CN103409415A - 检测高抗多菌灵的禾谷镰孢菌株的引物及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测高抗多菌灵的禾谷镰孢菌株的引物及方法，所述引物的碱基序列为：正向引物：5’-TTG CAA TTG CAA ATT TCA ACG TG-3’；反向引物：5’-CGT TAT CGA TAC AGA AGG TAA-3’；或5’-CGT TAT CGA TAC AGA AGG TTA-3’。本发明提供了两组引物，通过任意一组引物进行PCR扩增，即可对表现为多菌灵高抗性的禾谷镰孢菌株进行检测，引物的特异性高，另外，本发明的方法可以快速准确的检测多菌灵高抗的禾谷镰孢菌株，整个流程仅需要该两个小时左右，快速准确。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，尤其涉及一种检测高抗多菌灵的禾谷镰孢菌株的引物及方法。
背景技术
由禾谷镰孢菌群（Fusarium graminearum species complex）引起的小麦赤霉病严重威胁小麦生产安全。此外，赤霉病菌还产生单端孢霉烯类毒素（Trichothecenes），严重影响食品安全。
在我国，近年来由于秸秆还田和气候因素的变化，赤霉病发生呈加重趋势。因为缺乏高水平抗性的种质材料，目前生产上用于防治小麦赤霉病的主要方法是化学防治。多菌灵杀菌剂是防治小麦赤霉病的主要药剂，但由于该类药剂长期大量使用，导致浙江、江苏和安徽等地区的禾谷镰孢已出现多菌灵抗性问题。
已有研究发现，β-微管蛋白基因编码167、198或200位氨基酸的密码子发生点突变是导致大多数病原菌产生田间抗药性的主要原因。根据抗性指数（Resistant factor，RF），禾谷镰孢对多菌灵表现出低、中和高水平三类抗性，其中1≤RF<10为低抗，10≤RF<50为中抗，50≤RF<100为高抗。已有研究表明，β-微管蛋白上不同的点突变分别对应不同的抗性水平：E（GAG）198L（CTG）导致高水平抗性、F（TTT）167Y（TAT）、F（TTC）200Y（TAC）和E（GAG）198K（AAG）导致中水平抗性、E（GAG）198Q（CAG）导致低水平抗性。
传统的抗药性生物测定方法费时、费力且无法区分抗性菌株的突变类型。目前针对点突变F167Y、F200Y、E198Q和E198K已报道了ASO-PCR、PIRA-PCR和Tetra-primer ARMS-PCR等检测技术（如公开号为CN01475983的中国专利文献“禾谷镰孢菌鉴定及其对多菌灵产生中等抗药性水平确认的一管检测法”；公开号为CN101985653A的中国专利文献“禾谷镰孢菌对多菌灵的中等抗药性水平菌株的分子检测方法”），但是对于引起多菌灵高抗水平的点突变E198L尚缺乏快速、有效的分子检测方法。
因此，需要建立一种新的快速检测技术，准确、全面检测多菌灵高抗的禾谷镰孢。
发明内容
本发明提供了一种检测高抗多菌灵的禾谷镰孢菌株的引物，特异性强。
一种引物，碱基序列为：
正向引物：5’-TTG CAA TTG CAA ATT TCA ACG TG-3’；
反向引物：5’-CGT TAT CGA TAC AGA AGG TAA-3’；或
5’-CGT TAT CGA TAC AGA AGG TTA-3’。
一种检测高抗多菌灵的禾谷镰孢菌株的方法，包括：
（1）提取待检测菌株的DNA；
（2）以所述的DNA为模板，利用任一所述的引物进行PCR扩增；
（3）对PCR扩增产物进行凝胶分离，染色后成像；
（4）根据凝胶成像结果，判断待检测菌株是否为高抗多菌灵的禾谷镰孢菌株。
所述DNA的提取方法包括：
（1）取待检测菌株的菌丝或子囊壳，加入提取液研磨；
（2）将研磨后的混合液静置一段时间，离心取上清液；
（3）上清液用醇进行沉淀，沉淀物经洗涤后获得所述的DNA；
从菌丝中提取DNA时，所述的提取液包括：200mM Tris-HCl，50mMEDTA，20mM NaCl和1%SDS；
从子囊壳中提取DNA时，所述的提取液包括：1-2%聚乙烯吡咯烷酮，200mM Tris-HCl，50mM EDTA，200mM NaCl和1%SDS。
所述PCR扩增的体系为：DNA模板1μL，正、反向引物各0.2μmol/L，dNTP0.2μmol/L，MgCl22mmol/L，1×PCR Buffer，聚合酶1.5U，补充水至25μL。
上述DNA提取方法简单快速，不需要传统的DNA的抽提纯化步骤，且不影响后续检测的准确性。
步骤（3）中，可采用乙醇或者异丙醇对DNA进行沉淀。
所述PCR扩增的条件为：95℃预变性3min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，进行35个循环；72℃延伸5min。
PCR产物可用1.5%琼脂糖凝胶电泳进行分离，对凝胶染色后，若在494位置出现条带，则表明该菌株为高抗多菌灵的禾谷镰孢菌。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
（1）本申请提供了两组引物，均是针对高抗多菌灵的禾谷镰孢菌的β-微管蛋白基因（Genebank登录号为KC765118）突变位点（GAG）198L（CTG）进行设计，其中，设计的反向引物位于突变位点处，且对3’端碱基进行特殊设计，加大对多菌灵低抗、敏感菌株的错配几率，提高对高抗多菌灵的禾谷镰孢的特异性；设计的正向引物位于β-微管蛋白基因的第5个内含子，对禾谷镰孢特异；且扩增得到的片段大小为494bp，易于扩增。因此，通过选择适宜的靶标序列以及合理的对引物的碱基序列进行设计后，采用本申请的任意一组引物进行PCR扩增，即可对表现为多菌灵高抗的禾谷镰孢菌株进行准确的检测，引物的特异性高。
另外，本发明的引物不仅可以检测菌丝，还能够检测稻桩子囊壳（主要田间侵染源）中多菌灵高抗的禾谷镰孢。
（2）本发明的方法可以快速准确的检测多菌灵高抗的禾谷镰孢菌株，整个流程仅需要两个小时左右，快速准确，能在植物花期用药前快速且有效地检测田间高水平抗药性病菌，对农药的合理使用，病害的有效防治都具有指导意义，同时也为研究药剂筛选压力下，高抗群体的动态变化提供了基础。
附图说明
图1为本发明引物序列在β-微管蛋白基因的位置序列。
图2为本发明引物序列在β-微管蛋白基因序列上的位置图谱。
图3为引物Fgtub2-F/Fg198L-RB（a）和引物Fgtub2-F/Fg198L-RC（b）特异性检测各菌株DNA扩增后的电泳图。
图4为本发明引物Fgtub2-F/Fg198L-RB（A）和Fgtub2-F/Fg198L-RC（B）对不同地区稻桩子囊壳中多菌灵高抗的禾谷镰孢进行检测的电泳图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式进一步阐释本发明。
实施例1
1、菌株类型
燕麦镰孢菌（F.avenaceum）、锐顶镰孢菌（F.acuminatum）、半裸镰孢菌（F.semitectum）、串珠镰孢菌（F.subglutinans）、黄色镰孢菌（F.culmorum）各1株，以及11个禾谷镰孢（F.graminearum）菌株。11个禾谷镰孢中包括2个多菌灵敏感菌株（PH-1，HN9）、2个含E198Q点突变的低抗菌株（JM51，YL10）、2个含F167Y点突变的中抗菌株（YU59，BM10）、2个含F200Y点突变的中抗菌株（BY74，QJ42）、1个含E198K点突变的中抗菌株JL45，2个含E198L点突变的高抗菌株（JM2，JM5）。
上述菌株均为常见的植物病原真菌，保藏于浙江大学生物技术研究所，也可以通过常规的真菌分离纯化方法得到。
2、引物合成
研究发现，禾谷镰孢对多菌灵的高水平抗性是由于β-微管蛋白基因（Genebank登录号为KC765118）的第198位密码子G198AG突变成C198TG所致，根据该点突变设计了反向PCR引物GZ198L-RB，该引物3’端碱基A和高抗菌株中的突变碱基T配对，不能和敏感菌株中碱基A配对；为了进一步提高PCR引物的特异性，在引物3’端倒数的第二个碱基由G变成A（Fg198L-RB）或T（Fg198L-RC），这样对敏感菌株来说就有两个碱基错配，在相同的PCR反应条件下比只有一个碱基错配的引物特异性更高。正向引物Fgtub2-F序列位于β-微管蛋白基因的第5个内含子内，是对禾谷镰孢特异的序列，因此，利用Fgtub2-F/Fg198L-RB和Fgtub2-F/Fg198L-RC两组等位专化PCR引物，能从高抗多菌灵的禾谷镰孢菌株中扩增出条带，不能从低、中抗多菌灵和敏感的菌株或其它真菌中扩增出任何条带（引物所在的序列如图1所示）。
上述引物的具体碱基序列与序列表中序列对应关系表1所示。
表1
上述引物在β-微管蛋白基因序列上物理位置如图2所示。上述序列的引物由上海博彩合成。
3、提取DNA
本发明采用的是一种简便快速的DNA提取方法，具体操作如下：
（1）用接种针从PDA平板上刮取菌丝（100mg），置于1.5mLEppendorf管中；
（2）向EP管中加500μL DNA提取裂解液（200mM Tris-HCl，50mMEDTA，20mM NaCl，1%SDS，pH8.0），用电钻充分研磨，振荡混匀，室温静止10min；4℃，13200r/min，离心5min；
（3）取上清液约400μL于新的1.5mL Eppendorf管中，加750μL无水乙醇，混和混匀，4℃，13200r/min离心5min；
（4）弃上清，沉淀用70%乙醇洗涤，室温放置干燥5-10min，溶于30μL TE（pH8.0），-20℃保存备用。
本实施例的16种真菌菌株以及被检测菌的DNA均可采用上述方法提取。
4、引物特异性验证
以上述提取的16个真菌菌株的DNA为模板，用Fgtub2-F/Fg198L-RB和Fgtub2-F/Fg198L-RC两组引物分别进行PCR反应，每次反应均包含一个阴性对照（用无菌水代替DNA模板）。
PCR扩增体系为：1μL DNA模板（约0.4ng），正、反向引物各0.2μmol/L，dNTP0.2μmol/L，MgCl22mmol/L，1×缓冲液（北京东胜公司生产）2.5μL，聚合酶1.5U个单位，双蒸水补足至25μL。
PCR反应条件为：95℃预变性3min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，进行35个循环；72℃延伸5min。
PCR产物用1.5%的琼脂糖在1×TAE缓冲液中电泳后，用EB显色拍照。
如图3所示，分别采用本发明的两组引物，2个多菌灵高抗菌株（JM2，JM5）均能扩增到494bp的条带，而2个多菌灵低抗菌株（JM51，YL10）、5个多菌灵中抗菌株（YU59，BM10，BY74，QJ42，JL45）、2个多菌灵敏感菌株（PH-1，HN9）和其它病原真菌都没有扩增到任何条带。因此，验证这两组等位专化PCR引物都能特异性检测出高抗多菌灵的禾谷镰孢。
由此可见，上述两组引物的特异性很高，适合检测高抗多菌灵的禾谷镰孢。
实施例2检测不同地区稻桩上子囊壳中高抗多菌灵的禾谷镰孢
2012年4月，从江苏海安和靖江、安徽繁昌和池州的小麦田中收集带有子囊壳的稻桩（每块地约80个子囊壳）。
将稻桩上收集的子囊壳置于1.5mL Eppendorf管中，加入100μl DNA提取缓冲液（1-2%聚乙烯吡咯烷酮（PVP），200mM Tris-HCl，50mMEDTA，200mM NaCl，1%SDS，以ddH2O为溶剂，pH8.0），用尖头玻棒安装在常用的电工手电转上研磨1min，再向离心管中加入400μl的DNA提取缓冲液（DEB，DNA extraction buffer），涡旋混匀后，室温静置10min；将上述混合液4℃，15000rpm条件下离心5min，再将上清液转移到另一离心管中，然后加入750μl无水乙醇，混匀后4℃，15000r/min条件下离心2min，弃上清；将沉淀的DNA用70%乙醇洗涤，室温干燥后溶于50μl无菌水，即为提取的DNA；将上述的DNA溶液用UNIQ-10柱式PCR产物回收试剂盒（上海生工生产）过柱纯化。
用Fgtub2-F/Fg198L-RB和Fgtub2-F/Fg198L-RC两组引物分别进行PCR反应，反应设阴性对照，PCR反应体系及条件同实施例1。
如图4所示，四个地区中，仅在江苏靖江收集的田间样品中检测到多菌灵高抗的禾谷镰孢，整个PCR过程和电泳检测仅需2h。
Claims (5)
1.一种引物，其特征在于，碱基序列为：
正向引物：5’-TTG CAA TTG CAA ATT TCA ACG TG-3’；
反向引物：5’-CGT TAT CGA TAC AGA AGG TAA-3’；或
5’-CGT TAT CGA TAC AGA AGG TTA-3’。
2.一种检测高抗多菌灵的禾谷镰孢菌株的方法，其特征在于，包括：
（1）提取待检测菌株的DNA；
（2）以所述的DNA为模板，利用如权利要求1所述的引物进行PCR扩增；
（3）对PCR扩增产物进行凝胶分离，染色后成像；
（4）根据凝胶成像结果，判断待检测菌株是否为高抗多菌灵的禾谷镰孢菌株。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述DNA的提取方法包括：
（1）取待检测菌株的菌丝或子囊壳，加入提取液研磨；
（2）将研磨后的混合液静置一段时间，离心取上清液；
（3）上清液用醇进行沉淀，沉淀物经洗涤后获得所述的DNA；
从菌丝中提取DNA时，所述的提取液包括：200mM Tris-HCl，50mMEDTA，20mM NaCl和1%SDS；
从子囊壳中提取DNA时，所述的提取液包括：1-2%聚乙烯吡咯烷酮，200mM Tris-HCl，50mM EDTA，200mM NaCl和1%SDS。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的体系为：DNA模板1μL，正、反向引物各0.2μmol/L，dNTP0.2μmol/L，MgCl22mmol/L，1×PCR Buffer2.5μL，聚合酶1.5U，补充水至25μL。
5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的条件为：95℃预变性3min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，进行35个循环；72℃延伸5min。
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| CN101440402A (zh) * | 2008-12-11 | 2009-05-27 | 浙江大学 | 鉴定亚洲镰孢菌和禾谷镰孢菌的引物序列及其方法 |
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