CN104928364A - 基于环介导恒温扩增技术检测禾谷镰孢菌对多菌灵抗性基因型f200y的方法及引物组合物 - Google Patents

Abstract

本发明公开了基于环介导恒温扩增技术检测多菌灵抗性基因型F200Y禾谷镰孢菌的方法及引物组合物。用于检测多菌灵抗性基因型F200Y禾谷镰孢菌的引物组合物，由SEQ ID NO.2所示的正向内引物FIP、SEQ ID NO.3所示的反向内引物BIP、SEQ ID NO.4所示的正向外引物F3、SEQ ID NO.5所示的反向外引物B3组成。本发明的检测方法简便易行、实用性好、灵敏度高、特异性强、准确性高、实现了恒温扩增，同时还为多菌灵抗性基因型F200Y禾谷镰孢菌的检测提供了新的技术平台，能够对禾谷镰孢菌的多菌灵抗性群体进行监测，及时了解抗性群体发展动态，本发明对小麦赤霉病的抗药性治理和科学指导用药，降低生产成本，减少农药的环境污染也具有重要意义。

Description

基于环介导恒温扩增技术检测禾谷镰孢菌对多菌灵抗性基因型F200Y的方法及引物组合物

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及基于环介导恒温扩增技术检测禾谷镰孢菌对多菌灵抗性基因型F200Y菌株的方法及引物组合物；可用于禾谷镰孢菌对多菌灵抗性群体发展的动态监测与抗性风险评估，进行抗药性小麦赤霉病的流行预测，为小麦赤霉病的防治提供用药指导。

背景技术

由禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)引起小麦赤霉病是一种分布较广、破坏性较强的世界性病害，在小麦的整个生长阶段均可发生，可引起种腐、苗腐、茎腐、秆腐和穗腐，其中以穗腐的危害和损失最大，该病菌能在感病的麦粒中产生多种衍生真菌毒素及次生代谢物质，如脱氧雪腐镰刀菌烯醇(Deoxynivalenol，DON)和雪腐镰刀菌烯醇(Nivalenol，NIV)等，严重降低小麦的品质，并能引起人类和哺乳动物中毒，发生腹泻、头晕、流产等急性毒性和干扰蛋白质合成、免疫功能下降等慢性毒性，严重威胁着人和动物的健康。多年来，小麦赤霉病主要采用以多菌灵为主的苯并咪唑类杀菌剂或以这类药剂为主的复配剂进行化学防治。但是随着使用年限和频率的增长，田间逐渐产生了抗药性群体，从而导致该病防效下降。经过多年的研究，南京农业大学周明国教授课题组发现小麦赤霉病菌对多菌灵的抗药性主要是由禾谷镰孢菌β₂-微管蛋白基因(FGSG_06611.3)突变造成，该基因编码第167位和200位氨基酸密码子的突变分别为TTT(Phe)→TAT(Tyr)和TTC(Phe)→TAC(Tyr)。

病原菌在自然界的数量巨大，抗药性个体在群体中的比例达到3％时，即可引起抗药性病害流行，导致药剂防治失败。传统的抗性菌株的检测方法主要是通过分离培养病原菌，然后在含药培养基上培养，根据药剂对菌丝生长的抑制作用鉴别抗药性，该方法检测周期长，从分离到鉴定长达1周，甚至数周，且在病原菌培养过程中存在杂菌污染。近年来，随着核酸相关分子检测技术的发展，PCR技术为植物病原菌的抗药性检测提供了快速、灵敏、准确的优势，但是检测需要昂贵的实验仪器及繁琐的电泳过程，检测时间较长，检测成本高昂，不能满足快速检测的需求，并且在鉴定过程中还需要接触大量有毒有害试剂，对实验操作人员存在较大的安全隐患。

环介导恒温扩增反应(LAMP)是日本学者Notomi等发明的一种新颖的恒温核酸体外扩增技术，广泛应用于动物、植物等疾病的基因诊断。该技术原理是：利用一套(4种)特异性引物，在一种高活性链置换DNA聚合酶的作用下引起自循环链置换反应，60～65℃范围30-80min内，大量合成目标DNA的同时伴随有副产物——白色的焦磷酸镁沉淀产生。羟基萘酚蓝(HNB)是一种金属离子指示剂，根据反应液中镁离子的变化而呈现出不同的颜色，阴性(没有扩增出产物)时为紫色，阳性(有产物扩增)时为天蓝色。LAMP方法的最大特点就是实现恒温扩增，不需要循环仪、凝胶成像系统等昂贵的仪器；扩增反应极快，一般在1小时内完成；扩增产生的产物量大，通过肉眼即可判定结果，不需要繁琐的电泳过程；灵敏度高、特异性强；操作简便、快捷，极适于病原突变基因型的快速鉴定及检测。

本发明在抗药性机制研究的基础上，基于LAMP技术能快速、准确鉴定禾谷镰孢菌对多菌灵的抗性基因型F200Y。该鉴定方法具有简单、快速、成本低，灵敏性高等特点，能大大提高检测效率，对小麦赤霉病的抗药性治理、监测及抗药性流行预警具有重要的现实意义。然而，经检索，该技术在植物病原菌抗药性基因型的检测报道很少，目前国内外尚未有禾谷镰孢菌对多菌灵抗性基因型F200Y的LAMP快速分子鉴定的相关报道。

发明内容

发明目的：针对已有禾谷镰孢菌对多菌灵抗性菌株的鉴定方法中存在费时、费力、成本高、准确性低等缺点及PCR检测技术需要昂贵的热循环仪器和繁琐的电泳操作过程，无法快速检测禾谷镰孢菌的多菌灵抗性菌株，而提供一种禾谷镰孢菌对多菌灵抗性基因型F200Y的新颖快速的分子检测方法，对禾谷镰孢菌的多菌灵抗性基因型F200Y进行LAMP检测，检测周期短、准确性和灵敏度高、肉眼可以直接观察检测结果。

技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：

SEQ ID NO.1所示的禾谷镰孢菌含有200位点突变的β₂-微管蛋白基因序列作为靶标在LAMP检测多菌灵抗性基因型F200Y禾谷镰孢菌中的应用。

用于检测多菌灵抗性基因型F200Y禾谷镰孢菌的LAMP引物组合物：由SEQ ID NO.2所示的正向内引物FIP、SEQ ID NO.3所示的反向内引物BIP、SEQ ID NO.4所示的正向外引物F3、SEQ ID NO.5所示的反向外引物B3组成。

本发明所述的LAMP引物组合物在检测多菌灵抗性基因型F200Y禾谷镰孢菌中的应用。

本发明所述的LAMP引物组合物在制备多菌灵抗性基因型F200Y禾谷镰孢菌的LAMP检测试剂盒中的应用。

一种检测多菌灵抗性基因型F200Y禾谷镰孢菌的LAMP检测试剂盒：包括1mL检测溶液，所述的检测溶液包括：320U Bst DNA聚合酶，20mM Tris-HCl，10mM KCl，10mM(NH4)₂SO₄，2mM MgSO₄，0.1％Triton X-100，2.5mM MgCl₂，0.8mM dNTPs，0.96M甜菜碱，0.2mM羟基溴酚蓝(HNB)，1.0μM正向内引物FIP，1.0μM反向内引物BIP，0.25μM正向外引物F3，0.25μM反向外引物B3，加入无菌超纯水制备得到。

所述的检测多菌灵抗性基因型F200Y禾谷镰孢菌的LAMP试剂盒在检测多菌灵抗性基因型F200Y禾谷镰孢菌中的应用。

一种检测多菌灵抗性基因型F200Y禾谷镰孢菌的LAMP检测方法：包括提取待检禾谷镰孢菌的DNA，以提取的DNA为模板，利用LAMP检测引物组合物或LAMP检测试剂盒进行LAMP扩增，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，在紫外光下检测结果，若存在梯状条带，则证明所检测禾谷镰孢菌为多菌灵抗性基因型F200Y；若无梯状条带，则证明所检测禾谷镰孢菌为非多菌灵抗性基因型F200Y；或观察LAMP反应溶液颜色变化，若为天蓝色，判定为多菌灵抗性基因型F200Y的禾谷镰孢菌；若为紫色，判定为非多菌灵抗性基因型F200Y的禾谷镰孢菌。

所述的检测多菌灵抗性基因型F200Y禾谷镰孢菌的LAMP检测方法：提取待检禾谷镰孢菌的DNA，取1μL DNA溶液，加入10μL试剂盒中的检测溶液进行LAMP，LAMP反应参数为57～64℃，75～120min。

本发明的检测多菌灵抗性基因型F200Y禾谷镰孢菌的LAMP检测方法，包括提取待检禾谷镰孢菌的DNA，以提取的DNA为模板，利用所述的LAMP引物组合物进行LAMP；扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，在紫外光下检测结果(羟基溴酚蓝不会影响电泳结果)，若存在梯状条带，则证明所检测禾谷镰孢菌为多菌灵抗性基因型F200Y；羟基溴酚蓝(HNB)属于金属离子指示剂的一种。HNB是Mg²⁺的滴定剂，其颜色随溶液pH变化而改变，因此可以通过监测LAMP反应体系中Mg²⁺浓度的变化及溶液pH而起到颜色指示剂的作用。反应前将HNB加入到反应液中，反应体系呈紫色，反应过程中Mg²⁺与LAMP反应的副产物P₂O₇ ^4-结合产生大量沉淀，溶液中Mg²⁺浓度降低，pH发生变化，从而使HNB的颜色由紫色变为天蓝色。因此，反应结束后通过反应体系的颜色变化，来判断是否为禾谷镰孢菌的多菌灵抗性基因型F200Y：天蓝色表示检测为阳性，是禾谷镰孢菌的多菌灵抗性基因型F200Y；紫色表示检测结果为阴性，是禾谷镰孢菌的非多菌灵抗性基因型F200Y。

本发明的关键性技术之一是根据禾谷镰孢菌β₂微管蛋白200位氨基酸密码子TTC(Phe)→TAC(Tyr)的突变来设计和优选出的高效特异扩增的引物序列及其扩增方法。为了验证能鉴定出禾谷镰孢菌的多菌灵抗性基因型F200Y的特异性引物序列，本发明分别选取禾谷镰孢菌对多菌灵的敏感菌株、抗性基因型F167Y菌株、核盘菌和灰葡萄孢菌对多菌灵的不同抗性基因型菌株为供试材料，采用CTAB法提取供试菌株的DNA。具体方法如下：取少量菌丝，加800μL 2％CTAB提取液在球磨仪中研磨2min，加入等体积的苯酚-氯仿-异戊醇(25∶24∶1)，颠倒混匀后，12000rpm离心10min；取上清于新离心管中，加入2.5倍体积的无水乙醇，-20℃沉淀30min，12000rpm离心10min；弃上清，沉淀用70％酒精洗涤两次，风干，加适量无菌蒸馏水溶解沉淀，4℃保存备用。该DNA提取方法在1h内即可提取到菌丝中的DNA。

当LAMP进行反应扩增时，产生大量的焦磷酸镁白色沉淀导致反应液的浊度上升，通过HNB的显色反应结果所示，禾谷镰孢菌的多菌灵抗性基因型F200Y反应管均为天蓝色，其为阳性结果，而禾谷镰孢菌敏感菌株及其它抗性基因型和其它病原菌的抗性基因型等阴性对照反应管均为紫色，为阴性结果，证明设计和优选的LAMP引物组合物具有特异性。同时，反应产物经3％琼脂糖凝胶电泳，紫外光下观察扩增的反应产物，禾谷镰孢菌的多菌灵抗性基因型F200Y出现了典型的梯状条带，而其它阴性对照无梯状条带。这说明该LAMP引物组合物可被用于禾谷镰孢菌对多菌灵抗性基因型F200Y快速可靠的试剂盒鉴定，为禾谷镰孢菌的抗性监测及抗性评估提供理论基础和技术支撑，对我国小麦赤霉病的发生流行和抗性治理具有重要的理论指导意义。

本发明提供的快速鉴定禾谷镰孢菌对多菌灵抗性基因型F200Y的分子生物学方法，具有灵敏度高，特异性强等特点，与现有技术相比，本发明的有益结果是：

1、简便易行：本发明提供的检测禾谷镰孢菌对多菌灵抗性基因型F200Y的LAMP方法克服了现有检测方法所需周期长、费时费力、繁琐、特异性差的问题及PCR检测技术需要热循环仪器，不能实现快速检测的问题。本发明在57～65℃的任一等温条件下，能快速、方便、高效、高特异、高灵敏地检测到禾谷镰孢菌对多菌灵的抗性基因型F200Y菌株，不需要复杂和昂贵的仪器，能较好满足对抗性菌株的现场检测。

2、实用性好：PCR检测方法需要进行凝胶电泳，很容易造成产物扩散，成为实验室气凝胶污染的一个主要来源；而且溴化乙锭(EB)有毒，可累积致癌；长期观察紫外灯也会对实验人员造成一定程度的伤害。而LAMP反应只需在恒温水浴锅中进行，可以直接通过颜色变化即可直接判断结果，省去了昂贵的仪器设备及繁琐的电泳过程，增加了在农业生产中抗性监测的应用价值。

3、恒温扩增：本发明提供的检测禾谷镰孢菌对多菌灵抗性基因型F200Y的LAMP方法，不像PCR法必须要热循环仪，这样就摆脱了对热循环仪的依赖，只要有稳定的热源LAMP反应就可以发生，极大的扩展了LAMP使用的范围，LAMP之所以能在恒定的热源下发生反应是因为在LAMP反应液中添加了甜菜碱，使双链DNA处于解链的动态平衡中，在Bst DNA聚合酶的作用下实现扩增。

4、灵敏度高：将构建的质粒载体稀释成不同的浓度，作为模板，分别用LAMP法和PCR法进行灵敏度检测，本发明提供的检测禾谷镰孢菌对多菌灵抗性基因型F200Y的LAMP方法检测下限为2×10⁴拷贝数，是PCR法检测下限的100倍；

5、特异性强：本发明在设计和优选引物时，对禾谷镰孢菌β微管蛋白的200位的突变位点上尝试了多种碱基的错配，最终优选出一套能特异性鉴定禾谷镰孢菌对多菌灵抗性基因型F200Y的LAMP引物组合物，该方法通过2对引物特异性识别靶序列上的6个独立区域，相对于PCR引物识别靶序列的2个独立区域而言，特异性大大提高，假阳性出现的概率也随之降低；

6、准确性高：该方法几乎不受反应混合液中存在的大量外源DNA和杂质的影响，不需要从样本中纯化DNA，可直接利用发病组织提取DNA进行快速检测，大大提高检测准确度；

7、本发明为禾谷镰孢菌对多菌灵抗性基因型F200Y的检测提供了新的技术平台，可用于禾谷镰孢菌对多菌灵抗性基因型F200Y的快速检测，是国内外首次利用LAMP技术检测禾谷镰孢菌对多菌灵抗性基因型F200Y菌株，这种方法简便快捷，对抗性菌株的准确诊断、及时了解抗性群体发展动态、指导科学用药、降低成本及减少环境污染具有重要的现实意义。

附图说明

图1是禾谷镰孢菌对多菌灵抗性基因型F200Y菌株的LAMP特异性检测的颜色显色图。图中显示第2-3管呈天蓝色，为阳性；第1管以及第4-9管呈紫色，为阴性。其中，1：禾谷镰孢菌对多菌灵的敏感菌株2021；2：野生抗性基因型F200Y菌株NT-7；3：人工构建抗性基因型F200Y菌株NT200；4：抗性基因型F167Y菌株R9；5：抗性基因型E198K菌株J2；6：抗性基因型E198L菌株JT04；7：抗性基因型Y50C菌株NT50；8：抗性基因型Q73R菌株NT73；9：阴性对照ddH₂O；

图2是禾谷镰孢菌对多菌灵抗性基因型F200Y菌株的LAMP特异性检测的琼脂糖凝胶电泳图。其中M为DNA Marker；1：禾谷镰孢菌对多菌灵的敏感菌株2021；2：野生抗性基因型F200Y菌株NT-7；3：人工构建抗性基因型F200Y菌株NT200；4：抗性基因型F167Y菌株R9；5：抗性基因型E198K菌株J2；6：抗性基因型E198L菌株JT04；7：抗性基因型Y50C菌株NT50；8：抗性基因型Q73R菌株NT73；9：阴性对照ddH₂O；

图3是禾谷镰孢菌对多菌灵抗性基因型F200Y菌株的LAMP灵敏度检测的颜色显色图。图中显示第1-6管呈天蓝色，为阳性；第7-10管呈紫色，为阴性。其中，1：2×10⁹拷贝数；2：2×10⁸拷贝数；3：2×10⁷拷贝数；4：2×10⁶拷贝数；5：2×10⁵拷贝数；6：2×10⁴拷贝数；7：2×10³拷贝数；8：2×10²拷贝数；9：2×10¹拷贝数；10：2×10⁰拷贝数；

图4是禾谷镰孢菌对多菌灵抗性基因型F200Y菌株的LAMP灵敏度检测的琼脂糖凝胶电泳图。其中M为DNAMarker；1：2×10⁹拷贝数；2：2×10⁸拷贝数；3：2×10⁷拷贝数；4：2×10⁶拷贝数；5：2×10⁵拷贝数；6：2×10⁴拷贝数；7：2×10³拷贝数；8：2×10²拷贝数；9：2×10¹拷贝数；10：2×10⁰拷贝数；

图5是PCR灵敏度检测的琼脂糖凝胶电泳图。其中M为DNAMarker：1：2×10⁹拷贝数；2：2×10⁸拷贝数；3：2×10⁷拷贝数；4：2×10⁶拷贝数；5：2×10⁵拷贝数；6：2×10⁴拷贝数；7：2×10³拷贝数；8：2×10²拷贝数；9：2×10¹拷贝数；10：2×10⁰拷贝数；

图6是禾谷镰孢菌对多菌灵抗性基因型F200Y菌株的LAMP重复性检测的颜色显色图。图中显示第1-11管呈天蓝色，为阳性；第12管呈紫色，为阴性。其中，1-11均为：禾谷镰孢菌对多菌灵抗性基因型F200Y菌株，12为禾谷镰孢菌对多菌灵的敏感菌株；

图7是禾谷镰孢菌对多菌灵抗性基因型F200Y菌株的LAMP重复性检测的琼脂糖凝胶电泳图。其中M为DNA Marker；1-11均为：禾谷镰孢菌对多菌灵抗性基因型F200Y菌株，12为禾谷镰孢菌对多菌灵的敏感菌株；

具体实施方式

实施例1 LAMP反应引物组合物的特异性实验

为了验证LAMP反应引物组合物的特异性，以禾谷镰孢菌β₂微管蛋白(FGSG_06611.3)第200位氨基酸密码子TTC(Phe)→TAC(Tyr)的突变为依据，设计LAMP引物，其突变位点位于正向内引物FIP的3’端，在突变位点上下游各3个碱基间进行任一或任二碱基进行错配突变，并以禾谷镰孢菌敏感菌株和禾谷镰孢菌对多菌灵抗性基因型F167Y菌株的DNA为模板进行LAMP实验，优选出能特异性鉴定禾谷镰孢菌对多菌灵抗性基因型F200Y菌株的LAMP引物组合物。

各引物序列具体如下：

FIP：5’-GGCGATCTTGAGGGTCCTCTCGAGAACTCTGACGAGACAC-3’(SEQ ID NO.2)；

BIP：5’-CAACTACCTGATTTCTACCGTCATGATCCGAGTTGAGCTGTC-3’(SEQ ID NO.3)；

F3：5’-CCACTTTGTCTCTGAACCAG-3’(SEQ ID NO.4)；

B3：5’-GGGGAACGGAATCATGTT-3’(SEQ ID NO.5)。

其中，在正向内引物FIP的3’端碱基中，加粗的“A”碱基为禾谷镰孢菌对多菌灵抗性基因型F200Y的点突变碱基，方框中“GA”碱基为人为错配碱基。

实施例2 LAMP反应体系及检测试剂盒体系优化

为了节省鉴定成本，保证该鉴定方法的稳定性和可靠性，对反应体系中BstDNA聚合酶(8U/μL)(0.8-4.0U)、Mg²⁺(25mM)浓度(0.6-2.0μL)、引物FIP/BIP(40μM)及F3/B3(10μM)浓度(0.1-0.5μL)，甜菜碱(8M)浓度(0.4-2.0μL)、HNB(2.5mM)浓度(0.4-1.2μL)进行了优化，确定了试剂盒中各成分的最佳体系(1mL检测溶液)为：320U Bst DNA聚合酶，20mM Tris-HCl，10mM KCl，10mM(NH4)₂SO₄，2mM MgSO₄，0.1％Triton X-100，2.5mM MgCl₂，0.8mM dNTPs，0.96M甜菜碱，0.2mM羟基溴酚蓝(HNB)，1.0μM正向内引物FIP，1.0μM反向内引物BIP，0.25μM正向外引物F3，0.25μM反向外引物B3，加入无菌超纯水制备，100次包装，低温运输，-20℃保存，有效期1年。

其中各引物序列具体如下：

FIP：5’-GGCGATCTTGAGGGTCCTCTCGAGAACTCTGACGAGACAC-3’(SEQ IDNO.2)；

BIP：5’-CAACTACCTGATTTCTACCGTCATGATCCGAGTTGAGCTGTC-3’(SEQ ID NO.3)；

F3：5’-CCACTTTGTCTCTGAACCAG-3’(SEQ ID NO.4)；

B3：5’-GGGGAACGGAATCATGTT-3’(SEQ ID NO.5)。

实施例3 LAMP反应参数优化

为了得到最适的反应温度和时间，保证该检测方法的高效性，对反应参数中的反应温度及时间进行了优化，得出在反应温度为57～64℃和反应时间为75～120min时均能实现LAMP扩增。

实施例4 LAMP反应特异性试验

以禾谷镰孢菌对多菌灵的敏感菌株2021、野生抗性基因型F200Y菌株NT-7、人工构建抗性基因型F200Y菌株NT200、抗性基因型F167Y菌株R9、抗性基因型E198K菌株J2、抗性基因型E198L菌株JT04、抗性基因型Y50C菌株NT50等不同抗性基因型菌株为供试材料，进行LAMP反应。取上述供试菌株的DNA溶液1μL，加入10μL实施例2制备的检测溶液进行LAMP反应，反应程序是63℃75min。结果显示基于反应体系颜色反应作为结果判定标准，当DNA模板为禾谷镰孢菌对多菌灵抗性基因型F200Y菌株时，呈现天蓝色；当模板为非禾谷镰孢菌对多菌灵抗性基因型F200Y菌株时，呈现紫色(图1)；同时用凝胶成像系统进行检测时，阳性出现梯状DNA条带，阴性无条带(图2)。

实施例5 LAMP反应灵敏度试验

为了确定LAMP反应的检测下限，将禾谷镰孢菌对多菌灵抗性基因型F200Y菌株的含有200位突变位点的DNA片段克隆至载体pEASY-T3上，转化大肠杆菌，挑取阳性转化子，提取质粒后，测定其浓度，计算拷贝数，以10倍梯度稀释作为模板。分别取10比稀释后的各浓度DNA稀释液1μL作为模板进行PCR扩增，同时以上述稀释液1μL作为模板，加入10μL实例2制备的检测溶液进行LAMP扩增，反应程序为63℃75min。HNB显色反应表明LAMP反应的最低检测下限为2×10⁴拷贝数(图3)；同时分别取PCR和LAMP扩增产物3μL上样，在3％琼脂糖凝胶上电泳，结果显示LAMP和PCR的检测下限2×10⁴拷贝数(图4)和2×10⁶拷贝数(图5)；这表明LAMP的最低检测下限为普通PCR检测下限的100倍。

实施例6 LAMP反应重复性试验

为了测定LAMP的稳定性和重复性，本发明对经过测序验证的11个禾谷镰孢菌对多菌灵抗性基因型F200Y菌株的基因组DNA为模板进行LAMP检测，以野生型作为阴性对照。取上述供试菌株的DNA溶液1μL，加入10μL实施例2制备的检测溶液进行LAMP反应，反应程序是63℃75min。结果显示基于反应体系颜色反应作为结果判定标准，当DNA模板为禾谷镰孢菌对多菌灵抗性基因型F200Y菌株时，呈现天蓝色；当模板为非禾谷镰孢菌对多菌灵抗性基因型F200Y菌株时，呈现紫色(图6)；同时用凝胶成像系统进行检测时，阳性出现梯状DNA条带，阴性无条带(图7)。上述结果表明该鉴定方法结果可靠，重复性好。

实施例7 从田间采集的禾谷镰孢菌菌株中检测对多菌灵抗性基因型F200Y

实施例2中的检测试剂盒用于检测禾谷镰孢菌对多菌灵抗性基因型F200Y的方法，包括：

1)田间禾谷镰孢菌的采集。

2)从发病的小麦粒中提取DNA：将田间采集的发病的小麦粒中用次氯酸钠表面消毒后，浸入无水乙醇中，然后用无菌水冲洗小麦粒，并将小麦粒转移至2mL的离心管中，加入800μL2％CTAB提取液，1个直径为5mm的不锈钢钢珠，少许石英砂，在球磨仪中振荡研磨4min后，加入等体积的苯酚-氯仿-异戊醇(25∶24∶1)，颠倒混匀后，12000rpm离心5min；取上清于新离心管中，加入2.5倍体积的无水乙醇，-20℃沉淀，12000rpm离心5min；弃上清，沉淀用70％酒精洗涤，风干，加适量无菌蒸馏水溶解沉淀，4℃保存备用，用于LAMP扩增的模板。

3)LAMP检测：包括：禾谷镰孢菌对多菌灵抗性基因型F200Y的检测：取1μL DNA溶液，加入10μL的检测溶液进行LAMP反应，反应程序是63℃75min。以HNB作为反应指示剂，扩增结束后LAMP反应体系的颜色呈现天蓝色，以此判断田间采集的菌株为多菌灵抗性基因型F200Y的禾谷镰孢菌。

Claims (9)

1.SEQ ID NO.1所示的禾谷镰孢菌含有200位点突变的β₂-微管蛋白基因序列作为靶标在LAMP检测多菌灵抗性基因型F200Y禾谷镰孢菌中的应用。

2.用于检测多菌灵抗性基因型F200Y禾谷镰孢菌的LAMP引物组合物：由SEQ ID NO.2所示的正向内引物FIP、SEQ ID NO.3所示的反向内引物BIP、SEQ ID NO.4所示的正向外引物F3、SEQ ID NO.5所示的反向外引物B3组成。

3.权利要求2所述的LAMP引物组合物在检测多菌灵抗性基因型F200Y禾谷镰孢菌中的应用。

4.权利要求2所述的LAMP引物组合物在制备多菌灵抗性基因型F200Y禾谷镰孢菌的LAMP检测试剂盒中的应用。

5.一种检测多菌灵抗性基因型F200Y禾谷镰孢菌的LAMP检测试剂盒，其特征在于含有权利要求2所述的引物组合物。

6.根据权利要求5所述的检测多菌灵抗性基因型F200Y禾谷镰孢菌的LAMP检测试剂盒，其特征在于所述的试剂盒包含的检测溶液为：320U Bst DNA聚合酶，20mM Tris-HCl，10mM KCl，10mM(NH4)₂SO₄，2mM MgSO₄，0.1％Triton X-100，2.5mM MgCl₂，0.8mMdNTPs，0.96M甜菜碱，0.2mM羟基溴酚蓝(HNB)，1.0μM正向内引物FIP，1.0μM反向内引物BIP，0.25μM正向外引物F3，0.25μM反向外引物B3，加入无菌超纯水制备得到。

7.权利要求5所述的检测多菌灵抗性基因型F200Y禾谷镰孢菌的LAMP试剂盒在检测多菌灵抗性基因型F200Y禾谷镰孢菌中的应用。

8.一种检测多菌灵抗性基因型F200Y禾谷镰孢菌的LAMP检测方法，其特征在于取待检禾谷镰孢菌的DNA为模板，利用权利要求2所述的引物组合物或权利要求5所述的LAMP检测试剂盒进行LAMP扩增，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，在紫外光下检测结果，若存在梯状条带，则证明所检测禾谷镰孢菌为多菌灵抗性基因型F200Y；若无梯状条带，则证明所检测禾谷镰孢菌为非多菌灵抗性基因型F200Y；或观察LAMP反应溶液颜色变化，若为天蓝色，判定为多菌灵抗性基因型F200Y的禾谷镰孢菌；若为紫色，判定为非多菌灵抗性基因型F200Y的禾谷镰孢菌。

9.根据权利要求8所述的检测多菌灵抗性基因型F200Y禾谷镰孢菌的LAMP检测方法，其特征在于LAMP反应参数为57～64℃，75～120min。