CN103436628B - 一种快速检测禾谷镰孢菌对多菌灵中等抗性水平菌株的方法 - Google Patents

一种快速检测禾谷镰孢菌对多菌灵中等抗性水平菌株的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种快速检测禾谷镰孢菌对多菌灵中抗菌株的方法，可用于引起小麦赤霉病的禾谷镰孢菌对多菌灵的抗性群体的动态监测及流行预警。本发明是以环介导恒温扩增技术(LAMP)为基础建立起来的一种快速检测禾谷镰孢菌对多菌灵抗性菌株的分子技术。该检测方法通过在禾谷镰孢菌对多菌灵的中抗菌株(F167Y)的β2微管蛋白上设计2对特异性引物，进行LAMP扩增，根据反应产物颜色判定是否为禾谷镰孢菌对多菌灵抗性菌株。如果颜色为天蓝色(有扩增产物)为禾谷镰孢菌对多菌灵抗性菌株；如果颜色为紫色(无扩增产物)则为禾谷镰孢菌敏感菌株。本发明简便、快速、成本低，对小麦赤霉病菌抗性风险评估及合理用药具有重要的现实意义。

Description

一种快速检测禾谷镰孢菌对多菌灵中等抗性水平菌株的方法
技术领域
本发明是基于环介导恒温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)对禾谷镰孢菌的多菌灵中等抗性水平菌株的快速分子检测方法，可用于禾谷镰孢菌对多菌灵抗性群体发展的动态监测与抗性风险评估，进行抗药性小麦赤霉病的流行预测，为小麦赤霉病的防治提供用药指导。
背景技术
环介导恒温扩增反应(LAMP)是2000年由日本学者Notomi等发明的一种新颖的恒温核酸体外扩增技术，广泛应用于动物、植物等疾病的基因诊断。该技术原理是：利用一套(4种)特异性引物，在一种高活性链置换DNA聚合酶的作用下引起自循环链置换反应，60～65℃范围60min内，大量合成目标DNA的同时伴随有副产物——白色的焦磷酸镁沉淀产生。羟基萘酚蓝(HNB)是一种金属离子指示剂，根据反应液中镁离子的变化而呈现出不同的颜色，阴性(没有扩增出产物)时为紫色，阳性(有产物扩增)时为天蓝色。LAMP方法的最大特点就是实现恒温扩增，不需要循环仪等昂贵的仪器；扩增反应极快，一般在1小时内完成；扩增产生的产物量大，通过肉眼即可判定结果，不需要繁琐的电泳过程；灵敏度高、特异性强；操作简便、快捷，极适于病原的快速诊断及检测。
小麦赤霉病是一类由禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)引起的一种分布较广、破坏性较强的世界性病害，严重影响着小麦的产量和品质。多年来，小麦赤霉病主要采用苯并咪唑类杀菌剂或以这类药剂为主的复配剂进行化学防治。但是随着使用年限和频率的增长，田间逐渐产生了抗药性群体，从而导致该病防效下降。经过多年的研究，南京农业大学植物药理学和病害防控实验室发现小麦赤霉病菌对多菌灵的抗药性菌株主要是由禾谷镰孢菌β2-微管蛋白基因(FGSG06611.3)突变造成，该基因编码第167位和200位氨基酸密码子的突变分别为TTT(Phe)→TAT(Tyr)和TTC(Phe)→TAC(Tyr)。第167位或者200位氨基酸密码子的突变可引起禾谷镰孢菌对多菌灵中等抗药性的产生，其中第167位突变占所有抗药性突变类型总量的95％以上，成为病原菌产生田间抗药性的主要原因。
病原菌在自然界的数量巨大，抗药性个体在群体中的比例达到3％时，即可引起抗药性病害流行，导致药剂防治失败。传统的检测方法需要分离培养病原菌，然后在含药培养基上培养，再根据药剂对菌丝生长的抑制作用鉴别抗药性。本发明在抗药性机制研究的基础上，基于LAMP技术能快速、准确检测禾谷镰孢菌对多菌灵的抗药性。该检测方法具有简单、快速、成本低，灵敏性高等特点，能大大提高检测效率，对小麦赤霉病的有效防治、抗药性流行预警具有重要的现实意义。然而，经检索目前国内外尚未有禾谷镰孢菌对多菌灵抗性菌株的LAMP快速分子检测的相关报道。
发明内容
已报道的禾谷镰孢菌对多菌灵抗性菌株的鉴定及检测方法存在费时、费力、成本高的缺点。针对这一缺点，根据禾谷镰孢菌对多菌灵抗性菌株的基因型，通过实验条件优化，建立了一种快速检测禾谷镰孢菌对多菌灵抗性菌株的方法。该方法具有简便、快速、省时省力、灵敏度高等特点，对小麦赤霉病的合理用药、控制病害发生与流行、减少经济损失具有实用价值。
田间采集的多菌灵中抗禾谷镰孢菌菌株的95％以上的突变类型是由于禾谷镰孢菌的β2微管蛋白基因编码的第167位氨基酸密码子突变造成的。本发明所述的快速检测禾谷镰孢菌对多菌灵中等抗性水平菌株的分子生物学方法，步骤是：
(1)在禾谷镰孢菌的β2微管蛋白基因上包括167位氨基酸的序列设计1对外引物和1对内引物，利用该引物在恒温条件下，进行LAMP扩增；
①LAMP反应所用的外引物对：
F3：TTCCAGCTGACGCACTCT
B3：ACAGAAGGTCTCGTCAGAGT
②LAMP反应所用的内引物对(含人为引入错配碱基)：
FIP：TGCGATCGGGGAACTCCTCG-TGGTACCGGTTCCGGTATG
BIP：ACCGTTATGCCCTCGCCC-ACGAGCTGGTTCAGAGACAA
③LAMP反应体系及其条件：
反应体系(10μL)：
反应条件：
63℃60min，80℃10min；
(2)对上述LAMP扩增产物观察其颜色变化，并在3.0％琼脂糖凝胶电泳上分离，观察扩增结果；
(3)鉴定是否为多菌灵中抗的禾谷镰孢菌菌株；如果LAMP扩增产物显示天蓝色(有产物扩增)，这时电泳图谱应为梯状条带，判定为多菌灵中抗的禾谷镰孢菌菌株；如果扩增产物为紫色(无产物扩增)，这时电泳图谱无条带扩增，判定为多菌灵敏感的禾谷镰孢菌菌株(图1)。
本发明提供的快速检测对多菌灵中抗的禾谷镰孢菌的分子生物学方法，具有灵敏度高，特异性强等特点，与现有技术相比，本发明的有益结果是：
1、简便易行：该检测方法通过恒温水浴锅或有稳定热源的设备就能进行实验，通过反应产物颜色变化即可判定结果，省去了昂贵的仪器设备及繁琐的电泳过程；
2、检测高效性：该检测方法所用检测时间仅需1小时，而传统的室内生物测定法需要几天时间，PCR检测方法也要数小时，这样能大大提高检测效率；
3、灵敏度高：以禾谷镰孢菌对多菌灵中抗菌株(F167Y)基因组DNA为模板，该方法的检测下限是常规PCR的10倍；
4、特异性强：该方法通过2对引物特异性识别靶序列上的6个独立区域，相对于PCR引物识别靶序列的2个独立区域而言，特异性大大提高，假阳性出现的概率也随之降低；
5、准确性高：该方法几乎不受反应混合液中存在的大量外源DNA和杂质的影响，不需要从样本中纯化DNA，可直接利用发病组织及病残体提取DNA进行快速检测，大大提高检测准确度；
6、本发明是国内外首次利用LAMP技术对多菌灵中抗禾谷镰孢菌菌株进行检测，这种方法简便快捷，对抗性菌株的准确诊断、及时了解抗性群体发展动态、指导科学用药、降低成本及减少环境污染具有重要的现实意义；
7、对所采集的112株禾谷镰孢菌对多菌灵抗性菌株的LAMP检测结果与传统的室内生物测定法鉴定结果完全吻合。
附图说明
图1：禾谷镰孢菌野生菌株及多菌灵中抗菌株(F167Y)的LAMP反应颜色变化及电泳谱带图
其中：M-100bp Marker；1为禾谷镰孢菌野生菌株；2为禾谷镰孢菌对多菌灵中抗菌株(F167Y)。
具体实施方式
实施例1LAMP反应体系优化
为了节省检测成本，保证该检测方法的稳定性和可靠性，对反应体系中Bst DNA聚合酶(8U/μL)(0.8U-4U)、Mg2+(25mM)浓度(0.4-2.4μL)、引物FIP/BIP(40μM)及F3/B3(20μM)浓度(0.1-0.5μL)，甜菜碱(8M)浓度(0.4-2.4μL)、HNB(2.5mM)浓度(0.2-1μL)进行了优化，确定了最佳反应体系为：Bst DNA聚合酶(8U/μL)0.3μL，10×ThermoPol1μL，MgCl2(25mM)1.6μL，dNTP(10mM)1.0μL，FIP(40μM)0.4μL，BIP(40μM)0.4μL，F3(10μM)0.2μL，B3(10μM)0.2μL，甜菜碱(8M)1.2uL，HNB(2.5mM)0.6μL，基因组DNA0.5μL，dH2O(灭菌蒸馏水)2.6μL。
实施例2LAMP反应条件优化
为了得到最适的反应温度和时间，保证该检测方法的高效性，对反应参数中的反应温度(60-65℃)及时间(15-90min)进行了优化，最终确定最适的反应温度和时间分别为63℃和60min。
实施例3LAMP反应灵敏度检测
为了确定LAMP反应的检测下限，本实验以基因组DNA作为模板，以10倍梯度稀释。以上述稀释的基因组DNA作为模板，分别进行LAMP及PCR扩增。最终得出，LAMP的最低检测下限为普通PCR检测下限的10倍。
实施例4LAMP引物特异性检测
以禾谷镰孢菌对多菌灵中抗菌株(F167Y)及野生型菌株的基因组DNA为模板分别进行LAMP扩增，该技术具有较好的特异性。当模板为抗性菌株时，反应产物颜色为天蓝色，电泳图谱成梯状条带(图1)；当模板为野生型菌株时，反应产物颜色为紫色，电泳无条带(图)。
实施例5LAMP重复性检测
对2011-2013年采集不同地理位置的43个多菌灵抗性的禾谷镰孢菌菌株基因组DNA为模板进行LAMP检测，43个实验样品的反应颜色均为天蓝色，电泳图谱均呈梯状条带。并经过突变基因的测序结果表明，43个样品均在β2微管蛋白序列的167位发生点突变(F167Y)。上述结果表明该检测方法结果可靠，重复性好。
本发明所建立的检测方法能准确、快速检测出禾谷镰孢菌对多菌灵中抗的菌株，为科学研究和生产实践提供了一种简便、快速、成本低廉的检测技术，也为小麦赤霉病菌对多菌灵抗性群体的动态监测，抗药性病害的流行预警及合理用药提供了理论基础和技术指导，对增加生态、社会和经济效益都具有现实而深远的意义。

Claims (1)

1.一种基于LAMP技术快速检测禾谷镰孢菌对多菌灵中等抗性水平菌株的分子生物学方法，该方法共分三步：
(1)运用两对特异性引物对待鉴定真菌的基因组DNA进行LAMP恒温扩增，其中所述的两对特异性引物的碱基序列分别是：
LAMP反应所用的外引物对：
F3：5’-TTCCAGCTGACGCACTCT-3’
B3：5’-ACAGAAGGTCTCGTCAGAGT-3’
LAMP反应所用的内引物对：
FIP：5’-TGCGATCGGGGAACTCCTCG-TGGTACCGGTTCCGGTATG-3’
BIP：5’-ACCGTTATGCCCTCGCCC-ACGAGCTGGTTCAGAGACAA-3’
反应体系：
反应参数：63℃60min，80℃10min；
(2)对上述LAMP扩增产物观察其颜色变化，并在3.0％琼脂糖凝胶电泳上分离，观察扩增结果；
(3)鉴定是否为禾谷镰孢菌抗多菌灵菌株；LAMP扩增产物显示天蓝色，电泳图谱应为梯状条带，判定为禾谷镰孢菌抗多菌灵菌株；扩增产物为紫色，电泳图谱无条带扩增，判定为禾谷镰孢菌敏感菌株。
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