CN115161409B - E3泛素化酶MaUPL6作为香蕉枯萎病菌的生物标志物的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了E3泛素化酶MaUPL6作为香蕉枯萎病菌的生物标志物的应用，所述的E3泛素化酶MaUPL6如SEQ ID NO.1所示。本发明通过检测E3泛素化酶MaUPL6的含量，可以尽早，尽快的检测出香蕉枯萎病。为有效的防控香蕉枯萎病提供防控策略。

Description

E3泛素化酶MaUPL6作为香蕉枯萎病菌的生物标志物的应用

技术领域：

本发明属于香蕉枯萎病防治领域，具体涉及E3泛素化酶MaUPL6作为香蕉枯萎病菌的生物标志物的应用。

背景技术：

香蕉枯萎病是由尖孢镰刀菌巴专化型(Fusarium oxysporum f.sp.cubense,Foc)引起的一种土传真菌病害(Ploetz,2015；Liu et al.,2020)。按照寄主类型主要分为1号生理小种(Foc Race1)、2号生理小种(Foc Race2)、亚热带4号生理小种(Foc STR4)和热带4号生理小种(Foc TR4)等四个生理小种类型(Li et al.,2022)。其中以20世纪90年代爆发的由Foc TR4引起的枯萎病对全球香蕉产业造成的危害最大(Dale et al.,2017)。由于该病原菌致病力强、分布广、存活时间长以及化学农药难以防治等特点，迄今尚无有效的防控策略(Dou et al.,2020)。该病1996年在中国广州市番禺首次发现，其传播速度迅猛，仅我国广东、海南、福建等传统香蕉产区就有超过一半以上的蕉园遭受灭顶之灾(邓秀新等，2018)。目前该病在我国所有的香蕉主产区均有报道，对香蕉产业造成了严重影响，甚至造成蕉园毁灭丢荒，损失惨重(李华平等，2019)。可见枯萎病已成为限制香蕉产业健康持续发展的最主要问题，迫切需要解决。

HECT型E3s是研究最早、最为独特的一类E3泛素连接酶，该类蛋白因C末端含有一个与乳头状瘤病毒相关的E6-AP类似的保守HECT(Homologous to E6AP C-Terminus)结构域而得名(Marin and Zhang,2013)。HECT结构域由350个氨基酸残基组成，其中半胱氨酸残基起关键作用，如该位点突变导致蛋白失去E3连接酶活性。HECT结构域的N端和C端分别存在N-lobe和C-lobe，其作用机制是HECT结构域的N-lobe与E2结合酶共轭结合，泛素被转移到该结构域具有催化作用的C端C-lobe，与半胱氨酸残基形成泛素-E3巯基-酯中间体，作为近端泛素的供体直接参与泛素的转运(Rotin et al.,2009)。尽管HECT型E3s是最早研究的一类泛素连接酶，但是关于HECT E3s的功能研究主要集中于动物和模式植物拟南芥，在其它植物中的功能鲜有报道。拟南芥(Arabidopsis thaliana)HECT E3s家族有7个成员(也称为UPLs家族)，根据成员间的N-端结构域特征被区分为4个亚家族：UPL1/UPL2、UPL3/UPL4、UPL5和UPL6/UPL7。研究表明：AtUPL3通过介导GLABROUS 3和增强的GLAGROUS 3蛋白酶体降解，从而调节拟南芥中毛状体发育和类黄酮的生物合成(Downes et al.,2003；Patra etal.,2013)；AtUPL5可通过泛素化叶片衰老相关的转录因子AtWRKY53，从而负调控拟南芥植物的衰老进程(Miao and Zentgraf,2010)；棉花GhUPL7以负调控方式作用于AILP1，从而影响棉花的光形态建成(张旭艳，2019)。

我国香蕉的种植面积和总产量分别位居全球第五和第二位，其产业已成为我国南亚热带地区农民脱贫致富、乡村振兴的重要支柱产业(李华平等，2019)。香蕉枯萎病(又称巴拿马病)是限制香蕉产业可持续发展的最主要因子。由于该病原菌存活时间长、传播迅猛、变异速度快、防治靶点不清楚，迄今尚无有效的防控策略。另外，香蕉主栽品种大多为三倍体，通过杂交育种手段进行种质创新面临巨大挑战。因此，如何尽快的确定

发明内容：

本发明的目的是提供E3泛素化酶MaUPL6作为香蕉枯萎病菌的生物标志物的应用。

接种病原菌后MaUPL6在野生型香蕉植株根系中快速上调表达，在接种后的第5天达到较高的表达水平，接种后第10天表达水平最高。接种病原菌后MaUPL6在野生型香蕉植株假茎中逐渐上调表达，接种后第7天表达水平最高，随后逐渐降低。接种病原菌后MaUPL6在野生型香蕉植株叶片中逐渐上调表达。

由此，E3泛素化酶MaUPL6的表达量提升可以作为香蕉感染香蕉枯萎病菌早期发现的一个生物标志物。

因此，本发明提供了E3泛素化酶MaUPL6作为香蕉枯萎病菌的生物标志物的应用。

本发明的第二个目的是提供检测香蕉植株中的E3泛素化酶MaUPL6含量的试剂在制备检测香蕉枯萎病的制剂中的应用。

所述的检测香蕉植株中的E3泛素化酶MaUPL6含量的试剂可以是各种以E3泛素化酶MaUPL6作为靶基因的定量PCR试剂等。

优选，所述的香蕉植株中的E3泛素化酶MaUPL6是香蕉根、茎或叶中的E3泛素化酶MaUPL6。

本发明的第三个目的是提供一种检测香蕉枯萎病的方法，其是以香蕉植株为材料，提取其DNA，然后检测E3泛素化酶MaUPL6的含量。

所述的检测E3泛素化酶MaUPL6的含量是利用RT-PCR进行检测，其正向引物：TGCTGGTGTCCTTCCAGATTATATAG；反向引物：ACTGGTTTTGTACAGGTGACGAGT。

所述的检测E3泛素化酶MaUPL6的含量是利用RT-PCR进行检测，其反应程序是：95℃初始变性10s，然后95℃进行40次5s的循环，60℃退火和延伸20s。

本发明通过检测E3泛素化酶MaUPL6的含量，可以尽早，尽快的检测出香蕉枯萎病。为有效的防控香蕉枯萎病提供防控策略。

附图说明

图1是接种病原菌后MaUPL6基因在根系中的表达情况。

图2是接种病原菌后MaUPL6基因在假茎中的表达情况。

图3是接种病原菌后MaUPL6基因在叶片中的表达情况。

具体实施方式

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例1：

1、研究材料

以‘巴西蕉’香蕉组培苗为研究材料，经组织扩繁、生根后定植于温室大棚至五片叶期，供后续实验所需。接种菌株为广东省农科院果树研究所香蕉遗传改良室分离、保存的香蕉枯萎病菌(Foc TR4 II5菌株)

2、接种实验

解冻的Foc TR4 II5甘油菌首先在PDA平板上划线涂板，28℃生长7d左右至长出菌丝。然后用无菌接种环挑取菌丝加入到含有50mLPDA液体培养基的锥形瓶中，28℃ 200rpm震荡48h。在超净工作台用无菌纱布过滤掉菌丝，无菌水重新调整至分生孢子浓度为2×10⁶conidia.mL^-1备用。将生长状态一致的五叶期‘巴西蕉’香蕉植株根组织完全浸入上述浓度的香蕉枯萎病菌菌液中，浸根30min后取出沥干，种植于口径为14cm的小盆中，放于适宜的自然环境中，温度控制在25～30℃，正常的肥水管理。选取30株进行接种，实验重复三次。

3、定量分析

分别于接种前后(0天、3天、5天、7天、10天和14天)采集根部组织样品(球茎部位以下2cm的离区)、假茎(球茎部位以上2cm的离区)、叶片(第三片叶，去除叶脉)，用清水洗净，置于冰盒带回实验室，做好标记，样品可立即提取样品RNA，并反转录成cDNA备用，反转录试剂盒为

One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis Super Mix(TransGeneBiotech)。MaUPL6基因表达量利用qRT-PCR的方法进行检测，仪器使用美国Bio-Rad CFX96荧光定量PCR仪，定量耗材(包括定量板和PCR定量荧光染料)也为美国Bio-Rad产品。PCR反应：2×SYBR Green PCR Master Mix(Toyobo)10μL,200nM引物(正向引物：TGCTGGTGTCCTTCCAGATTATATAG；反向引物：ACTGGTTTTGTACAGGTGACGAGT)，2μL 1:40稀释的模板cDNA，总体积为20μL。RT-qPCR程序包括：95℃初始变性10s，然后95℃进行40次5s的循环，60℃退火和延伸20s。选择MaACT1基因(PCR引物：ATTGTGCTTGATTCTGGTGATG；TTCAGCAGTGGTAGTGAAGGAA)作为内参基因。

采用比较阈值周期法计算扩增产物的相对表达量。MaUPL6基因的转录丰度与内参基因进行归一化。

MaUPL6基因的核苷酸序列SEQ ID NO.1所示，具体为：

ATGTTCTTCATGGGGGACGCCTCCACCCGCAAACGAGTGGATTTGGGTGGACGGAGCTCGAAGGAGAGTGACCGGCAGGTGTTATTGGAACAGGCACGGCTTGATAGGAAGCGCCGGTTAGTGCATCGACAGCAAACGTCAGCAGCGATAAAGATCCAGAAATGCTTCAGAGGGATGAAGGATGTCAAGATGGCACGAACAGAAGTGCGGCAGCAATTCCATGTTACCTATGGGGACCGTGGTGAAAGGGCAGATTGGCATTGCTTTGGTCCTGACTCAGAGTTTCTTCGCCAGCTGCTTTTCTTCTTTACTGCAAATAACATTAGCGATGTTACACTTCTTGTGGAAGCTTGTCGACTGCTTCTGCAGTATCGTCAGCAGAGTGGCAATATTATTACCCTTTTTGCTGGTTTGGACTATCCTCTAAAGCGTTCACTAGTGGATCTTAGAGTAAAAAAACTTGCATATGCTTGTCTTCAAGCAATCTTCCATAATAGGAATCATTATAAGGACAAACTACTGATGCCATCCACGAGCTCTGATTGGCCAACAGTTGCCTTATTCGAAACAGTAGCTTGTTTAACAAATCCTGAACTTCCATGGAACTGTAGTGTTATTGATTATCTGTTGGAGAGAAAAGTTTTTTTGCTGTTACGTTGCATCATTCTAGCTGGCGTGCACGACGTGAAATCTCCTGAGCTTCGTGTTAATGCATCTGCGTTGGAGCATGTTCTTATCAGTCTTGTTTCGCATGTTGGTCAGCAACCATGCCATTGTTCAAATGCAGATCCAAGANGGAATTTTTCGTTGCAAATTCTTTCCATTCCCTTTCTGTGGCATCATTTGCCATTTTTCAAAGAGGTTTTTTGGGCCAAGGGTTTANGCAGGCATTATATTCATCAAATGGCCAATTTTTTGCCTAGTCATGCTGGTGTCCTTCCAGATTATATAGTACAAGAGTATCCTGGTCATGCCTGCTTGCTTGGGAATTTACTTGANGTTGCTGGAGTTGTTTTATCTGATCCAAGCACTACTTATCATACAGCAATTGATTTTCTGACTGTTTCGACATTTTTATTGGAAGTATTGCCTTCCGTNGACTCGTCACCTGTACAAAAACCAGTTGATGATGAATTAACAATGGATGACGAAGTTCTAAGTCCAGATTTACAGAAGCAGATATCCAGTTCAATAGATTCACGCCTTTTACAGCATTTGGTGAATGCTTTGTTAAAGGCTACATGTCCAACTGGTTATTCTGATAAGACTTGGCCATCTAATGTAGAAGTGGAAGCAATAAGTGCTGTTTGCACTTTCCTTCATGTTACATTCTGTACGCTGCCTCATGAACTCATCATGACCCTACTAGCCTACAGAACTGAGCTTCTTCCTGCTCTTTGGAATTATATAAAGCGATGCCATGAGAATCAAAGATGGCCATTCTATTCTACGCTCACAGCGCATATACCTGGAGATACTCCAGGTTGGCTGTTGCCTCTGGCAGTTTTTTGCCCTTTGTACAAGCACATGCTAAAGTTTGTTGATACCGAAGAATTCTATGAGCAGGAAACACCAGTTAAAATAAAGGATATTCCATCTTTGGTTATCATTATAAAGCAGGCATTATGGCAGCTCCTATGGACATTACATGGGCATGTGTCGTCTCAAANATCATCAAGATCTCTTCTGGATGATAAGAAGCTGTCTGTGGAACTAATTAACCGTAAAGCCAGGGTTGCAATGTCTGAGCTTCTGAGCCAGTTGCAAGACTGGAACAATAGAAGGCAGTTCATGTCTGCTGATGATTTCCATCTTCAAGAAGCAAGGAGTGAAACTTTTGTTTCTCAGGCCTTACTTGGAAATACTCGAGCTTCTGATATATTAAAACAAGCTCCATTCTTAGTGCCATTTACAAGCAGGGTCGAAATTTTCACTTCAGAGTTAGTGGCTTCTAGACAAAGAAGTGGAGCTCATCCTGCTTTAGTTAGATGCAGATTCAAAATAAGAAGAAATCGAATACTTGAAGATGCTTTCAATCAACTGCATACATTATCAGAGGATGATCTAAGAGGACCCATTCGGATATCTTTTGTTAATGAATTTGGAGTTGAGGAGGCTGGGATTGATGGTGGTGGAATTTTTAAAGATTTTATGGAGAACATAATCCAGGCTGCTTTTGATGTCCAGTATGGGCTATTCAAGGAAACACCCAATCATCTTCTTTATCCGAATCCTGGGTCAGCATTAGTTCACGAACAACATCTTCAGTTTTTCCATTTTCTTGGGACTCTCCTCGGGAAGGCTATGTATGAGGGCATCCTCGTGGACATACCATTTGCAGCATTCTTCCTTAGCAAATTGAAAGAGAAGAGCAACTTTTTGCATGACTTGCCGTCACTAGATCCAGAGTTGTATCGACACCTTCTCTTTTTAAAGCATTATAAAGGTGATGTTTCAGAGTTGGAACTGTATTTTGTTGCTGTAAACAATGAATATGGTGAACAAACAGAAGAGGAGCTAATCCCTGGTGGAAAAAATCTGCGTGTTACCAAGGACAACGTTATTGCCTTCATTCATCTTGTTGCAAATTATCGCCTAAATTTTCAGATTCGCACTCAAAGCTTGCATTTTTTACGAGGATTCCAACAACTTGTACAAAAGGAATGGATTGAAATGTTCAATGAACATGAAATTCAGCTTCTTATATCAGGTTCGCTTGAAAGCATGAATGTGGATGATCTGCGCTCAAATACCCGTTATACTGGTGGATATCATCATGAACATCAAGTCATTGAGATGTTATGGGAAGTTCTCAAAAGCTTTTCTCTGGAGTATCAGAAGAAATTTCTTAAGTTTGTAACCGGATGTTCTAGAGGTCCACTTCTCGGTTTCAAGTATCTTGAACCGAAATTCTGCATACTGAGGGCTGCTCCTTTGGATGCCTCNGAAGAGGATCTTGATCGCCTACCGACATCAGCCACTTGCATGAATCTGCTGAAGTTACCACCATATCAAAGTAAAGCACAAATGCGAACCAAATTGATCTACGCAATAAGTGCAGATGCTGGTTTTGATTTGAGTTGA

3、实验结果：

结果如图1-图3所示。图1是接种病原菌后MaUPL6基因在根系中的表达情况，从图1可以看出接种病原菌后MaUPL6在野生型香蕉植株根系中快速上调表达，在接种后的第5天达到较高的表达水平，接种后第10天表达水平最高，在两个MpICE1转基因株系中，表达水平始终处于较低水平。图2是接种病原菌后MaUPL6基因在假茎中的表达情况接种病原菌后MaUPL6在野生型香蕉植株假茎中逐渐上调表达，接种后第7天表达水平最高，随后逐渐降低。图3是接种病原菌后MaUPL6基因在叶片中的表达情况，接种病原菌后MaUPL6在野生型香蕉植株根系中逐渐上调表达，接种后的第10天表达水平最高，随后逐渐降低。

序列表

<110> 广东省农业科学院果树研究所

<120> E3泛素化酶MaUPL6作为香蕉枯萎病菌的生物标志物的应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 3084

<212> DNA

<213> 巴西蕉(Mimosa nana Lour)

<400> 1

atgttcttca tgggggacgc ctccacccgc aaacgagtgg atttgggtgg acggagctcg 60

aaggagagtg accggcaggt gttattggaa caggcacggc ttgataggaa gcgccggtta 120

gtgcatcgac agcaaacgtc agcagcgata aagatccaga aatgcttcag agggatgaag 180

gatgtcaaga tggcacgaac agaagtgcgg cagcaattcc atgttaccta tggggaccgt 240

ggtgaaaggg cagattggca ttgctttggt cctgactcag agtttcttcg ccagctgctt 300

ttcttcttta ctgcaaataa cattagcgat gttacacttc ttgtggaagc ttgtcgactg 360

cttctgcagt atcgtcagca gagtggcaat attattaccc tttttgctgg tttggactat 420

cctctaaagc gttcactagt ggatcttaga gtaaaaaaac ttgcatatgc ttgtcttcaa 480

gcaatcttcc ataataggaa tcattataag gacaaactac tgatgccatc cacgagctct 540

gattggccaa cagttgcctt attcgaaaca gtagcttgtt taacaaatcc tgaacttcca 600

tggaactgta gtgttattga ttatctgttg gagagaaaag tttttttgct gttacgttgc 660

atcattctag ctggcgtgca cgacgtgaaa tctcctgagc ttcgtgttaa tgcatctgcg 720

ttggagcatg ttcttatcag tcttgtttcg catgttggtc agcaaccatg ccattgttca 780

aatgcagatc caaganggaa tttttcgttg caaattcttt ccattccctt tctgtggcat 840

catttgccat ttttcaaaga ggttttttgg gccaagggtt tangcaggca ttatattcat 900

caaatggcca attttttgcc tagtcatgct ggtgtccttc cagattatat agtacaagag 960

tatcctggtc atgcctgctt gcttgggaat ttacttgang ttgctggagt tgttttatct 1020

gatccaagca ctacttatca tacagcaatt gattttctga ctgtttcgac atttttattg 1080

gaagtattgc cttccgtnga ctcgtcacct gtacaaaaac cagttgatga tgaattaaca 1140

atggatgacg aagttctaag tccagattta cagaagcaga tatccagttc aatagattca 1200

cgccttttac agcatttggt gaatgctttg ttaaaggcta catgtccaac tggttattct 1260

gataagactt ggccatctaa tgtagaagtg gaagcaataa gtgctgtttg cactttcctt 1320

catgttacat tctgtacgct gcctcatgaa ctcatcatga ccctactagc ctacagaact 1380

gagcttcttc ctgctctttg gaattatata aagcgatgcc atgagaatca aagatggcca 1440

ttctattcta cgctcacagc gcatatacct ggagatactc caggttggct gttgcctctg 1500

gcagtttttt gccctttgta caagcacatg ctaaagtttg ttgataccga agaattctat 1560

gagcaggaaa caccagttaa aataaaggat attccatctt tggttatcat tataaagcag 1620

gcattatggc agctcctatg gacattacat gggcatgtgt cgtctcaaan atcatcaaga 1680

tctcttctgg atgataagaa gctgtctgtg gaactaatta accgtaaagc cagggttgca 1740

atgtctgagc ttctgagcca gttgcaagac tggaacaata gaaggcagtt catgtctgct 1800

gatgatttcc atcttcaaga agcaaggagt gaaacttttg tttctcaggc cttacttgga 1860

aatactcgag cttctgatat attaaaacaa gctccattct tagtgccatt tacaagcagg 1920

gtcgaaattt tcacttcaga gttagtggct tctagacaaa gaagtggagc tcatcctgct 1980

ttagttagat gcagattcaa aataagaaga aatcgaatac ttgaagatgc tttcaatcaa 2040

ctgcatacat tatcagagga tgatctaaga ggacccattc ggatatcttt tgttaatgaa 2100

tttggagttg aggaggctgg gattgatggt ggtggaattt ttaaagattt tatggagaac 2160

ataatccagg ctgcttttga tgtccagtat gggctattca aggaaacacc caatcatctt 2220

ctttatccga atcctgggtc agcattagtt cacgaacaac atcttcagtt tttccatttt 2280

cttgggactc tcctcgggaa ggctatgtat gagggcatcc tcgtggacat accatttgca 2340

gcattcttcc ttagcaaatt gaaagagaag agcaactttt tgcatgactt gccgtcacta 2400

gatccagagt tgtatcgaca ccttctcttt ttaaagcatt ataaaggtga tgtttcagag 2460

ttggaactgt attttgttgc tgtaaacaat gaatatggtg aacaaacaga agaggagcta 2520

atccctggtg gaaaaaatct gcgtgttacc aaggacaacg ttattgcctt cattcatctt 2580

gttgcaaatt atcgcctaaa ttttcagatt cgcactcaaa gcttgcattt tttacgagga 2640

ttccaacaac ttgtacaaaa ggaatggatt gaaatgttca atgaacatga aattcagctt 2700

cttatatcag gttcgcttga aagcatgaat gtggatgatc tgcgctcaaa tacccgttat 2760

actggtggat atcatcatga acatcaagtc attgagatgt tatgggaagt tctcaaaagc 2820

ttttctctgg agtatcagaa gaaatttctt aagtttgtaa ccggatgttc tagaggtcca 2880

cttctcggtt tcaagtatct tgaaccgaaa ttctgcatac tgagggctgc tcctttggat 2940

gcctcngaag aggatcttga tcgcctaccg acatcagcca cttgcatgaa tctgctgaag 3000

ttaccaccat atcaaagtaa agcacaaatg cgaaccaaat tgatctacgc aataagtgca 3060

gatgctggtt ttgatttgag ttga 3084

Claims (7)

1.如SEQ ID NO.1的第927-1124位碱基所示的E3泛素化酶MaUPL6基因片段作为香蕉枯萎病菌Foc TR4的生物标志物的应用。

2.检测香蕉植株中的如SEQ ID NO.1的第927-1124位碱基所示的E3泛素化酶MaUPL6基因片段转录含量的试剂在制备检测香蕉枯萎病菌Foc TR4导致的香蕉枯萎病的制剂中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的香蕉植株是香蕉根、茎或叶。

4.一种检测香蕉枯萎病的方法，其特征在于，是以香蕉植株为材料，提取其RNA，反转录成cDNA，然后检测如SEQ ID NO.1的第927-1124位碱基所示的E3泛素化酶MaUPL6基因片段转录含量，所述的香蕉枯萎病是香蕉枯萎病菌Foc TR4导致的。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的检测E3泛素化酶MaUPL6基因片段转录含量是利用RT-PCR进行检测，其正向引物：TGCTGGTGTCCTTCCAGATTATATAG；

反向引物：ACTGGTTTTGTACAGGTGACGAGT。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的RT-PCR，其反应程序是：95℃初始变性10s，然后95℃进行40次5s的循环，60℃退火和延伸20s。

7.根据权利要求4、5或6所述的方法，其特征在于，所述的香蕉植株是香蕉根、茎或叶。

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