCR扩增得到的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图7所示。结果显示，STR4(泳 道3)可以扩增到大小在500bp-750bp间的条带(测序结果表明，该500bp-750bp的条带的大小为663bp)，B2(泳道1)、TR4(泳道2)、N2(泳道4)和阴性对照(泳道5)均不能得到任何条带。结果表明，实施例1的鉴定香蕉枯萎病菌中的尖孢镰刀菌古巴专化型亚热带4号生理小种的PCR引物对C与其他菌株没有交叉反应，没有非特异的杂带产生，可以特异地从香蕉枯萎病菌中的尖孢镰刀菌古巴专化型亚热带4号生理小种的cDNA中扩增出大小为663bp的条带。
二、实施例1的鉴定香蕉枯萎病菌中的尖孢镰刀菌古巴专化型亚热带4号生理小种的PCR引物对C的灵敏度实验
用无菌水对实施例2步骤一的BW4菌株的总DNA进行梯度稀释，得到浓度分别为50ng/μL、5ng/μL、500pg/μL、50pg/μL、5pg/μL、500fg/μL、50fg/μL和5fg/μL的BW4总DNA溶液。
分别以浓度为50ng/μL、5ng/μL、500pg/μL、50pg/μL、5pg/μL、500fg/μL、50fg/μL和5fg/μL的BW4总DNA溶液中的核酸为模板，用实施例1的鉴定香蕉枯萎病菌中的尖孢镰刀菌古巴专化型亚热带4号生理小种的PCR引物对C进行PCR扩增，PCR扩增均采用25μL的反应体系，将对浓度为50ng/μL、5ng/μL、500pg/μL、50pg/μL、5pg/μL、500fg/μL、50fg/μL和5fg/μL的BW4总DNA溶液中的核酸进行PCR扩增的反应体系分别命名为50ng/25μL反应体系、5ng/25μL反应体系、500pg/25μL反应体系、50pg/25μL反应体系、5pg/25μL反应体系、500fg/25μL反应体系、50fg/25μL反应体系和5fg/25μL反应体系。
50ng/25μL反应体系的配制方法为：Taq DNA polymerase(5U/μL)0.2μL，10×PCRbuffer 2.5μL，含有dATP、dTTP、dCTP和dGTP各2.5mM的dNTPs 2μL，浓度为50ng/μL的BW4总DNA溶液1μL，SEQ ID No.5所示的单链DNA，SEQ ID No.6所示的单链DNA，加水补足至25μL。反应体系中SEQ ID No.5所示的单链DNA和SEQ ID No.6所示的单链DNA的浓度均为0.4μmol/L。
按照上述方法，将浓度为50ng/μL的BW4总DNA溶液分别替换为上述浓度分别为5ng/μL、500pg/μL、50pg/μL、5pg/μL、500fg/μL、50fg/μL和5fg/μL的BW4总DNA溶液，其他步骤均不变，分别得到5ng/25μL反应体系、500pg/25μL反应体系、50pg/25μL反应体系、5pg/25μL反应体系、500fg/25μL反应体系、50fg/25μL反应体系和5fg/25μL反应体系。
以无菌水作为阴性对照进行PCR扩增，PCR扩增的程序均为：94℃5min；94℃30s，54℃30s，72℃45s，35个循环；72℃10min。
对PCR扩增得到的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图11所示。结果显示，50ng/25μL的反应体系(泳道1)、5ng/25μL的反应体系(泳道2)、500pg/25μL的反应体系(泳道3)、50pg/25μL的反应体系(泳道4)、5pg/25μL的反应体系(泳道5)、500fg/25μL的 反应体系(泳道6)均可以扩增到大小在500bp-750bp间的条带(测序结果表明，这些500bp-750bp的条带的大小均为663bp)，50fg/25μL的反应体系(泳道7)、5fg/25μL的反应体系(泳道8)和阴性对照(泳道9)均不能得到任何条带。结果表明，实施例1的鉴定香蕉枯萎病菌中的尖孢镰刀菌古巴专化型亚热带4号生理小种的PCR引物对C鉴定香蕉枯萎病菌中的尖孢镰刀菌古巴专化型亚热带4号生理小种的灵敏度可达500fg/25μL。
实施例5、实施例1的鉴定香蕉枯萎病菌中的尖孢镰刀菌古巴专化型和尖孢镰刀菌古巴专化型亚热带4号生理小种的成套引物3的特异性实验
按照文献(刘金福，潘东明，代立春,陈清西,庄西卿,李英豪.中国农学通报,2009,25(16):51-55.)的方法提取并得到下述感染不同菌株的巴西蕉球茎和粉蕉球茎的总DNA及健康巴西蕉球茎和健康粉蕉球茎的总DNA：感染STR4的巴西蕉球茎、感染B2的巴西蕉球茎、感染N2的粉蕉球茎、未感染任何菌株的巴西蕉球茎和未感染任何菌株的粉蕉球茎。
用Actin2的引物Actin2-F：ACAGTGTCTGGATTGGAGGC(5’-3’)和Actin2-R：GCACTTCATGTGGACAATGG(5’-3’)对上述球茎总DNA进行检测，均能扩增出目的条带，表明，上述总DNA均可进行下一步的实验。
用实施例1的鉴定香蕉枯萎病菌中的尖孢镰刀菌古巴专化型和香蕉枯萎病菌中的尖孢镰刀菌古巴专化型亚热带4号生理小种的成套引物3对实施例2步骤一的STR4总DNA、B2总DNA和N2总DNA以及上述球茎总DNA进行双重PCR扩增。
双重PCR扩增的反应体系均为：Taq DNA polymerase(5U/μL)0.2μL，10×PCRbuffer2.5μL，含有dATP、dTTP、dCTP和dGTP各2.5mM的dNTPs 2μL，菌株总DNA或球茎总DNA(每个反应体系中一种DNA)1μL，SEQ ID No.3所示的单链DNA，SEQ ID No.4所示的单链DNA，SEQ ID No.5所示的单链DNA，SEQ ID No.6所示的单链DNA，加水补足至25μL。以无菌水作为阴性对照，反应体系中SEQ ID No.3所示的单链DNA和SEQ ID No.4所示的单链DNA的浓度均为0.4μmol/L，SEQ ID No.5所示的单链DNA和SEQ ID No.6所示的单链DNA的浓度均为0.4μmol/L。
双重PCR扩增的反应程序如下：94℃5min；94℃30s，54℃30s，72℃45s，35个循环；72℃10min。
对双重PCR扩增得到的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图8所示。结果显示，STR4菌株(泳道1)和感染STR4的巴西蕉球茎(泳道4)均能扩增出两条大小均在500bp-750bp间的条带(测序结果表明，这两条在500bp-750bp的条带的大小分别为730bp和663bp)，B2菌株(泳道2)、N2菌株(泳道3)、感染B2的巴西蕉球茎(泳道5)和感染N2的粉蕉球茎(泳道6)均只能扩增出一条大小在500bp-750bp间的条带(测序结果表明，该500bp-750bp的条带的大小为730bp)，未感染任何菌株的巴西蕉球茎、未感染任何菌株的粉蕉球茎和阴性对照均不能扩增出任何条带。结果表明，实施例1的鉴定香蕉枯萎病菌中 的尖孢镰刀菌古巴专化型的PCR引物对B和鉴定香蕉枯萎病菌中的尖孢镰刀菌古巴专化型亚热带4号生理小种的PCR引物对C与其他菌株和植物组织均没有交叉反应，没有非特异的杂带产生，可以同时使用鉴定待测菌株或鉴定待测植株是否感染尖孢镰刀菌古巴专化型，并确定感染的尖孢镰刀菌古巴专化型是否为尖孢镰刀菌古巴专化型亚热带4号生理小种。本发明的鉴定或辅助鉴定香蕉枯萎病菌的成套引物鉴定香蕉枯萎病菌时，模板不受来源的限制，所用模板可为待测菌株核酸也可为植物组织核酸。

Claims (13)

1.鉴定或辅助鉴定香蕉枯萎病菌的成套引物，其特征在于：所述成套引物由名称为A的PCR引物对、名称为B的PCR引物对和名称为C的PCR引物对组成；
所述A由序列表中SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的两条单链DNA组成；所述B由序列表中SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示的两条单链DNA组成；所述C由序列表中SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示的两条单链DNA组成。
2.鉴定或辅助鉴定香蕉枯萎病菌的成套引物，其特征在于：所述成套引物由权利要求1所述A和权利要求1所述C组成。
3.鉴定或辅助鉴定香蕉枯萎病菌的成套引物，其特征在于：所述成套引物由权利要求1所述B和权利要求1所述C组成。
4.鉴定或辅助鉴定香蕉枯萎病菌的PCR引物对，其特征在于：所述PCR引物对为权利要求1所述C。
5.鉴定或辅助鉴定香蕉枯萎病菌的系统，其特征在于：所述系统为下述Hh-Kk中的任一种：
Hh、含有权利要求1所述成套引物的系统；
Ii、含有权利要求2所述成套引物的系统；
Jj、含有权利要求3所述成套引物的系统；
Kk、含有权利要求4所述C的系统。
6.根据权利要求5所述的系统，其特征在于：所述系统还包括DNA聚合酶。
7.鉴定或辅助鉴定香蕉枯萎病菌的方法，为下述H、I、J和K中的任一种：
H下述H1）或H2）：
H1）下述H11）和H12）：
H11）以待测生物样品的核酸为模板，用权利要求1所述A进行PCR扩增得到PCR产物A1；以所述待测生物样品的RNA或以RNA为模板转录得到的cDNA为模板，用权利要求1所述B进行PCR扩增得到PCR产物B1；以所述待测生物样品的核酸为模板，用权利要求1所述C进行PCR扩增得到PCR产物C1；
H12）检测H11）所述PCR产物A1、所述PCR产物B1和所述PCR产物C1的大小，如果所述PCR产物B1中含有699bp的DNA片段，所述PCR产物A1中含有699bp的DNA片段，所述PCR产物C1中含有663bp的DNA片段，所述待测样品含有尖孢镰刀菌古巴专化型亚热带4号生理小种；如果所述PCR产物B1中含有699bp的DNA片段，所述PCR产物A1中含有699bp的DNA片段，所述PCR产物C1中不含663bp的DNA片段，所述待测样品含有尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种，所述尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种不为尖孢镰刀菌古巴专化型亚热带4号生理小种；如果所述PCR产物B1中含有699bp的DNA片段，所述PCR产物A1中不含699bp的DNA片段，所述待测样品含有尖孢镰刀菌古巴专化型，所述尖孢镰刀菌古巴专化型不为尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种；如果所述PCR产物B1中不含699bp的DNA片段，所述待测样品不含尖孢镰刀菌古巴专化型；
H2）下述H21）和H22）：
H21）以待测生物样品的核酸为模板，用权利要求1所述A进行PCR扩增得到PCR产物A2；以所述待测生物样品的DNA为模板，用权利要求1所述B进行PCR扩增得到PCR产物B2；以所述待测生物样品的核酸为模板，用权利要求1所述C进行PCR扩增得到PCR产物C2；
H22）检测H21）所述PCR产物A2、所述PCR产物B2和所述PCR产物C2的大小，如果所述PCR产物B2中含有730bp的DNA片段，所述PCR产物A2中含有699bp的DNA片段，所述PCR产物C2中含有663bp的DNA片段，所述待测样品含有尖孢镰刀菌古巴专化型亚热带4号生理小种；如果所述PCR产物B2中含有730bp的DNA片段，所述PCR产物A2中含有699bp的DNA片段，所述PCR产物C2中不含663bp的DNA片段，所述待测样品含有尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种，所述尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种不为尖孢镰刀菌古巴专化型亚热带4号生理小种；如果所述PCR产物B2中含有730bp的DNA片段，所述PCR产物A2中不含699bp的DNA片段，所述待测样品含有尖孢镰刀菌古巴专化型，所述尖孢镰刀菌古巴专化型不为尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种；如果所述PCR产物B2中不含730bp的DNA片段，所述待测样品不含尖孢镰刀菌古巴专化型；
I下述I1）和I2）：
I1）以待测生物样品的核酸为模板，用权利要求1所述A进行PCR扩增得到PCR产物A1；以所述待测生物样品的核酸为模板，用权利要求1所述C进行PCR扩增得到PCR产物C1；
I2）检测I1）所述PCR产物A1和所述PCR产物C1的大小，如果所述PCR产物A1中含有699bp的DNA片段，所述PCR产物C1中含有663bp的DNA片段，所述待测样品含有尖孢镰刀菌古巴专化型亚热带4号生理小种；如果所述PCR产物A1中含有699bp的DNA片段，所述PCR产物C1中不含663bp的DNA片段，所述待测样品含有尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种，所述尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种不为尖孢镰刀菌古巴专化型亚热带4号生理小种；如果所述PCR产物A1中不含699bp的DNA片段，所述待测样品不含尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种；
J下述J1）或J2）或J3）或J4）：
J1）下述J11）和J12）：
J11）以待测生物样品的RNA或以RNA为模板转录得到的cDNA为模板，用权利要求1所述B进行PCR扩增得到PCR产物B1；以所述待测生物样品的核酸为模板，用权利要求1所述C进行PCR扩增得到PCR产物C1；
J12）检测J11）所述PCR产物B1和所述PCR产物C1的大小，如果所述PCR产物B1中含有699bp的DNA片段，所述PCR产物C1中含有663bp的DNA片段，所述待测样品含有尖孢镰刀菌古巴专化型亚热带4号生理小种；如果所述PCR产物B1中含有699bp的DNA片段，所述PCR产物C1中不含663bp的DNA片段，所述待测样品含有尖孢镰刀菌古巴专化型，所述尖孢镰刀菌古巴专化型不为尖孢镰刀菌古巴专化型亚热带4号生理小种；如果所述PCR产物B1中不含699bp的DNA片段，所述待测样品不含尖孢镰刀菌古巴专化型；
J2）下述J21）和J22）：
J21）以待测生物样品的DNA为模板，用权利要求1所述B进行PCR扩增得到PCR产物B2；以所述待测生物样品的核酸为模板，用权利要求1所述C进行PCR扩增得到PCR产物C2；
J22）检测J21）所述PCR产物B2和所述PCR产物C2的大小，如果所述PCR产物B2中含有730bp的DNA片段，所述PCR产物C2中含有663bp的DNA片段，所述待测样品含有尖孢镰刀菌古巴专化型亚热带4号生理小种；如果所述PCR产物B2中含有730bp的DNA片段，所述PCR产物C2中不含663bp的DNA片段，所述待测样品含有尖孢镰刀菌古巴专化型，所述尖孢镰刀菌古巴专化型不为尖孢镰刀菌古巴专化型亚热带4号生理小种；如果所述PCR产物B2中不含730bp的DNA片段，所述待测样品不含尖孢镰刀菌古巴专化型；
J3）下述J31）和J32）：
J31）在同一个PCR反应体系中，以待测生物样品的RNA或以RNA为模板转录得到的cDNA为模板，用权利要求3所述成套引物进行PCR扩增得到PCR产物；
J32）检测J31）所述PCR产物的大小，如果所述PCR产物中含有699bp和663bp的DNA片段，所述待测样品含有尖孢镰刀菌古巴专化型亚热带4号生理小种；如果所述PCR产物中仅含有一条699bp的DNA片段，所述待测样品含有尖孢镰刀菌古巴专化型，所述尖孢镰刀菌古巴专化型不为尖孢镰刀菌古巴专化型亚热带4号生理小种；如果所述PCR产物中不含699bp和663bp的DNA片段，所述待测样品不含尖孢镰刀菌古巴专化型；
J4）下述J41）和J42）：
J41）在同一个PCR反应体系中，以待测生物样品的DNA为模板，用权利要求3所述成套引物进行PCR扩增得到PCR产物；
J42）检测J41）所述PCR产物的大小，如果所述PCR产物中含有730bp和663bp的DNA片段，所述待测样品含有尖孢镰刀菌古巴专化型亚热带4号生理小种；如果所述PCR产物中仅含有一条730bp的DNA片段，所述待测样品含有尖孢镰刀菌古巴专化型，所述尖孢镰刀菌古巴专化型不为尖孢镰刀菌古巴专化型亚热带4号生理小种；如果所述PCR产物中不含730bp和663bp的DNA片段，所述待测样品不含尖孢镰刀菌古巴专化型；
K下述K1）和K2）：
K1）以所述待测生物样品的核酸为模板，用权利要求1所述C进行PCR扩增得到PCR产物C1；
K2）检测K1）所述PCR产物C1的大小，如果所述PCR产物C1中含有663bp的DNA片段，所述待测样品含有尖孢镰刀菌古巴专化型亚热带4号生理小种；如果所述PCR产物C1中不含663bp的DNA片段，所述待测样品不含尖孢镰刀菌古巴专化型亚热带4号生理小种。
8.权利要求1所述的成套引物、或权利要求5或6所述系统中Hh、或权利要求7所述方法中H在鉴定香蕉枯萎病菌中的应用；
所述香蕉枯萎病菌为尖孢镰刀菌古巴专化型和/或尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种和/或尖孢镰刀菌古巴专化型亚热带4号生理小种。
9.权利要求2所述的成套引物、或权利要求5或6所述系统中Ii、或权利要求7所述方法中I在鉴定香蕉枯萎病菌中的应用；
所述香蕉枯萎病菌为尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种和/或尖孢镰刀菌古巴专化型亚热带4号生理小种。
10.权利要求3所述的成套引物、或权利要求5或6所述系统中Jj、或权利要求7所述方法中J在鉴定香蕉枯萎病菌中的应用；
所述香蕉枯萎病菌为尖孢镰刀菌古巴专化型和/或尖孢镰刀菌古巴专化型亚热带4号生理小种。
11.权利要求4所述的PCR引物对、或权利要求5或6所述系统中Kk、或权利要求7所述方法中K在鉴定香蕉枯萎病菌中的应用；
所述香蕉枯萎病菌为尖孢镰刀菌古巴专化型亚热带4号生理小种。
12.权利要求1或2或3所述成套引物的制备方法，其特征在于：所述方法包括将所述成套引物中各引物对的两条单链DNA分别单独包装的步骤。
13.权利要求4所述PCR引物对的制备方法，其特征在于：所述方法包括将所述C的两条单链DNA分别单独包装的步骤。
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