CN116555457A - 检测树生黄单胞桃李致病变种的一步三重pcr引物组合及其应用 - Google Patents

检测树生黄单胞桃李致病变种的一步三重pcr引物组合及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及农业生物技术领域，具体涉及用于一步法三重PCR检测树生黄单胞桃李致病变种的特异性引物组合，以及利用上述引物鉴定树生黄单胞桃李致病变种和检测细菌性桃穿孔病的方法。本发明的一步三重PCR引物组合扩增产物大小为579bp、286bp、218bp，具有操作简便、特异、灵敏、经济等特点，适用于细菌菌株鉴定、田间病害检测、以及种质资源抗病性分析等方面。

Description

检测树生黄单胞桃李致病变种的一步三重PCR引物组合及其 应用
技术领域
本发明属于农业生物技术领域，具体涉及检测树生黄单胞桃李致病变种的一步三重PCR引物组合及其应用。
背景技术
桃细菌性穿孔病是一种世界性的桃细菌病害，其病原为树生黄单胞桃李致病变种(Xanthomonas arboricola pv.pruni,Xap)。Xap是一种革兰氏阴性菌，隶属于原核生物界(Procaryotes)，薄壁菌门(Gracilicutes)，假单胞菌科(Pseudomonadaceae)，黄单胞菌属(Xanthomonas)。Xap基因组长～5.2M，GC值含量大约65％。该病原存活能力强，最适温度为25-28℃，存活最低温度为7℃，存活最高温度在38℃，在干燥条件下能够存活10-13天，而在溃疡的枝条组织内能够存活1年以上，严重危害桃、杏、李等核果类经济作物。
在田间生产中，多种细菌及真菌病原侵染均能够造成叶片穿孔，或枝条韧皮部坏死，与Xap引发的症状极为相似。传统的植物病原鉴定与检测主要依据病原的形态学和免疫学特性，操作复杂，周期长，技术门槛高，因而目前针对Xap已建立了常规PCR、TaqMan探针法实时荧光定量PCR、环介导等温扩增等分子检测技术体系。但是，现有这些技术体系均以hrp或ftsX基因为检测靶标，二者为细菌保守基因，据此设计的引物在应用于田间复杂样本的检测中，结果的特异性难以保证。
树生黄单胞菌是一大类重要的植物病原细菌。除Xap之外，还有至少八种已知致病变种，如：核桃致病变种(X.arboricola pv.juglandis)、杨树致病变种(X.arboricolapv.populi)、草莓致病变种(X.arboricola pv.fragariae)等。这些树生黄单胞致病变种之间的基因组序列高度相似，极难找到分别靶向不同致病变种的特异性区段。
本申请发现Xap假定蛋白(GenBank:UJY95693.2)由2,084个氨基酸组成，其编码基因(以下命名为Xap 95693)在目前所有6个已完成全基因组测定的Xap菌株(Xcp1、CITA33、IVIA2626.1、T1、R1、15-008)中保守存在，但其5′端611bp的核酸序列在现有的GenBank数据库中没有同源序列，因而可作为检测Xap的特异靶标。但是，在自然环境中存在海量基因组信息未知的微生物，如果按照常规思路，借助引物设计软件分析611bp核酸序列，选择一对引物进行PCR扩增，最终根据DNA条带的有无、预期大小判断检测结果，仍有可能导致假阳性结果。因此，需要对PCR检测方案创新设计，提高检测结果的准确性。
发明内容
本发明的目的在于提供一种检测树生黄单胞桃李致病变种的一步三重PCR引物组合。
本发明的再一目的在于提供上述检测树生黄单胞桃李致病变种的一步三重PCR引物组合的应用。
本发明的再一目的在于提供树生黄单胞桃李致病变种的一步三重PCR检测方法。
本发明的再一目的在于提供树生黄单胞桃李致病变种的一步三重检测试剂盒。
本发明的检测树生黄单胞桃李致病变种的一步三重PCR引物组合，包括以下特异性引物：
树生黄单胞桃李致病变种上游引物Xap-F1，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；
树生黄单胞桃李致病变种上游引物Xap-F2，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；
树生黄单胞桃李致病变种下游引物Xap-R1，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；
树生黄单胞桃李致病变种下游引物Xap-R2，其核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。
SEQ ID NO:1:5'-ATGAGCGGCCCCGTGTACTAT-3'
SEQ ID NO:2:5'-CAGCAGGCATAGATCTTCCAAC-3'
SEQ ID NO:3:5'-GTACCACTCTTCCCCTGTCCT-3'
SEQ ID NO:4:5'-TAGACCCTACCCTCGTTGAATC-3'。
使用上述一步三重特异性PCR引物组合，扩增获得树生黄单胞桃李致病变种特异性基因片段，大小分别为579bp、286bp、218bp，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO：5、SEQ IDNO:6、SEQ ID NO:7所示。
SEQ ID NO:5:
ATGAGCGGCCCCGTGTACTATGTTGAAATTAGATACGATATTGGCGGTTCGAATA
ATATACCGCACACCTTTTTTGTAATTACGAAGCCTGACGGCAGTTCGCGTGAAT
ACGGGTTTGCTCCCTTGGAGGGAGGTGCCCTCGCAGGGGATGGCGCAGTATAC
GAAACAGGTGTAGGAACTGCCGAGGGCGAGCACGAATATCAGGCTGCTAGTAG
TAAATACTCAATAAATCAGGCTCAGTATGAATCCCTCATGGGATTTGTTGATTCA
ACGAGGGTAGGGTCTACCTATTGGGCGGGAGGTGACCATTTTTCTGCCAGTATG
TATAACTGCACCACTTGGCAGAGCACTGCATTTAACGCAGCAGGCATAGATCTT
CCAACTGAGGCTGATCATGCGTGGAATCCTTACCAGCAATATACTTACGATAGG
ATTGAAGACTTTCATGATGCTGCAAGTGATTGGATTAATGATAAGGTAAATGAG
GTTGGCGACTGGAGTGAGAAAACGGCAGAGCAGGTTTCAGATTGGGTGAAAGACCAGGCGGATCGTGCCCAAAGGACAGGGGAAGAGTGGTAC。
SEQ ID NO:6:
ATGAGCGGCCCCGTGTACTATGTTGAAATTAGATACGATATTGGCGGTTCGAATA
ATATACCGCACACCTTTTTTGTAATTACGAAGCCTGACGGCAGTTCGCGTGAAT
ACGGGTTTGCTCCCTTGGAGGGAGGTGCCCTCGCAGGGGATGGCGCAGTATAC
GAAACAGGTGTAGGAACTGCCGAGGGCGAGCACGAATATCAGGCTGCTAGTAG
TAAATACTCAATAAATCAGGCTCAGTATGAATCCCTCATGGGATTTGTTGATTCAACGAGGGTAGGGTCTA。
SEQ ID NO:7:
CAGCAGGCATAGATCTTCCAACTGAGGCTGATCATGCGTGGAATCCTTACCAGC
AATATACTTACGATAGGATTGAAGACTTTCATGATGCTGCAAGTGATTGGATTAA
TGATAAGGTAAATGAGGTTGGCGACTGGAGTGAGAAAACGGCAGAGCAGGTT
TCAGATTGGGTGAAAGACCAGGCGGATCGTGCCCAAAGGACAGGGGAAGAGTGGTAC。
根据本发明具体实施方式的树生黄单胞桃李致病变种的一步三重PCR检测方法，所述方法包括使用上述树生黄单胞桃李致病变种特异性引物组合进行PCR扩增的步骤。
根据本发明具体实施方式的树生黄单胞桃李致病变种的一步三重PCR检测方法，树生黄单胞桃李致病变种的两条上游引物(Xap-F1、Xap-F2)和两条下游引物(Xap-R1、Xap-R2)的工作浓度分别为0.4μM、0.2μM、0.4μM、0.2μM。
根据本发明具体实施方式的树生黄单胞桃李致病变种的一步三重PCR检测方法，退火温度为58℃。
根据本发明具体实施方式的树生黄单胞桃李致病变种的一步三重PCR检测试剂盒，所述试剂盒包括上述树生黄单胞桃李致病变种的引物组合。
本发明的有益效果：
(1)本发明根据树生黄单胞桃李致病变种Xap 95693基因5′端611bp核酸序列，设计“4件套”引物组合“Xap-F1/Xap-F2/Xap-R1/Xap-R2”，在PCR快速检测树生黄单胞桃李致病变种时，同时发生三种引物配对方式：Xap-F1/Xap-R1，Xap-F1/Xap-R2，Xap-F2/Xap-R1，扩增出长度为579bp、286bp、218bp的三个PCR产物，呈现特有的电泳图谱，提高了检测的准确性。
(2)采用本发明的检测方法，同时扩增出长度为579bp、286bp、218bp的三个DNA片段，大小不同，一步三重，无需进行DNA片段回收、序列测定、比对分析，根据特定条带的有无、大小即可判定病原种类，完成特异性检测，整个过程可在2个小时内完成，操作简单，快速高效。
(3)本发明的“4件套”引物组合可检测树生黄单胞桃李致病变种，在其近缘种、属细菌中无扩增产物，特异性强。
(4)本发明的“4件套”引物组合可检测到的树生黄单胞桃李致病变种的最低模板DNA为10-2ng，相当于2000个细菌的基因组DNA，灵敏度高。
附图说明
图1显示引物设计方案及验证，以树生黄单胞桃李致病变种假定蛋白(GenBankNo.UJY95693.2)的编码基因的5′端611bp序列为靶标，设计“4件套”引物组合(Xap-F1/Xap-F2/Xap-R1/Xap-R2)，进行一步法PCR扩增，其中Xap-F1/Xap-R1、Xap-F1/Xap-R2、Xap-F2/Xap-R2分别配对，同时产生579bp、286bp、218bp三种不同长度的PCR产物，N:ddH2O；1：树生黄单胞桃李致病变种；
图2显示利用组合引物检测树生黄单胞桃李致病变种的特异性，N:ddH2O；1：树生黄单胞桃李致病变种；2：稻黄单胞稻致病变种；3：丁香假单胞菌斑点致病变种；4：嗜酸菌属西瓜种；5：茄科雷尔氏菌；6：丁香假单胞杆菌番茄致病变种；7：根瘤农杆菌；8：野油菜黄单胞菌属；9：大肠杆菌；10：考氏科萨克氏菌；11：成团泛菌；12：树生黄单胞核桃致病变种；
图3显示利用组合引物检测树生黄单胞桃李致病变种的灵敏度，M:分子量标准，N：ddH2O(阴性对照)，1-6为树生黄单胞桃李致病变种的基因组DNA，分别对应1ng、10-1ng、10- 2ng、10-3ng、10-4ng、10-5ng；
图4显示利用组合引物检测不同桃品种的穿孔病田间样品，N：ddH2O(阴性对照)，1:Pg-1；2：奥油叶片；3：奥油主叶脉；4：奥油枝条韧皮部；5：中油蟠9主叶脉；6：中油蟠9枝条韧皮部；7：瑞光主叶脉；8：瑞光枝条韧皮部。
具体实施方式
下面实施案中采用的酶与试剂：Ex Taq购自Takara公司，细菌基因组DNA提取试剂盒，植物基因组DNA提取试剂盒。
下面实施例中采用的实验仪器分别为：PCR仪，凝胶成像仪器，电泳仪；其它仪器包括：电子天平、离心机、涡旋仪、纯水仪等。
实施例1、组合引物的设计与验证
本发明以树生黄单胞桃李致病变种假定蛋白(GenBank No.UJY95693.2)的编码基因的5′端611bp区段为特异靶标，设计PCR引物。为了提高检测结果的准确性，设计“4件套”引物组合，具体为：
Xap-F1:5'-ATGAGCGGCCCCGTGTACTAT-3'
Xap-F2:5'-CAGCAGGCATAGATCTTCCAAC-3'
Xap-R1:5'-GTACCACTCTTCCCCTGTCCT-3'
Xap-R2:5'-TAGACCCTACCCTCGTTGAATC-3'
以树生黄单胞桃李致病变种基因组DNA为模板，利用上述组合引物进行一步PCR扩增。其中，引物(Xap-F1、Xap-F2、Xap-R1、Xap-R2)工作浓度分别为0.4μM、0.2μM、0.4μM、0.2μM；反应程序如下：95℃，3min；94℃，30s；58℃，30s；72℃，20s；30个循环；72℃，5min。PCR反应产物包括579bp、286bp、218bp三种长度不同的DNA片段(图1)，一步三重，简捷高效，无需再进行DNA片段回收、碱基序列测定、比对分析，即可完成特异性检测。
实施例2、验证组合引物的特异性
制备树生黄单胞桃李致病变种的基因组DNA，同时提取三种黄单胞属细菌(树生黄单胞核桃致病变种、野油菜黄单胞菌、稻黄单胞稻致病变种)、八种其他科属细菌(丁香假单胞菌斑点致病变种、嗜酸菌属西瓜种、茄科雷尔氏菌、丁香假单胞杆菌番茄致病变种、根瘤农杆菌、大肠杆菌、科萨克氏菌、成团泛菌)基因组DNA，作为对照。
分别取上述细菌的1ng基因组DNA为模板，设置ddH2O为阴性对照，利用组合引物(Xap-F1、Xap-F2、Xap-R1、Xap-R2)，在20μL反应体系中进行一步PCR扩增。如图2所示，只有树生黄单胞桃李致病变种(No.1)成功扩增出579bp、286bp、218bp三条目标条带，而阴性对照(N)和其他11种近缘种、属的细菌(No.2-12)均无扩增产物。因此，本发明设计的一步三重PCR扩增组合引物，对树生黄单胞桃李致病变种具有高度的特异性。
实施例3、验证组合引物的灵敏度
提取树生黄单胞桃李致病变种的基因组DNA；调整DNA浓度为1ng/μL，按照10倍梯度稀释，为减小误差，每个浓度梯度设置3个重复，再把3个重复混匀，依次制备10-1ng至10- 5ng的DNA溶液。
分别取不同浓度梯度的DNA 1μL作为模板，以ddH2O为阴性对照，应用组合引物(Xap-F1、Xap-F2、Xap-R1、Xap-R2)在20μL反应体系中进行一步法PCR扩增。如图3所示，在模板量为1ng、10-1ng、10-2ng时(No.1-3)，均扩增出579bp、286bp、218bp三条清晰的目标条带；降至10-3ng(No.4)时，仅出现微弱的目标条带。因此，本发明的引物组合对树生黄单胞桃李致病变种基因组DNA的检测极限为10-2ng，相当于～2000个细菌，具有较高的灵敏度。
实施例4：组合引物的实际应用
采集田间不同桃品种的穿孔病疑似病样(表1)，共计7个样品，提取总DNA；取1ng总DNA为模板，以ddH2O为阴性对照(N)，应用组合引物(Xap-F1、Xap-F2、Xap-R1、Xap-R2)在20μL反应体系中进行一步法PCR扩增。如图4所示，与阳性对照(No.1)相同，从奥油叶片、以及奥油、中油蟠9、瑞光的主叶脉(No.2,3,6,7)四个样品中，均扩增出579bp、286bp、218bp三条清晰的目标条带；奥油、中油蟠9、瑞光的枝条韧皮部样品(No.4,5,8)未检出目标条带。因此，本发明设计的一步三重PCR扩增组合引物可用于田间复杂样品的Xap检测。
表1.田间样品信息
以上实施例仅用于理解本申请的技术方案，不限定本申请的保护范围。

Claims (7)

1.检测树生黄单胞桃李致病变种的一步三重PCR引物组合，其特征在于，所述PCR引物组合包括以下特异性引物：
树生黄单胞桃李致病变种上游引物Xap-F1，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，SEQ IDNO:1:5'-ATGAGCGGCCCCGTGTACTAT-3'；
树生黄单胞桃李致病变种上游引物Xap-F2，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，SEQ IDNO:2:5'-CAGCAGGCATAGATCTTCCAAC-3'；
树生黄单胞桃李致病变种下游引物Xap-R1，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，SEQ IDNO:3:5'-GTACCACTCTTCCCCTGTCCT-3'；
树生黄单胞桃李致病变种下游引物Xap-R2，其核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示，SEQ IDNO:4:5'-TAGACCCTACCCTCGTTGAATC-3'。
2.一种树生黄单胞桃李致病变种的一步三重PCR检测方法，其特征在于，所述方法包括使用权利要求1所述的检测树生黄单胞桃李致病变种的一步三重PCR引物组合进行PCR扩增的步骤。
3.根据权利要求2所述的树生黄单胞桃李致病变种的一步三重PCR检测方法，其特征在于，所述树生黄单胞桃李致病变种上游引物Xap-F1和所述树生黄单胞桃李致病变种上游引物Xap-F2的工作浓度分别为0.4μM、0.2μM。
4.根据权利要求2所述的树生黄单胞桃李致病变种的一步三重PCR检测方法，其特征在于，所述树生黄单胞桃李致病变种上游引物Xap-F2和所述树生黄单胞桃李致病变种下游引物Xap-R2的工作浓度分别为0.4μM、0.2μM。
5.根据权利要求2所述的树生黄单胞桃李致病变种的一步三重PCR检测方法，其特征在于，PCR扩增的退火温度为58℃。
6.根据权利要求2所述的树生黄单胞桃李致病变种的一步三重PCR检测方法，其特征在于，如PCR扩增获得三条条带，且大小分别为579bp、286bp、218bp，则待测菌株为树生黄单胞桃李致病变种。
7.树生黄单胞桃李致病变种的一步三重PCR检测试剂盒，其特征在于，所述PCR检测试剂盒包括权利要求1所述的检测树生黄单胞桃李致病变种的一步三重PCR引物组合。
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