CN103898138A - 用于检测单核细胞增生李斯特菌的质粒及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及的是一种用于检测单核细胞增生李斯特菌的质粒及其制备方法。该质粒为SEQIDNO.1所示的碱基序列。本发明有助于PCR检测体系能够显示假阴性的发生，避免了因样品中存在抑制剂或操作失误所导致检测结果呈现假阴性的结果，从而提高了PCR检测的准确性。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于检测单核细胞增生李斯特菌的质粒及其制备方法。
背景技术
PCR，英文polymerase chain reaction的缩写。单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)简称单增李斯特菌是一种重要的食源性人畜共患病院菌，它能引起人、畜的李斯特菌病，感染后主要表现为败血症、脑膜炎和单核细胞增多，特别对孕妇、新生儿、老年人和免疫缺陷病人危害还严重。被感染者也会出现和流感类似的症状，但并不常见。孕妇感染后，如果治疗不当，会引发菌血症导致早产、死婴等严重后果。虽然丹增李斯特菌在食物中毒和感染的事件发生的较少，但其致死率较高，平均达33.3%，是细菌中致死率较高的一种，如2006年法国因食物感染引起67人死亡。国内外对单增李斯特菌的危害均给以高度重视，WHO将其列为20世纪90年代食品中四大致病菌之一。食品是导致人类受单核细胞增生李斯特氏菌感染的主要传播途径,该菌在4 ℃冰箱保存的食物中仍可生长繁殖,是冷藏食品威胁人类健康的主要病原菌。在绝大多数食品中都能找到李斯特氏菌,肉类、蛋类、禽类、海产品、乳制品、蔬菜等都已被证实是李斯特氏菌的感染源随着我国冷藏、速冻食品消费量的迅速增多,食品中单增李斯特氏菌的潜在危险性也越来越突出,因此在食品卫生微生物检验中,必须加以重视。因此，如何通过快速的检测单增李斯特菌来解决食品安全问题成为了国家迫切的需求。我国目前对食品中单增李斯特菌的检测仍使用传统的平板培养法，但是检测过程中，制备培养基、计算菌落数量和鉴定菌落的生化特征都耗时耗力，并且培养方法的成功依赖于样本中细菌的数量和状况、培养基的灵敏度、孵化条件和分离培养基的选择性，不适合当前食品快速检测的需求。
聚合酶链式反应(Polymerase chain Reaction,PCR)最早由Mulhs和Cetus公司的同事于1985年发明的,是一种通过在体外模拟自然DNA复制过程快速扩增特定DNA序列的方。Bessesen MT等于1990年建立了PCR检测单核细胞增生李斯特氏菌的方法,通过扩增李斯特氏菌溶血素基因hlyA中386 bp的PCR方法检测单核细胞增多性李斯特氏菌,DNA检测量为25 ng，详见：BESSESEN MT,LUO QA,ROTBART HA,et al.“Deteetion of Listeria monoeytogenes by using the Polylnerase chain reaction”[J].Appl Environ Mierobiol,1990,56(9): 2930-2932.（BESSESEN MT,LUO QA,ROTBART HA,et al等.“运用PCR检测单核细胞增生李斯特菌”，应用环境微生物学，1990,56（9）：2930-2932页。
虽然， PCR已经广泛被使用了，但在使用中仍存在以下限制。一个关键的方面是目标基因的模版浓度，这直接决定了试验的可靠性。从临床样品中残留的微生物混合物，选择性富集培养基和核酸抽提试剂都会抑制PCR反映和可能导致降低扩增效率和结果不准确。PCR检测技术虽然不断改进，但是还没有有效的方法消除抑制剂对PCR检测的影响。因而一些学者开始认识到在PCR反应体系放置指示假阴性的扩增内标( internal amp lification control, IAC) 是必要的。
在2002年，A.Abdulmawjoodf等用两种方法构建了一条200bp的扩增内标片段，并在实验结果中能够指示假阳性的发生。详见：A. Abdulmawjoodf,S.Roth,M.Bülte. “Two methods for construction of internal amplification controls for the detection of Escherichia coli O157 by polymerase chain reaction”[J] Molecular and Cellular Probes,2002,16(5):335-339.( A. Abdulmawjoodf,S.Roth,M.Bülte.“构建两种用于PCR检测大肠杆菌O157的扩增内标”，细胞与分子探针，2002,16（5）：335-339页。
由于在PCR检测中，培养基残留物以及试剂抽提剂都会一定程度上抑制PCR的扩增，导致假阴性的出现，在本发明中，加入了扩增内标，用以指示假阴性，有效地避免了假阴性的出现，提高了PCR检测的准确率。
发明内容
本发明的目的之一在于克服现有技术中存在的问题，提供一种用于检测单核细胞增生李斯特菌的质粒。
本发明目的之二在于提供该质粒的制备方法。
为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种用于检测单核细胞增生李斯特菌的质粒，其特征在于该质粒为SEQ ID NO.1所示的碱基序列。
一种制备上述的用于检测单核细胞增生李斯特菌的质粒的方法，其特征在于该方法的具体步骤为：
a. 从单核细胞增生李斯特菌中选取lmo1035-lom1037的DNA序列作为目的基因，然后根据该序列设计一对引物进行PCR扩增，所述的引物如下：
lmoF:5’- TTAGAGCCAATCAAGCCAGTT-3’
lmoR:5’- ATCGCATAGTCATCCAAAGA-3’；
b. 拟南芥hlp50基因的DNA序列为模板，设计一对内标引物：PRIMER1和PRIMER2，进行梯度PCR扩增，得到扩增内标产物；然后，在内标引物PRIMER1末端连接步骤a所得的目标引物lmoF，在内标引物PRIMER2末端连接lmoR，形成一对长引物；利用该对长引物进行扩增，得到了IAC片段；再将该IAC片段克隆到T载体中，得到用于检测在于克服PCR检测单核细胞增生李斯特菌的质粒；所述的内标引物PRIMER1和PRIMER2为：
PRIMER1:5’-ACAAAGTTTTGAGTCAAA-3’
PRIMER2:5’-GGAAGAGAAGGCAGAGAGGT-3’。
上述的梯度PCR扩增的具体方法为：分别取2μl梯度稀释的李斯特菌溶液作为模板，10×buffer为3.5μl，25mM MgCl2溶液为1.5μl，2.5mM dNTP为3.0μl，上下游引物分别为1μl，TAQ DNA聚合酶为1μl，再补无菌水至50μl；PCR循环参数为，在95°C预变性2min，接着95°变性45s，退火温度52°C，退火时间45s，72°C下延伸55s，经历35次循环，最后在72°C下延伸10min。
上述的对长引物进行扩增的具体方法为： 分别取1μl的拟南芥基因组作为模板10×buffer为3.5μl，25mM MgCl2溶液为2μl，2.5mM dNTP为3.0μl，上下游引物分别为1μl，TAQ DNA聚合酶为1μl，再补无菌水至50μl；PCR循环参数为，在95°C预变性2min，接着95°变性45s，退火温度53°C，退火时间45s，72°C下延伸55s，经历35次循环，最后在72°C下延伸10min。
通过对MgCl2浓度和退火温度Tm选择最佳的PCR反应体系，具体为：首先，根据Primer5推荐的引物退火温度Tm，在Tm±5°C范围内以1°C设计温度梯度，根据扩增产物在电泳中亮度选择最佳Tm。退火温度确定后，在反应体系设置Mg2+的浓度梯度，从1.0mmol/L到3.0mmol/L（间隔0.5mmol/L），同理根据产物亮度选择最佳Mg2+浓度。
将经过测定的单核细胞增生李斯特菌总DNA溶液用无菌水作10倍剃度稀释至10-10，分别取3μl加入到PCR反应体系，进行PCR，通过产物的电泳图亮度，选择PCR的检测灵敏度。然后加入不同稀释浓度的扩增内标，检测DNA的灵敏度，选择对检测灵敏度影响最小的并且能够指示假阴性的扩增内标的浓度作为添加浓度。
提取不同血清型的单核细胞增生李斯特菌和不同种属的非单核细胞增生李斯特菌菌株的DNA（猪霍乱沙门氏菌Salmonella choleraesuis、金色葡萄球菌S.aureus、鼠伤寒沙门氏菌株Salmonella typhimurium、大肠杆菌E.coli），进行PCR检测，确定引物的特异性，以及扩增内标能否在非单核细胞增生李斯特菌中正常扩增。结果，单核细胞增生李斯特菌呈阳性，而非单核细胞增生李斯特菌呈阴性。
对人工污染样品进行PCR检测以及抗干扰实验。通过检测人工污染样品判断扩增内标能否指示假阳性，抗干扰实验判断PCR检测体系的稳定性，以此来判断PCR体系的检测结果准确性。
所述的抗干扰实验，检测方法：
将猪霍乱沙门氏菌Salmonella choleraesuis、金色葡萄球菌S.aureus、大肠杆菌E.coli作为干扰菌株，提取其DNA加入到单细胞增生李斯特菌PCR反应体系中去，检测是否会干扰到李斯特菌灵敏度。
所述的人工污染样品，其检测方法是：
（1） 从LB平板上挑取单核细胞增生李斯特菌的单菌落，接入到50mL LB 液体培养基中去，在37°C培养12h。
（2） 用生理盐水作10倍的梯度稀释，并取1mL稀释度为10-8的菌液作平板计数，计算单核细胞增生李斯特菌纯培养的起始浓度。
（3） 40份猪肉样品，无菌取样25mL，接入1mL 10-2梯度稀释的单核细胞增生李斯特菌菌悬液。将40份人工污染样品添加到225mL LB液体培养基中。在37°C的摇床（120r/min）中增菌。
（4） 12h后进行取样1次。每份样品取样1mL，放入1.5mL离心管中，30000r/min离心10min，沉淀培养物中的食品残渣。取上清液，在12000g/min离心5min，收集单核细胞增生李斯特菌菌体。
（5） 倒去上清液后，用无菌双蒸水重新悬浮菌体，离心洗涤3次。然后加入100μL无菌超纯水，在沸水浴中煮10min然后取出，在-20°C放置30min。
（6） 37°C解冻后，12000g/min离心5min。上清液为PCR模板DNA溶液，获得人工污染样品中PCR模板DNA溶液。
所述的扩增内标DNA序列是人工合成的。在确保它能正常扩增的同时，也保证了它与单核细胞增生李斯特菌的基因非同源。在此DNA序列的两端含有检测引物的特异性序列。它可以检测假阴性，提高PCR检测的准确性
所述的扩增内标，是指：根据拟南芥基因hlp50基因其中的500bpDNA片段设计的一段人工合成的扩增内标，它即可以减少非单核细胞增生李斯特菌（猪霍乱沙门氏菌Salmonella choleraesuis、金色葡萄球菌S.aureus、鼠伤寒沙门氏菌株Salmonella typhimurium、大肠杆菌E.coli）的DNA对PCR干扰，又能防止与目的基因的同源交联干扰。提高检测效率。
所述的特异性引物，是指：一对用于单核细胞增生李斯特菌PCR检测的检测引物（lmoF/R）,进行PCR检测时，能同时检测单核细胞增生李斯特菌特有的基因序列或者是PCR体系中添加的扩增内标；还有两对用于构建扩增内标的扩增引物（hlpF/R）和长引物（sinF/R），前者hlpF/R只能扩增到用于构建内标的DNA片段，后者（sinF/R）可以通过PCR扩增和基因克隆等手段得到扩增内标。
所述的目的基因，是指：单核细胞增生李斯特菌lmo1035-lmo1037的部分DNA序列。
所述的假阴性：是指在PCR检测过程中，由于体系中存在抑制剂或者由于人为的操作失误导致了最终的的结果呈现假阴性。
本发明在普通的PCR反应体系中加入了一条扩增内标的片段。在同一PCR扩增过程中，可以让目的基因和扩增内标同时进行扩增，当样品中含有单核细胞增生李斯特菌含量高于检测灵敏度时，电泳结果中含有目的基因的扩增片段，检测结果呈现阳性；当样品中不含有或者低于检测灵敏度时，结果中只有扩增内标的扩增片段，检测结果呈现阴性；如果电泳结果中不含有任何扩增片段，则结果即为假阴性。此检测体系能够显示假阴性的发生，避免了样品中由于存在抑制剂或者是由于人为操作失误导致最终的结果呈现假阴性的误判，从而提高了PCR的准确率。
附图说明
图1 未添加IAC时单核细胞增生李斯特菌检测灵敏度的示意图
图中：电泳泳道1-8：每个PCR反应体系中模板DNA浓度分别为1.18ng/μL,118pg/μL，11.8pg/μL，1.18pg/μL，118fg/μL，11.8fg/μL，1.18fg/μL，0.118 fg/μL。9为阴性对照（dH2O）。M：5000bpDNA分子量标准。
图2 添加IAC为6.068×105拷贝时单核细胞增生李斯特菌检测灵敏度的示意图
图中：电泳泳道1-8：每个PCR反应体系中模板DNA浓度分别为1.18ng/μL,118pg/μL，11.8pg/μL，1.18pg/μL，118fg/μL，11.8fg/μL，1.18fg/μL，0.118 fg/μL。9为阴性对照（dH2O）。M：5000bpDNA分子量标准。
图3 菌落灵敏度检测示意图
图中：点用到1-8：每个PCR反应体系中加入单核细胞增生李斯特菌的起始菌落分别为：3.44×107，3.44×106，3.44×105，3.44×104，3.44×103，3.44×102，34.4,3.44(CFU/mL)。9为阴性对照（dH2O）。M：5000bpDNA分子量标准。
具体实施方式
实验例一：
一、 检测体系初步建立
1. 选取检测的目的基因
利用生物信息学对单核细胞增生李斯特菌进行分析，从中选取lmo1035-lom1037的部分DNA序列作为目的基因，用过BLAST软件，目的基因具有很高的保守性和特异性。然后用Primer5.0在这段特异性序列中设计一对内标引物，引物如下：
lmoF:5’- TTAGAGCCAATCAAGCCAGTT-3’
lmoR:5’- ATCGCATAGTCATCCAAAGA-3’
(a) 检测目的基因的序列特征：
*长度：455bp
*类型：核酸
*链型：双链
*拓扑类型：线形
(b) 分子类型：DNA
(c) 最初来源：单核细胞增生李斯特菌
(d) 序列描述：SEQ ID NO.6：
序列中下划线部分的字母代表了引物lmoF和lmoR的位置
2. PCR反应体系的优化
通过对退火温度和Mg2+浓度的优化，确定反应体系如下：
10×buffer 3.5μl
MgCl2溶液（25mM） 1.5μl
dNTP(2.5mM) 3.0μl
上下游引物 1μl+1μl
TAQ DNA聚合酶 1μl
模版 2μl
补无菌水至 50μl
PCR循环参数为，在95°C预变性2min，接着95°变性45s，退火温度52°C，退火时间45s，72°C下延伸55s，经历35次循环，最后在72°C下延伸10min，整个操作结束。
二、 用于制备扩增内标的基因序列扩增
1. 选取用于制备扩增内标的基因序列
选取拟南芥的hlp50基因的一段DNA序列来构建扩增内标，选取的hlp50基因不但可以保证与检测的目的基因同源性低，而且能与其他微生物的总DNA序列的同源性也低。所述的构建扩增内标可以减少非单核细胞增生李斯特菌的DNA对PCR检测的干扰，同时也避免了扩增内标对目的基因的同源交联干扰，使扩增内标降低对目的基因在检测过程中的干扰，增加检测的准确率。引物如下：
hlpF:5’-ACAAAGTTTTGAGTCAAA-3’
hlpR:5’-GGAAGAGAAGGCAGAGAGGT-3’
(a) 检测目的基因的序列特征：
*长度：500bp
*类型：核酸
*链型：双链
*拓扑类型：线形
(b) 分子类型：DNA
(c) 最初来源：拟南芥
(d) 序列描述：SEQ ID NO.7：
2. 连接
PCR回收扩增片段。将回收的扩增片段与pMD19-T载体在Ligation Solution I作用下16°C过夜。
3. 转化大肠杆菌
将从-70℃冰箱中取出的感受受态细胞放在冰上融化。
加入质粒或者连接产物，轻轻混合均匀，冰浴30min。
将EP管放入预加热至42℃的水浴中90sec。
将EP管转移到冰浴中，使细胞冷却1-3min。
每管加LB培养基900μl，将EP管放入37℃摇床250r/min培养1小时。
取200μl培养物涂板，将平板轩于室温直至液体被吸收。倒轩平皿，于37℃恒温箱中培养，12-16小时可出现菌落。
4. 检测
用菌落PCR检测转化大肠杆菌的阳性克隆。并对确定的阳性克隆提取大肠杆菌的质粒PMD-hlp并送去测序验证。
三、 扩增内标的制备
1. 设计长引
在所设计的hlp内标引物5’端分别连接目标引物lmoF和lmoR形成一对约为40bp的长引物。引物序列如下：
hlvF:5’-TTAGAGCCAATCAAGCCAGTTACAAAGTTTTGAGTCAAA-3’
hlvR:5’-ATCGCATAGTCATCCAAAGAGGAAGAGAAGGCAGAGAGGT-3’
2. PCR扩增获得扩增内标
用长引物hlvF和hlvR扩增质粒pMD-hlp的DNA，扩增产物即为扩增内标
(e) 检测目的基因的序列特征：
*长度：541bp
*类型：核酸
*链型：双链
*拓扑类型：线形
(f) 分子类型：DNA
(g) 最初来源：拟南芥
序列描述：SEQ ID NO.10：
序列中划线和阴影部分的字母分别代表hlvF和hlvR的位置。
3. 连接
PCR回收扩增片段。将回收的扩增片段与pMD19-T载体在Ligation Solution I作用下16°C过夜。
4. 转化大肠杆菌
将从-70℃冰箱中取出的感受受态细胞放在冰上融化。
加入质粒或者连接产物，轻轻混合均匀，冰浴30min。
将EP管放入预加热至42℃的水浴中90sec。
将EP管转移到冰浴中，使细胞冷却1-3min。
每管加LB培养基900μl，将EP管放入37℃摇床250r/min培养1小时。
取200μl培养物涂板，将平板轩于室温直至液体被吸收。倒轩平皿，于37℃恒温箱中培养，12-16小时可出现菌落。
5. 检测
用菌落PCR检测转化大肠杆菌的阳性克隆。并对确定的阳性克隆提取大肠杆菌的质粒PMD-iac并送去测序验证。
四、 模板DNA的灵敏度测定
1. 扩增内标及单核细胞增生李斯特菌总DNA的定量测定
纯化的扩增内标和单核细胞增生李斯特菌的总DNA，经DU-800紫外分光光度计测量，起含量分别为21.5ng/μL和29.5ng/μL。根据计算公式N copies/μL=PCR片段的质量（g/μL）/(660g/mol×碱基数) ×（6.023×*1023）可以得到1μL扩增内标的拷贝数是6.068×109
2. 未添加扩增内标时的检测灵敏度
将上述测定的单核细胞增生李斯特菌的总DNA溶液用无菌水10倍梯度稀释，从29.5ng/μL-29.5fg/μLDNA溶液分别取2μL加入PCR反应体系，使每个PCR反应体系（50μL）分别含DNA为：1.18ng/μL,118pg/μL，11.8pg/μL，1.18pg/μL，118fg/μL，11.8fg/μL，1.18fg/μL，0.118 fg/μL扩增结果如图1所示，只有含0.118fg/μLDNA的PCR反应体系没有目标序列的扩增条带，其余反应体系均有，因此，其检测灵敏度为11.8fg/μL。
3. 添加扩增内标的检测灵敏度
纯化的扩增内标先用无菌水作10倍梯度稀释，从6.068×109拷贝/μL-6.068拷贝/μL。然后在上述PCR反应体系中分别加入扩增内标，研究扩增内标对灵敏度的影响。当PCR反应体系添加扩增内标量为6.068×105拷贝时，其检测灵敏度仍然是11.8fg/μL，扩增内标的扩增产物条带清晰（如图2所示）。当PCR反应体系添加扩增内标量小于6.068×105拷贝时，扩增条带荧光强度较弱，不能达到指示假阴性的效果。因此，添加6.06×105拷贝的扩增内标对上述PCR体系的灵敏度没有影响，在本实施例建立的PCR反应体系采用6.068×105拷贝的扩增内标。
4. 菌落灵敏度检测
从平板上，挑取单核细胞增生李斯特菌接入LB培养液，经过8h增菌以后，用生理盐水作10倍剃度稀释，共稀释9个梯度，用平板计数法计算单核细胞增生李斯特菌的菌落浓度。经计算，单核细胞增生李斯特菌菌落浓度为8.6×108CFU/ml。取2μL加入50μLPCR反应体系，经PCR扩增后，可检测到的菌落灵敏度为3.44×104CFU/ml。
五、 特异性评价
采用本实施例建立的PCR检测体系对40株单核细胞增生李斯特菌和30株非单核细胞增生李斯特菌分别进行检测扩增，发现以单核细胞增生李斯特菌都能扩增出455bp的目标序列特异性产物和541bp的扩增内标产物，而非单核细胞增生李斯特菌只能扩增出541bp的扩增内标产物
六、 抗干扰实验
将猪霍乱沙门氏菌Salmonella choleraesuis、金色葡萄球菌S.aureus、大肠杆菌E.coli作为干扰菌株，提取其DNA加入到单细胞增生李斯特菌PCR反应体系中去，每个PCR反应体系分别含有单细胞增生李斯特菌DNA为：1.18ng/μL,118pg/μL，11.8pg/μL，1.18pg/μL，118fg/μL，11.8fg/μL，1.18fg/μL，0.118 fg/μL。实验结果表明在猪霍乱沙门氏菌、金色葡萄球菌、大肠杆菌的干扰下，单细胞增生李斯特菌不受影响，仍为11.8fg/μL，具有良好的稳定性。
七、 准确率评价
从LB平板上挑取单核细胞增生李斯特菌的单菌落，接入到50mL LB 液体培养基中去，在37°C培养12h。用生理盐水作10倍的梯度稀释，并取1mL稀释度为10-8的菌液作平板计数，计算单核细胞增生李斯特菌纯培养的起始浓度。40份猪肉样品，无菌取样25mL，接入1mL 10-2梯度稀释的单核细胞增生李斯特菌菌悬液。将40份人工污染样品添加到225mL LB液体培养基中。在37°C的摇床（120r/min）中增菌。12h后进行取样1次。每份样品取样1mL，放入1.5mL离心管中，30000r/min离心10min，沉淀培养物中的食品残渣。取上清液，在12000g/min离心5min，收集单核细胞增生李斯特菌菌体。倒去上清液后，用无菌双蒸水重新悬浮菌体，离心洗涤3次。然后加入100μL无菌超纯水，在沸水浴中煮10min然后取出，在-20°C放置30min。37°C解冻后，12000g/min离心5min。上清液为PCR模板DNA溶液，获得人工污染样品中PCR模板DNA溶液,进行PCR检测。检测结果中有39份为阳性，1份为阴性（没有目标序列和扩增内标的扩增产物），阴性对照与空白对照仅有扩增内标的扩增产物而无目标序列扩增产物。出现假阴性的样品经过重新纯化DNA后，再次进行检测，假阴性的结果显示为阳性结果。这说明这份假阴性样品中存在抑制PCR反应体系的因子存在，本实施例建立的的检测体系在进行大量样品检测时能够指示假阴性，有助于提高检测的准确度。
<120> 用于检测单核细胞增生李斯特菌的质粒及其制备方法
<160> 10
<210> 1
<211> 3233
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
TCGCGCGTTT CGGTGATGAC GGTGAAAACC TCTGACACAT GCAGCTCCCG GAGACGGTCA 60
CAGCTTGTCT GTAAGCGGAT GCCGGGAGCA GACAAGCCCG TCAGGGCGCG TCAGCGGGTG 120
TTGGCGGGTG TCGGGGCTGG CTTAACTATG CGGCATCAGA GCAGATTGTA CTGAGAGTGC 180
ACCATATGCG GTGTGAAATA CCGCACAGAT GCGTAAGGAG AAAATACCGC ATCAGGCGCC 240
ATTCGCCATT CAGGCTGCGC AACTGTTGGG AAGGGCGATC GGTGCGGGCC TCTTCGCTAT 300
TACGCCAGCT GGCGAAAGGG GGATGTGCTG CAAGGCGATT AAGTTGGGTA ACGCCAGGGT 360
TTTCCCAGTC ACGACGTTGT AAAACGACGG CCAGTGAATT CGAGCTCGGT ACCCGGGGAT 420
CCTCTAGAGA TTTAGAGCCA ATCAAGCCAG TTACAAAGTT TTGAGTCAAA TTGGGTAAAT 480
TTTTTGGTTA TTTTGGTCAT AAAAATAACT AGATTATCTC TTATATCTTA TGAGTTAATT 540
TGGTAAATAA ACCATTTATT TGGGTCAAAC TATTTTTTTC CCCATATATA TATCCAATCA 600
ATAATAAATT CATAATATAT TTCATTAACG CGATTGAAAT ACTAGTAATT AATTGAGGAC 660
TAAAGAAAAA GTAATTTCCT TTTTATCTTT AAAATGTGCA AAAAAAACAA AAATGTTAAT 720
TGGGTGATGA AATAACTTGT TTTCAAAACG GGAGTTACTA TTTGACAATT TAAAAAAGAC 780
CCATCTCGAA GGAGCTAGAA GCGATAACAA AATAAAAAGG AAACAATAGT AATTAGATGG 840
CGCAAAAATA AGATCCAACG GCTGAGATCT TTACTCGTGA ACGTTCTCGA AAGCTCTTTG 900
CCGACCCACT CTTCATTCAT ATATAAACAA ACACCTCTCT GCCTTCTCTT CCTCTTTGGA 960
TGACTATGCG ATATCGTCGA CCTGCAGGCA TGCAAGCTTG GCGTAATCAT GGTCATAGCT 1020
GTTTCCTGTG TGAAATTGTT ATCCGCTCAC AATTCCACAC AACATACGAG CCGGAAGCAT 1080
AAAGTGTAAA GCCTGGGGTG CCTAATGAGT GAGCTAACTC ACATTAATTG CGTTGCGCTC 1140
ACTGCCCGCT TTCCAGTCGG GAAACCTGTC GTGCCAGCTG CATTAATGAA TCGGCCAACG 1200
CGCGGGGAGA GGCGGTTTGC GTATTGGGCG CTCTTCCGCT TCCTCGCTCA CTGACTCGCT 1260
GCGCTCGGTC GTTCGGCTGC GGCGAGCGGT ATCAGCTCAC TCAAAGGCGG TAATACGGTT 1320
ATCCACAGAA TCAGGGGATA ACGCAGGAAA GAACATGTGA GCAAAAGGCC AGCAAAAGGC 1380
CAGGAACCGT AAAAAGGCCG CGTTGCTGGC GTTTTTCCAT AGGCTCCGCC CCCCTGACGA 1440
GCATCACAAA AATCGACGCT CAAGTCAGAG GTGGCGAAAC CCGACAGGAC TATAAAGATA 1500
CCAGGCGTTT CCCCCTGGAA GCTCCCTCGT GCGCTCTCCT GTTCCGACCC TGCCGCTTAC 1560
CGGATACCTG TCCGCCTTTC TCCCTTCGGG AAGCGTGGCG CTTTCTCATA GCTCACGCTG 1620
TAGGTATCTC AGTTCGGTGT AGGTCGTTCG CTCCAAGCTG GGCTGTGTGC ACGAACCCCC 1680
CGTTCAGCCC GACCGCTGCG CCTTATCCGG TAACTATCGT CTTGAGTCCA ACCCGGTAAG 1740
ACACGACTTA TCGCCACTGG CAGCAGCCAC TGGTAACAGG ATTAGCAGAG CGAGGTATGT 1800
AGGCGGTGCT ACAGAGTTCT TGAAGTGGTG GCCTAACTAC GGCTACACTA GAAGAACAGT 1860
ATTTGGTATC TGCGCTCTGC TGAAGCCAGT TACCTTCGGA AAAAGAGTTG GTAGCTCTTG 1920
ATCCGGCAAA CAAACCACCG CTGGTAGCGG TGGTTTTTTT GTTTGCAAGC AGCAGATTAC 1980
GCGCAGAAAA AAAGGATCTC AAGAAGATCC TTTGATCTTT TCTACGGGGT CTGACGCTCA 2040
GTGGAACGAA AACTCACGTT AAGGGATTTT GGTCATGAGA TTATCAAAAA GGATCTTCAC 2100
CTAGATCCTT TTAAATTAAA AATGAAGTTT TAAATCAATC TAAAGTATAT ATGAGTAAAC 2160
TTGGTCTGAC AGTTACCAAT GCTTAATCAG TGAGGCACCT ATCTCAGCGA TCTGTCTATT 2220
TCGTTCATCC ATAGTTGCCT GACTCCCCGT CGTGTAGATA ACTACGATAC GGGAGGGCTT 2280
ACCATCTGGC CCCAGTGCTG CAATGATACC GCGAGACCCA CGCTCACCGG CTCCAGATTT 2340
ATCAGCAATA AACCAGCCAG CCGGAAGGGC CGAGCGCAGA AGTGGTCCTG CAACTTTATC 2400
CGCCTCCATC CAGTCTATTA ATTGTTGCCG GGAAGCTAGA GTAAGTAGTT CGCCAGTTAA 2460
TAGTTTGCGC AACGTTGTTG CCATTGCTAC AGGCATCGTG GTGTCACGCT CGTCGTTTGG 2520
TATGGCTTCA TTCAGCTCCG GTTCCCAACG ATCAAGGCGA GTTACATGAT CCCCCATGTT 2580
GTGCAAAAAA GCGGTTAGCT CCTTCGGTCC TCCGATCGTT GTCAGAAGTA AGTTGGCCGC 2640
AGTGTTATCA CTCATGGTTA TGGCAGCACT GCATAATTCT CTTACTGTCA TGCCATCCGT 2700
AAGATGCTTT TCTGTGACTG GTGAGTACTC AACCAAGTCA TTCTGAGAAT AGTGTATGCG 2760
GCGACCGAGT TGCTCTTGCC CGGCGTCAAT ACGGGATAAT ACCGCGCCAC ATAGCAGAAC 2820
TTTAAAAGTG CTCATCATTG GAAAACGTTC TTCGGGGCGA AAACTCTCAA GGATCTTACC 2880
GCTGTTGAGA TCCAGTTCGA TGTAACCCAC TCGTGCACCC AACTGATCTT CAGCATCTTT 2940
TACTTTCACC AGCGTTTCTG GGTGAGCAAA AACAGGAAGG CAAAATGCCG CAAAAAAGGG 3000
AATAAGGGCG ACACGGAAAT GTTGAATACT CATACTCTTC CTTTTTCAAT ATTATTGAAG 3060
CATTTATCAG GGTTATTGTC TCATGAGCGG ATACATATTT GAATGTATTT AGAAAAATAA 3120
ACAAATAGGG GTTCCGCGCA CATTTCCCCG AAAAGTGCCA CCTGACGTCT AAGAAACCAT 3180
TATTATCATG ACATTAACCT ATAAAAATAG GCGTATCACG AGGCCCTTTC GTC 3240
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213>人工序列
<400> 1
TTAGA GCCAA TCAAG CCAGT T 21
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213>人工序列
<400> 1
ATCGC ATAGT CATCC AAAGA 20
<210> 4
<211>
<212> DNA
<213>人工序列
<400> 1
ACAAAGTTTTGAGTCAAA 18
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213>人工序列
<400> 1
GGAAGAGAAGGCAGAGAGGT 20
<210> 6
<211> 455
<212> DNA
<213>单核细胞增生李斯特菌
<400> 1
TTAGA GCCAA TCAAG CCAGT TATCA ATTCA GAACC GTGTT ACGAA TTGAT GGGAT ATAGT 60
CGACA AAAAT ATGGT CGTTT TAGCC GAGAA GATGT ACGAA AAGCA GCTTG GCAAA GTGTC 120
TTATC TGGTG CTATA GCTGG TATTT CTTAT GGGGC ACATG GCATT TGGAG TTGGC ATGAA 180
GAAGG AAGTA CATTT GGATC AGCTC TAGGT GAAGG ATTTG TTTCT CCATT TAATT GGCGA 240
CAAGC ACTTC ATTTT GAAGG AGCTA CAGAT TATGC ATTTC TAAAA TCCTT TATTC TGGCT 300
AATGA CTTAA CAACA CTGGC ACCAA TAAAT CTAGT TTTAA ATCAA ACTCC AGAAA TTCGA 360
GCAGC GGAGA CCGAA AAAGT AGTTA TCATT TATGT GCCAT CAAAT GTCCC AATTT ATTTG 420
AAAGG GCAAT TTGTT TCTTT GGATG ACTAT GCGAT 480
210> 7
<211> 500
<212> DNA
<213>拟南芥
<400> 1
ACAAA GTTTT GAGTC AAATT GGGTA AATTT TTTGG TTATT TTGGT CATAA AAATA ACTAG 60
ATTAT CTCTT ATATC TTATG AGTTA ATTTG GTAAA TAAAC CATTT ATTTG GGTCA AACTA 120
TTTTT TTCCC CATAT ATATA TCCAA TCAAT AATAA ATTCA TAATA TATTT CATTA ACGCG 180
ATTGA AATAC TAGTA ATTAA TTGAG GACTA AAGAA AAAGT AATTT CCTTT TTATC TTTAA 240
AATGT GCAAA AAAAA CAAAA ATGTT AATTG GGTGA TGAAA TAACT TGTTT TCAAA ACGGG 300
AGTTA CTATT TGACA ATTTA AAAAA GACCC ATCTC GAAGG AGCTA GAAGC GATAA CAAAA 360
TAAAA AGGAA ACAAT AGTAA TTAGA TGGCG CAAAA ATAAG ATCCA ACGGC TGAGA TCTTT 420
ACTCG TGAAC GTTCT CGAAA GCTCT TTGCC GACCC ACTCT TCATT CATAT ATAAA CAAAC 480
ACCTC TCTGC CTTCT CTTCC 540
210> 8
<211> 39
<212> DNA
<213>人工序列
<400> 1
TTAGA GCCAA TCAAG CCAGT TACAA AGTTT TGAGT CAAA 39
210> 9
<211> 40
<212> DNA
<213>人工序列
<400> 1
ATCGC ATAGT CATCC AAAGA GGAAG AGAAG GCAGA GAGGT 40
210> 10
<211> 541
<212> DNA
<213>拟南芥
<400> 1
TTAGA GCCAA TCAAG CCAGT TACAA AGTTT TGAGT CAAAT TGGGT AAATT TTTTG GTTAT 60
TTTGG TCATA AAAAT AACTA GATTA TCTCT TATAT CTTAT GAGTT AATTT GGTAA ATAAA 120
CCATT TATTT GGGTC AAACT ATTTT TTTCC CCATA TATAT ATCCA ATCAA TAATA AATTC 180
ATAAT ATATT TCATT AACGC GATTG AAATA CTAGT AATTA ATTGA GGACT AAAGA AAAAG 240
TAATT TCCTT TTTAT CTTTA AAATG TGCAA AAAAA ACAAA AATGT TAATT GGGTG ATGAA 300
ATAAC TTGTT TTCAA AACGG GAGTT ACTAT TTGAC AATTT AAAAA AGACC CATCT CGAAG 360
GAGCT AGAAG CGATA ACAAA ATAAA AAGGA AACAA TAGTA ATTAG ATGGC GCAAA AATAA 420
GATCC AACGG CTGAG ATCTT TACTC GTGAA CGTTC TCGAA AGCTC TTTGC CGACC CACTC 480
TTCAT TCATA TATAA ACAAA CACCT CTCTG CCTTC TCTTC CTCTT TGGAT GACTA TGCGA 540
T
Claims (4)
1.一种用于检测单核细胞增生李斯特菌的质粒，其特征在于该质粒为SEQ ID NO.1所示的碱基序列。
2.一种制备根据权利要求1所述的用于检测单核细胞增生李斯特菌的质粒的方法，其特征在于该方法的具体步骤为：
a. 从单核细胞增生李斯特菌中选取lmo1035-lom1037的DNA序列作为目的基因，然后根据该序列设计一对引物进行PCR扩增，所述的引物如下：
lmoF:5’- TTAGAGCCAATCAAGCCAGTT-3’
lmoR:5’- ATCGCATAGTCATCCAAAGA-3’；
b. 拟南芥hlp50基因的DNA序列为模板，设计一对内标引物：PRIMER1和PRIMER2，进行梯度PCR扩增，得到扩增内标产物；然后，在内标引物PRIMER1末端连接步骤a所得的目标引物lmoF，在内标引物PRIMER2末端连接lmoR，形成一对长引物；利用该对长引物进行扩增，得到了IAC片段；再将该IAC片段克隆到T载体中，得到用于检测在于克服PCR检测单核细胞增生李斯特菌的质粒；所述的内标引物PRIMER1和PRIMER2为：
PRIMER1:5’-ACAAAGTTTTGAGTCAAA-3’
PRIMER2:5’-GGAAGAGAAGGCAGAGAGGT-3’。
3. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述的梯度PCR扩增的具体方法为：分别取2μl梯度稀释的李斯特菌溶液作为模板，10×buffer为3.5μl，25mM MgCl2溶液为1.5μl，2.5mM dNTP为3.0μl，上下游引物分别为1μl，TAQ DNA聚合酶为1μl，再补无菌水至50μl；PCR循环参数为，在95°C预变性2min，接着95°变性45s，退火温度52°C，退火时间45s，72°C下延伸55s，经历35次循环，最后在72°C下延伸10min。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述的对长引物进行扩增的具体方法为： 分别取1μl的拟南芥基因组作为模板10×buffer为3.5μl，25mM MgCl2溶液为2μl，2.5mM dNTP为3.0μl，上下游引物分别为1μl，TAQ DNA聚合酶为1μl，再补无菌水至50μl；PCR循环参数为，在95°C预变性2min，接着95°变性45s，退火温度53°C，退火时间45s，72°C下延伸55s，经历35次循环，最后在72°C下延伸10min。
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Cited By (1)
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|---|---|---|---|---|
| CN104313173A (zh) * | 2014-11-11 | 2015-01-28 | 舟山市质量技术监督检测研究院 | 单核细胞增生李斯特氏菌实时浊度lamp检测方法 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101177714A (zh) * | 2007-11-15 | 2008-05-14 | 上海交通大学 | 添加扩增内标的单核细胞增生李斯特菌pcr检测方法 |
| CN103320435A (zh) * | 2013-06-28 | 2013-09-25 | 华南理工大学 | 含内标的单核细胞增生李斯特氏菌lamp检测试剂盒 |
-
2014
- 2014-03-21 CN CN201410107255.8A patent/CN103898138A/zh active Pending
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|---|---|---|---|---|
| CN101177714A (zh) * | 2007-11-15 | 2008-05-14 | 上海交通大学 | 添加扩增内标的单核细胞增生李斯特菌pcr检测方法 |
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Non-Patent Citations (1)
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|---|
| 张丹丹: "单核细胞增生李斯特菌PCR检测方法与试剂盒的建立", 《中国优秀硕士论文全文数据库2013年 工程科技Ⅰ辑》 * |
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| CN104313173B (zh) * | 2014-11-11 | 2016-05-04 | 舟山市质量技术监督检测研究院 | 单核细胞增生李斯特氏菌实时浊度lamp检测方法 |
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20140702 |