CN105483260B - 北京泛菌特异引物对及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了北京泛菌特异引物对及其应用。本发明提供的北京泛菌特异引物对ALF‑ALR，由引物ALF和引物ALR组成；所述引物ALF为SEQ ID No.1所示的单链DNA分子；所述引物ALR为SEQ ID No.2所示的单链DNA分子。北京泛菌特异引物对ALF‑ALR只在北京泛菌的基因组DNA中扩增出了特异条带，在其它菌株中均没有得到扩增产物，北京泛菌特异引物对ALF‑ALR可用于快速鉴定北京泛菌。

Description

北京泛菌特异引物对及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域中北京泛菌特异引物对及其应用。
背景技术
我国从上世纪九十年代开始杏鲍菇规模化栽培。泛菌属包括作为植物促生菌、生防菌或植物病原菌的几个种(Pantoea:insights into a highly versatile and diversegenus within the Enterobacteriaceae,FEMS Microbiology Reviews(2015)39:968-984)。由泛菌引起的杏鲍菇细菌性软腐病是近几年在国内外杏鲍菇工厂化生产中发生的严重病害，报道于北京地区的杏鲍菇软腐病的病原菌被鉴定及定名为北京泛菌(Pantoeabeijingensis sp.nov.,isolated from the fruiting body of Pleurotus eryngii.Liuet al.Antonie van Leeuwenhoek(2013)104:1039–1047)。杏鲍菇细菌性软腐病在生产车间一旦发生，就很难控制，给杏鲍菇工厂化生产造成严重的损失。北京泛菌也是北京地区发生的白灵菇软腐病的致病细菌(First report of Pantoea beijingensis induced softrot disease of Pleurotus nebrodensis in China.Xu et al.Plant Disease(2014)98(7):1000)。北京泛菌快速诊断技术的开发，对杏鲍菇软腐病和白灵菇软腐病的有效防控具有重要意义。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何鉴定或辅助鉴定北京泛菌(Pantoeabeijingensis)。
为解决上述技术问题，本发明提供了北京泛菌特异PCR引物对。
本发明所提供的北京泛菌特异PCR引物对名称为ALF-ALR，由引物ALF和引物ALR组成；所述引物ALF为SEQ ID No.1所示的单链DNA分子；所述引物ALR为SEQ ID No.2所示的单链DNA分子。
本发明还提供了包括北京泛菌特异引物对ALF-ALR的鉴定或辅助鉴定北京泛菌的试剂或试剂盒。
上述鉴定或辅助鉴定北京泛菌的试剂或试剂盒还包括进行PCR反应所需的除引物外的其它试剂。
本发明还提供了北京泛菌特异引物对ALF-ALR的制备方法，鉴定或辅助鉴定北京泛菌的试剂或试剂盒的制备方法。
本发明所提供的北京泛菌特异引物对ALF-ALR的制备方法包括将北京泛菌特异引物对ALF-ALR的所述两条单链DNA分子分别单独包装的步骤。
本发明所提供的鉴定或辅助鉴定北京泛菌的试剂或试剂盒的制备方法，包括将北京泛菌特异引物对ALF-ALR的所述两条单链DNA分子分别单独包装的步骤。
本发明还提供了SEQ ID No.3所示的DNA分子。
SEQ ID No.3所示的DNA分子为北京泛菌的特异DNA片段。
北京泛菌特异引物对ALF-ALR在鉴定或辅助鉴定北京泛菌中的应用、鉴定或辅助鉴定北京泛菌的试剂或试剂盒在鉴定或辅助鉴定北京泛菌中的应用和SEQ ID No.3所示的DNA分子在鉴定或辅助鉴定北京泛菌中的应用也属于本发明的保护范围。
上述应用均不包括疾病的诊断方法和/或治疗方法。
本发明还提供了鉴定或辅助鉴定北京泛菌的方法。
本发明所提供的鉴定或辅助鉴定北京泛菌的方法，包括以待测生物样品的基因组DNA为模板，用北京泛菌特异引物对ALF-ALR进行PCR扩增得到PCR产物，检测所述PCR产物的大小，如果所述PCR产物含有500-1000bp的DNA片段(或所述PCR产物为500-1000bp的DNA片段)，所述待测生物样品为北京泛菌或含有北京泛菌，或者所述待测生物样品候选为北京泛菌或候选含有北京泛菌；如果所述PCR产物不含有500-1000bp的DNA片段(或所述PCR产物不为500-1000bp的DNA片段)，所述待测生物样品不为北京泛菌或不含有北京泛菌，或者所述待测生物样品候选不为北京泛菌或候选不含有北京泛菌。
上述鉴定或辅助鉴定北京泛菌的方法中，所述500-1000bp的DNA片段具体可为700-1000bp的DNA片段，如840bp的DNA片段。
实验证明，北京泛菌特异引物对ALF-ALR只在北京泛菌的基因组DNA中扩增出了特异条带，在其它菌株中均没有得到扩增产物，北京泛菌特异引物对ALF-ALR可用于快速鉴定北京泛菌。本发明为及早地预防和及时地切断北京泛菌引起的杏鲍菇软腐病和白灵菇软腐病的传染源及传播途径提供了技术支持，可实现对北京泛菌引起的杏鲍菇软腐病和白灵菇软腐病进行早期预防和控制。
附图说明
图1为引物对16sp1-16sp2对泛菌的PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图。其中，M：1kb plus DNA ladder；1.北京泛菌(Pantoea beijingensis sp.nov.)JZB2120001T；2.Pantoea gaviniae DSM22758；3.Pantoea eucalypti DSM23077；4.Pantoea anthophilaDSM23080；5.Pantoea agglomerans DSM30072；6Pantoea dispersa DSM30073；7.Pantoeaagglomerans JCM1236；8.Pantoea agglomerans JCM20143；9.Pantoea pleurotisp.nov.JZB2120015T。
图2为北京泛菌特异引物对ALF-ALR特异性检测泛菌的PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图。其中，M：1kb plus DNA ladder；1.北京泛菌(Pantoea beijingensis sp.nov.)JZB2120001T；2.Pantoea gaviniae DSM22758；3.Pantoea eucalypti DSM23077；4.Pantoea anthophila DSM23080；5.Pantoea agglomerans DSM30072；6Pantoeadispersa DSM30073；7.Pantoea agglomerans JCM1236；8.Pantoea agglomeransJCM20143；9.Pantoea pleuroti sp.nov.JZB2120015T。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的北京泛菌(Pantoea beijingensis sp.nov.)JZB2120001T(即LMG27579T或KCTC 32406T)(Pantoea beijingensis sp.nov.,isolated from the fruitingbody of Pleurotus eryngii.Liu etal.Antonie van Leeuwenhoek(2013)104:1039–1047)公众可从北京市农林科学院植物保护环境保护研究所或比利时BCCM/LMG菌种保藏中心或韩国KCTC菌种保藏中心获得该菌株。
下述实施例中的Pantoea pleuroti sp.nov.JZB2120015T(Pantoea pleurotisp.nov.,Isolated from the Fruiting Bodies of Pleurotus eryngi i.Ma etal.Current Microbiology.19November 2015)公众可从北京市农林科学院植物保护环境保护研究所或比利时BCCM/LMG菌种保藏中心或中国CGMCC菌种保藏中心获得该菌株。
下述实施例中的Pantoea gaviniae DSM22758、Pantoea eucalypti DSM23077、Pantoea anthophila DSM23080、Pantoea agglomerans DSM30072和Pantoea dispersaDSM 30073均为德国DSM菌种保藏中心的菌株。
下述实施例中的Pantoea agglomerans JCM1236和Pantoea agglomeransJCM20143为日本JCM菌种保藏中心的菌株。
实施例1、利用PCR引物对ALF-ALR鉴定北京泛菌
1、鉴定北京泛菌的PCR试剂
本实施例的鉴定北京泛菌的PCR试剂由北京泛菌特异引物对ALF-ALR、2×Taq PCRMix(Bioeasy)和ddH2O组成。
其中,北京泛菌特异引物对ALF-ALR由ALF(上游引物)和ALR(下游引物)组成，ALF的核苷酸序列是5'ATCTCTCAGACAAGCCCGTTAGTAACAACT 3'(SEQ ID No.1)，ALR的核苷酸序列是5'GATTTTCCTTCACATATTCCACTGCACGAG 3'(SEQ ID No.2)。
2、鉴定北京泛菌
2.1、提取菌株的DNA
从-80℃保存的菌种(北京泛菌(Pantoea beijingensis sp.nov.)JZB2120001T；Pantoea gaviniaeDSM22758；Pantoea eucalypti DSM23077；Pantoea anthophilaDSM23080；Pantoea agglomerans DSM30072；Pantoea dispersa DSM30073；Pantoeaagglomerans JCM1236；Pantoea agglomerans JCM20143或Pantoea pleurotisp.nov.JZB2120015T)在固体LB培养基中划线，28℃培养20h，用接种环挑取各细菌菌株单个菌落接于装有LB培养基(3mL)的试管中，以200rpm 28℃振荡培养18h。
将各供试菌株用DNeasy Blood&Tissue Kit(QIAGEN)提取总DNA作为PCR模板，按照试剂盒的说明书操作，具体步骤如下：
1)收集2ml细菌培养液，12000rpm离心1min，去掉上清。
2)加入180μl Buffer ATL，20μl蛋白酶K，4μl RNaseA，56℃处理1小时。
3)振荡15s，加入200μl buffer AL混匀。
4)加入200μl无水乙醇，8000rpm离心3min。
5)上清收集到离心柱中，8000rpm离心1min。
6)在离心柱中加入500μl Buffer AW1，8000rpm离心1min。
7)在离心柱中加入500μl Buffer AW2，8000rpm离心1min。
8)将离心柱放到一个新的1.5ml离心管上，加入50μl Buffer AE，室温放置1min，8000rpm离心1min，所得即为细菌的总DNA。
2.2、PCR扩增
分别以2.1提取的各菌株的总DNA为模板，利用步骤1的北京泛菌特异引物对ALF-ALR进行PCR。PCR反应体系(20μL)：10μmol·L-1的上、下游引物各1μL，2×Taq PCR Mix(Bioeasy)10μL，模板DNA 1μL，ddH2O 7μL。PCR反应条件：95℃，5min；95℃，30s，66℃，30s，72℃1min,30个循环；72℃延伸10min。1％琼脂糖凝胶电泳检测。
利用引物对16sp1-16sp2PCR扩增各菌株的16srDNA片段。引物对16sp1-16sp2由16sp1(序列为5’AGAGTTTGATCCTGGCTCAGAACGAACGCT 3’)和16sp2(序列为5’TACGGCTACCTTGTTACGACTTCACCCC 3’)组成。PCR反应体系(20μL)：10μmol·L-1的上、下游引物各1μL，2×Taq PCR Mix(Bioeasy)10μL，模板DNA 1μL，ddH2O 7μL。PCR反应条件：95℃，5min；95℃，30s，55℃，30s，72℃2min,30个循环；72℃延伸10min。1％琼脂糖凝胶电泳检测。
结果表明引物对16sp1-16sp2在供试的9个菌株中均能扩增出目的条带，说明供试菌株的DNA提取效果良好(图1)。北京泛菌特异引物对ALF-ALR只能以北京泛菌(Pantoeabeijingensis sp.nov.)JZB2120001T为模板扩增出大小为500-1000bp条带，其它8个菌株没有该500-1000bp条带(图2)。回收北京泛菌(Pantoea beijingensis sp.nov.)JZB2120001T的500-1000bp条带，进行测序，结果表明该500-1000bp条带的大小为840bp，其序列为SEQ ID No.3。说明北京泛菌特异引物对ALF-ALR是北京泛菌的特异引物对，可用于快速鉴定北京泛菌。

Claims (9)

1. 北京泛菌特异引物对，由引物ALF和引物ALR组成；所述引物ALF为SEQ ID No.1所示的单链DNA分子；所述引物ALR为SEQ ID No.2所示的单链DNA分子。
2.鉴定或辅助鉴定北京泛菌的试剂或试剂盒，包括权利要求1所述的北京泛菌特异引物对。
3.权利要求1所述的北京泛菌特异引物对的制备方法，包括将所述北京泛菌特异引物对的所述两条单链DNA分子分别单独包装的步骤。
4.权利要求2所述的试剂或试剂盒的制备方法，包括将所述北京泛菌特异引物对的所述两条单链DNA分子分别单独包装的步骤。
5.权利要求1所述的北京泛菌特异引物对在鉴定或辅助鉴定北京泛菌中的应用。
6.权利要求2所述的试剂或试剂盒在鉴定或辅助鉴定北京泛菌中的应用。
7.鉴定或辅助鉴定北京泛菌的方法，包括以待测生物样品的基因组DNA为模板，用权利要求1所述的北京泛菌特异引物对进行PCR扩增得到PCR产物，检测所述PCR产物的大小，如果所述PCR产物含有840bp的DNA片段，所述待测生物样品为北京泛菌或含有北京泛菌，或者所述待测生物样品候选为北京泛菌或候选含有北京泛菌；如果所述PCR产物不含有840bp的DNA片段，所述待测生物样品不为北京泛菌或不含有北京泛菌，或者所述待测生物样品候选不为北京泛菌或候选不含有北京泛菌。
8. SEQ ID No.3所示的DNA分子。
9. SEQ ID No.3所示的DNA分子在鉴定或辅助鉴定北京泛菌中的应用。
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