CN104313173A - 单核细胞增生李斯特氏菌实时浊度lamp检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明的目的是提供一种单核细胞增生李斯特氏菌的实时浊度LAMP快速检测方法，从而弥补现有技术的不足。本发明首先提供一种用于检测单核细胞增生李斯特氏菌的LAMP引物组，其核苷酸序列为SEQ ID NO:1-4。本发明针对单核细胞增生李斯特氏菌的溶血素基因设计一套LAMP引物，利用实时浊度仪对单核细胞增生李斯特氏菌进行检测，并验证检测方法的特异性和灵敏度，从而建立快速、特异、灵敏的单核细胞增生李斯特氏菌LAMP检测方法。

Description

单核细胞增生李斯特氏菌实时浊度LAMP检测方法
技术领域
本发明属于微生物检测技术领域，具体涉及一种单核细胞增生李斯特氏菌的实时浊度LAMP快速检测方法。
背景技术
单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)是一类兼性细胞内生长的革兰阳性细菌，致病力较强，能引起人和动物的李斯特菌病，是重要的食源性人畜共患病原菌。单增李斯特氏菌营养要求不高，环境适应性强，既可在2～4℃下生长，也可在-18℃下存活，甚至在反复冻融的条件下仍可存活。近年来，欧美国家因食用李斯特菌污染的食品的病患呈上升趋势，世界卫生组织(WHO)已将其列为20世纪90年代以来食品中四大致病菌之一，成为许多国家食品卫生安全的必检项目。
目前，对单核细胞增生李斯特氏菌的检测仍以传统方法为主，不但检验周期长(4～7d)、操作繁琐，且准确性和灵敏性低，不利于食源性疾病的快速检测。因此，有必要提供一种更有效的检测单核细胞增生李斯特氏菌的方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种单核细胞增生李斯特氏菌的实时浊度LAMP快速检测方法，从而弥补现有技术的不足。
本发明首先提供一种用于检测单核细胞增生李斯特氏菌的LAMP引物组，引物信息如下：
LMO-F3：ATCGATCACTCTGGAGGA(SEQ ID NO:1)
LMO-B3：AAGCTAAACCAGTGCATTC(SEQ ID NO:2)
LMO-FIP(SEQ ID NO:3)：
TGAACAATTTCGTTACCTTCAGGATTACGTTGCTCAATTCAACATCT
LMO-BIP(SEQ ID NO:4)：
GGAGCGAAAACAATAAAAGTAAGCTGCGTAAACATTAATATTTCTTGCG。
本发明还提供一种利用上述的LAMP引物组检测单核细胞增生李斯特氏菌的方法，包括有如下的步骤：
1)待检测基因组DNA的提取：用细菌基因组DNA提取试剂盒(上海生工)提取细菌DNA；
2)环介导等温扩增步骤：根据本发明设计的单核细胞增生李斯特氏菌的LAMP引物，加入反应体系中各组分，扩增温度为62.5℃，实时浊度仪中反应60min，80℃，5min，终止反应；
3)结果检测：直接通过实时浊度仪观察或扩增产物经2％琼脂糖凝胶电泳鉴定。
本发明针对单核细胞增生李斯特氏菌的溶血素基因设计一套LAMP引物，利用实时浊度仪对单核细胞增生李斯特氏菌进行检测，并验证检测方法的特异性和灵敏度，从而建立快速、特异、灵敏的单核细胞增生李斯特氏菌LAMP检测方法。
附图说明
图1：LAMP特异性试验结果图，其中曲线为单核细胞增生李斯特氏菌扩增曲线，其余11株其他菌株均未出现扩增曲线。
图2：LAMP灵敏度试验结果图，其中1～6为10-1～10-6浓度级稀释菌液，7为空白对照。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的方法进行详细的描述。
一、用于检测单核细胞增生李斯特氏菌的LAMP引物组的设计
本发明根据GeneBank中公布的单核细胞增生李斯特氏菌hlyA基因，进行序列的保守性分析，从中筛选出溶藻胶弧菌的高度保守序列，用PrimerExplorer V4.0软件(http://primer-explorer.jp/e/v4-manual/index.heml)进行引物设计。设计合适的引物是进行LAMP反应的关键，通过考虑碱基组成，GC含量，二级结构的形成，Tm值等因素来设计溶藻胶弧菌LAMP反应的引物。引物由宝生物工程(大连)有限公司合成。引物如表1所示：
表1 用于扩增单核细胞增生李斯特氏菌hlyA基因的LAMP引物序列
二、溶藻胶弧菌的LAMP引物的效果检测
1.1试验材料
菌株：单核细胞增生李斯特氏菌、拟态弧菌、溶藻弧菌、哈氏弧菌、河流弧菌、霍乱弧菌、拟态弧菌、志贺氏菌、沙门氏菌、大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、创伤弧菌。
1.2细菌DNA提取
将供实验的菌株分别接种于5mL增菌培养基(单核细胞增生李斯特氏菌用TSB-YE培养液培养，弧菌用碱性蛋白胨水培养，其他菌株用BPW培养)中，按每种细菌的最适温度培养过夜，取1mL菌液，按照试剂盒说明书提取细菌基因组DNA。提取的基因组DNA于-20℃保存备用。
1.3LAMP扩增体系
反应体系为25μL，包括Bst DNA聚合酶0.32U/μL，Tris-HCl 20mM，KCl 10mM，(NH4)2SO4 10mM，MgSO4 8mM，4dNTPs 1.4mM，引物(F3和B30.2μM、FIP和BIP 1.6μM)，Betaine 0.8M，Tween200.1％，模板DNA。反应条件为：62.5℃60min，80℃5min。
1.4LAMP方法的特异性评价
采用建立的LAMP检测方法并利用实时浊度仪分别对12株实验菌株进行扩增，根据浊度变化和琼脂糖凝胶电泳观察结果，检验方法的特异性。
1.5LAMP方法的灵敏度评价
取培养过夜的单核细胞增生李斯特氏菌增菌液，用无菌磷酸盐缓冲液进行10倍稀释，从10-1～10-6稀释液中吸取100μL到营养琼脂平板上，用涂布棒及时涂布均匀，每个稀释度做2个平行，于37℃培养箱中培养24h后进行计数。同时，各浓度吸取1mL，提取DNA，作LAMP检测。
2结果与分析
2.1特异性检测结果
特异性检测结果如图1所示，在40-60min内单核细胞增生李斯特氏菌CMCC54002出现扩增，浊度明显上升，LAMP检测结果呈阳性；其余11株其他菌株均未出现扩增，浊度无明显变化，LAMP检测结果呈阴性。
2.2灵敏性检测结果
经平板计数，原始菌液浓度为3.0×106CFU/mL，10倍系列稀释菌液进行检测，如图2所示，1～6号通道为10-1～10-6浓度级稀释菌液提取DNA后LAMP反应的结果，7号通道为空白对照。电泳和实时浊度仪检测结果表明(见图2)，1～5号通道浊度明显上升，说明10-1～10-5浓度级稀释菌液出现扩增，呈LAMP阳性；6号和7号通道浊度无变化，说明10-6浓度级稀释菌液和空白对照未出现扩增，呈LAMP阴性。上述结果说明，该方法的最低检测限为30CFU/mL。
上述结果表明，本发明提供LAMP引物及检测方法特异性好，灵敏度高，且在恒温条件下反应，实验条件不够的机构用水浴锅代替实时浊度仪即可完成，不需要使用昂贵、精密的仪器与设备，具有操作简便的特点，尤其适合用于现场或野外等简陋场所的检测。

Claims (5)

1.一种LAMP引物组，其特征在于，所述的引物组的序列信息如下：
LMO-F3：ATCGATCACTCTGGAGGA、
LMO-B3：AAGCTAAACCAGTGCATTC、
LMO-FIP：
TGAACAATTTCGTTACCTTCAGGATTACGTTGCTCAATTCAACATCT
LMO-BIP：
GGAGCGAAAACAATAAAAGTAAGCTGCGTAAACATTAATATTTCTTGCG。
2.权利要求1所述的引物组在检测单核细胞增生李斯特氏菌中的应用。
3.一种用于检测单核细胞增生李斯特氏菌的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包含有权利要求1所述的LAMP引物组。
4.权利要求3所述的试剂盒在检测单核细胞增生李斯特氏菌中的应用。
5.一种检测单核细胞增生李斯特氏菌的方法，其特征在于，所述的方法包括有如下的步骤：
1)待检测基因组DNA的提取：用细菌基因组DNA提取试剂盒提取细菌DNA；
2)环介导等温扩增步骤：将权利要求1所述的LAMP引物组加入反应体系，扩增温度为62.5℃，实时浊度仪中反应60min，80℃，5min，终止反应；
3)结果检测：直接通过实时浊度仪观察或扩增产物经2％琼脂糖凝胶电泳鉴定。
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