CN114438257B - 一种同时检测烟草5种病原菌的引物组、试剂盒及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于烟草病害检测技术领域，具体涉及一种同时检测烟草5种病原菌的引物组、试剂盒及其应用。一种同时检测烟草5种病原菌的引物组，包括5对特异性引物：引物对Sf1和Sr1、引物对Rf1和Rr1、引物对Ff1和Fr1、引物对TBf1和TBr1以及引物对Pf1和Pr1，其序列分别对应如SEQ ID No.1至SEQ ID No.10所示。本发明的引物组和试剂盒能够同时快速检测烟草黑胫病菌、青枯病菌、立枯病菌、根腐病菌和根黑腐病菌以及田间带菌烟草病株和土壤，对混合DNA检测的灵敏度达到了100 pg/µL，可以为烟草土传病害以及同种病原菌引起的其他作物病害的快速诊断、早期监测预警以及防控提供有力依据，具有较高的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于烟草病害检测技术领域，具体涉及一种同时检测烟草黑胫病、青枯病、立枯病、根腐病和根黑腐病的引物组、试剂盒及其应用。
背景技术
烟草是我国重要的经济作物，但田间易受多种病害的威胁，其中根茎部土传病害危害严重，导致烟草的产量和品质下降，严重制约我国烟草产业的发展。烟草上分布较广的重要土传病害包括烟草疫霉（Phytophthora parasitica）引起的黑胫病、假茄科雷尔氏菌（Ralstonia pseudosolanacearum）引起的青枯病、立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）引起的立枯病、尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）引起的根腐病以及基生根串珠霉（Thielaviopsis basicola）引起的根黑腐病等，这五种病害发病早期隐蔽性强，发病症状比较类似，并且待发病明显时多已难以救治，田间很难从症状上准确区分，容易导致误诊而无法有效控制病害蔓延。另外，土传病害易发生复合侵染，增加病害诊断和防治的难度。因此，建立一种能够在早期对多种烟草土传病原菌进行快速、准确、高效的检测方法有助于控制烟草土传病害带来的严重损失。常规检测方法主要是对病株进行分离鉴定，其分离难度大，灵敏度低，耗时长，难以满足生产上的需求。血清学检测易出现假阳性反应且一次只能检测一种病原。近年来，随着分子生物学的发展，已有很多PCR相关技术运用在植物病害的快速检测方面。如利用环介导等温技术扩增实现了对假茄科雷尔氏菌的快速分子鉴定。利用巢式PCR实现了对烟草疫霉的快速鉴定。利用UP-PCR分子技术实现了对立枯丝核菌的快速鉴定。利用比较基因组学的方法，建立了尖孢镰刀菌的多重PCR检测体系。用多重PCR技术实现了对烟草疫霉和烟草根腐病的快速检测。但田间烟草土传病原菌种类较多，建立同时检测更多病原菌种类的技术将提高检测效率和应用价值。
多重PCR技术是在同一反应体系中加入多对特异性引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应，其原理与常规PCR相同。在病害研究中，主要应用于多种病原物的同步检测。与常规PCR相比，多重PCR具有成本低、检测效率高等优点。目前也有运用多重PCR检测烟草病原菌的报道，但不同烟草种植区域病害种类有所不同，病原菌分布不一致，需要根据当地病害发生情况设计相应病原菌组合的多重PCR体系。
在多重PCR分子检测技术中，为每个目的病原菌设计出特异性引物，保证各病原菌引物之间没有交叉反应是成功的关键。另外，引物扩增片段的大小应存在一定差异，便于区分。其次，引物浓度对多重PCR扩增也很重要，必须保证所有的引物具有相似的扩增效率。
广西高温高湿的气候特点特别有利于多种烟草土传病害的发生，以黑胫病和青枯病为主，另外还有立枯病、根腐病、根黑腐病等在局部区域分布。本研究建立了一种同时检测更多病原菌种类的多重PCR方法，能够同时检测田间病株和土壤中烟草黑胫病菌、青枯病菌、立枯病菌、根腐病菌和根黑腐病菌，对混合DNA检测的灵敏度达到了100pg/µL，进一步提高了检测效率，可以更好地服务于当地烟草农业生产。
公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
发明内容
本发明的目的在于提供一种同时检测烟草黑胫病、青枯病、立枯病、根腐病和根黑腐病的引物组、试剂盒及其应用，能够同时快速检测烟草黑胫病菌、青枯病菌、立枯病菌、根腐病菌和根黑腐病菌以及田间带菌烟草病株和土壤，为田间烟草根茎部病害的早期诊断和有效防治提供依据。
为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：
本发明的第一个目的在于提供一种同时检测烟草5种病原菌的引物组，包括5对特异性引物：引物对Sf1和Sr1、引物对Rf1和Rr1、引物对Ff1和Fr1、引物对TBf1和TBr1以及引物对Pf1和Pr1，其序列分别对应如SEQ ID No.1至SEQ ID No.10所示。
本发明的第二个目的在于提供一种同时检测烟草5种病原菌的试剂盒，所述试剂盒包括以下多重PCR反应体系：2×PCR Mix 12.5μL、待测病原菌模板DNA各1μL、5对特异性引物混合物，加ddH2O补足至25μL；其中，所述5对特异性引物分别为引物对Sf1和Sr1、引物对Rf1和Rr1、引物对Ff1和Fr1、引物对TBf1和TBr1以及引物对Pf1和Pr1，其序列分别对应如SEQ ID No.1至SEQ ID No.10所示。
作为优选，所述5对特异性引物混合物具体为：引物对Sf1和Sr1、引物对Ff1和Fr1以及引物对Pf1和Pr1各0.3μL、引物对Rf1和Rr1 1.8μL以及引物对TBf1和TBr1 1μL。
作为优选，所述多重PCR反应体系的多重PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，循环30次；72℃延伸10min。
本发明的第三个目的在于提供所述的同时检测烟草5种病原菌的引物组或所述的同时检测烟草5种病原菌的试剂盒在检测烟草黑胫病、青枯病、立枯病、根腐病和根黑腐病上应用。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明筛选引起五种根茎部病害的病原菌的特异性引物组合，通过不同的引物浓度和退火温度对多重PCR体系进行优化，检测体系的灵敏度，并对土壤和植株样品进行测试，验证其实用性，能够同时快速检测烟草黑胫病菌、青枯病菌、立枯病菌、根腐病菌和根黑腐病菌以及田间带菌烟草病株和土壤，对混合DNA检测的灵敏度达到了100pg.µL-1，可以为烟草土传病害以及同种病原菌引起的其他作物病害的快速诊断、早期监测预警以及防控提供有力依据，具有较高的应用前景。
附图说明
图1为5对特异性引物的特异性检测结果；
图2为不同引物用量下多重PCR的扩增结果；
图3为不同退火温度下多重PCR的扩增结果；
图4为五种烟草病原菌的多重PCR扩增结果；
图5为单重PCR及多重PCR灵敏度检测结果；
图6为人工接种样品的多重PCR检测结果；
图7为田间样品的多重PCR检测结果。
有关附图标记的说明：
图1中，A-E依次为引物对Sf1和Sr1、引物对Rf1和Rr1、引物对Ff1和Fr1、引物对Tbf1和Tbr1以及引物对Pf1和Pr1的特异性验证；F为引物对Sf1和Sr1、引物对Rf1和Rr1、引物对Ff1和Fr1、引物对Tbf1和Tbr1以及引物对Pf1和Pr1的阴性对照。A-E中泳道1-10分别为假茄科雷尔氏菌R. pseudosolanacearum、立枯丝核菌R. solani、尖孢镰刀菌F.oxysporum、基生根串珠霉T. basicola、烟草疫霉P. parasitica、胡萝卜果胶杆菌P.carotovorum、丁香假单胞菌P. syingae、灰葡萄孢B. cinerea、茄病镰刀菌F. solani、终极腐霉P. ultimum。
图5中，泳道1-5的基因组浓度分别为10 ng.µL-1、1 ng.µL-1、100 pg.µL-1、10 pg.µL-1、1 pg.µL-1。
图6中，泳道1：五重PCR对照；泳道2：阴性土壤样品；泳道3-8：阳性土壤样品。
图7中，A：贺州市样品；B：靖西市样品；C：广西大学农科基地样品。泳道1：五重PCR对照；泳道2：健康烟草植株；泳道3-5：土壤样品；泳道6-9：植株样品。
具体实施方式
下面结合对本发明专利的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域所属的技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例
1材料和方法
1.1材料
1.1.1供试病原菌
烟草疫霉（P. parasitica）、假茄科雷尔氏菌（R. pseudosolanacearum）、立枯丝核菌（R. solani）（AG-2）、灰葡萄孢（Botrytis cinerea）、茄病镰刀菌（Fusarium solani）、终极腐霉（Pythiumultimum）、胡萝卜果胶杆菌（Pectobacterium carotovorum subsp.carotovorum）、丁香假单胞菌（Pseudomonas syingae）由广西大学农学院提供。
尖孢镰刀菌（F. oxysporum）由河南省农业科学院烟草研究所提供。
基生根串珠霉（T. basicola）由安徽农业大学植物保护学院提供。
1.1.2试剂
PCR反应液MasterMix（2×）购自南宁市拓普邦生物科技有限公司。
DNA Marker、细菌DNA提取试剂盒购自上海生工生物工程（上海）股份有限公司。
真菌DNA提取试剂盒、植物DNA提取试剂盒以及土壤DNA提取试剂盒购自杭州博日科技股份有限公司。
1.1.3供试培养基
燕麦琼脂（OMA）培养基：燕麦片30 g，琼脂20 g，去离子水1000 mL。
马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基：46 g PDA制剂粉（青岛高科技工业园海博生物技术有限公司），去离子水1000 mL。
V8汁琼脂（V8）培养基：V8蔬菜汁200 mL，CaCo33 g，琼脂20 g，去离子水1000 mL。
牛肉膏蛋白胨（NB）培养液：牛肉膏3 g，蛋白胨8 g，蔗糖10 g，去离子水1000 mL，pH=7。
1.2 DNA提取
将烟草立枯病菌和根腐病菌分别接种于PDA培养基上，根黑腐病菌接种于V8培养基上，黑胫病菌接种于OMA培养基上，28℃培养5 d后刮取菌丝体，按照真菌DNA提取试剂盒说明提取DNA；将青枯病菌接种于NB培养液28℃下180r/min振荡培养24 h，按照细菌DNA试剂盒说明提取DNA；植株和土壤样品分别按照植株DNA提取试剂盒和土壤DNA提取试剂盒提取DNA。
1.3五种目的病原菌菌株验证
利用真菌通用引物ITS4和ITS5扩增烟草黑胫病菌、立枯病菌、根腐病菌以及根黑腐病菌的ITS序列；利用细菌通用引物16s-63F和16s-1387R扩增青枯病菌的16S rRNA序列，将所得到的PCR产物测序，测序结果在NCBI中进行同源性比较，并对五种目标病原菌菌株进行致病性测定。
1.4引物设计与合成
根据烟草青枯病菌的fliC基因（GenBank登录号LC102464）、立枯病菌的RPB2基因（GenBank登录号MT150070）、根腐病菌的COI基因（GenBank登录号FJ590533）以及根黑腐病菌的TEF1基因（GenBank登录号HM569628），应用Primer 6.0设计引物，黑胫病菌采用基于parA1基因设计的特异性引物，引物由南宁捷尼斯生物科技有限公司合成，引物序列如表1所示。使用时引物浓度先稀释为10 µmol.L-1，然后在PCR反应体系中加入相应体积的该浓度的引物。
表1 PCR特异性引物信息
1.5单重PCR特异性检测
以五种目标病原菌基因组DNA为模板，分别以常见的土传病原菌终极腐霉、灰葡萄孢、茄病镰刀菌、胡萝卜果胶杆菌和丁香假单胞菌基因组DNA为对照，检测设计的五对引物的特异性，PCR反应体系如表2所示。
表2单重PCR特异性检测PCR反应体系
PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，循环30次；72℃延伸10min。结束后将PCR反应产物在质量分数为1%的琼脂糖凝胶电泳分析，结果见图1。
1.6多重PCR体系的建立
在常规PCR反应体系的基础上，同时加入五种目标病原菌的基因组DNA和特异性引物，对影响PCR体系的重要因素进行优化。引物用量设置如表3，退火温度分别设置为52℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、62℃、64℃。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳，紫外凝胶成像仪进行电泳观察，筛选出最佳PCR体系。
表3引物体积（µL）
1.7多重PCR特异性验证
将五种目标病原菌DNA随机组合，采用设计的5对引物用优化的PCR体系进行多重PCR验证。
1.8多重PCR灵敏度检测
分别将这五种目标病原菌的基因组DNA进行10倍梯度稀释（10 ng-1 pg），以五种病原菌10 ng-1 pg范围内的基因组DNA作为模板，采用其引物进行单重PCR扩增，PCR反应体系（25 µL)：2×PCR Mix 12.5 µL，DNA模板1 µL，引物各1 µL，ddH2O 9.5 µL。再以稀释后的这五种病原菌10 ng-1 pg范围内的基因组DNA为模板，每个反应中加入等量的这五种病原菌的基因组DNA，多重PCR反应体系（25 µL)：2×PCR Mix 12.5 µL，五种DNA模板各1 µL，引物对Sf1和Sr1、引物对Ff1和Fr1、引物对Pf1和Pr1各0.3 µL，引物对Rf1和Rr1 1.8 µL，引物对TBf1和TBr1 1 µL，加ddH2O补足25µL。按照优化的PCR程序进行扩增。
1.9带菌土壤和植株样品的多重PCR检测
1.9.1人工接种土壤和植株样品的多重PCR检测
在种植烟草的田块采集土壤进行干燥灭菌，分别将烟草黑胫病菌、青枯病菌、立枯病菌、根腐病菌和根黑腐病菌单独和混合后加入土壤中，得到人工接种的阳性土壤样品，灭菌后的田间土壤样品为阴性土壤样品。按照优化PCR反应体系进行扩增。
1.9.2田间样品的多重PCR检测
利用本研究建立的多重PCR体系，对从广西贺州市、靖西市、广西大学农科基地随机采集的烟田土壤和发病烟株样品进行检测。采用植株DNA提取试剂盒和土壤DNA提取试剂盒分别提取烟株和烟田土壤DNA，以提取的健康烟株DNA为对照，进行多重PCR扩增。
2结果和分析
2.1目标菌株的验证
ITS扩增的烟草黑胫病菌、根腐病菌、根黑腐病菌、立枯病菌与16S rRNA扩增青枯病菌的PCR产物经测序后，在NCBI网站上的GenBank同源性比对结果显示，其与相对应病原菌的同源性都达到100%。
另外，致病性测定结果表明，这五种病原菌均可使烟草发生相应病害。
综上，说明供检测的目标病原菌鉴定无误。
2.2单重PCR特异性验证结果
从图1可以看出，以五种病原菌的DNA作为模板，用相应的引物经PCR扩增分别得到424 bp、316 bp、219 bp、139 bp、110 bp的特异性条带，与预期片段一致，而在丁香假单胞菌、胡萝卜果胶杆菌、灰葡萄孢、茄病镰刀菌、终极腐霉等非目标病菌和阴性对照中均未能扩增出条带。说明引物特异性高，可用于多重PCR检测。
另外，利用Clone Manager引物比对结果显示设计的引物均只能在该病原菌全基因组上找到位点。
2.3多重PCR体系的建立
不同引物用量下多重PCR的扩增结果如图2所示。
从图2的1中可以看出，当引物浓度一样时，立枯病菌和根黑腐病菌无目标条带，通过逐渐降低青枯病菌、根腐病菌以及黑胫病菌的引物用量，同时增加立枯病菌引物用量，立枯病菌和根黑腐病菌条带逐渐清晰，结果如图2的8所示，当引物对Sf1和Sr1、引物对Ff1和Fr1、引物对Pf1和Pr1各0.3µL，引物对Rf1和Rr1 1.8µL，引物对TBf1和TBr1 1µL时，能获得五条清晰的条带，应为最佳引物用量。
不同退火温度下多重PCR的扩增结果如图3所示。
从图3可以看出，退火温度从52℃到62℃均可扩增出五条带，55℃到58℃时条带清晰；当退火温度≥64℃时，多重PCR已不能扩增出青枯病菌和根腐病菌的目的条带。综合引物特异性和条带清晰度，设定58℃为最佳退火温度。
2.4多重PCR特异性验证
结果如图4所示。
从图4可以看出，多重PCR反应能随机扩增R.pseudosolanacearum、R. solani、F.oxysporum、T. basicola以及P. parasitica这五种病原菌，结果说明：这五对引物之间不会互相产生影响，检测特异性强。
2.5多重PCR灵敏度检测结果
单重PCR灵敏度检测结果如图5A-E所示，多重PCR灵敏度检测结果如图5-F所示。
从图5A-E可以看出，烟草青枯病菌的检测极限为1 pg.µL-1，立枯病菌和根腐病菌的检测极限都是10 pg.µL-1，根黑腐病菌和黑胫病菌的检测极限为100 pg.µL-1。
从图5-F可以看出，与单重PCR相比，青枯病菌的检测极限降低了一个数量级，立枯病菌、根腐病菌、根黑腐和黑胫病菌的检测极限与单重PCR的一致，能够同时检测到五种病原菌的灵敏度为100 pg.µL-1。
2.6人工接种样品的多重PCR检测结果
人工接种样品检测结果如图6所示。
从图6可以看出，阳性土壤样品均能扩增出目的条带，阴性土壤样品无条带。说明本研究建立的多重PCR方法可应用于后续田间样品检测。
2.7田间样品的多重PCR检测结果
分别从广西贺州市、靖西市、广西大学农科基地烟田随机采集的9份土壤和12份烟草病株样品中提取DNA，进行五重PCR检测，阴性对照为采自广西大学玻璃温室的健康烟株，结果如7所示。
从图7可以看出，6份土壤和8份病株样品中检测出青枯病菌，1份植株样品中检测出立枯病菌，1份土壤和7份病株样品检测出根腐病菌，1份土壤样品中检测出根黑腐病菌，3份病株样品中检测出黑胫病菌，2份土壤中未见目标菌，检测结果与分离培养结果相吻合。通过检测发现，田间存在两种甚至三种土传病原菌复合侵染现象。因此，该研究建立的多重PCR体系可用于田间烟草青枯病菌、立枯病菌、根腐病菌、根黑腐病菌以及黑胫病菌的快速检测。
从上可以看出，本发明能够同时快速检测烟草黑胫病菌、青枯病菌、立枯病菌、根腐病菌和根黑腐病菌以及田间带菌烟草病株和土壤，对混合DNA检测的灵敏度达到了100pg/µL，可以为烟草土传病害以及同种病原菌引起的其他作物病害的快速诊断、早期监测预警以及防控提供有力依据，具有较高的应用前景。
前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。
序列表
<110> 广西大学
<120> 一种同时检测烟草5种病原菌的引物组、试剂盒及其应用
<130> 2020
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aatccaacaa cggcggtct 19
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tcagaagcgt agtcggtatc g 21
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
aacggtgtct ggcttggtat t 21
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tctcttcttc gtccgcatcg 20
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
agccataatt gaaggtggag tg 22
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
actgctcatc cgaataatgc ta 22
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gagcgtgagc gtggtatca 19
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gcgtctgttg atggcttgtt a 21
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
cattgagtag ccagagtccg tc 22
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ccaccacgca gcaaactgcg gc 22
Claims (4)
1.一种同时检测烟草5种病原菌的引物组，其特征在于，包括5对特异性引物：引物对Sf1和Sr1、引物对Rf1和Rr1、引物对Ff1和Fr1、引物对TBf1和TBr1以及引物对Pf1和Pr1，其序列分别对应如SEQ ID No.1至SEQ ID No.10所示。
2.一种同时检测烟草5种病原菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括以下多重PCR反应体系：2×PCR Mix 12.5μL、待测病原菌模板DNA各1μL、5对特异性引物混合物，加ddH2O补足至25μL；其中，所述5对特异性引物分别为引物对Sf1和Sr1、引物对Rf1和Rr1、引物对Ff1和Fr1、引物对TBf1和TBr1以及引物对Pf1和Pr1，其序列分别对应如SEQ ID No.1至SEQID No.10所示。
3.根据权利要求2所述的同时检测烟草5种病原菌的试剂盒，其特征在于，所述5对特异性引物混合物具体为：引物对Sf1和Sr1、引物对Ff1和Fr1以及引物对Pf1和Pr1各0.3μL、引物对Rf1和Rr1 1.8μL以及引物对TBf1和TBr1 1μL。
4.根据权利要求1所述的同时检测烟草5种病原菌引物组或权利要求2-3任一项所述的同时检测烟草5种病原菌的试剂盒在检测烟草黑胫病、青枯病、立枯病、根腐病和根黑腐病上应用。
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